Новые гибридные функциональные материалы на основе наночастиц золота для ВЭЖХ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Полякова (Блфимова) Яна Андреевна

НОВЫЕ ГИБРИДНЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА ДЛЯ ВЭЖХ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2013

005060557

005060557

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель

член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Шпигун Олег Алексеевич Официальные оппоненты

Яшин Яков Иванович, доктор химических наук, профессор, ООО «Интерлаб», руководитель отдела исследований и разработок Департамента инжиниринга

Староверов Сергей Михайлович, доктор химических наук, ЗАО «БиоХимМак СТ», генеральный директор

Ведущая организация

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ордена Трудового красного знамени Институт нефтехимического синтеза имени А.В. Топчиева РАН

Защита состоится «24» апреля 2013 г. в 15.00 в аудитории 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ имени М.В. Ломоносова, химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: г. Москва, Ломоносовский проспект, д.27.

Автореферат диссертации размещен на сайте ВАК http://vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан «22» марта 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 501.001.88, кандидат химических наук

Торочешникова И.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) на сегодняшний день во всех ее вариантах является наиболее распространенным методом разделения разных классов органических соединений. Появление новых и более сложных для определения синтетических или выделяемых органических соединений, в частности, изомеров, энантиомеров, диастереомеров и др., тенденции к сокращению времени анализа и повышению эффективности разделения предъявляют новые требования к проведению современного хроматографического анализа: целенаправленный синтез новых сорбентов для решения конкретных аналитических задач, повышение стабильности сорбентов, снижение стоимости.

В последнее время наночастицы золота (НЧЗ) и материалы на их основе привлекают все большее внимание ученых из разных областей, что объясняется уникальными физико-химическими свойствами веществ в наноразмерном состоянии. Поскольку наночастицы хорошо поглощают и рассеивают свет, нетоксичны, химически стабильны и биосовместимы, то перспективы их практического применения не ограничены: химический анализ, медицинская диагностика и лечение, катализ, создание сенсоров, оптических и наноэлектронных устройств.

В силу большой поверхности и связанной с ней избыточной поверхностной энергии НЧЗ неустойчивы в водных растворах, поэтому для их стабилизации используют органические лиганды, которые образуют защитную оболочку на поверхности наночастиц за счет химической или физической адсорбции. Чаще всего для стабилизации НЧЗ используют разнообразные серусодержащие соединения, поскольку они образуют на поверхности золота самоорганизованные монослои (СОМ) тиолятов за счет прочной ковалентной связи Аи-Э. Варьирование природы серусодержащих соединений позволяет проводить целенаправленный синтез стабилизированных наночастиц, а их дальнейшая адсорбция на твердую поверхность с сохранением всех основных уникальных свойств наночастиц открывает новые перспективы их применения. Успехи, достигнутые при использовании таких систем в катализе, биохимии и особенно методах разделения (капиллярном электрофорезе и капиллярной электрохроматографии), позволяют считать целесообразным использование стабилизированных НЧЗ и в ВЭЖХ. Таким образом, большая площадь функциональной поверхности НЧЗ, возможность ее ковалентной модификации монослоями серусодержащих соединений и последующее закрепление полученных наночастиц на твердой поверхности открывают путь к созданию новых хроматографических сорбентов.

К достоинствам применения получаемых материалов можно отнести ковалентное закрепление серусодержащих органических лигандов на поверхности НЧЗ, возможность варьирования природы используемого лиганда, простоту синтеза и коммерческую доступность исходных реагентов. Вдобавок, модифицирование НЧЗ на поверхности носителя хиральным селектором позволит проводить разделение оптически активных соединений, что особенно актуально, поскольку существующие на данный момент хроматографические сорбенты для разделения энантиомеров либо очень дороги, либо обладают низкой стабильностью. Стоит отметить, что в литературе имеется только две работы по использованию подобных систем в колоночной ВЭЖХ. Таким образом, актуальность работы определяется потребностью в разработке новых хроматографических сорбентов для разделения широкого круга органических соединений, включая оптически активные, с использованием всех вышеперечисленных достоинств НЧЗ.

Цель работы заключалась в разработке рациональных основ синтеза новых хроматографических сорбентов для ВЭЖХ на основе модифицированных НЧЗ и их применении для разделения разных классов органических соединений, в том числе оптически активных.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• исследовать влияние размера наночастиц золота на степень покрытия матрицы;

• разработать метод иммобилизации наночастиц золота, стабилизированных различными органическими лигандами, на поверхность матрицы (силикагель, функционализированный силикагель, полимерная матрица);

• исследовать строение и состав синтезированных сорбентов комплексом физико-химических методов;

• изучить возможность применения полученных сорбентов на основе НЧЗ в качестве неподвижной фазы в ВЭЖХ для разделения разных классов органических соединений;

• изучить возможность разделения оптически активных соединений на синтезированных сорбентах методом ВЭЖХ;

• апробировать новые синтезированные сорбенты на основе НЧЗ при анализе реальных объектов.

Научная новнзна работы. В результате проведенных систематических исследований синтезирован ряд новых сорбентов для ВЭЖХ на основе НЧЗ и немодифицированного силикагеля; силикагеля, модифицированного 3-аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС), 3-меркаптопропилтриметоксисиланом (МПТМС), а также сополимера стирола и дивинилбензола (ССД).

Структура всех синтезированных сорбентов изучена методами сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), просвечивающей электронной спектроскопии (ПЭМ), атомно-абсорбционной спектроскопии (ААС), спектроскопии диффузного отражения (ДО). Показано, что лучшими матрицами для синтеза сорбентов с точки зрения наибольшей адсорбции НЧЗ являются силикагель, модифицированный МПТМС, и ССД.

Установлены закономерности удерживания аминопиридинов, нитроанилинов и триазольных пестицидов в нормально-фазовом (НФ) режиме ВЭЖХ на синтезированных сорбентах. Предположен характер взаимодействия аминопиридинов с поверхностью силикагеля, модифицированного НЧЗ с Ь-цистеином или метиловым эфиром Ь-цистеина, который подтвержден данными квантово-химического моделирования.

Найдены условия разделения гидрофобных производных гидразина (Ги) и его метилзамещенных на силикагеле, модифицированном НЧЗ с Ь-цистеином. Проведено систематическое изучение энантиоселективных свойств сорбентов с иммобилизованным на НЧЗ Ь-цистеином, бычьим сывороточным альбумином (БСА) и ванкомицином в обращенно-фазовом (ОФ) или полярно-органическом (ПО) вариантах ВЭЖХ при разделении энантиомеров (5-блокаторов. Оптимизированы условия разделения энантиомеров р-блокаторов и профенов на ССД, модифицированном НЧЗ с Ь-цистеином.

Практическая значимость. Разработанный способ получения наногибридных сорбентов для ВЭЖХ, включающий закрепление на носителе НЧЗ и их последующую модификацию серусодержащими органическими соединениями, позволяет получать стабильные сорбенты для ВЭЖХ. В ходе работы впервые синтезированы 7 новых сорбентов на основе НЧЗ для разделения широкого круга органических соединений, включая 4 сорбента для экспрессного разделения энантиомеров Р-блокаторов и профенов в ОФ или ПО вариантах ВЭЖХ.

Практическую значимость имеют разработанные методики определения метопролола и пиндолола в лекарственных препаратах на силикагеле, модифицированном НЧЗ с иммобилизованным ванкомицином.

Показана возможность использования нового сорбента, представляющего собой силикагель, модифицированный стабилизированными Ь-цистеином НЧЗ, для разделения

гидрофобных производных гидразина методом ОФ ВЭЖХ, а также для определения Ги в природной воде на уровне ПДК.

Автор выносит на защиту:

• разработанные способы синтеза 7 новых сорбентов для ВЭЖХ;

• результаты исследования влияния природы и размера наночастиц, а также природы матрицы на выбор оптимальных условий синтеза сорбентов и их хроматографические свойства;

• результаты исследования структуры синтезированных сорбентов комплексом физико-химических методов;

• данные по разделению аминопиридинов, нитроанилинов, пестицидов на синтезированных сорбентах в НФ ВЭЖХ;

• условия разделения гидрофобных производных гидразина и его метилзамещенных на силикагеле, модифицированном НЧЗ с L-цистеином, и результаты определения гидразина в природной воде;

• данные по разделению энантиомеров p-блокаторов на силикагеле, модифицированном НЧЗ с иммобилизованным L-цистеином, БСА или ванкомицином, в ОФ и ПО вариантах ВЭЖХ и условия определения метопролола и пиндолола в лекарственных препаратах;

• данные по разделению энантиомеров p-блокаторов и профенов на ССД, модифицированном НЧЗ и L-цистеином, в ПО и ОФ вариантах ВЭЖХ.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на следующих конференциях: 6th Nanoscience and Nanotechnology Conference (Измир, Турция, 2010), I Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010), IV Всероссийской конференции по наноматериалам «Нано-2011» (Москва, 2011), XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), International Congress of Analytical Science (Киото, Япония, 2011), 36th International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques (Будапешт, Венгрия, 2011), XIX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012» (Москва, 2012), Advances in chromatography and electrophoresis (Оломоуц, Чехия, 2012), 29lh International Symposium on Chromatography (Торунь, Польша, 2012).

Публикации. Основное содержание работы изложено в 15 печатных работах: в 4 статьях и 11 тезисах докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3 глав обзора литературы, 6 глав экспериментальной части, общих выводов и списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на 190 страницах машинописного текста, содержит 63 рисунка, 27 таблиц и 1 приложение, в списке цитируемой литературы 210 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

В обзоре литературы систематизированы и обсуждены сведения из научных публикаций, посвященных различным методам синтеза НЧЗ, а также рассмотрены основные закономерности организации СОМ тиолятов на поверхности золотых наночастиц. Большое внимание уделено способам иммобилизации НЧЗ на поверхность силикагеля и полимерных матриц, а также применению НЧЗ для модифицирования неподвижных фаз в таких методах разделения, как газовая и жидкостная хроматография, капиллярный электрофорез и капиллярная электрокинетическая хроматография. Показана перспективность использования

стабилизированных органическими лигандами НЧЗ в качестве модификаторов неподвижных фаз в различных вариантах хроматографии.

Экспериментальная часть

В качестве матриц для синтеза сорбентов использовали силикагель Kromasil 100-5-Sil (сферический, размер частиц 5 мкм, площадь поверхности 300 м2/г, размер пор 100 А, «Ека Chemicals», Швеция), и ССД (степень сшивки 50%, размер частиц 3.3 ± 0.2 мкм, удельная площадь поверхности 200 м2/г, общий объем пор 0.64 см3/г, средняя длина пор 5 нм, средний диаметр пор 6 нм).

Синтезировали НЧЗ (10 нм) по методу Туркевича, восстанавливая HAuC14 3H20 цитратом натрия в водном кипящем растворе. Полученные наночастицы, стабилизированные цитрат-ионами, затем иммобилизовали на поверхность нефункционализированного силикагеля или силикагеля, функционализированного МПТМС или АПТЭС, а также ССД. Впоследствии заменяли цитрат-ионы на различные серусодержащие соединения: L-цистеин, метиловый эфир L-цистеина, БСА; а также иммобилизовали БСА и ванкомицин посредством сшивающего реагента 3-меркаптопропионовой кислоты (МПК), химически связанной с НЧЗ.

Синтезированными сорбентами заполняли стальные колонки размером 100x4.6 мм или 150x2.1 мм при помощи насоса «Knauer К-1900» под давлением 150-200 бар суспензионным способом. Для этого навеску сорбента (1.200 г) вносили в 20 мл растворителя и гомогенизировали полученную суспензию в ультразвуковой ванне в течение 5 мин. Затем проводили заполнение колонки.

