Определение фотофизических параметров хлорофилла α в фотосинтезирующих организмах методом нелинейной лазерной флуориметрии тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

Гостев Тимофей Сергеевич

Определение фото физических параметров хлорофилла а в фотосинтезирующих организмах методом нелинейной лазерной флуориметрии

Специальность 01.04.21 —лазерная физика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

- 1 ДЕК 2011

Москва — 2011

005004408

Работа выполнена на кафедре квантовой электроники физического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор Фадеев Виктор Владимирович.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор

Витухновский Алексей Григорьевич, Физический институт имени П. Н. Лебедева РАН, Москва;

доктор физико-математических наук Разживин Андрей Павлович, Институт физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского, Москва.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт спектроскопии РАН, Троицк, Московская область.

Защита состоится 15 декабря 2011 года в 15:00 на заседании диссертационного совета Д 501.001.31 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, МГУ, ул. Академика Хохлова, д. 1, стр. 62, Корпус нелинейной оптики, аудитория имени С. А. Ахматова.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан «. П _» ноября 2

Общая характеристика работы

Актуальность темы исследования

Флуоресценция молекул хлорофилла а — основного пигмента фотосинтезирую-щих организмов (ФСО) — является важным каналом получения информации о функциональном состоянии фотосинтетического аппарата и эффективности первичных процессов фотосинтеза, протекающих в нем.

Из всех методов флуоресцентной спектроскопии (флуориметрии) ФСО наиболее распространенными являются подходы, позволяющие измерять фотофизические параметры фотосинтетического аппарата как целого, то есть на уровне клеток и клеточных органелл. В основе этих методов лежит зависимость квантового выхода флуоресценции молекул хлорофилла а от эффективности остальных, конкурирующих с флуоресценцией процессов дезактивации их возбужденных состояний. К заметным преимуществам подобных «классических» подходов можно отнести однозначную биофизическую интерпретацию определяемых параметров и относительную простоту их технической реализации. Вместе с тем, эти методы не решают в полной мере задачу установления механизмов ряда фотофизических процессов в ФСО, таких, например, как фотоадаптация к избыточному освещению и изменения в фотосинтетическом аппарате под воздействием факторов окружающей среды. Эти методы оказываются недостаточными и для флуоресцентной диагностики ФСО в режиме дистанционного зондирования с характерным для этого режима дефицитом априорной информации об исследуемых объектах.

Возможности флуоресцентной диагностики существенно возрастают, если определение флуоресцентных параметров на клеточном уровне дополнено измерением параметров на молекулярном уровне — параметров молекул хлорофилла a in vivo. Наиболее перспективными из методов, позволяющих проводить подобные измерения, представляются методы, использующие для возбуждения флуоресценции импульсное лазерное излучение, в частности, развиваемый в диссертационной работе метод нелинейной лазерной флуориметрии.

Однако к началу исследований по теме диссертации возможности этого метода были реализованы в ограниченном объеме: созданные ранее алгоритмы решения обратной задачи нелинейной лазерной флуориметрии ФСО, входными данными для которой являются кривые насыщения флуоресценции, позволяли определять, с приемлемой точностью, лишь два параметра, представляющих собой свертки нескольких фотофизических параметров молекул хлорофилла а. Установленная высокая чувствительность этих параметров к видовой принадлежности микроводорослей, составляющих фитопланктонное сообщество, и некоторым факторам среды, стала стимулом к исследованию путей увеличения числа раздельно определяемых фотофизических параметров до величины, принципиально ограниченной формой кривой насыщения флуоресценции. Это открыло бы новые возможности в исследовании механизмов фотофизических процессов в ФСО и использования их в качестве биоиндикаторов состояния среды. Такая задача и была поставлена в данной работе.

Светособирающие пигмент-белковые комплексы ФСО являются представителями широкого класса систем с высокой локальной концентрацией содержащихся в них флуорофоров (локальная концентрация пигментов, в том числе хлорофилла а, в светособирающих комплексах составляет щ ~ 1019 см'3), что принципиальным образом характеризует кривые насыщения флуоресценции таких объектов и, как следствие, подходы к разработке алгоритмов решения обратной задачи нелинейной лазерной флуориметрии. Это определяет актуальность темы диссертации в развитии новых методик лазерной флуоресцентной спектроскопии. Актуальность темы диссертационной работы для лазерной биофотоники ФСО связана с отмеченными выше перспективами использования ее результатов в исследовании фотофизических процессов в ФСО на молекулярном уровне, а также в разработке новых подходов в создании флуоресцентных биоиндикаторов состояния среды на основе ФСО.

Цели и задачи диссертационной работы

Целью диссертационной работы являлось дальнейшее развитие метода нелинейной лазерной флуориметрии ФСО как представителей класса систем с высо-

кой локальной концентрацией флуорофоров и исследование новых возможностей применения его в изучении фотофизических процессов в ФСО. Для этого в

диссертационной работе решаются следующие задачи:

1. Путем математического моделирования исследовать возможность увеличения размерности обратной задачи нелинейной лазерной флуориметрии ФСО до величины, принципиально ограниченной формой кривой насыщения флуоресценции.

2. Создать лазерный спектрометр для экспериментальной реализации предложенных методических подходов к увеличению размерности обратной задачи нелинейной лазерной флуориметрии ФСО.

3. Исследовать возможности метода нелинейной лазерной флуориметрии в рамках разработанных подходов в изучении биофизических процессов в ФСО, в том числе, совместно с «классическими» флуоресцентными методиками.

4. С использованием метода нелинейной лазерной флуориметрии провести оценку чувствительности фотофизических параметров молекул хлорофилла а в водных ФСО к различным факторам среды.

Научная новизна

1. Предложен двухэтапный алгоритм решения обратной задачи нелинейной лазерной флуориметрии применительно к системам с высокой локальной концентрацией флуорофоров, существенно повышающий ее размерность и позволяющий определить из экспериментальных кривых насыщения полный набор фотофизических параметров флуорофоров, используемых в принятой математической модели флуоресцентного отклика.

2. Создан лазерный спектрометр для нелинейной флуориметрии ФСО, позволяющий реализовать как нестационарный (длительность лазерных импульсов — о,3 не), так и квазистационарный (длительность импульсов — 20 не) режимы возбуждения их флуоресценции.

3. Впервые из экспериментальных кривых насыщения флуоресценции пигмент-белковых комплексов микроводорослей определены четыре приори-

тетных фотофизических параметра молекул хлорофилла a in vivo — сечение возбуждения, эффективное время жизни возбужденного состояния, квантовый выход флуоресценции и максимальная скорость синглет-синглетной аннигиляции — причем на одном приборе, в рамках единого алгоритма.

4. С использованием предложенных подходов нелинейной флуориметрии исследованы процессы фотоадаптации в ФСО; полученные результаты позволяют сделать выводы об эффективности различных фотопротекторных механизмов.

5. Экспериментально показана высокая чувствительность фотофизических параметров хлорофилла а в водных ФСО к различным факторам среды — естественным (в частности, изменению солености и содержания азота в водной среде) и антропогенным (присутствию в среде тяжелых металлов).

Научная и практическая значимость

Научная и практическая ценность диссертационной работы обусловлена возможным применением полученных в ней результатов для решения фундаментальных и прикладных задач лазерной флуоресцентной спектроскопии, биофизики фотосинтеза и экологии:

— в исследованиях объектов, относящихся к классу систем с высокой локальной концентрацией флуорофоров;

— для получение новой информации о первичных процессах фотосинтеза и процессах фотоадаптации в ФСО (в частности, о конформационных изменениях в светособирающих пигмент-белковых комплексах);

— при практической разработке лазерных (в том числе, дистанционных) методов биоиндикации состояния водных экосистем с использованием ФСО в качестве флуоресцентного сенсора;

— при разработке систем мониторинга влияния глобального изменения климата на состояние водной экосистемы.