В работе использовали жидкостной хроматографе LC-20 Prominence («Shimadzu», Япония) с диодно-матричным детектором SPD-M20A («Shimadzu», Япония); жидкостной хроматограф «Shimadzu» SLC-10A со спектрофотометрическим детектором «Shimadzu» SPD-10AV и насосом LC-10AT («Shimadzu», Япония). Сбор данных и обработку хроматограмм проводили с помощью программного обеспечения LC Solution фирмы «Shimadzu». Скорость подачи элюента составляла 0.5-1.0 мл/мин, объем петли дозатора составлял 20 мкл, ввод пробы осуществляли шприцом объемом 50 мкл.

Разделение производных гидразинов с 2,3-нафталиндикарбоксальдегидом (НДА) проводили на жидкостном хроматографе «Agilent 1200» («Agilent Technologies», США) с автоматическим инжектором, диодно-матричным и флуориметрическим детекторами. Для записи хроматограмм применяли программное обеспечение Chemstation («Agilent Technologies», США). Скорость подачи элюента составляла 0.8 мл/мин, объем вводимой пробы 100 мкл.

Атомно-абсорбционное определение золота проводили на атомно-абсорбционном спектрометре Contr АА300 (пламя С2Н2/воздух, «Analytic Jena», Германия), высота над срезом горелки 6 мм, расход: ацетилен 45 л/час, воздух 644 л/час. Линия Au 242.8 нм. Элементный анализ образцов проводили на анализаторе Elemenar Vario Micro CUBE («Elementar», Германия). Микрофотографии НЧЗ получали на просвечивающем электронном микроскопе LE0912 AB OMEGA (ускоряющее напряжение 100 кВ, «Cal Zeiss SMT AG Oberckochen», Германия). Образцы готовили нанесением 1-2 мкл золя на покрытую формваром медную сетку (d = 3.05 мм), которую затем сушили на воздухе. Для получения микрофотографий сорбентов использовали сканирующий электронный микроскоп JEOL JSM-6390LA (ускоряющее напряжение 20 kB, «JEOL», Япония). Морфологию образцов определяли в режиме вторичных электронов SEI. Для элементного микроанализа поверхности образцов использовали энергодисперсионную систему ЕХ-54 175 JMH («JEOL», Япония). Регистрацию спектров ДО синтезированных сорбентов осуществляли на мини-спектрофотометре Eye-One Pro

(«GretagMacbeth», Швейцария). Измерение ^-потенциала поверхности синтезированных сорбентов осуществляли с помощью прибора Malvern ZetaSizer («Malvern», Великобритания).

Квантово-химические расчеты проводили в программе Priroda 10 методом функционала плотности (DFT) с неэмпирическим функционалом РВЕ (Perdew, Burke, Ernzerhow) при использовании полноэлектронного лямбда-базиса. Значительные релятивистские эффекты золота учитывали в рамках релятивистского подхода с модифицированным гамильтонианом Дирака-Кулона-Брейта в двухкомпонентном приближении с перенормировкой большой компоненты биспинора.

Силикагель, модифицированный наночастицами золота, стабилизированными

L-цистеином

Синтез и характеристики НЧЗ.

Поскольку свойства наночастиц очень сильно зависят от их размера, то прежде всего проанализировали влияние размера НЧЗ на степень покрытия ими силикагеля. В работе синтезировали НЧЗ размером 2, 10 и 20 нм. Наночастицы размером 2 нм получали по методу Бруста-Шиффрина в водно-толуольном растворе. В качестве стабилизатора наночастиц в реакционную среду добавляли гексантиол. Частицы размером 10 и 20 нм синтезировали стандартным методом Туркевича, используя соотношение НАиСЦ/цитрат натрия 1/3.9 и 1/1.2 соответственно. ПЭМ-изображения НЧЗ разного размера, а также электронные спектры поглощения НЧЗ приведены на рис. 1. Наличие в спектрах характерного максимума поглощения наночастиц в области 510-530 нм, обусловленного поверхностным плазменным резонансом (ППР), подтверждают

Рис. 1. Фотографии (ПЭМ) НЧЗ размером 2 нм Факт П0ЛУче™я НЧЗ. С увеличением (а), 10 нм (б), 20 нм (в) и электронные спектры размера НЧЗ максимум сдвигается в поглощения НЧЗ (г-е). длинноволновую область.

Модифицирование силикагеля наночастицами золота. Модифицирование силикагеля НЧЗ проводили путем добавления определенного количества раствора НЧЗ к суспензии носителя. После иммобилизации НЧЗ размером 10 и 20 нм, стабилизированных цитрат-ионами, силикагель приобретал бледно-фиолетовую окраску, что свидетельствовало об адсорбции золота. В случае частиц размером 2 нм окраска силикагеля лишь слегка изменялась на бледно-розовую. Поскольку цитрат-ионы слабо стабилизируют наночастицы, то следующим этапом синтеза была замена цитрат-ионов или гексантиола на аминокислоту L-цистеин. Выбор L-цистеина в качестве стабилизатора объясняется следующими аспектами: он ковалентно связывается с золотом, при этом содержит функциональные группы, способные взаимодействовать с разными классами органических соединений, и обладает хиральностью для разделения оптически активных соединений. Для сравнения поверхность силикагеля

7

модифицировали также НЧЗ, полученными in situ путем восстановления НАиСЦ цитрат-ионами при нагревании в присутствии силикагеля, а затем проводили замену цитрат-ионов на L-цистеин. Использование такого метода привело к образованию НЧЗ с широким распределением по размерам (30-100 нм).

Из рис. 2а, б, на которых представлены микрофотографии поверхности силикагеля и карта распределения золота, видно, что НЧЗ размером 10 нм адсорбировались на

нефункционализированную поверхность силикагеля. При этом распределение золота по поверхности носит достаточно однородный характер, хотя и присутствует небольшое количество золотых агрегатов. Поскольку размер наночастиц близок к размеру пор силикагеля (100 А), то наночастицы 10 нм не проникают в поры, а раполагаются на геометрической поверхности носителя. Аналогичную картину наблюдали при использовании НЧЗ размером 20 нм (рис. 2в). Получение НЧЗ in situ в присутствии силикагеля также приводило к адсорбции НЧЗ, однако распределение частиц по поверхности крайне неоднородно, и на микрофотографии (рис. 2г) видно значительное количество агрегатов золота. На микрофотографиях силикагеля, модифицированного НЧЗ размером 2 нм, не удалось увидеть золота, поскольку наночастицы такого размера полностью проникают в поры силикагеля.

Количество адсорбированного золота определяли методом ААС. Установили, что на 1 г силикагеля адсорбировалось 23 мкг НЧЗ размером 2 нм, 62 мкг - 10 нм, 53 мкг - 20 нм и 107 мкг-30-100 нм. Таким образом, проведенные исследования показали, что возможно проводить модификацию силикагеля как заранее синтезированными НЧЗ, так и проводить восстановление прекурсора золота в присутствии силикагеля. С точки зрения равномерности покрытия лучше использовать первый подход. При использовании НЧЗ размером 10 нм достигнули максимальной адсорбции золота (6% от исходной массы золота), поэтому в дальнейшем работу проводили с наночастицами такого размера. Исследование влияния массы НЧЗ (10 нм) на их иммобилизацию на силикагель в диапазоне 0.4-6.0 мг методом ААС показало, что наибольшая поверхностная концентрация золота на носителе (62 мкг/г) наблюдается при добавлении к силикагелю средней массы наночастиц (0.45 мг).

Спектры ДО исходного и модифицированного НЧЗ разного размера силикагеля представлены на рис. 3. Появление характерного ярко-выраженного максимума при 530-545 нм в спектрах модифицированного силикагеля обусловлено плазмонным резонансом НЧЗ. Наличие плеча в области 600-700 нм на спектрах свидетельствует о присутствии золотых агрегатов. Спектры силикагеля с НЧЗ размером 10 и 20 нм имеют одинаковую форму, лишь немного отличаясь интенсивностью сигнала. На спектре силикагеля с наночастицами размером 30-100 нм максимум немного сдвигается в область 540 нм, при этом его интенсивность больше, чем в остальных случаях.

Рис. 2. СЭМ-микрофотографии силикагеля, модифицированного НЧЗ размером 10 (а). 20 (в), 30100 нм (г), и карта распределения золота (10 нм) по поверхности силикагеля (б).

Р

0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0

30-100 пи /10 нм \

- - -ч

"У/20нм чЧ^

. У

2 им 8ІО,

450 500 550 600 650 700

Л, НМ

Рис. 3. Спектры ДО исходного силикагеля и силикагеля, модифицированного НЧЗ разного размера, стабилизированных Ь-цистеином.

Таким образом, для получения закрепленных на носителе НЧЗ можно использовать нефункционализированный силикагель. Исходя из литературных данных, иммобилизация цитратных наночастиц происходит за счет физической адсорбции на дефектах и ненасыщенных связях кремния. Последующая замена цитрат-ионов на серусодержащий Ь-цистеин не приводит к десорбции или заметному перераспределению золота на поверхности.

Хроматографическое разделение тестовых соединений. Первоначально свойства сорбента исследовали в НФ ВЭЖХ, используя в качестве подвижной фазы (ПФ) смесь гексана с изопропанолом (90/10 об.%). Полученные результаты показали, что заметным удерживанием (к' > 1) на сорбенте обладают основные вещества: аминопиридины, нитроанилины и пестициды, поэтому эти вещества выбрали в качестве тестовых для дальнейших исследований.

Для сравнения провели также исследование удерживания тестовых соединений на немодифицированном силикагеле и сорбенте 8Ю2-Аи(10 нм)-цитрат. Наибольшее удерживание всех исследуемых соединений наблюдали на сорбенте ЗЮг-Аи-цитрат. В работе рассмотрели закономерности удерживания всех тестовых соединений в зависимости от их структуры и природы сорбента. Полученные данные показали, что селективность разделения и разрешение пиков нитроанилинов выше на сорбенте с цитратом, а пестицидов - на ЗЮг-Аи-Ь-цистеин. Эффективность колонок довольна невысока (Ы 2700-11100 тт/м по пестицидам). На сорбенте БЮг-Аи-Ь-цистеин пропиконазол и дифеноконазол элюируются двумя пиками, которые соответствуют двум стереоизомерам. На немодифицированном силикагеле делятся только изомеры дифеноконазола. Хроматограммы разделения смеси пестицидов на БЮг-Аи-Ь-цистеин и немодифицированном силикагеле приведены на рис 6.

I, ОТН. ед. I отн ед_

и

б

Время, мин

Время, мин

Рис. 6. Хроматограммы разделения смеси пестицидов на (а) ЭЮг -Аи - Ь-цистеин, (б) БЮг. ПФ: гексан/изо-пропанол (90/10 об. %). 1 - диниконазол, 2 -пропиконазол, 3 - дифеноконазол. Скорость потока 0.8 мл/мин. ХШКС = 230 нм

Стоит отметить, что хотя степень покрытия нефункционализированного силикагеля НЧЗ невелика, и внутренняя поверхность силикагеля остается в исходном состоянии и в значительной степени влияет на хроматографические характеристики сорбента, модифицирование силикагеля стабилизированными Ь-цистеином НЧЗ приводит к улучшению селективности разделения (от 1.11 до 1.6 раза) и разрешения пиков (от 1.17 до 2.41 раза) ряда тестовых соединений по сравнению с обычным силикагелем.

Квантово-хнмическое моделирование адсорбции аминопиридннов. Поскольку для дальнейшего применения сорбента ЗЮг-Аи-Ь-цистеин необходимо понимание того, как происходит связывание исследуемых соединений с поверхностью золота, то синтезировали также сорбент, в котором цистеин заменили на его метиловый эфир, чтобы оценить реакционную способность СООН-группы. На данных сорбентах проанализировали удерживание замещенных аминопиридннов, поскольку на примере этого класса соединений удобно рассмотреть влияние структуры сорбатов на удерживание. Выявленные в работе закономерности удерживания в зависимости от структуры аминопиридннов одинаковы для двух сорбентов, однако факторы емкости практически всех аминопиридннов больше на колонке с метиловым эфиром L-цистеина. Для объяснения полученных результатов по разделению замещенных пиридинов провели квантово-химическое моделирование адсорбции цистеина и его эфира на поверхности частицы золота и последующей адсорбции замещенных пиридинов на модифицированной частице. В качестве модели частицы рассмотрели кластер AulO. По данным расчета, взаимодействие кислоты и эфира с кластером происходит путем образования связей Au-S и AU-NH2 с наиболее координационно-ненасыщенными атомами золота, расположенными на грани кластера. Для выявления предположительных центров сорбции замещенных пиридинов на модифицированном кластере провели оптимизацию комплексов Auio(LcysPy) и (PyAu10)Lcys, где Ру-различные аминопиридины. В последнем случае рассматривали координацию аминопиридина по трем различным центрам: атому золота Аи(1), связанному с ЫНг-группой цистеина, соседним с ним атому Аи(2) или по Аи(3), связанному с S-группой. Во всех случаях для AuioLcys и AuioLcysOCH3 рассчитали энтальпии сорбции.

В случае AuioLcys связывание замещенных аминопиридннов с большей вероятностью осуществляется по молекуле цистеина, при этом возможен перенос водорода карбоксильной группы цистеина на азот молекулы пиридина (рис. 7а). В случае замещенных

аминопиридннов на комплексе Ац-Ь-цистеин вносят дисперсионные взаимодействия и образование водородной связи между пиридиновым атомом азота сорбатов и водородом карбонильной группы цистеина. В случае замещенных 2-аминопиридинов происходит дополнительное связывание карбонильного кислорода цистеина с ЫНг-группой исследуемых соединений, что увеличивает их удерживание. При стабилизации НЧЗ метиловым эфиром Ь-цистеина координация аминопиридннов по молекуле модификатора невозможна, что приводит к наряду с дисперсионными взаимодействиями к их связыванию по атомам золота.

2-аминопиридинов также имеет место дополнительное взаимо-

действие водорода ЫНг-группы пиридина с карбонильным атомом кислородом цистеина. При адсорбции пиридинов на комплексе АиюЬсувОСНз их связывание более выгодно на атомах золота, причем наименьшая энергия связи получена при координации азота по Аи(2) (рис. 76). Полученные расчеты позволяют сделать вывод, что основной

вклад в удерживание молекул I

Оценка применимости вытеснптельпых моделей. Для подтверждения механизма удерживания аминопиридинов на сорбенте БіОг-Аи-Ь-цистеин оценили возможность описания полученных экспериментальных данных моделями Снайдера-Сочевинского \%к' = а - п1%ст и Скотга-Кучеры 1 /к' = А + Вс, где а - коэффициент, п - отношение площадей молекул сорбата и наиболее сильно адсорбирующегося компонента ПФ, ст -мольная доля полярного растворителя в элюенте, А, В - коэффициенты, с — концентрация полярного растворителя в ПФ (об.%). Для этого построили зависимости логарифма фактора емкости от логарифма мольной доли изопропанола в ПФ (рис. 8а) и обратной величины фактора емкости (1/к1) от

концентрации изопропанола (с, об.%) (рис. 86).

♦ 5

■ 4

" 3 » 2

• 1

• 1 Ш

* 2 5

«3 4

■ 4 3

»5

2

20 40 60 С, об.% Рис. 8. Зависимости логарифма фактора емкости (\%к') замещенных аминопиридинов от логарифма мольной доли (1§ст) изопропанола в ПФ (а) и обратной величины фактора емкости (1/к') замещенных аминопиридинов от концентрации (с, об.%) изопропанола (б). Колонка БЮг-Аи-Ь-цистенн. ПФ: гексан/изопропанол. Сорбаты: 1 - 3-аминопиридин, 2 - 2-амино-4-метилпиридин, 3 -2-амино-5-метилпиридин, 4 - 2-аминопиридин, 5 -2-амино-5-хлорпиридин.

Зависимость 1/к' от объемной доли изопропанола (рис. 86) для сильно удерживаемых соединений 2-5 линейна в диапазоне 5-70 об.% изопропанола, в то время как для слабоудерживаемого соединения 1 (2-амино-5-хлорпиридина) наблюдается отклонение точек от прямолинейной зависимости, что связано с нарастанием роли межмолекулярных взаимодействий адсорбент-органический модификатор. Полученные результаты свидетельствуют о выполнении традиционного для НФ ВЭЖХ механизма удерживания, обусловленного специфическими взаимодействиями сорбатов с поверхностью неподвижной фазы, и лишь при большом содержании полярной добавки начинают играть роль межмолекулярные взаимодействия с компонентами ПФ, которые не учитываются в рассматриваемых моделях.

Сравнение хроматографических свойств силикагеля, модифицированного наночастицами золота и серебра. Поскольку в литературе не описано применение наночастиц серебра в хроматографических методах анализа, то исследовали возможность использования серебряных наночастиц для модифицирования поверхности силикагеля. Наночастицы серебра получали восстановлением АзЫОз в водном растворе глюкозой. По данным ПЭМ установили, что образовались частицы размером 15-33 нм, при этом 45% частиц имеют средний размер 25 нм. Затем проводили модификацию поверхности силикагеля полученными наночастицами и далее заменяли глюкозу, стабилизирующую поверхность наночастиц, на Ь-цистеин. Из литературных данных известно, что цистеин связывается с серебром посредством образования связи А§-8, аналогично взаимодействию с золотом.

По данным ААС на поверхность силикагеля (1 г) адсорбировалось 25 мкг серебра. Сравнение хроматографических параметров разделения аминопиридинов и нитроанилинов на колонках БЮг-АиОО нм)-Ь-цистеин и 5Ю2-А§ (25 нм)-Ь-цистеин показало, что удерживание исследованных соединений больше на силикагеле с наночастицами серебра, но пики

соединений сильно асимметричны и размыты, что приводит к плохому разрешению (Лб < 0.74) как аминопиридинов, так и нитроанилинов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что модифицирование силикагеля наночастицами серебра, в отличие от НЧЗ, ухудшает хроматографические параметры разделения, что, по нашему мнению, связано, во-первых, с крайней неоднородностью покрытия сорбента, во-вторых, с дополнительными взаимодействиями исследуемых соединений с самими частицами серебра посредством аминогрупп. Все дальнейшие исследования проводили с использованием НЧЗ.

Разделение НДА-пронзводных гидразинов. Еще одним классом азотсодержащих соединений, потребность в определении которых существует в современной аналитической химии, являются гидразины. Одним из лучших методов определения гидразина (Ги), 1-метилгидразина (МГ) и 1,1-диметилгидразина (НДМГ) является их перевод в гидрофобные НДА-производные и последующее разделение в ОФ ВЭЖХ со спектрофотометрическим (Ги и МГ) или флуориметрическим детектированием (НДМГ)- Используя данный подход, установили оптимальные условия разделения НДА-производных на сорбенте БЮг-Ли-Ь-цистсин: для Ги и МГ - 5% ацетонитрила, ЮмМ фосфорная кислота (рН 2.5); для НДМГ - 2% ацетонитрила, ЮмМ фосфорная кислота (рН 2.5). Хроматограммы модельной смеси НДА-производных Ги, МГ и НДМГ, полученные на немодифицированном силикагеле и синтезированном сорбенте в выбранных условиях, представлены на рис. 9. На модифицированном силикагеле наблюдали улучшение формы пиков исследуемых производных и сокращение времени анализа. Установили, что порядок выхода НДА-производных гидразинов на синтезированном сорбенте определяется структурой образующихся производных.

I, ото. ед. а, ед. опт. пл.-ю-3 -----ЭЮ:

100 " 1 -—ЗЮ'-Аи-Ь-цистеин

15

Время, мин

3 .......-5І02 -БіОг-Аи-Ь-цистеин

б

3 і <'

УЧ.......

5 1° Время, МІІН

Рис. 9. Хроматограммы НДА-производных Ги (1), МГ (2) и НДМГ (3). ПФ: 98% Н3Р04 (10 мМ, рН 2.5) - 2% СНзСЫ. Скорость потока 0.8 мл/мин. Детектирование: (а) флуоресцентный детектор, Хвозб = 273 НМ, Хфл = 500 ИМ, (б) спектрофотометрический детектор, Хшкс = 260 нм. Сги ~ смг = 25 мкг/л, сндмг = 75 мг/л.

Рассчитанные аналитические характеристики хроматографического определения НДА-гидразинов приведены в табл. 1. Высокий предел обнаружения производного НДМГ связан с более низкой чувствительностью спектрофотометрического детектора по сравнению с флуориметрическим. К тому же определению низких концентраций НДМГ мешает большой избыток НДА, необходимый для полного протекания реакции дериватизации, поскольку пик реагента в этих условиях частично перекрывается с пиком НДМГ-НДА (рис. 96). Правильность определения НДА-производных Ги и МГ на синтезированном сорбенте проверяли методом «введено-найдено» на примере анализа реального образца воды озера Имандра. Данные, представленные в табл. 2, свидетельствуют о возможности использования модифицированного НЧЗ силикагеля для анализа Ги и МГ в объектах окружающей среды.

Таблица 1. Аналитические характеристики хроматографического определения НДА-гидразинов (« = 3, Р = 0.95). Вид градуировочной зависимости у = а-х

Производное Диапазон линейности, мкг/л а Г " Cmі„, МКГ/Л Sr

Ги-НДА 0.05 -100 82.3 ±0.1 0.9999 0.02 0.04

МГ-НДА 0.1-50 72.0 ± 0.4 0.9998 0.06 0.05

НДМГ-НДА 100-10000 1250±10 0.9998 30 0.05

Таблица 2. Результаты проверки методом «введено-найдено» (п = 3, Р = 0.95)

Производное Введено, мкг/л Найдено, мкг/л Проба

Ги-НДА 0.30 0.28 ± 0.04

5.0 4.7 ±0.5 Вода озера

МГ-НДА 0.30 0.31 ±0.04 Имандра

5.0 5.2 ± 0.6

На синтезированном сорбенте возможно определение Ги в природной воде на уровне ПДК (0.01 мг/л в воде хозяйственно-бытового использования). Стоит отметить, что разделение производных гидразина на модифицированном НЧЗ силикагеле можно проводить менее чем за 7 минут, при этом отсутствует необходимость использования градиентного режима элюирования. Синтезированный сорбент также, как и обращенно-фазовый сорбент, позволяет разделять НДА-производные Ги и МГ с Rs > 1.5, а достигнутые пределы обнаружения этих соединений сравнимы с таковыми на колонке Zorbax Eclipse AAA. Можно сделать вывод, что для определения НДМГ-НДА новый синтезированный сорбент оказался менее пригодным, но при этом по некоторым хроматографическим параметрам показывает лучшие результаты при разделении Ги и МГ, чем обращенно-фазовые сорбенты.