Положения, выносимые на защиту

1. Метод нелинейной лазерной флуориметрии с использованием предложенных в работе алгоритмов позволяет определять из экспериментальной кри-

вой насыщения флуоресценции комплексов с высокой локальной концентрацией флуорофоров четыре фотофизических параметра флуорофоров — сечение возбуждения, максимальную скорость синглет-синглетной аннигиляции, время дезактивации возбужденного состояния, учитывающее все каналы релаксации возбуждения за исключением синглет-синглетной аннигиляции, и квантовый выход флуоресценции.

2. Использование нестационарного режима возбуждения флуоресценции позволяет повысить точность решения обратной задачи нелинейной флуори-метрии на величину, эквивалентную снижению амплитуды шума в экспериментальных кривых на 3 dB при измерении их в квазистационарном режиме.

3. Предложенные в работе подходы позволяют определять константы скоростей фотохимического и нефотохимического тушения возбужденных состояний молекул хлорофилла а, а также регистрировать конформационные изменения в фотосинтетическом аппарате.

4. Анализ фотофизических параметров, определяемых методом нелинейной лазерной флуориметрии, позволяет установить влияние на функциональное состояние фотосинтетического аппарата ионов тяжелых металлов (на примере ионов меди Сип вплоть до концентраций ниже ПДК).

Достоверность полученных в работе результатов

Обоснованность и достоверность полученных результатов определяется тщательной теоретической проработкой предложенных методических подходов, использованием для настройки и калибровки созданного в ходе выполнения работы лазерного спектрометра эталонных объектов, а также многократным повторением экспериментов с контролем воспроизводимости получаемых результатов. Полученные данные хорошо согласуются с результатами исследований других научных групп, приведенными в цитируемой литературе.

Апробация работы

Полученные в диссертационной работе результаты прошли апробацию на следующих российских и международных конференциях: 4,ь EARSeL Workshop on Remote Sensing of Coastal Zone (18-20 июня 2009 года, Хания, о. Крит, Гре-

ция); Инновационные аспекты фундаментальных исследований по актуальным проблемам физики (25-30 октября 2009 года, Москва, Россия); SPIE Photonics Europe (12-16 апреля 2010 года, Брюссель, Бельгия); XII International Conference on Laser Applications in Life Sciences (9-11 июня 2010 года, Оулу, Финляндия); International Workshop "Mechanisms of Non-Photochemical Quenching" (6-10 апреля 2011 года, Пассау, Германия); 5th EARSeL Workshop on Remote Sensing of Coastal Zone (1-3 июня 2011 года, Прага, Чехия); XIX International Conference on Advanced Laser Technologies (3-8 сентября 2011 года, Золотые пески, Болгария).

Публикации

Автором опубликованы 14 научных работ, в том числе 10 работ по теме диссертации, из них 4 статьи в реферируемых журналах (3 из списка ВАК России) и 6 трудов конференций. Список публикаций по теме диссертации приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, трех глав и заключения. Структура диссертации подразумевает разбиение обзора литературы на три части и изложение их в соответствующих главах, что способствует целостному восприятию материала каждой главы. В параграфах 1.6, 2.5 и 3.5 сформулированы выводы к соответствующим главам диссертации. В конце работы приведен библиографический список использованной литературы, содержащий 98 наименований. Диссертационная работа изложена на 120 страницах и содержит 38 рисунков.

Личный вклад автора

Все изложенные в диссертации результаты оригинальны и получены автором самостоятельно. Постановка задач, интерпретация полученных результатов и формулировка выводов исследования осуществлялись совместно с научным руководителем.

Содержание диссертации

Во Введении обосновывается выбор темы диссертационной работы; формулируется цель и решаемые задачи, обсуждается их актуальность в контексте научной новизны и практической значимости; формулируются основные положения, выносимые на защиту. В этом разделе также описывается структура диссертации и излагается краткое содержание глав; приводится список публикаций по результатам работы и сведения о ее апробации.

Глава 1 посвящена разработке теоретических и экспериментальных подходов к увеличению размерности решаемой, с приемлемой точностью, обратной задачи нелинейной лазерной флуориметрии ФСО как представителей класса систем с высокой локальной концентрацией флуорофоров. Во введении к данной главе кратко излагаются сведения об исследуемых объектах, применении с этой целью метода нелинейной флуориметрии и трудностях, возникающих при этом. Раздел 1.2 содержит обзор литературных данных по методу нелинейной флуориметрии ФСО и состоит из трех подразделов. В пункте 1.2.1 дается теория формирования флуоресцентного отклика хлорофилла а в фотосинтетическом аппарате на импульсное лазерное возбуждение, в частности, вводятся эффективные фотофизические параметры — сечение возбуждения а и время внутримолекулярной дезактивации г, которые наряду с максимальной скоростью синглет-синглетной аннигиляции уп0 определяют флуоресценцгный отклик ансамбля ФСО в рамках принятой малопараметрической модели. В пункте 1.2.2 кратко излагаются основные принципы метода нелинейной лазерной флуориметрии, описываются методики перехода от относительных величин, измеряемых в эксперименте, к абсолютным величинам фотофизических параметров и появляющийся в результате этого перехода четвертый параметр, определяющий экспериментальные кривые насыщения флуоресценции — ненасыщенный флуоресцентный параметр Фа зависящий от квантового выхода флуоресценции и концентрации флуорофоров. Пункт 1.2.3 посвящен особенностям насыщения флуоресценции хлорофилла а в фотосинтетическом аппарате как системе с высокой локальной концентрацией флуорофоров. В нем приводится редуцированная ма-

тематическая модель флуоресцентного отклика, применимая для описания кривых насыщения, измеренных в диапазоне плотностей потока фотонов К» 1019-ЗхЮ23 см"2-с'1 с использованием для возбуждения флуоресценции лазерных импульсов длительностью, значительно превосходящей характерное время внутримолекулярной дезактивации г (т. е., в квазистационарном режиме).

В разделе 1.3 излагаются результаты теоретического исследования прямой задачи нелинейной флуориметрии ФСО. Установлено, что в кривых насыщения флуоресценции возможно выделить участки, которые формируются под доминирующим влиянием различных механизмов: начальный участок в основном определяется синглет-синглетной аннигиляцией возбужденных состояний хлорофилла а, затем при увеличении плотности потока фотонов начинает играть роль динамическое обеднение основного состояния. В пункте 1.3.1 основное внимание уделяется различиям в формировании флуоресцентного отклика в случае квазистационарного и нестационарного возбуждения. Путем математического моделирования показано, что один из механизмов насыщения флуоресценции — динамическое обеднение основного состояния молекул хлорофилла а — сильнее проявляется при использовании для возбуждения флуоресценции лазерных импульсов длительностью, не превышающей время внутримолекулярной дезактивации, то есть в нестационарном режиме. Пункт 1.3.2 посвящен исследованию границ применимости используемой модели флуоресцентного отклика, в частности, проведен анализ зависимости эффективных параметров от характеристик лазерного излучения. В результате определены экспериментальные условия, при выполнении которых эффективные фото физические параметры являются параметрами в строгом смысле, т. е. не зависят от параметров возбуждающего излучения (или эта зависимость пренебрежимо мала). В пункте 1.3.3 исследовано влияние пространственно-временного распределения лазерных импульсов на экспериментальные кривые насыщения, особое внимание при этом уделено случаю нестационарного возбуждения: для его реализации требуются лазерные импульсы длительностью, не превышающей 0,3 не, и точное измерение их временной структуры сопряжено с определенными техническими трудностями.

В разделе 1.4 предложен и проанализирован двухэтапный алгоритм решения обратной задачи нелинейной флуориметрии ФСО. Он основан на подтвержденном в разделе 1.3 предположении о доминирующих механизмах формирования различных участков кривых насыщения флуоресценции. В первом варианте алгоритма, изложенном в пункте 1.4.1, кривые насыщения измеряются в квазистационарном режиме возбуждения в широком диапазоне плотностей потока фотонов Р= 1022—5х1023 см"2-с"' (все указываемые границы диапазонов определены в результате математического моделирования). На первом этапе с использованием начального участка кривых (^в 10й-Зх1023см'2-с"1) решаем редуцированную двухпараметрическую обратную задачу, при этом определяем значение ненасыщенного флуоресцентного параметра Фо и свертки фотофизических параметров а^упо. На втором этапе, зафиксировав их, численно решаем двухпараметрическую обратную задачу на всей экспериментальной кривой. Параметрами, определяемыми на втором этапе, являются время линейной дезактивации г и сечение возбуждения в. Наконец, используя найденное на первом этапе значение свертки параметров, вычисляем упо- Второй вариант алгоритма, описанный в пункте 1.4.2, использует последовательную комбинацию квазистационарного и нестационарного режимов. Первый этап повторяет таковой в первом варианте алгоритма, а на втором используем кривую насыщения, измеренную в нестационарном режиме (длительность лазерных импульсов меньше времени линейной дезактивации т) в диапазоне плотностей потока фотонов 1023—5х1025 см"2-с'1. Математическая задача минимизации функционала невязки решается в предложенных алгоритмах методом ортогональной регрессии, который позволяет снизить влияние случайных ошибок экспериментальных данных на точность решения обратной задачи. В Таблице 1 приведены результаты численной оценки среднеквадратичного отклонения фотофизических параметров, определенных с использованием двух вариантов алгоритма, при различных уровнях зашумления входных данных.

Корневой шум с амплитудой 3-5 % наиболее точно аппроксимирует шум системы регистрации используемого лазерного спектрометра. При таком уровне

зашумления экспериментальных кривых насыщения описанные алгоритмы позволяют определить фотофизические параметры с точностью не хуже 20 %, что является приемлемым для многих задач, связанных с исследованием фотофизических процессов в ФСО.

Таблица 1, Устойчивость решения обратной задачи нелинейной флуориметрии по двухэтапному алгоритму к зашумлению входных данных. Вариант 1 — квазистационарный режим возбуждения; вариант 2 — комбинация квазистационарного и нестационарного режимов. Серым отмечены значения, наиболее близкие к реализуемым в созданном в ходе выполнения работы лазерном спектрометре.

Амплитуда входного шума, % Вариант решения обратной задачи Погрешность определения <Т,% Погрешность определения г,% Погрешность определения упо, %

1 1 7 5 6

2 6 4 6

3 1 13 12 15

2 12 11 14

ч 1 18 1Г) 20

2 15 14 17

10 1 31 27 34

2 28 26 32

Из таблицы также видно, что второй вариант алгоритма позволяет заметно повысить точность решения обратной задачи при не слишком большой амплитуде входного шума (не более 5 %).

Раздел 1.5 посвящен разработке экспериментальных методов, позволяющих реализовать предложенные алгоритмы решения обратной задачи. В пункте 1.5.1 описывается созданный в ходе выполнения работы лазерный спектрометр для нелинейной флуориметрии, схема которого приведена на Рисунке 1. Для возбуждения флуоресценции в нем используются два твердотельных лазерных излучателя: 1) излучатель (1), состоящий из чип-лазера (2) с активным элементом из УАО:Ш3+ с диодной накачкой (3) и пассивной синхронизацией мод, генерирующего импульсы длительностью 0,3 не, двух каскадов усиления (4,5) (с активными элементами из УАО:Ш3+ с ламповой накачкой), один из которых может пре-

образовываться в генератор лазерных импульсов длительностью 20 не, и узла умножения частоты (6); 2) однокаскадный излучатель (7) с активным элементом из УАЮЗ:Ш3+, генерирующий импульсы длительностью 20 не на длине волны 1340 нм, которые преобразуются во вторую гармонику (длина волны 667 нм) в узле умножения частоты (8).

тосинтезирующих организмов.

Выходное лазерное излучение на длине волны 667 нм применяется параллельно с возбуждением на длине волны 532 нм и позволяет определить дополнительный набор параметров, в частности, сечение поглощения хлорофилла а. Выходная мощность обоих излучателей плавно регулируется с помощью электрооптических ячеек Поккельса (9, 10). Кювета с исследуемым объектом помещается в юоветный блок (11) с магнитной мешалкой. Для регистрации сигнала флуоресценции применяется фотоэлектронный умножитель (12), спектральная селекция осуществляется с помощью узкополосного интерференционного фильтра с максимумом пропускания на длине волны 685 нм, что соответствует положению максимума полосы флуоресценции хлорофилла а. Для регистрации реперного сигнала, пропорционального интенсивности возбуждения, применяется PIN-фо-тодиод с трансимпедансным предусилителем (13) (динамический диапазон по-

рядка 10 ), на который светоделительной пластиной направляется прошедшее через кювету лазерное излучение. Для оцифровки сигналов с детекторов используются 16-битные АЦП (14), оптически синхронизированные с лазерными импульсами с помощью РШ-фотодиода с предусилителем (15), работающего в режиме насыщения. С учетом нелинейности и шумов полный динамический диапазон системы регистрации составляет не менее 5000, амплитуда шума не превышает 5 %. На Рисунке 2 приведены типичные кривые насыщения флуоресценции ФСО, измеренные на описанном флуориметре.

I "

V I

I «ч

о фотоалшпяция

О 1x10" 2x10м 3x10" 4x10" 5x10"

Плотность потока фотонов лазерного излучения F. cm'-c"'

Рисунок 2. Кривые насыщения флуоресценции микроводоросли Chlorella pyrenoidosa, находящейся в различных функциональных состояниях. Точки — экспериментальные данные; кривые построены по теоретической модели с использованием значении фотофизических параметров, определенных в результате решения обратной задачи.

Пункт 1.5.2 посвящен описанию методики измерения кривых насыщения. В нем изложены процедуры калибровки лазерного спектрометра, определения характеристики линейности системы регистрации, а также учета пространственно-временного распределения лазерных импульсов при решении обратной задачи.

В разделе 1.6 анализируются полученные в Главе 1 результаты и формулируются выводы к данному разделу работы.

Глава 2 посвящена первому применению метода нелинейной лазерной флуориметрии (с использованием предложенных в Главе 1 подходов) для изучения нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла а в све-тособирающих комплексах ФСО. Во введении к данному разделу кратко анализируются причины интереса к нефотохимическому тушению для фундаментальной лазерной физики, в частности, лазерной флуоресцентной спектроскопии. В разделе 2.2 дается обзор литературных данных по основным аспектам биофизики фотосинтеза, необходимых для изложения оригинальных материалов. В пункте 2.2.1 описываются каналы дезактивации возбужденных состояний молекул хлорофилла а в ФСО и вводится понятие нефотохимического тушения — группы механизмов, развивающихся под воздействием избыточного освещения и направленных на увеличение скорости безызлучательной релаксации возбужденных состояний хлорофилла а с целью защиты организма от образования синглетного кислорода, обладающего сильной окислительной способностью. В пункте 2.2.2 изложены данные по одному из этих механизмов, связанному со светоиндуцированным превращением вспомогательных пигментов — зеаксан-тин-зависимому тушению. Изучению данного механизма посвящена оригинальная часть данной главы. В этом же пункте обсуждается возможная роль белковой субъединицы РэЬЗ в нефотохимическом тушении. Пункт 2.2.3 посвящен описанию одного из «классических» флуоресцентных методов исследования и диагностики ФСО — метода индукции и релаксации флуоресценции, который применяется в данной работе в дополнение к методу нелинейной флуориметрии.