Разделение энантиомеров |5-блокаторов. Следующий этап работы заключался в исследовании возможности разделения энантиомеров p-блокаторов на колонке SiCh-Au-L-цистеин. В табл. 3 представлены данные по разделению энантиомеров p-блокаторов в ПО ВЭЖХ в зависимости от состава ПФ. Удерживание P-блокаторов растет с уменьшением их гидрофобности, что соответствует НФ механизму удерживания. При этом сорбент проявляет энантиоселективность только к некоторым соединениям: алпренололу, окспренололу и пиндололу. Лучшие результаты наблюдали при разделении энантиомеров пиндолола, однако разрешение пиков недостаточное (Rs = 0.78). Хроматограммы энантиоразделения пиндолола и окспренолола в выбранных оптимальных условиях приведены на рис. 10.

Таблица 3. Хроматографические параметры разделения энантиомеров P-блокаторов на SÍO2-Au-L-цистеин (150x2.1 мм). Скорость потока 1 мл/мин. Х„,ах = 276 нм

Р-Блокатор к,' fe' а Rs Nh тт/м N2, тт/м ПФ

1 2 3 4 5 6 7 8

Алпренолол 9.9 11.5 1.16 0.45 8600 9400

Окспренолол 10.7 12.9 1.21 0.60 8300 11700

Метопролол 11.0 11.0 1.00 0.00 7700 - CH3CN/CH3OH/T3A/CH3COOH

Пиндолол 11.2 11.2 1.00 0.00 8900 - 90/10/0.01/0.01 об.%

Надолол 23.5 23.5 1.00 0.00 9300 -

Атенолол 27.5 27.5 1.00 0.00 16000 -

Алпренолол 4.9 6.0 1.23 0.42 6100 8300 CH3CN/CH3OH/T3A/CH3COOH

Окспренолол 5.2 6.3 1.21 0.55 6700 7900 90/10/0.05/0.05 об.%

Алпренолол 3.6 4.6 1.29 0.41 3200 4400 CH3CN/CH3OH/T3A/CH3COOH

Окспренолол 3.7 5.2 1.40 0.57 3500 5600 90/10/0.1/0.1 об.%

1 2 3 4 5 6 7 8

Алпренолол 5.4 5.4 1.00 0.00 4400 -

Окспренолол 5.5 5.5 1.00 0.00 4700 -

Пиндолол 5.5 6.9 1.25 0.78 4900 6500 СНзСЫ/СНзОН/ТЭА/СНзСООН

Метопролол 6.0 6.0 1.00 0.00 5500 - 95/5/0.1/0.1 об.%

Надолол 11.7 11.7 1.00 0.00 7300 -

Атенолол 13.5 13.5 1.00 0.00 8800 -

Пиндолол 5.1 5.9 1.16 0.68 5500 6400 СНзС1Ч/СНзОН/ТЭА/СНзСООН 95/5/0.1/0.05 об.%

Пиндолол 3.9 4.5 1.13 0.64 4500 5600 СНзСЫ/СНзОН/ТЭА/СНзСООН 95/5/0.15/0.05 об.%

Пиндолол 3.1 3.5 1.14 0.40 4300 4800 СНзСЫ/СНзОН/ТЭА/СНзСООН 95/5/0.2/0.05 об.%

І, отн. ед.

з-5-Г"

Время, !ііш

А.

8 10 12 Время, мин

Рис. 10. Хроматограммы энантиоразделения пиндолола (а) и окспренолола (б). Колонка БЮг-Аи-Ь-цистеин (150x2.1 мм). ПФ: СН3С№МеОН/ТЭА/ СНзСООН (а) 95/5/0.1/0.1 об.%, (б) 90/10/0.01/0.01 об.%. Скорость потока 1 мл/мин. Х„,ах = 276 нм.

Полученные экспериментальные результаты показывают возможность использования наночастиц, стабилизированных даже низкомолекулярными хиральными селекторами, в качестве модификаторов поверхности силикагеля для разделения оптически активных соединений. При этом стоит отметить, что полученные результаты очень важны, поскольку открывают дальнейшие перспективы получения новых хроматографических сорбентов путем модифицирования нефункцио-нализированного силикагеля НЧЗ, стабилизированными различными хиральными соединениями.

Функционализированный амино- и меркаптогруппами силикагель, модифицированный наночастнцамн золота с Ь-цистеином

Синтез и исследование структуры. Из литературных данных известно, что лучшим способом увеличения количества НЧЗ на поверхности силикагеля является предварительная функционализация силикагеля различными амино- или меркаптозамещенными силанами. Поэтому следующий этап работы заключался в проведении адсорбции НЧЗ на поверхность силикагеля, предварительно функционализированного АПТЭС или МПТМС. В случае использования меркаптосилана образуется ковалентная связь Аи-Б, а в случае аминосилана адсорбция золота носит электростатический характер. В дальнейшем проводили замену стабилизирующих НЧЗ цитрат-ионов на Ь-цистеин с целью сравнения хроматографических свойств сорбентов на основе нефункционализированного и функционализированного силанами силикагеля с НЧЗ.

Результаты ААС показали, что предварительная функционализация силикагеля значительно увеличила степень покрытия поверхности НЧЗ: в случае АПТЭС адсорбировалось 2.8 мг золота, а в случае МПТМС - 10.3 мг золота, при этом стоит отметить, что 100% добавленного в реакционную среду золота адсорбировалось на силикагеле, функционализиро-ванном МПТМС.

Как видно из рис 11а, б на поверхность Si02-NH2 НЧЗ адсорбировались достаточно равномерно, на фотографии видны золотые агрегаты (самые яркие точки), однако их количество невелико. По поверхности Si02-SH (рис. 11 в, г) НЧЗ также распределены достаточно однородно, и поверхность сорбента покрыта также определенным количеством агрегатов золота.

Рис. 11. СЭМ-микрофотографии и карты распределения золота сорбентов Si02-NH2-Au-L-цистеин (а, б) и 8Ю2-8-Аи-Ь-цистеин (в, г).

1.5

1

0.5

\

/ \

/

N

Ч .

/

\

\

\

\

_Л, нм

500

600

700

0

400

Рис. 12. Спектры ДО Si02-NH2-Au—L-цистеин (1) и Si02-S-Au-L-цистеин (2).

Спектры ДО сорбентов (рис. 12) лишь частично подтверждают выводы, сделанные из рассмотрения СЭМ-микрофотографий. Наличие протяженного плеча на спектре сорбента 8Ю2-ЫН2-Аи—Ь-цистеин свидетельствует об адсорбции большого количества золотых агрегатов. Напротив, максимум на спектре сорбента 8Ю2-8-Аи-1_.-цистеин ярко выражен, и его интенсивность в 3 раза больше, чем у аминированного аналога.

Хроматографические свойства сорбентов.

Хроматографические свойства сорбентов исследовали в НФ ВЭЖХ при разделении смесей аминопиридинов. нитроанилинов и триазольных пестицидов. Провели

сравнение хроматографических параметров (фактор емкости, эффективность, селективность) разделения тестовых соединений на колонках 8Ю2-ЫН2-Аи-Ь-цистеин, 8Ю2-МН2< 8і02-8-Аи-Ь-цистеин, 8Ю2-8Н и 8Ю2-Аи-Ь-цистеин. В целом, хроматографические параметры тестовых соединений оказались хуже на колонке 8Ю2-ЫН2-Аи-Ь-цистеин, за исключением нитроанилинов, селективность разделения которых возросла. Увеличение количества НЧЗ на поверхности меркаптосиликагеля привело к улучшению эффективности колонки, селективности разделения всех тестовых соединений и улучшению разрешения пиков пестицидов. Если на 8Ю2-8Н эффективность разделения соединений не превышала 4000 тт/м, то на колонке 8Ю2-8-Аи-Ь-цистеин она увеличилась до 31000 тт/м, что также в 3 раза больше, чем на колонке 8Ю2-Аи-Ь-цистеин. Хроматограммы разделения модельных смесей нитроанилинов и пестицидов на сорбентах 8Ю2-ЫН2-Аи-Ь-цистеин и 8Ю2-8-Аи-Ь-цистеин представлены на рис. 13.

Полученные результаты показали, что синтезированные сорбенты заметно отличаются по своим хроматографическим свойствам, что связано с различным характером связи НЧЗ с функциональными группами на поверхности силикагеля. В целом, увеличение содержания НЧЗ на поверхности силикагеля приводит к увеличению эффективности колонки и селективности разделения некоторых тестовых соединений.

Рис. 13. Хроматограммы разделения нитроанилинов на 3102-ЫН2-Аи-Ь-цистеин (а) и пестицидов на ЗЮг-Б-Аи-Ь-цистеин (б). ПФ: гексан/ изопропанол (90/10 об.%). Скорость потока: (а) - 0.5 мл/мин, (б) - 1 мл/мин. Хмакс = 230 нм. Сорбаты: 1 -2-нитроанилин, 2 - 3-нитроанилин, 3 -4-нитроанилин, 4 - диниконазол, 5 -тебуконазол, 6, 6' - пропиконазол, 7, 7' -дифеноконазол.

0 2 ' 4 ( I » 13 и « И » 0 ¿4*8

Время, мин Время, мнн

Разделение водорастворимых витаминов. Также в работе исследовали возможность разделения водорастворимых витаминов на сорбенте ЗЮг-МНг-Аи-Ь-цистеин. Исследование влияние рН ПФ на удерживание выбранных витаминов показало, что основной вклад в удерживание витаминов на синтезированном сорбенте вносят электростатические взаимодействия сорбатов с Ь-цистеином, что характерно для варианта Н11ЛС хроматографии. Оптимальное значение рН с точки зрения продолжительности анализа и приемлемого разрешения пиков витаминов составило 3.8. Исследование влияния содержания ацетонитрила в элюенте на разделение витаминов показало, что для разделения смеси витаминов С, ВЗ, В12 и В5 ПФ должна содержать 25% ацетонитрила. Приемлемое разрешение пиков (/?э > 1.0) и время анализа (12 мин) разделения витаминов В1, В2, В6, В10 достигались при содержании в элюенте 92% ацетонитрила. Хроматограммы разделения смесей витаминов приведены на рис. 14 и 15.

Рис. 14. Разделение смеси витаминов С, ВЗ, Рис. 15. Разделение смеси витаминов В1, В2.

В12, В5 на ЗЮг-ИНг-Аи-Ь-цистеин (100x4.6 В6, В10 на 8Ю2-Ш2-Аи-Ь-цистеин (100x4.6

мм). ПФ: 25% СНзС№75% ААБ (50 мМ, рН мм). ПФ: 92% СН3СЫ /8% ААБ (50 мМ, рН

3.8). = 270 нм. Свз = Св5 = Сс = 0.5 мг/мл, 3.8). А^х = 270 нм. Св! = СВ6 = Свю = 1 мг/мл,

СВ12 = 5 мг/мл. Сш = 0.04 мг/мл.

Таким образом, проведенные исследования открыли еще одну возможную область применения силикагеля, модифицированного НЧЗ - разделение водорастворимых витаминов. Предложенный подход является альтернативой применению стандартных обращенно-фазовых колонок. Использование градиентного режима элюирования позволит в дальнейшем проводить определение всех 8 исследованных витаминов в лекарственных препаратах или витаминизированных продуктах.

I, отн. ед. 1 2

II

I, отн. ед.

Силикагель, модифицированный наночастииами золота с иммобилизованным бычьим

сывороточным альбумином

Синтез и исследование структуры сорбента. Учитывая хорошую энантиоразделительную способность белков и высокую биосовместимость НЧЗ с белками, синтезировали сорбент, содержащий в качестве хирального селектора БСА. Для иммобилизации БСА на НЧЗ использовали 2 разных подхода. Первый заключался в закреплении БСА на НЧЗ за счет образования связей между золотом и серусодержащими группами или аминогруппами аминокислот, входящих в состав белка (сорбент SiCh-S-Au-БСА). Второй подход предполагал пришивку БСА посредством использования сшивающего реагента МПК (сорбент Si02-S-Au-S-C00H-BCA). В обоих случаях НЧЗ закрепляли на поверхности функционализированного МПТМС силикагеля. Расчеты по данным элементного анализа показали, что в случае прямой пришивки иммобилизуется большее количество белка (96 мг/1 г Si02), чем посредством МПК (70 мг/1 г S1O2).

Разделение эиантиомеров ß-блокаторов. При использовании в качестве элюента смеси фосфатного буфера (ФБ, pH 7.5, 2 мМ) с изопропанолом (85/15 об.%) на сорбенте SiC>2-S-Au-S-СООН-БСА наблюдали энантиоразделение ряда ß-блокаторов: метопролола, надолола и атенолола. Поскольку состав элюента, и особенно его pH играют важную роль в энантиоразделении на сорбентах с БСА, определяя как заряд самого белка, так и исследуемых соединений, то на примере надолола исследовали влияние pH, концентрации ФБ, природы и содержания органического растворителя на разделение энантиомеров надолола и фактор емкости первого элюирующегося изомера (рис. 17, 18).

Rs_ k' Rs _ к'

40 60

Рн с, мМ

Рис. 17. Влияние рН (а) и концентрации (б) ФБ на разрешение пиков энантиомеров надолола и фактор емкости первого элюирующегося изомера. ПФ: (а) ФБ (2 мМ)//-РЮН (85/15 об.%), (б) ФБ (рН 7.5)/;-РгОН (95/5 об.%). Колонка ЗЮг-Э-Аи-Б-СООН-БСА (100x4.6 мм). 1 мл/мин.

г-РЮН

Рис. 18. Влияние природы органического растворителя (а) и содержания изопропанола в элюенте (б) на разрешение пиков энантиомеров надолола и фактор емкости первого элюирующегося изомера. ПФ: (а) ФБ (20 мМ, рН 7.5)/органический растворитель (95/5 об.%), (б) ФБ (20 мМ, рН 7.5)//-РЮН. Колонка 8Ю2-5-Аи-8-СООН-БСА (100x4.6 мм). 1 мл/мин.

17

С увеличением рН, уменьшением концентрации ФБ и увеличением содержания /-РЮН в элюенте удерживание надолола уменьшается, поскольку ослабляются гидрофобные взаимодействия блокаторов с поверхностью неподвижной фазы, что справедливо для ОФ ВЭЖХ. Проведенные исследования показали, что лучшие результаты энантиоразделения надолола достигаются при использовании 20мМ ФБ с рН 7.5 и 5% ;-РЮН.

В табл. 4 представлены хроматографические параметры разделения 6 исследованных (3-блокаторов на синтезированных разными способами сорбентах с БСА. Энантиоселективность сорбентов оказалась различной, что и следовало ожидать, поскольку способ химического связывания БСА оказывает существенное влияние на селективность разделения энантиомеров. На сорбенте, полученном иммобилизацией БСА через МПК, удалось добиться частичного разделения энантиомеров 4-х р-блокаторов: надолола, пиндолола, метопролола и окспренолола. Максимальную селективность достигнули для надолола и метопролола (а = 1.11), но разрешение пиков не превышало 0.84. На сорбенте, полученном прямой иммобилизацией БСА на НЧЗ, частично делятся изомеры пиндолола, метопролола и окспренолола, и пропадает энантиоразделение надолола. Селективность разделения немного увеличивается по сравнению с первым сорбентом, но низкая эффективность приводит к ухудшению разрешения пиков, которое не превышает 0.47. Хроматограмма энантиоразделения смеси надолола и метопролола на колонке ЭЮг-З—Аи-Б-ССЮН-БСА приведена на рис. 19.

Таблица 4. Хроматографические параметры разделения энантиомеров (3-блокаторов на ЗЮг-Э-Аи-Б-СООН-БСА и БЮг-Б-Аи-БСА (100x4.6 мм). ПФ: ФБ (20 мМ, рН 7.5)/г-РЮН (95/5 об.%). Скорость потока 1 мл/мин. ХП1ах=270 нм

Блокатор ЗЮ2-3-Аи-3-СООН-БСА Э Юг-З-Аи-БСА

к'і к'2 а N. тт/м к', к'2 а Дз N. тт/м

Атенолол 8.2 8.2 1.00 0.00 7900 3.9 3.9 1.00 0.00 3400

Надолол 16.7 18.5 1.11 0.84 8300 8920 7.4 7.4 1.00 0.00 4100

Пиндолол 20.1 21.0 1.04 0.37 10500 11300 12.1 12.7 1.05 0.21 4200 4500

Метопролол 21.1 23.3 1.11 0.78 11700 11900 13.1 15.1 1.15 0.47 4800 5900

Окспренолол 24.3 25.1 1.03 0.33 12800 13300 15.6 16.5 1.06 0.24 4800 3900

Алпренолол 63.5 63.5 1.00 0.00 5700 46.1 46.1 1.00 0.00 3200

Рис. 19. Хроматограмма разделения смеси надолола (1) и метопролола (2) на ЗЮг-З-Аи-З-СООН-БСА (100x4.6 мм). ПФ: ФБ (20 мМ, рН 7.5)/;-РЮН (95/5 об.%). Скорость потока 1 мл/мин. Ятах=270 нм.

Полученные результаты показали перспективность использования НЧЗ в качестве спейсера между силикагелем и БСА. Синтезированные сорбенты устойчивы при непрерывной работе в течение нескольких месяцев при соблюдении условий правильного

А, тАи

Время, мин

хранения (4°С, промывка с добавлением 0.1% азида натрия). Воспроизводимость результатов разделения Р-блокаторов на SiCh-S-Au-S-COOH-ECA составила 4%.

Силикагель, модифицированный наночастнцами золота с иммобилизованным

ванкомицином

Синтез и исследование структуры сорбента. Поскольку сорбенты на основе макроциклических гликопептидных антибиотиков с успехом применяются для разделения энантиомеров различных оптически активных соединений, и энантиоселективность таких сорбентов зависит от способа иммобилизации антибиотика, то синтезировали новый сорбент на основе меркаптосиликагеля и НЧЗ, которые сначала модифицировали МПК, а затем после активации иммобилизовали антибиотик ванкомицин посредством образования амидной связи между -СООН группой кислоты и -NH2 группами ванкомицина. Данные элементного анализа показали, что плотность иммобилизации ванкомицина составила 51 ммоль/г. При этом с модифицированной поверхностью силикагеля прореагировало 74% от исходного ванкомицина, введенного в реакцию.

Разделение энантиомеров p-блокаторов. Разделение энантиомеров Р-блокаторов проводили в ОФ ВЭЖХ, выбрав в качестве стартовой ПФ триэтиламин-ацетатный буферный раствор (ТЭАА) (50 мМ, рН 4.0) с добавкой ацетонитрила (95/5 об.%). Исследование влияния природы органического растворителя (рис. 20а) на Rs энантиомеров Р-блокаторов показало, что лучшее разделение во всех случаях достигалось при использовании ацетонитрила. Оптимальным буферным раствором для разделения энантиомеров пиндолола, метопролола, окспренолола и аппренолола является ФБ, для разделения надолола и атенолола — ААБ (рис. 206).

СНзСК МеОН Z-РЮН ТЭАА ААБ ФБ

Рис. 20. Влияние природы органического растворителя (а) и буферного раствора (б) на разрешение энантиомеров р-блокаторов на ЗЮг-З-Аи-Э-СООН-ванкомицин (100x4.6 мм). ПФ: буферный раствор (50 мМ, рН 4.0)/органический растворитель (95/5 об.%). Скорость потока 0.5 мл/мин. Х,„ах = 270 нм. 1 - пиндолол, 2 - метопролол, 3 - окспренолол, 4 -алпренолол, 5 - надолол, 6 - атенолол.

Зависимость Дэ энантиомеров от концентрации буферного раствора (для тех буферных растворов, в которых наблюдали лучшее разделение) представлена на рис. 21а. Для пиндолола, метопролола, окспренолола, алпренолола и надолола лучшее разрешение пиков наблюдали при использовании 25мМ ФБ (Дв = 0.72-0.92). Для атенолола лучшее разделение достигнуто при использовании 50мМ ААБ (Дв = 0.53). Максимальное разрешение пиков энантиомеров всех блокаторов наблюдается при рН 4.0 (рис. 216). Хроматографические параметры разделения в выбранных для каждого р-блокатора оптимальных условиях приведены в табл. 5.

Лв 1

0.8 0.6 0.4 0.2 0

—•— Пиндолол —•— Метопролол —♦■-Окспренолол

- •*- Алпренолол —«— Надолол

- ■•* ■ Атенолол

---»-—Пиндолол —Метопролол —••-Окспренолол

- -*- Алпренолол —■— Надолол

- . Атенолол

С, мМ

3.5 4 4.5

Рис. 21. Влияние концентрации буферного раствора (а) и рН ПФ (б) на разрешение энантиомеров р-блокаторов на ЭЮг-З-Аи-З-СООН-ванкомицин (100x4.6 мм). ПФ: буферный раствор/СНзС>І (96/4 об.%). Скорость потока 0.5 мл/мин. Х,^ = 270 нм.

Таблица 5. Хроматографические параметры разделения энантиомеров Р-блокаторов на сорбенте ЗЮг-З-Ац-З-СООН-ванкомицин (100x4.6 мм). Скорость потока 0.5 мл/мин. Х™* = 270 нм

Р-Блокатор /г> мин К а Я, тт/м ПФ

Надолол 1.62 0.62 0.71 1.38 8200 ААБ (25 мМ, рН 4.0)/СНзСЫ

1.85 0.85 9700 (96/4 об.%)

Атенолол 1.57 0.57 0.53 1.28 7600 ААБ (50 мМ, рН 4.0)/СНзСЫ

1.73 0.73 10500 (96/4 об.%)

Метопролол 2.11 1.11 0.92 1.27 10100

2.40 1.40 13200

Алпренолол 2.23 1.23 0.81 1.28 10700

2.58 1.58 12600 ФБ (25 мМ, рН 4.0)/СН3СЫ

Окспренолол 2.10 1.10 0.91 1.30 13000 (96/4 об.%)

2.43 1.43 16300

Пиндолол 1.94 0.94 0.93 1.30 16400

2.22 1.22 13200

В оптимальных условиях разделения пиндолола и метопролола на синтезированном сорбенте разработали методику их определения с аналитическими характеристиками, представленными в табл. 6. Предложенные методики позволяют определять пиндолол и метопролол в широком диапазоне концентраций с хорошей воспроизводимостью.

Таблица 6. Аналитические характеристики хроматографического определения пиндолола и метопролола (л = 3, Р = 0.95)

Р-Блокатор Диапазон определяемых концентраций, мг/л Уравнение градуировочной зависимости г ■5г

Пиндолол 0.001 -500 у = (1819 ± 30)хс 0.9994 0.06

Метопролол 0.005 - 100 у = (1278 ±15)хс 0.9998 0.05

Воспроизводимость результатов разделения энантиомеров Р-блокаторов на синтезированном сорбенте при работе в течение 3 месяцев составила 2%. Проведенные исследования показали, что хиральная неподвижная фаза на основе силикагеля, модифицированного НЧЗ с иммобилизованным ванкомицином, показала хорошие результаты при разделении энантиомеров р-блокаторов. Для дальнейшего успешного ее применения

необходимо увеличить длину колонки, что приведет к увеличению удерживания и улучшению разрешения пиков, а также оптимизировать способ иммобилизации ванкомицина. Однако и сейчас полученные значения Дв (0.91-0.93) приемлемы для анализа лекарственных препаратов (3-блокаторов.