В разделе 2.3 приведены результаты экспериментов на выделенных препаратах светособирающих комплексов. В пункте 2.3.1 дано краткое описание методики приготовления препаратов и экспериментального протокола. В пункте 2.3.2 показано, что в отсутствие зеаксантина белок РбЬБ не приводит к заметной агрегации светособирающих комплексов при варьировании рН буферной среды в пределах 6-8; в присутствии зеаксантина при уменьшении рН ниже 6,5 начинает проявляться агрегация препаратов, что проявляется в увеличении скорости безызлучательной релаксации возбужденных состояний хлорофилла а и росте максимальной скорости синглет-синглетной аннигиляции. Показано, что обра-

ботка светособирающих комплексов холатом с целью удаления из них белка PsbS приводит к уменьшению сечения возбуждения на длине волны 532 нм на 15 %. Из этого можно сделать вывод о влиянии холата на структурную организацию препаратов, в частности на локальную концентрацию пигмента лютеина в них.

Раздел 2.4 посвящен изучению зеаксантин-зависимого нефотохимического тушения в клетках микроводоросли Chlorella pyrenoidosa. В пункте 2.4.1 описаны условия и протокол эксперимента. В пункте 2.4.2 с использованием метода индукции и релаксации флуоресценции показано, что в выбранных для эксперимента условиях доминирующим механизмом тушения является зеаксантин-за-висимое. В пункте 2.4.3 методом нелинейной флуориметрии с возбуждением на длинах волн 532 и 667 нм измерена кинетика фотофизических параметров хлорофилла а в фотосинтетическом аппарате при развитии в клетках нефотохимического тушения (Рисунок 3).

2 4 б s

Длительность яасвстки. ш

Рисунок 3. Кинетика времени линейной дезактивации (круги) и сечения возбуждения на длине волны 532 нм (квадраты) хлорофилла а в клетках микроводоросли Chlorella pyrenoidosa при включении постоянной внешней засветки, индуцирующей нефотохимическое тушение.

Определены константы скорости фотохимического и нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла а, они составили (1,26±0,11) с'1 и (1,39±0,13) с'1 соответственно. Показано, что сечение возбуждения хлорофилла а на длине волны 532 нм, определяемое в основном переносом энергии со вспомогательных пигментов (в частности, лютеина), уменьшается при развитии нефотохимического тушения на (5±1)х10'17 см2. Это может быть объяснено в рамках гипотезы о замещении молекул лютеина на зеаксантин. В отсутствие априорных данных о средней концентрации клеток в возбуждаемом лазерным излучением объеме определено сечение поглощения хлорофилла а на длине волны 667 нм, составившее (5,2±0,2)х10"16 см2; отношение сечений возбуждения на длинах волн 532 и 667 нм хорошо согласуется с результатами абсорбционной спектроскопии. Установлена корреляция фотофизических параметров хлорофилла а и коэффициента нефотохимического тушения, определенного методом индукции и релаксации флуоресценции (Рисунок 4).

0,5 0.6 0,7 0,8 0.9 3

Коэффициыгт нсфотохкмнчсского тушения, от. сл.

Рисунок 4. Зависимость константы максимальной скорости синглет-синглет-ной аннигиляции (круги) и времени линейной дезактивации (квадраты) возбужденных состояний хлорофилла а от коэффициента нефотохимического тушения. Точки — экспериментальные данные; прямые — результат аппроксимации линейной зависимостью (коэффициент корреляции Л > 0,93).

Линейный характер полученных зависимостей указывает на то, что основным процессом, определяющим эффективность зеаксантин-зависимого тушения является агрегация пигмент-белковых комплексов; вклад прямого тушения хлорофилла а вспомогательными пигментами при этом мал.

В разделе 2.5 обсуждаются полученные в Главе 2 результаты.

В Главе 3 проведен экспериментальный анализ возможностей метода нелинейной флуориметрии в диагностике ФСО. Во введении обосновывается фундаментальный и практический интерес к флуоресцентной биодиагностике. Раздел 3.2 посвящен обзору литературы по влиянию факторов среды на функциональное состояние фитопланктона, которые условно разделены в диссертационной работе на два класса — естественные и антропогенные. В пункте 3.2.1 описывается влияние условий роста, в частности, солености среды и содержания азота, — как примеров естественных факторов (подверженных, в частности, глобальному изменению климата) — на ФСО. В пункте 3.2.3 рассматривается влияние на фотосинтетический аппарат антропогенного фактора — присутствия в воде ионов тяжелых металлов.

В разделе 3.3 на примере трех классов водных ФСО исследовано влияние условий роста на фотосинтетический аппарат. В частности, показано, что диатомовые микроводоросли Г/ю/аыгсш'га \veissflogii проявляют высокую чувствительность к изменениям солености и содержания азота. Увеличение концентрации азота в среде в 2 раза приводит к увеличению времени линейной дезактивации больше, чем на порядок, максимальная скорость синглет-синглетной аннигиляции снижается при этом на 30 %. Эти эффекты могут быть объяснены высказанными в ряде цитируемых работ предположениями о влиянии концентрации азотного питания на структурную организацию фотосинтетического аппарата и на количество фотосинтетически активных реакционных центров в нем. Изменение солености среды (как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения ее значения относительно нормального для данного вида ФСО) также приводит к значительному увеличению времени линейной дезактивации, что указывает (вместе с данными, полученными методом индукции и релаксации флуо-

ресценции) на значительное ингибирование фотосинтеза. В данном разделе также показано, что параметры, определяемые методом нелинейной лазерной флуо-риметрии и методом индукции и релаксации флуоресценции хорошо согласуются между собой, и совокупность данных методов позволяет сформировать наиболее информативный (на данный момент) подход для диагностики ФСО.

Раздел 3.4 посвящен исследованию влияния на параметры хлорофилла о в фотосинтетическом аппарате микроводоросли Chlorella pyrenoidosa присутствия в водной среде ионов меди Си2'. Показано, что сечение возбуждения на длине волны 532 нм практически не зависит от присутствия тяжелых металлов. Увеличение времени линейной дезактивации (Рисунок 5) связано с нарушением цепи электронного транспорта в клетке; уменьшение скорости синглет-синглетной аннигиляции можно объяснить показанным в ряде цитируемых работ влиянием ионов тяжелых металлов на связь липидной внутриклеточной мембраны с пигмент-белковыми комплексами, и ассоциированными с этим конформационными изменениями в последних.

5. 3,6x10

| 3,3x10"-

9 3,(1x10"-

I?

I 2,7x10"-|

^ 2,4x10" -

I

| 2,1x11)"-

| I.SülO" ■

| 1.5*10"-

| 1.2x10" -к

I

Ж

10'' 10° 10

Концентрация ионов меди Си отн. сд.

4 I

4,5<!0 - 4,2x10 " 3,i>xl0'ls »

З.61Ю" | |

" 3,3xlO'° j -1,0» КС'" ^ 3,7« 1(1'"' -2,4x10"

Рисунок 5. Зависимость константы максимальной скорости синглет-синглет-ной аннигиляции (круги) и времени линейной дезактивации (квадраты) возбужденных состояний хлорофилла а в фотосинтетическом аппарате микроводоросли Chlorella pyrenoidosa от концентрации ионов меди Czr+ в буферной среде. Вертикальная линия отмечает границу ПДК.

Полученные в данном разделе результаты показывают, что фотофизические параметры хлорофилла а позволяют зарегистрировать изменения в состоянии фотосинтетического аппарата уже при концентрациях ионов меди, ниже ПДК, что указывает на принципиальную возможность использования фитопланктона в качестве флуоресцентного биоиндикатора присутствия в воде тяжелых металлов. В разделе 3.5 даются основные выводы к Главе 3.

В Заключении формулируются основные результаты и выводы диссертационной работы, которые перечислены ниже.

Основные результаты работы

1. Предложен двухэтапный алгоритм решения обратной задачи нелинейной лазерной флуориметрии применительно к системам с высокой локальной концентрацией флуорофоров, существенно повышающий ее размерность и позволяющий определить из экспериментальных кривых насыщения флуоресценции полный набор фотофизических параметров флуорофоров, используемых в принятой математической модели флуоресцентного отклика.