Анализ лекарственных препаратов «Вискен» и «Вазокардин». Практическое применение разработанного подхода для разделения и определения энантиомеров р-блокаторов продемонстрировали на примере анализа фармацевтического препарата «Вискен», содержащего в качестве действующего вещества пиндолол, и «Вазокардин», содержащего метопролол. Результаты определения пиндолола и метопролола в указанных препаратах методом внешнего стандарта приведены в табл. 7. Из представленных на рис. 22 хроматограмм препаратов «Вискен» и «Вазокардин» видно, что препараты представляют собой рацемическую смесь.

Таблица 7. Результаты определения пиндолола в фармацевтическом препарате «Вискен» и метопролола в препарате «Вазокардин» (п = 5, Р = 0.95)

Препарат Найдено, мг Паспортное содержание, мг &

«Вискен» 4.7 ±0.5 5.0 0.07

«Вазокардин» 110± 10 100.0 0.05

Время, мин Время, мин

Рис. 22. Хроматограммы препаратов «Вискен» (а) и «Вазокардин» (б). Колонка ЭЮг-З-Аи-З-СООН-ванкомицин (100x4.6 мм). ПФ: ФБ (25 мМ, рН 4.0)/СН3СЫ (96/4 об.%). Скорость потока 0.5 мл/мин. Хтах = 270 нм.

Таким образом, можно сделать вывод, что на силикагеле, модифицированном НЧЗ и ванкомицином, возможно проводить определение содержания [3-блокаторов в лекарственных препаратах. При этом разработанные методики более экспрессны (время анализа 15-20 мин), просты и менее трудоемки, чем известные из литературы.

Сополимер стирола и дивинилбензола, модифицированный наночастицами золота с

Ь-цистеином

Синтез и исследование структуры сорбента. Полимерные материалы наряду с силикагелем находят широкое применение в качестве неподвижных фаз в ВЭЖХ. Ввиду этого самостоятельный научный интерес представляло сравнение поведения НЧЗ на поверхности нефункционализированного полимерного материала и силикагеля. В качестве носителя НЧЗ использовали сферической формы микросферы ССД (3.3 мкм) со степенью сшивки 50%. Модифицировали полимер напрямую НЧЗ, стабилизированными цитрат-ионами, размером 10 нм, а затем проводили замену цитрат-ионов на Ь-цистеин. Как видно из рис. 23а, на котором приведена микрофотография сорбента, НЧЗ равномерно адсорбировались на

нефункционализированную поверхность сорбента. Спектры ДО исходного ССД и модифицированного НЧЗ, а также сорбента ЭЮг-Аи-Ь-цистеин, представленные на рис. 236, отчетливо демонстрируют, что на полимерную матрицу сорбируется больше золота, чем на поверхность силикагеля.

1йВ

ИДЯМВИ ІІІІірі

. ІШЯШ

Ш

■ дДДД

нра ИИ НВІІН

0.6 0.4 0.2

6

Рис. 23. СЭМ-микрофотография сорбента ССД-Аи-Ь-цистеин (а) и спектры ДО (б) немодифицированного ССД (1), БЮг-Аи-Ь-цистеин (2) и ССД-Аи-Ь-цистеин (3).

400

500

600

700

~А, нм

Эти данные подтверждаются также результатами атомно-абсорбционного определения золота, которые показали, что на поверхность сополимера адсорбировалось 0.18 мг золота, что в 3 раза больше, чем на немодифицированный силикагель. Таким образом, замена силикагелевой матрицы на полимерный материал приводит к увеличению степени покрытия поверхности золотом.

Разделение энантиомеров (5-блокаторов. В ОФ ВЭЖХ при использовании в качестве элюента смеси ацетонитрила с ААБ (рН 4.0, 10 мМ) сорбент не проявил энантиоселективности к исследуемым соединениям. При переходе к ПО ВЭЖХ наблюдали энантиоразделение всех 6

исследуемых Р-блокаторов. На рис. 24 А, шАи приведены хроматограммы энантио-

разделения атенолола в зависимости от соотношения метанола и ацетонитрила при постоянной добавке уксусной кислоты и ТЭА (0.05 об.% и 0.15 об.% соответственно). С увеличением содержания ацетонитрила удерживание р-блокаторов увеличивается, энантиоселективность при этом достигает максимального значения при составе элюента 85% СН3СЫ/15% МеОН/0.05% СНзСООН/О.15% ТЭА (об.%) (Ля = 0.71, «= 1.31).

Исследование влияния

концентрации ТЭА на разделение энантиомеров атенолола показало, что лучшее разделение обеспечивает добавка в ПФ 0.15% амина. Хроматографические параметры

разделения энантиомеров всех исследуемых Р-блокаторов приведены в табл. 8. Селективность энантиоразделения достаточна высока (а 1.15-1.31), но невысокая эффективность (/V 4760-7620 тт/м) приводит к тому, что разрешение пиков энантиомеров не превышает 0.76. Наилучшие значения Дз достигаются для алпренолола и пиндолола.

85% СНзСК-15% МеОН

Время, мин

Рис. 24. Хроматограммы энантиоразделения атенолола в зависимости от состава ПФ. ПФ: СН3СЫ/МеОН/0.05% СНзСООН/О.15% ТЭА (об.%). Скорость потока 0.9 мл/мин. Атах = 270 нм.

Таблица 8. Хроматографические параметры разделения энантиомеров ß-блокаторов на ССД-Au-L-цистеин (100x4.6 мм). ПФ: 85% CH3CN/15% МеОН/0.05% CH3COOH/O.15% ТЭА (об.%). Скорость потока 0.9 мл/мин. Х„,ах = 270 нм

Р-Блокатор к,' к2' Rs а JV;, ТТ/М N2, тг/м

Атенолол 1.31 1.71 0.71 1.31 4760 5570

Окспренолол 1.80 2.26 0.68 1.26 5590 6830

Пиндолол 1.82 2.20 0.72 1.21 5770 6420

Надолол 2.07 2.38 0.74 1.15 5820 6800

Метопролол 2.49 2.86 0.69 1.15 6030 7380

Алпренолол 2.83 3.30 0.76 1.17 6550 7620

Хроматограммы энатиоразделения пиндолола и алпренолола на исходном и модифицированном сополимере приведены на рис. 25. Видно, что модифицирование ССД НЧЗ с Ь-цистеином приводит к увеличению удерживания соединений и появлению энантиоразделения. Сравнивая хроматографические параметры разделения энантиомеров Р-блокаторов на модифицированном сополимере и силикагеле (табл. 3, 8), можно сделать вывод, что селективность разделения и разрешение пиков одинаково для обоих сорбентов.

-ССД

-ССД-Аи-Ь-цистеин

Рис. 25. Хроматограммы энантиоразделения алпренолола (а) и пиндолола (б) на ССД и ССД-Аи-Ь-цистеин (100x4.6 мм). ПФ: 85% CH3CN/15% МеОН/0.05% СНзСООН/О.15% ТЭА (об.%). Скорость потока 0.9 мл/мин. Ята* = 270 НМ.

Время, мин

Время, мин

Разделение энантиомеров профенов. Еще одной важной группой оптически активных соединений являются профены. На сорбенте ССД-Аи-Ь-цистеин проводили разделение энантиомеров профенов в ОФ варианте. Наилучшее энантиоразделение было достигнуто при использовании в качестве элюента смеси ацетонитрила с ФБ (20 мМ, pH 6.5) (80/20 об.%). На рис. 26 представлены хроматограммы энантиоразделения флурбипрофена и ибупрофена на модифицированном и исходном сополимере. Как и в случае с нефункционализированным силикагелем, селективность энантиоразделения достаточная (а 1.19-1.57), но низкая эффективность колонки (N 2730-4820 тт/м) является основным фактором, не позволяющим добиться разрешения пиков до базовой линии. Наилучшие параметры энантиоразделения на синтезированном сорбенте достигнуты для флурбипрофена (а = 1.57, Rs = 0.78). Также определили порядок выхода энантиомеров на примере кетопрофена. Для этого получили хроматограммы рацемической смеси кетопрофена и раствора 8-(+)-кетопрофена. Из сравнения полученных хроматограмм сделали вывод, что 8-(+)-кетопрофен элюируется позже R-(+)-кеторопрофена.

А, тАи

ССД

- ССД-Аи-1_-цистеин'

А, тАи

______Рис. 26. Хроматограммы энан-

--ССД-Аи-Ь-цистенн тиоразделения ибупрофена (а) и

флурбипрофена (б) на ССД и ССД-Аи-Ь-цистеин (100x4.6 мм). ПФ: 80 об.% СНзСЫ/20 об.% ФБ (20 мМ, рН 6.5). Скорость потока 0.6 мл/мин. Хщах = 254 нм.

Время, мин

Время, мин

Настоящая работа является первым исследованием, в котором проведено систематическое изучение адсорбции НЧЗ на поверхность силикагеля и полимерной матрицы с целью использования полученных материалов в ВЭЖХ для разделения разных классов органических соединений. Главными достоинствами предложенных материалов являются простота синтеза, возможность на основе одной методики синтезировать множество разных сорбентов для решения конкретных задач, меняя стабилизатор НЧЗ, а также экспрессность разделения. К недостаткам стандартных способов модифицирования силикагеля зачастую можно отнести невозможность пришивки соединений, функциональные группы которых несовместимы в одной молекуле с якорными группами, ответственными за закрепление на поверхности матрицы. Предложенный нами подход основан на высоком сродстве серы к золоту, что позволяет получать сорбенты, несущие на поверхности соединения с разными функциональными группами, что особенно важно при разделении оптически активных соединений.

Для расширения круга возможных разделяемых соединений и увеличения эффективности разделения необходимо дальнейшее усовершенствование способов синтеза сорбентов на основе НЧЗ. Однако результаты проведенных исследований свидетельствуют о перспективности хроматографического применения полученных наногибридных материалов уже в настоящее время.

ВЫВОДЫ

1. Для выбора рациональных основ синтеза сорбентов изучено влияние размера и природы наночастиц, способа их иммобилизации и природы матрицы. На основе полученных данных разработаны способы синтеза 7 новых сорбентов, полученных адсорбцией золотых наночастиц на нефункционализированный силикагель; силикагель, функционализированный 3-аминопропилтриэтоксисиланом и 3-меркаптопропилтриметоксисиланом, а также сополимер стирола и дивинилбензола с использованием в качестве модификаторов наночастиц золота Ь-цистеина, метилового эфира Ь-цистеина, ванкомицина и бычьего сывороточного альбумина.

2. Структура синтезированных сорбентов исследована методами сканирующей электронной микроскопии, просвечивающей электронной микроскопии, атомно-абсорбционной спектроскопии, спектроскопии диффузного отражения, и установлено, что лучшими матрицами для синтеза сорбентов с точки зрения наибольшей адсорбции наночастиц золота являются силикагель, функционализированный 3-меркаптопропилтриметоксисиланом, и сополимер стирола и дивинилбензола.

3. Установлены закономерности удерживания нитроанилинов, аминопиридннов, триазольных пестицидов на силикагеле, модифицированном наночастицами золота с Ь-цистеином, в

24

нормально-фазовой ВЭЖХ. Взаимодействие аминопиридинов с поверхностью сорбента происходит путем связывания с молекулами стабилизатора, что соответствует результатам квантово-химического моделирования.

4. Выбраны условия разделения производных гидразина и его метилзамещенных с 2,3-нафталиндикарбоксальдегидом на силикагеле, модифицированном наночастицами золота с L-цистеином, и адаптирована методика определения гидразина в природной воде на синтезированном сорбенте (стщ = 0.02 мкг/л , лг = 0.04).