2. Показано, что использование для возбуждения флуоресценции лазерных импульсов длительностью, не превышающей характерное время внутримолекулярной релаксации возбужденного состояния флуорофора (нестационарной режим) позволяет повысить точность решения обратной задачи нелинейной флуориметрии на величину, эквивалентную снижению амплитуды шума в экспериментальных кривых на 3 с1В при измерении их в квазистационарном режиме. Это связано с тем, что в нестационарном режиме сильнее проявляется эффект насыщения за счет динамического обеднения основного состояния флуорофоров.

3. Создан лазерный спектрометр для нелинейной флуориметрии фотосинтези-рующих организмов, позволяющий реализовать как нестационарный (длительность лазерных импульсов — 0,3 не), так и квазистационарный (длительность импульсов — 20 не) режимы возбуждения их флуоресценции и

обеспечивающий измерение кривых насыщения с погрешностью не более 5 % в диапазоне изменения плотности потока фотонов возбуждающего излучения 1022-1026 см'2-с

4. С использованием определяемых методом нелинейной лазерной флуоримет-рии параметров хлорофилла а экспериментально исследованы механизмы фотоадаптации в клетках микроводоросли Chlorella pyrenoidosa. Установленная корреляция между фотофизическими параметрами хлорофилла а и коэффициентом нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла а в случае, когда основным механизмом является зеаксантин-зави-симое тушение, подтверждает гипотезу о связи данного механизма с информационными изменениями в фотосинтетическом аппарате.

5. Показана высокая чувствительность фотофизических параметров молекул хлорофилла а в водных фотосинтезирующих организмах к различным факторам среды, что открывает перспективы использования фотосинтезирующих организмов в качестве флуоресцентных биоиндикаторов.

Список публикаций по теме диссертации

1. Гостев Т. С., Фадеев В. В. Определение фотофизических параметров хлорофилла а в фотосинтезирующих организмах методом нелинейной лазерной флуориметрии // Квантовая электроника. 2011. Т. 41. № 5. С.414-419.

2. Гостев Т. С., Кузьминов Ф. И., Моисеев С. А. Лазерный сенсор загрязнений природных вод, использующий фотосинтезирующие организмы в качестве флуоресцентных биоиндикаторов//Краткие сообщения по физике ФИАН. 2011. Т. 38. № 1.С. 19-22.

3. Максимов Е. Г., Гостев Т. С., Кузьминов Ф. И., Случанко Н. Н., Стадничук И. Н., Пащенко В. 3., Рубин А. Б. Гибридные системы из квантовых точек и фоточувствительного белка фикоэритрина // Российские нанотехнологии. 2010. Т. 5. № 7_8. С. 107-113.

4. Гостев Т. С., Кузьминов Ф. И., Горбунов М. Ю., Фадеев В. В. Биофотоника водных фотосинтезирующих организмов: флуоресцентные методы диагностики // Фотоника. 2011. № 2. С. 72-81.

5. Gostev Т., Kouzminov F., Paschenko V., Fadeev V. On the novel possibilities of using phytoplankton as a bioindicator of toxicants in natural waters // 4th EARSeL Workshop on Remote Sensing of Coastal Zone, 18-20 June 2009, Chania, Crete, Greece. Workshop Proceedings. № 2. P. 1-5.

6. Gostev Т., Kouzminov F., Gorbunov M., Fadeev V. Phytoplankton as a fluorescent bioindicator of ecotoxicants in natural waters // SPIE Photonics Europe, 1216 April 2010, Brussels, Belgium. Proceedings of SPIE. 2010. V. 7715. P. 771520.

7. Gostev Т., Kuzminov F., Fadeev V. Application of nonlinear laser fluorimetry for study of photophysical processes in photosynthetic organisms // The XII International Conference on Laser Applications in Life Sciences, 9-11 June 2010, Oulu, Finland. Book of Abstracts. P. 273.

8. Gostev Т., Fadeev V., Gorbunov M. Study of the Non-Photochemical Quenching of Chlorophyll a Excited States in Algae using Variable Fluorescence and Nonlinear Laser Fluorimetry // International Workshop "Mechanisms of Non-Photochemical Quenching", 6-10 April 2011, Passau, Germany. Book of Abstracts. P. 42.

9. Gostev Т., Kouzminov F., Gorbunov M„ Voronova E„ Fadeev V. Effects of variations in salinity and nitrogen concentration on the physiological characteristics of phytoplankton obtained using fluorescence spectroscopy techniques // 5th EARSeL Workshop on Remote Sensing of Coastal Zone, 1-3 June 2011, Prague, Czech Republic. Workshop Proceedings. № 3. P. 9-18.

10. Gostev Т., Fadeev V., Gorbunov M. Application of nonlinear laser fluorimetry for studying photoprotective processes in photosynthetic organisms//XIX International Conference on Advanced Laser Technologies, 3-8 September 2011, Golden Sands, Bulgaria. Book of Abstracts. P. 35-36.

Подписано в печать: 10.11.11

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 785 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Принятые сокращения.

Введение.

Глава 1. — Решение многопараметрической обратной задачи нелинейной флуориметрии молекулярных систем с высокой локальной концентрацией флуорофоров (на примере молекул хлорофилла а в фотосинтези-рующих организмах).

1.1. Введение.

1.2. Нелинейная лазерная флуориметрия молекул хлорофилла а в фотосинте-зирующих организмах (по литературным данным).

1.2.1. Модель формирования флуоресцентного отклика хлорофилла а в фотосинтетическом аппарате на импульсное лазерное возбуждение.

1.2.2. Метод нелинейной флуориметрии.

1.2.3. Особенности нелинейной флуориметрии фотосинтезирующих организмов как представителей систем с высокой локальной концентрацией флуорофоров.

1.3. Теоретическое исследование прямой задачи нелинейной лазерной флуориметрии фотосинтезирующих организмов.

1.3.1. Анализ формирования кривых насыщения флуоресценции хлорофилла а в квазистационарном и нестационарном режимах возбуждения.

1.3.2. Исследование зависимости фотофизических параметров от характеристик лазерного возбуждения: границы применимости используемой модели.

1.3.3. Влияние пространственно-временного распределения лазерных импульсов на кривые насыщения флуоресценции в квазистационарном и нестационарном режимах возбуждения.

1.4. Двухэтапный алгоритм решения многопараметрической обратной задачи нелинейной лазерной флуориметрии.

1.4.1. Вариант I: квазистационарный режим возбуждения флуоресценции на обоих этапах. Исследование единственности и устойчивости решения обратной задачи к ошибкам входных данных.

1.4.2. Вариант П: последовательное применение квазистационарного и нестационарного режимов возбуждения флуоресценции. Исследование единственности и устойчивости решения обратной задачи к ошибкам входных данных.

1.4.3. Анализ источников ошибок в решении обратной задачи нелинейной флуориметрии по предложенному алгоритму.

1.5. Экспериментальная реализация предложенных алгоритмов определения фотофизических параметров хлорофилла а из кривых насыщения флуоресценции

1.5.1. Экспериментальная установка.

1.5.2. Методика измерения кривых насыщения флуоресценции.

1.5.3. Экспериментальная апробация лазерного спектрометра.

1.6. Обсуждение результатов.

Глава 2. — Исследование механизмов нефотохимического тушения возбужденных состояний хлорофилла а в фотосинтезирующих организмах.

2.1. Введение.

2.2. Механизмы нефотохимического тушения (по литературным данным).

2.2.1. Каналы дезактивации возбужденных состояний молекул хлорофилла а в фотосинтетическом аппарате.

2.2.2. Тушение возбужденных состояний хлорофилла а при светоиндуци-рованном превращении вспомогательных пигментов фотосинтетического аппарата (зеаксантин—зависимое тушение).

2.2.3. «Классические» флуоресцентные методы исследования фотосинте-зирующих организмов: метод индукции и релаксации флуоресценции.

2.3. Исследование механизмов зеаксантин-зависимого тушения на выделенных препаратах фотосинтетического аппарата.

2.3.1. Материалы исследования: препараты светособирающих комплексов фотосистемы 2.

2.3.2. Зависимость времени жизни возбужденных состояний хлорофилла а и скорости их синглет-синглетной аннигиляции от значения pH буферной среды.

2.4. Изучение механизмов нефотохимического тушения в нативных клетках микроводоросли Chlorella pyrenoidosa.

2.4.1. Протокол исследования нефотохимического тушения в нативных клетках Chlorella pyrenoidosa.

2.4.2. Определение кинетики нарастания и затухания нефотохимического тушения с использованием метода индукции и релаксации флуоресценции.

2.4.3. Связь значений фотофизических параметров хлорофилла а с эффективностью зеаксантин-зависимого нефотохимического тушения.

2.5. Обсуждение результатов.

Глава 3. — Изучение влияния факторов среды на фотофизические параметры хлорофилла а в микроводорослях.

3.1. Введение.

3.2. Влияние факторов среды на функциональное состояние фотосинтетического аппарата (по литературным данным).

3.2.1. Влияние условий роста фотосинтезирующих организмов на фотосинтетический аппарат и эффективность фотофизических процессов в нем.

3.2.2. Токсичность ионов тяжелых металлов (на примере Си ) в клетках фотосинтезирующих организмов.

3.3. Экспериментальное изучение влияния естественных факторов среды на фотофизические параметры хлорофилла а в фотосинтетическом аппарате.

3.4. Исследование возможности использования фотосинтезирующих организмов в качестве биоиндикаторов присутствия в среде тяжелых металлов.

3.5. Обсуждение результатов.

Флуоресценция молекул хлорофилла а (Хл а) — основного пигмента фотосинтези-рующих организмов (ФСО) — является важным каналом получения информации о функциональном состоянии фотосинтетического аппарата и эффективности первичных процессов фотосинтеза, протекающих в нем [1].

Из всех методов флуоресцентной спектроскопии (флуориметрии) ФСО наиболее распространенными являются подходы, позволяющие измерять фотофизические параметры фотосинтетического аппарата как целого [2], то есть на уровне к леток.и клеточных органелл. В основе этих методов лежит зависимость квантового выхода флуоресценции молекул Хл а от эффективности остальных, конкурирующих с флуоресценцией процессов дезактивации их возбужденных состояний [3]. К заметным преимуществам подобных «классических» подходов« можно отнести однозначную биофизическую интерпретацию определяемых параметров и относительную простоту их технической реализации. Вместе с тем, эти методы не решают в полной мере задачу установления механизмов ряда фотофизических процессов * в ФСО, таких, например, как фотоадаптация к избыточному освещению [4] и изменения в фотосинтетическом аппарате под воздействием факторов окружающей среды [5]. Эти методы оказываются недостаточными и для флуоресцентной диагностики ФСО в режиме дистанционного зондирования [6] с характерным для этого режима дефицитом априорной информации об исследуемых объектах.

Возможности флуоресцентной диагностики существенно возрастают, если определение флуоресцентных параметров на клеточном уровне дополнено измерением параметров на молекулярном уровне [7] — параметров молекул Хл а т vivo. Наиболее перспективными из методов, позволяющих проводить подобные измерения, представляются методы, использующие для возбуждения флуоресценции импульсное лазерное излучение, в частности, развиваемый в диссертационной работе метод нелинейной лазерной флуориметрии [8].

Однако > к началу исследований по теме диссертации возможности этого метода были реализованы в ограниченном объеме: созданные ранее алгоритмы решения обратной задачи нелинейной лазерной флуориметрии ФСО, входными данными для которой являются кривые насыщения флуоресценции, позволяли определять, с приемлемой точностью, лишь два параметра, представляющих собой свертки нескольких фотофизических параметров молекул Хл а [9]. Установленная высокая чувствительность этих параметров к видовой принадлежности микроводорослей, составляющих фитопланктонное сообщество, и некоторым факторам среды [10], стала стимулом к исследованию путей увеличения числа раздельно определяемых фотофизических параметров до величины, принципиально ограниченной формой кривой насыщения флуоресценции. Это открыло бы новые возможности в исследовании механизмов фотофизических процессов в ФСО и использования их в качестве биоиндикаторов состояния среды. Такая задача и была поставлена в данной работе.

Светособирающие пигмент—белковые комплексы ФСО'являются представителями широкого класса систем с высокой локальной концентрацией содержащихся в них флуорофоров (локальная концентрация пигментов, в том числе Хл а, в свето-собирающих комплексах составляет п0~ 1019 см"3 [11]), что принципиальным образом* характеризует кривые насыщения флуоресценции таких объектов и, как следствие, подходы к разработке алгоритмов решения. обратной<задачи .нелинейной лазерной флуориметрии. Это определяет актуальность темы диссертации в развитии новых методик лазерной флуоресцентной спектроскопии. Актуальность темы диссертационной работы для лазерной биофотоники ФСО связана с отмеченными выше перспективами использования ее результатов в исследовании фотофизических процессов в ФСО на молекулярном уровне, а также в разработке новых подходов в создании флуоресцентных биоиндикаторов состояния среды на основе ФСО.

Целью диссертационной работы является дальнейшее развитие метода нелинейной лазерной флуориметрии ФСО как представителей класса систем с высокой локальной концентрацией флуорофоров и исследование новых возможностей применения его в изучении фотофизических процессов в ФСО. Для этого в диссертационной работе решаются следующие задачи:

Г. Путем математического моделирования исследовать возможность увеличения размерности обратной задачи нелинейной лазерной флуориметрии ФСО до величины, принципиально ограниченной формой кривой насыщения флуоресценции.

2. Создать лазерный спектрометр для экспериментальной реализации предложенных методических подходов к увеличению размерности обратной задачи нелинейной лазерной флуориметрии ФСО.

3. Исследовать возможности метода нелинейной лазерной флуориметрии в рамках разработанных подходов в изучении биофизических процессов в ФСО (на примере процессов фотоадаптации к избыточному освещению), в том числе, совместно с «классическими» флуоресцентными методиками.

4. С использованием метода нелинейной лазерной флуориметрии провести оценку чувствительности фотофизических параметров молекул Хл а в водных ФСО к различным факторам среды.

Научная новизна диссертационной работы связана со следующими положениями:

1. Предложен двухэтапный алгоритм решения обратной задачи нелинейной лазерной флуориметрии применительно к системам с высокой локальной концентрацией флуорофоров, существенно повышающий ее размерность и позволяющий- определить из экспериментальных кривых насыщения полный набор фотофизических параметров флуорофоров; используемых в-принятой математической модели флуоресцентного отклика.

2. Создан лазерный спектрометр для нелинейной флуориметрии ФСО, позволяющий реализовать как нестационарный (длительность лазерных импульсов — 0,3 не), так и квазистационарный (длительность импульсов-— 20 не) режимы возбуждения их флуоресценции.

3. Впервые из экспериментальных кривых насыщения флуоресценции пигмент-белковых комплексов микроводорослей определены четыре приоритетных фотофизических параметра-молекул Хл a in vivo — сечение возбуждения, эффективное время жизни возбужденного состояния, квантовый выход флуоресценции и максимальная скорость синглет-синглетной аннигиляции — причем на одном приборе, в рамках единого алгоритма.

4. С использованием предложенных подходов нелинейной флуориметрии исследованы процессы фотоадаптации в ФСО; полученные результаты позволяют сделать выводы об эффективности различных фотопротекгорных механизмов.