5. Проведено разделение энантиомеров ß-блокаторов на тиолированном силикагеле, модифицированном наночастицами золота с иммобилизованным бычьим сывороточным альбумином или ванкомицином в обращенно-фазовой ВЭЖХ, а также на нефункционализированном силикагеле и сополимере стирола и дивинилбензола, модифицированных золотьми наночастицами с L-цистеином, в полярно-органическом варианте ВЭЖХ. Выбраны условия разделения (природа, концентрация и pH буферного раствора, природа и концентрация органического растворителя) энантиомеров ß-блокаторов. Установлено, что большей энантиораспознавательной способностью по отношению к ß-блокаторам обладает сорбент на основе ванкомицина. Показана возможность разделения энантиомеров профенов на модифицированном наночастицами золота сополимере стирола и дивинилбензола.

6. Разработаны методики определения пиндолола и метопролола и их энантиомерного состава на тиолированном силикагеле, модифицированном наночастицами золота с иммобилизованным ванкомицином: диапазон определяемых концентраций 0.001 - 500 и 0.005 - 100 мг/л, J, 0.06 и 0.05 для пиндолола и метопролола соответственно.

7. Разработанные методики апробированы при анализе лекарственных препаратов «Вискен» и «Вазокардин», а также при анализе реального образца воды озера Имандра на содержание гидразина.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Ананьева И.А., Елфимова Я.А.. Мажуга А.Г., Рудаковская П.Г., Шаповалова E.H., Зык Н.В., Шпигун O.A. Новый наногибридный функциональный материал для ВЭЖХ на основе наночастиц золота, стабилизированных L-цистеином. // Сорбц. хромат, процессы. 2011. Т. 11. Вып. 3. С. 281-291.

2. Шаповалова E.H., Ананьева И.А., Елфимова Я.А.. Гринева Л.А., Мажуга А.Г., Шпигун O.A. Разделение азотсодержащих соединений методом ВЭЖХ на силикагеле, модифицированном наночастицами золота, стабилизированными хитозаном. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2012. Т. 53. № 2. С. 108-114.

3. Елфимова Я.А.. Ананьева И.А., Мажуга А.Г., Шпигун O.A. Определение замещенных гидразинов в виде производных с 2,3-нафталиндикарбоксальдегидом методом ВЭЖХ на силикагеле, модифицированном наночастицами золота. // Заводск. лаборатория. Диагностика материалов. 2012. Т. 78. № 6. С. 20-27.

4. Елфимова Я.А.. Пичугина Д.А., Ананьева И.А., Мажуга А.Г., Шпигун O.A. Закономерности удерживания аминопиридинов на силикагеле, модифицированном наночастицами золота. // Журн. физ. химии. 2012. Т. 86. № 9. С. 1-8.

5. Elfimova Y.A.. Ananieva I.A., Majouga A.G., Zyk N.V., Shpigun O.A. L-cysteine gold nanoparticles on silica surface for HPLC separation. / Materials of 6lh Nanoscience and Nanotechnology Conference, Izmir, Turkey, June 15-18,2010. P. 217.

6. Ananieva I.A., Elfimova Y.A.. Majouga A.G., Zyk N.V., Shpigun O.A. New stationary phase based on stabilized by organic ligands gold nanoparticles on silica surface for HPLC. / Materials of 6th Nanoscience and Nanotechnology Conference, Izmir, Turkey, June 15-18,2010. P. 216.

7. Елфимова Я.А.. Ананьева И.А., Мажуга А.Г., Шпигун O.A. Сравнение хроматографических свойств силикагеля, модифицированного наночастицами золота,

стабилизированными 4'-(6-сульфидо-гексилокси)-[2,2';6',2"]-терпиридином и пиридилтиолом. / Материалы I Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез», Краснодар, 26 сентября - 01 октября 2010 г. С. 24.

8. Елфимова Я.А.. Ананьева И.А., Мажуга А.Г., Шпигун О.А. Хроматографические свойства силикагелей, модифицированных частицами золота и серебра. / Материалы IV Всероссийской конференции по наноматериалам «Нано-2011», Москва, 1-4 марта 2011 г. С. 153.

9. Елфимова Я.А.. Кузнецов А.А. Применение наночастиц золота как модификаторов поверхности силикагеля для ВЭЖХ. / Материалы XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011», Москва, 11-15 апреля 2011 г. «Химия». Подсекция «Аналитическая химия». Электронный носитель.

10. Ananieva I.A., Elfimova Y.A.. Rodin I.A., Shpigun О.А. Retention ability of silica gel modified with gold nanoparticles stabilized by L-cysteine and L-cysteine methyl ester. / Materials of International Congress of Analytical Science, Kyoto, Japan, May 22-26, 2011. Reference code: 23P036.

11. Ananieva I.A., Elfimova Y.A.. Majouga A.G., Pichugina D.A., Shpigun O.A. The application of silica gel supported gold nanoparticles in HPLC. / Materials of Зб"1 International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, Budapest, Hungary, June 19-23, 2011. Reference code: P2-G-513-WE.

12. Elfimova Y.A.. Ananieva I.A., Kuznetsov A.A., Majouga A.G., Shpigun O.A. Amino-coated silica gel modified with gold nanoparticles as a novel stationary phase for HPLC. / Materials of Зб"1 International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, Budapest, Hungary, June 19-23,2011. Reference code: P2-G-430-TH.

13. Елфимова Я.А. Новые наногибридные функциональные материалы для ВЭЖХ. / Материалы XIX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012», Москва, 9-13 апреля 2012 г. «Химия». Подсекция «Аналитическая химия». Электронный носитель.

14. Elfimova Y.A.. Ananieva I.A., Rudakovskaya P.G., Majouga A.G., Shpigun O.A. HPLC enantiomeric separation of p-blockers using bovine serum albumin immobilized on gold nanoparticles supported on silica gel. / Materials of advances in chromatography and electrophoresis, Olomouc, Czech Republic, June 11-14,2012. P. 72-73.

15. Elfimova Y.A.. Ananieva I.A., Rudakovskaya P.G., Majouga A.G., Shpigun O.A. New chiral stationary phase for HPLC based on silica gel modified with vancomycin-gold nanoparticles conjugates. / Materials of 29lh International Symposium on Chromatography, Torun, Poland, September 9-13,2012. P. 636.

Автор выражает искреннюю благодарность к.х.н, Ананьевой И.А. (кафедра аначитической химии Химического факультета МГУ) за неоценимую помощь в ходе выполнения диссертации; к.х.н. Шаповаловой Е.Н. (кафедра аначитической химии Химического факультета МГУ) за ценные советы и помощь в подготовке диссертации; к.х. н. Мажуге А.Г., асп. Рудаковской П.Г., Кузнецову А.А (кафедра органической ximuu Химического факультета МГУ) за помощь в проведении органического синтеза и ценные советы; к.х.н. Пичугиной Д.А. (кафедра физической химии Химического факультета МГУ) за проведение квантово-химических расчетов; к.х.н. Савичову С. В. и м.н.с. Нестеровой Е.А. (кафедра физической химии Химического факультета МГУ) за помощь в проведении микроскопических исследований; к.х.н. Апяри ВВ. (кафедра аналитической химии Химического факультета МГУ) за помощь в регистрации спектров диффузного отражения; аспиранту Синицину М.Ю. (кафедра аналитической химии Химического факультета МГУ) за помощь в проведении атомно-абсорбционного аначиза.

Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и пауки РФ (госконтракты: № 16.740.11.0331, № 16.740.11.0203, № 14.740.11.0614, Ns14.740.11.0365) и РФФИ (гранты: № 09-03-00519-а и Ш2-03-00405-а).

Подписано в печать: 21.03.2013 Объем 1,0 п.л Тираж 100 экз. Заказ № 40 Отпечатано в типографии «Реглет» 119606, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Химический факультет

На правах рукописи 042013555ГГ ОУ &

Полякова Яна Андреевна

НОВЫЕ ГИБРИДНЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА ДЛЯ ВЭЖХ

02.00.02 - Аналитическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель Чл.-корр. РАН, проф. О.А. Шпигун

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений, используемых в работе............................................................4

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................10

Глава 1. Методы синтеза наночастиц золота........................................................10

1.1. Общая информация о наночастицах золота....................................................10

1.2. Химические методы синтеза наночастиц золота............................................11

1.3. Физические и электрохимические методы синтеза наночастиц золота.......20

1.4. Самоорганизованные монослои тиолятов на поверхности наночастиц

золота..........................................................................................................................22

Глава 2. Иммобилизация наночастиц золота на носитель................................28

2.1. Иммобилизация наночастиц золота на силикагель........................................29

2.2. Иммобилизация наночастиц золота на полимерные материалы...................40

Глава 3. Применение наночастиц золота в методах разделения......................46

3.1. Применение наночастиц золота в газовой хроматографии...........................46

3.2. Применение наночастиц золота в ВЭЖХ........................................................52

3.3. Применение наночастиц золота в капиллярном электрофорезе...................53

3.4. Применение наночастиц золота в капиллярной электрокинетической

хроматографии..........................................................................................................57

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...........................................................................64

Глава 4. Исходные вещества, аппаратура, методики эксперимента, техника эксперимента...............................................................................................................64

4.1. Исходные вещества............................................................................................64

4.2. Аппаратура..........................................................................................................66

4.3. Методики эксперимента....................................................................................68

Глава 5. Силикагель, модифицированный наночастицами золота, стабилизированными L-цистеином........................................................................77

5.1. Синтез и характеристики наночастиц золота..................................................77

5.2. Модифицирование силикагеля наночастицами золота..................................79

5.3. Хроматографическое разделение тестовых соединений...............................87

5.4. Закономерности удерживания аминопиридинов............................................93

5.5. Сравнение хроматографических свойств силикагеля, модифицированного

наночастицами золота и серебра..........................................................................102

5.6. Разделение НДА-производных гидразинов..................................................105

5.7. Разделение энантиомеров ß-блокаторов.......................................................116

Глава 6. Функционализированный амино- и меркаптогруппами силикагель, модифицированный наночастицами золота с L-цистеином..........................121

6.1. Синтез и исследование структуры................................................................121

6.2. Исследование хроматографических свойств сорбентов в НФ ВЭЖХ......124

6.3. Разделение водорастворимых витаминов.....................................................128

Глава 7. Силикагель, модифицированный наночастицами золота с иммобилизованным бычьим сывороточным альбумином.............................133

7.1. Синтез и исследование структуры сорбента................................................133

7.2. Разделение оптически активных соединений..............................................137

Глава 8. Силикагель, модифицированный наночастицами золота с иммобилизованным ванкомицином....................................................................143

8.1. Синтез и исследование структуры сорбента................................................143

8.2. Разделение энантиомеров p-блокаторов......................................................146

8.3. Анализ лекарственных препаратов «Вискен» и «Вазокардин».................153

Глава 9. Влияние природы матрицы на хроматографические свойства сорбентов...................................................................................................................155

9.1. Синтез и исследование структуры сополимера стирола и дивинилбензола, модифицированного НЧЗ с L-цистеином............................................................155

9.2. Разделение энантиомеров Р-блокаторов.......................................................156

9.3. Разделение энантиомеров профенов.............................................................160

ВЫВОДЫ.......................................................................................................................166

ПРИЛОЖЕНИЕ...........................................................................................................168

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................................................................171