5. Экспериментально показана высокая чувствительность фотофизических параметров Хл а в водных ФСО к различным факторам среды — естественным (в частности, изменению солености и содержания азота в водной среде) и антропогенным (присутствию в среде тяжелых металлов). Научная и практическая значимость диссертационной работы обусловлена возможным применением полученных в ней результатов для решения фундаментальных и прикладных задач лазерной флуоресцентной спектроскопии, биофизики фотосинтеза и экологии: в исследованиях объектов, относящихся к классу систем с высокой локальной концентрацией флуорофоров; для получение новой информации о первичных процессах фотосинтеза и процессах фотоадаптации в ФСО (в частности, о конформационных изменениях в светособирающих пигмент-белковых комплексах); при»практической разработке лазерных (в том числе, дистанционных) методов биоиндикации состояния водных экосистем с использованием ФСО в качестве флуоресцентного сенсора; при разработке систем мониторинга влияния глобального изменения климата на состояние водной экосистемы.

Положения, выносимые на защиту:

1. Метод нелинейной лазерной флуориметрии с использованием предложенных в работе алгоритмов позволяет определять из экспериментальной кривой насыщения флуоресценции комплексов с высокой локальной концентрацией флуорофоров четыре фотофизических параметра флуорофоров — сечение возбуждения, максимальную скорость синглет-синглетной аннигиляции, время дезактивации возбужденного состояния, учитывающее все каналы релаксации возбуждения за исключением синглет-синглетной аннигиляции, и квантовый выход флуоресценции.

2. Использование нестационарного режима возбуждения флуоресценции позволяет повысить точность решения обратной задачи нелинейной флуориметрии на величину, эквивалентную снижению амплитуды шума в экспериментальных кривых на 3 с1В при измерении их в квазистационарном режиме.

3. Предложенные в работе подходы позволяют определять константы скоростей фотохимического и нефотохимического тушения возбужденных состояний молекул хлорофилла а, а также регистрировать конформационные изменения в фотосинтетическом аппарате.

4. Анализ фотофизических параметров, определяемых методом нелинейной лазерной флуориметрии, позволяет установить влияние на функциональное состояние фотосинтетического аппарата ионов тяжелых металлов (на примере ионов меди Си2+ вплоть до концентраций ниже ПДК).

Обоснованность и достоверность полученных результатов определяется тщательной теоретической проработкой предложенных методических подходов, использованием для настройки и калибровки созданного в ходе выполнения работы лазерного спектрометра эталонных объектов, а также многократным повторением экспериментов с контролем воспроизводимости получаемых результатов. Полученные данные хорошо согласуются с результатами исследований других научных групп, приведенными-в цитируемой литературе.

Полученные в диссертационной работе результаты прошли апробацию на следующих российских и международных конференциях: 4th EARSeL Workshop on Remote Sensing of Coastal Zone (18-20 июня ?2009'года, Хания, о. Крит, Греция); Инновационные аспекты фундаментальных исследований по актуальным проблемам физики (25-30 октября 2009 года, Москва, Россия); SPIE Photonics Europe (1216 апреля 2010 года, Брюссель, Бельгия); ХП International Conference on Laser Applications in Life Sciences (9-11 июня 2010 года, Оулу, Финляндия); International Workshop "Mechanisms of Non-Photochemical Quenching" (6-10 апреля 2011 года, Пассау, Германия); 5th EARSeL Workshop on Remote Sensing of Coastal Zone (1-3 июня 2011 года, Прага, Чехия); XIX International' Conference on Advanced Laser Technologies (3-8 сентября 2011 года, Золотые пески, Болгария).

Автором опубликованы 14 научных работ, в том числе 10 работ по теме диссертации, из них 4 статьи в реферируемых журналах (3 из списка ВАК России) [30, 31, 91, 96] и 6 в трудах конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения и библиографического списка использованной литературы, содержащего 98 наименований. Работа изложена на 120 страницах и содержит 28 рисунков.

Заключение

Сформулируем основные результаты, полученные в диссертационной работе:

1. Предложен двухэтапный алгоритм решения обратной задачи нелинейной лазер-нош флуориметрии применительно к системам с высокой локальной концентрацией флуорофоров, существенно повышающий ее размерность и: позволяющий определить из экспериментальных, кривых насыщения флуоресценции полный набор фотофизическихпараметров-флуорофоров« используемых в принятой;ма-тематическошмодели! флуоресцентного отклика;- . ••

2. Показано,«, что использование для. возбуждения» флуоресценции лазерных импульсов? длительностью^ не превышающей:: характерное: время» внутримолекулярной релаксации возбужденного состояния флуорофора (нестационарной режим) тюзволяет повысить точность.решенияюбратной задачи нелинейной.флуо-римегрии на величину,, эквивалентную снижсншо амплитуды шума в; экспериментальных кривых на 3 с1В при измерении их в квазистационарном режиме. Это-связано с тем; .что вшестационарномфежиме;сильнее проявляется«эффект насыщения.за счет динамического, обеднения; основного«состояния* флуорофоров. '*'., ' .- ; • . .:■■"".';.'. ■- , • , ■,".'.'

3. Создан лазерный спектрометр для нелинейной флуориметриигфотосинтезирую-щих организмов,, позволяющий реализовать как нестационарный«(длительность: лазерных-, импульсов; — 0;3 не), так и квазистационарный (длительность импульсов: — 20 нс):режймы возбужденияшх. флуоресценции и обеспечивающий; измерение кривых насыщениях погрешностью не более 5 % в диапазоне изменения плотности потока фотонов возбуждающего излучения 1022-1026 см"2-с"1.

4. С использованием определяемых методом нелинейной лазерной флуориметрии параметров; хлорофилла: а экспериментально исследованы механизмы, фото-адаитации в клетках микроводоросли С/г/оге//а/»угеА2о/^ол-а. Установленная'корреляция между фотофизическими параметрами1хлорофилла а и коэффициентом: нефотохймического тушения возбужденных состояний хлорофилла й в случае, когда основным механизмом является зеаксантин-зависимое тушение, подтверждает гипотезу о связи данного механизма с конформационными изменениями в фотосинтетическом аппарате.

5. Показана высокая чувствительность фотофизических параметров молекул хлорофилла а в водных фотосинтезирующих организмах к различным факторам среды, что открывает перспективы использования фотосинтезирующих организмов в качестве флуоресцентных биоиндикаторов.

1. Maxwell К., Johnson G. N. Chlorophyll fluorescence — a practical guide // J. Exp. Bot. 2000. 51(345). P. 659-668.

2. Antal Т., Rubin A. In vivo analysis of chlorophyll a fluorescence induction // Photo-synth. Res. 2008: 96(3). P. 217-226.

3. Shinkarev V., Govindjee P. Insight into; the relationship of chlorophyll a fluorescence yield to the concentration of its- natural quenchers; in1 oxygenic photosynthesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. 90(16). P. 7466-7469.

4. Hoge F. E. et al. Chlorophyll biomass in the global oceans. airborne lidar retrieval using fluorescence of both chlorophyll and chromophoric dissolved organic matter // Appl.

5. Opt. 2005. 44(14). P. 2857-2862.

6. Ostroumov E. E. et al; Fluorescence characteristics and; photophysical parameters of aggregates of light-harvesting chlorophyll a/b complexes // Biophysics: 2007. 52(5). P. 855-860.

7. Фадеев В; В., Бунин,Д. К., Венедиктов П. С. Методышазерного мониторинга фото-синтезирующих организмов; (обзор) 7/ Квантовая электроника. 1996. Т. 23. №11. С. 963-973.

8. Маслов Д. В., Остроумов Е. Е., Фадеев В. В: Флуориметрия насыщения сложных органических' соединений с высокой локальной • концентрацией- флуорофоров (нашримере фитопланктона) // Квантоваягэлектроника: 2006.^'.'Tv^ 36; № 2. С. 163— 168.

9. Маслов Д. В., Ильяш JI. В., Остроумов Е. Е., Могосян С. И., Фадеев В. В. О возможностях диагностики состояния фотосинтетического аппарата фитопланктонаметодом нелинейной лазерной флуориметрии // Биофизика. 2005. Т. 50. № 5. С. 843-850.