Список сокращений, используемых в работе

ВЭЖХ Высокоэффективная жидкостная хроматография

НЧЗ Наночастицы золота

СОМ Самоорганизованные монослои

АПТЭС З-Аминопропилтриэтоксисилан

МПТМС 3 -Меркаптопропилтриметоксисилан

ССД Сополимер стирола и дивинилбензола

СЭМ Сканирующая электронная микроскопия

ПЭМ Просвечивающая электронная микроскопия

ААС Атомно-абсорбционная спектроскопия

ДО Диффузное отражение

НФ ВЭЖХ Нормально-фазовая ВЭЖХ

БСА Бычий сывороточный альбумин

ОФ ВЭЖХ Обращенно-фазовая ВЭЖХ

ПО ВЭЖХ Полярно-органическая ВЭЖХ

КЭ Капиллярный электрофорез

КЭХ Капиллярная электрокинетическая хроматография

ППР Поверхностный плазмонный резонанс

МПТЭС 3 -Меркаптопропилтриэтоксисилан

ГХ Газовая хроматография

ПФ Подвижная фаза

ФБ Фосфатный буферный раствор

ФЭ Фоновый электролит

ДДАБ Дидодецилдиметиламмония бромид

ТЭА Триэтиламин

НДА 2,3-Нафталиндикарбоксальдегид

Ги Гидразин

МГ 1-Метилгидразин

НДМГ Несимметричный диметилгидразин или 1,1-диметилгидразин

МПК З-Меркаптопропионовая кислота

ААБ Аммонийно-ацетатный буферный раствор

ТЭАА Триэтиламин ацетатный буферный раствор

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) на сегодняшний день во всех ее вариантах является наиболее распространенным методом разделения различных классов органических соединений. Появление все более новых и сложных для определения синтетических или выделяемых органических соединений, в частности, изомеров, энантиомеров, диастереомеров и др., тенденции к сокращению времени анализа и повышению эффективности разделения предъявляют новые требования к проведению современного хроматографического анализа: целенаправленный синтез новых сорбентов для решения конкретных аналитических задач, повышение стабильности сорбентов, снижение стоимости.

В последнее время наночастицы золота (НЧЗ) и материалы на их основе привлекают все большее внимание ученых из разных областей, что объясняется уникальными физико-химическими свойствами веществ в наноразмерном состоянии. Известно что, НЧЗ обладают каталитическими, настраиваемыми оптическими, ферромагнитными свойствами и способностью к самосборке [1]. Поскольку наночастицы хорошо поглощают и рассеивают свет, нетоксичны, химически стабильны и биосовместимы, то перспективы их практического применения не ограничены: химический анализ, медицинская диагностика и лечение, катализ, создание сенсоров, оптических и наноэлектронных устройств [2].

В силу большой поверхности и связанной с ней избыточной поверхностной энергии НЧЗ неустойчивы в водных растворах, поэтому для их стабилизации используют органические лиганды, которые образуют защитную оболочку на поверхности наночастиц за счет химической или физической адсорбции. Чаще всего для стабилизации НЧЗ используют разнообразные серусодержащие соединения, поскольку они образуют на поверхности золота самоорганизованные монослои (СОМ) тиолятов за счет прочной ковалентной связи Аи-8 [1]. Варьирование природы серусодержащих соединений позволяет проводить целенаправленный синтез стабилизированных наночастиц, а их дальнейшая адсорбция на твердую поверхность с сохранением всех основных уникальных свойств наночастиц открывает новые перспективы их применения. Успехи, достигнутые при использовании таких наночастиц в катализе, биохимии и

особенно методах разделения (капиллярном электрофорезе (КЭ) и капиллярной электрохроматографии), позволяют считать целесообразным использование стабилизированных НЧЗ и в ВЭЖХ [2]. Таким образом, большая площадь функциональной поверхности НЧЗ, возможность ее ковалентной модификации монослоями серусодержащих соединений и последующее закрепление полученных наночастиц на твердой поверхности открывают путь к созданию новых хроматографических сорбентов.

К достоинствам применения получаемых материалов можно отнести ковалентное закрепление органических лигандов на поверхности НЧЗ для синтеза стабильного сорбента, который не теряет своих свойств в процессе работы, а также простота синтеза и коммерческая доступность исходных реагентов, удешевляющих синтез. Вдобавок, НЧЗ могут быть модифицированы на поверхности носителя хиральным селектором, что позволит проводить разделение оптически активных соединений, что особенно актуально, поскольку существующие на данный момент хроматографические сорбенты для разделения энантиомеров либо очень дороги, либо обладают низкой стабильностью. Таким образом, актуальность работы определяется потребностью в разработке новых хроматографических сорбентов для разделения широкого круга органических соединений, включая оптически активные, с использованием всех вышеперечисленных достоинств НЧЗ.

Цель работы заключалась в разработке рациональных основ синтеза новых хроматографических сорбентов для ВЭЖХ на основе модифицированных НЧЗ и их применении для разделения разных классов органических соединений, в том числе оптически активных.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• исследовать влияние размера наночастиц золота на степень покрытия матрицы;

• разработать метод иммобилизации наночастиц золота, стабилизированных различными органическими лигандами, на поверхность матрицы (силикагель, функционализированный силикагель, полимерная матрица);

• исследовать строение и состав синтезированных сорбентов комплексом физико-химических методов;

• изучить возможность применения полученных сорбентов на основе НЧЗ в качестве неподвижной фазы в ВЭЖХ при разделения разных классов органических соединений;

• изучить возможность разделения оптически активных соединений на синтезированных сорбентах методом ВЭЖХ;

• апробировать новые синтезированные сорбенты на основе НЧЗ при анализе реальных объектов.

Научная новизна работы. В результате проведенных систематических исследований синтезирован ряд новых сорбентов для ВЭЖХ на основе НЧЗ и ^модифицированного силикагеля; силикагеля, модифицированного 3-аминопропилтриэтоксисиланом (АПТЭС), 3-меркаптопропилтриметоксисиланом (МПТМС), а также сополимера стирола и дивинилбензола (ССД).

Структура всех синтезированных сорбентов изучена методами сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), просвечивающей электронной спектроскопии (ПЭМ), атомно-абсорбционной спектроскопии (ААС), спектроскопии диффузного отражения (ДО). Показано, что лучшими матрицами для синтеза сорбентов с точки зрения наибольшей адсорбции НЧЗ являются модифицированный МПТМС силикагель и ССД.

Установлены закономерности удерживания аминопиридинов, нитроанилинов и триазольных пестицидов в нормально-фазовом (НФ) режиме ВЭЖХ на синтезированных сорбентах. Предположен характер взаимодействия аминопиридинов с поверхностью силикагеля, модифицированного НЧЗ с Ь-цистеином или метиловым эфиром Ь-цистеина, который подтвержден данными квантово-химического моделирования.

Найдены условия разделения гидрофобных производных гидразина (Ги) и его метилзамещенных на силикагеле, модифицированном НЧЗ с Ь-цистеином. Проведено систематическое изучение энантиоселективных свойств сорбентов с иммобилизованным на НЧЗ Ь-цистеином, бычьим сывороточным альбумином (БСА) и ванкомицином в обращенно-фазовом (ОФ) или полярно-органическом (ПО) вариантах ВЭЖХ при разделении энантиомеров Р-блокаторов. Оптимизированы условия разделения энантиомеров Р-блокаторов и профенов на ССД, модифицированном НЧЗ с Ь-цистеином.

Практическая значимость. Разработанный способ получения наногибридных сорбентов для ВЭЖХ, включающий закрепление на носителе НЧЗ и их последующую модификацию серусодержащими органическими соединениями, позволяет получать стабильные сорбенты для ВЭЖХ. В ходе работы впервые синтезированы 7 новых сорбентов на основе НЧЗ для разделения широкого круга органических соединений, включая 4 сорбента для экспрессного разделения энантиомеров |3-блокаторов и профенов в ОФ или ПО вариантах ВЭЖХ.

Практическую значимость имеют разработанные методики определения метопролола и пиндолола в лекарственных препаратах на силикагеле, модифицированном НЧЗ с иммобилизованным ванкомицином.

Показана возможность использования нового сорбента, представляющего собой силикагель, модифицированный стабилизированными Ь-цистеином НЧЗ, для разделения гидрофобных производных гидразина методом ОФ ВЭЖХ, а также для определения Ги в природной воде на уровне ПДК. Автор выносит на защиту:

• разработанные способы синтеза 7 новых сорбентов для ВЭЖХ;

• результаты исследования влияния природы и размера наночастиц, а также природы матрицы на выбор оптимальных условий синтеза сорбентов и их хроматографические свойства;

• результаты исследования структуры синтезированных сорбентов комплексом физико-химических методов;

• данные по разделению аминопиридинов, нитроанилинов, пестицидов на синтезированных сорбентах в НФ ВЭЖХ;

• условия разделения гидрофобных производных гидразина и его метилзамещенных на силикагеле, модифицированном НЧЗ с Ь-цистеином, и результаты определения Ги в природной воде;

• данные по разделению энантиомеров (3-блокаторов на силикагеле, модифицированном НЧЗ с иммобилизованным Ь-цистеином, БСА или ванкомицином, в ОФ и ПО вариантах ВЭЖХ и условия определения метопролола и пиндолола в лекарственных препаратах;

• данные по разделению энантиомеров р-блокаторов и профенов на ССД,

8

модифицированном НЧЗ и L-цистеином, в ПО и ОФ вариантах ВЭЖХ.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на

следующих конференциях: 6th Nanoscience and Nanotechnology Conference (Измир,

Турция, 2010), I Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и

капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010), IV Всероссийской конференции по

наноматериалам «Нано-2011» (Москва, 2011), XVIII Международной конференции

студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011» (Москва, 2011),

International Congress of Analytical Science (Киото, Япония, 2011), 36th International

Symposium on High-Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques.

(Будапешт, Венгрия, 2011), XIX Международной конференции студентов,

аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012» (Москва, 2012), Advances in

th •

chromatography and electrophoresis (Оломоуц, Чехия, 2012), 29 International Symposium on Chromatography (Торунь, Польша, 2012).

Публикации. Основное содержание работы изложено в 15 печатных работах: в 4 статьях и 11 тезисах докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав экспериментальной части, общих выводов и списка цитируемой литературы. Материал диссертации изложен на 190 страницах машинописного текста, содержит 63 рисунка и 27 таблиц, в списке цитируемой литературы 210 наименований.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы систематизированы и обсуждены сведения из научных публикаций, посвященных методам синтеза НЧЗ, иммобилизации наночастиц на поверхность силикагеля и полимерных матриц, а также применению подобных наноматериалов в таких методах разделения, как КЭ, газовая и жидкостная хроматография, капиллярная электрокинетическая хроматография (КЭХ).

Глава 1. Методы синтеза наночастиц золота 1.1. Общая информация о наночастицах золота

На сегодняшний день НЧЗ являются самым изучаемым и популярным

объектом нанонауки. Можно выделить много достоинств наноразмерного золота,

но основными достоинствами являются следующие: во-первых, коллоидное золото

очень легко получить; во-вторых, золото является инертным металлом, не

окисляется при температурах ниже температуры плавления, не взаимодействует с

кислородом воздуха и большинством химических реагентов, поэтому с ним можно

работать на воздухе без ультравысокого вакуума; в третьих, НЧЗ реагируют с

тиолами без каких-либо побочных реакций с образованием монослоев тиолятов,

которые изучены наиболее полно среди всех подобных систем [1, 2]. Пристальное

внимание к НЧЗ объясняется также особенностями их электронной структуры.

Валентные электроны золота покидают свои атомы и образуют зону проводимости.

Именно эти обобществленные электроны определяют энергетическую структуру

наночастиц и их необычные свойства [3]. В частности, д