10. Wei X. et al. Two-dimensional crystallization and preliminary structure analysis of LHC-II from cucumber and spinach// Sci. China. C. Life. Sci. 1998. 41(3). P. 265-271.

11. Lakowicz J. R. Fluorescence spectroscopic investigations of the dynamic properties of proteins membranes and nucleic acids // J. Biochem. Biophys. Methods. 1980. 2(1). P. 91-119.

12. Бунин Д. К., Горбунов М. Ю., Фадеев В. В., Чекалюк А. М. Формирование флуоресценции хлорофилла a in vivo при наносекундном импульсном лазерном* возбуждении //Квантовая электроника. 1992. Т. 19. № 5. С. 421—423.

13. Govindjee G. R., Govindjee. The absorption of light in photosynthesis // Sci. Am. 1974. 231(6). P. 68-82.

14. Vredenberg W. J. A three-state model for energy trapping and chlorophyll fluorescence in photosystem II incorporating radical pair recombination // Biophys. J: 2000. 79(1). P. 26-38.

15. Barzda V. et al. Singlet-singlet annihilation kinetics in aggregates and trimers of LHCII //Biophys. Jt 2001. 80(5). P. 2409-2421.

16. Lakowicz J. R. et al. Fluorescence lifetime imaging // Anal. Biochem. 1992. 202(2). P. 316-330.

17. Croce R. et al. Carotenoid-to-chlorophyll energy transfer in recombinant major light-harvesting complex (LHCII) of higher plants I. Femtosecond transient absorption measurements //Biophys. J. 2001. 80(2). P. 901-915.l

18. Brown J. S. Absorption and fluorescence of chlorophyll a in particle fractions from different plants // Biophys. J. 1969. 9(12). P. 1542-1552.

19. Klimov V. V. et al. Reduction of pheophytin in the primary light reaction of photosystem II //FEBS Lett. 1977. 82(2). P. 183-186.

20. Klimov V. V., Krasnovskii A. A. Pheophytin participation in primary processes of electron transfer in photosystem II reaction centers // Biophysics. 1982. 27(1). P. 179-189.

21. Schatz G. H., Brock H., Holzwarth A. R. Kinetic and Energetic Model for the Primary Processes in Photosystem II // Biophys. J. 1988. 54(3). P. 397^05.

22. Allakhverdiev S. I., Recent progressvin the studies of structure and function1 of photosystem II// J. Photochem. Photobiol. B: 2011. 104(1-2). P. 1-8.

23. Paschenko V. Z. et al: Probing the kinetics of photosystem I and photosystem II fluorescence in pea chloroplasts on a picosecond pulse fluorometer // Biochim. Biophys. Acta. 1975.,408(2). P. 143-153.

24. Маслов Д. В., Фадеев В. В., Литвинов П. Н. Трехпараметрическая- модель формирования флуоресцентного отклика фотосинтезирующих организмов при импульсном лазерном возбуждении // Вестник Московского Университета физическая• серия. 2002. № 1.С. 34-37.

25. Фадеев В. В., Клышко Д. Н. Дистанционное определение концентрации примесей в воде методом лазерной спектроскопии, с калибровкой по комбинационному рассеянию // Докл. АН СССР. 1978. Т. 238. № 2. С. 320-323.

26. Ширшин Е. А., Петров' ВС Г., Будылин-Г. С., Обморошев Б. Л:, Калмыков С. Н-., Фадеев В. В. Лазерная флуориметрия уранила и его комплексов,в водной среде. // М.: Макс Пресс. Сб.: Физические проблемы экологии! (экологическая физика). 2009. С. 356-378.

27. Гостев Т. С., Фадеев В. В: Определение фотофизических параметров хлорофилла а в фотосинтезирующих организмах методом нелинейной лазерной флуоримет-рии // Квантовая электроника. 2011. Т. 4Г. № 5. С. 414-419.

28. Максимов:Е. Г., Гостев Т. С., Кузьминов Ф. И., Случанко Н: Н., Стадничук И. Н., Пащенко В. 3., Рубин А. Б. Гибридные системы из квантовых точек и-фоточувствительного белка фикоэритрина // Российские нанотехнологии. 2010. Т. 5. №7-8. С. 107-113.

29. Butler W. L., Norris K. H. Lifetime of the long-wavelength chlorophyll fluorescence // Biochim. Biophys. Acta. 1963. 66. P. 72-77.

30. Butler W. L. Energy distribution in the photosynthetic apparatus of plants // Brookhaven Symp. Biol. 1976(28). P. 338-346.

31. Grossman A.R. et al. Light-harvesting complexes in oxygenic photosynthesis, diversity control and evolution // Annu. Rev. Genet. 1995. 29. P. 231-288:

32. Amesz J. The function of plastoquinone in photosynthetic electron transport // Biochim. Biophys. Acta. 1973. 301(1). P. 35-51. . '

33. Arnon D. I., Tsujimoto H. Y., McSwain B. D. Photosynthetic phosphorylation and electron transport//Nature. 1965. 207(5004). P! 1367-1372.

34. Linnanto J. et all Excitation'energy transfer in the LHC-II trimer — a-model based on the new 2.72 A structure // Photosynth. Res. 2006. 87(3). P. 267-279.

35. ZankeFK. L., ReedD. W., Clayton R. K. Fluorescence and photochemical quenching in photosynthetic reaction centers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1968. 61(4). P. 12431249:

36. Santabarbara S. et al. Chlorophyll triplet states associated with photosystem II of thyla-koids. Biochemistry. 2002. 41(25). P. 8184-8194.

37. Kato M. C. et al. The excess light energy that is neither utilized'in, photosynthesis nor dissipated by photoprotective mechanisms determines the rate of photoinactivation in photosystem II // Plant. Cell. Physiol. 2003. 44(3). P. 318-325.

38. Vass I. et al. Reversible and irreversible intermediates during photoinhibition of photosystem II: stable reduced QA species promote chlorophyll triplet formation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. 89(4). P. 1408-1412.

39. Hideg E. P., Kos B., Vass I. Photosystem II damage induced by chemically generated singlet oxygen in tobacco leaves // Physiol. Plant. 2007. 131(1). P. 33-40.

40. Muller P., Li X. P., Niyogi.K. K. Non-photochemical1 quenching. A response to.excess light energy //Plant. Physiol. 2001. 125(4). P. 1558-1566.v

41. Ruban A.V. et ah The Effects of Illumination^ on,the Xanthophyll Composition of the Photosystem II Light-Harvesting Complexes of-Spinach Thylakoid1 Membranes // Plant Physiol 1994*. 104(1). P.,227-234'.

42. Allen J: F. Protein phosphorylation^ regulation of photosynthesis// Biochirm Biophys.

43. Acta. 1992. 1098(3). P. 275-335.

44. Steinback K. E., Bose S., Kyle D. J. Phosphorylation of the light-harvesting chlorophyll-protein' regulates excitation energy distribution between photosystem II and photosystem I // Arch. Bi'ochem. Biophys. 1982. 216(1). P: 356-361.

45. Horton P., Ruban A. V., Walters R. G. Regulation of Light Harvesting in Green Plants // Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. 1996. 47. P. 655-684.

46. Ivanov A. G. et aL// Photosystem-IF reaction* centre quenching: mechanisms and phy. siological role. Photosynth: Res. 2008. 98(1-3). P. 565-574.

47. Depka B., Jahns P., Trebst A. Beta-carotene to zeaxanthin conversion in the rapid turnover of the D1 protein of photosystem II // FEBS Lett. ,1998. 424(3). P. 267-270.

48. Johnson M. P. et al. The zeaxanthin-independent and zeaxanthin-dependent qE components of nonphotochemical quenching involve common conformational changes withinthe photosystem II antenna in Arabidopsis II Plant. Physiol. 2009. 149(2). P. 1061— 1075.

49. Holt N. E. et al. Carotenoidcatiomformation ¡and;the regulation^ . harvesting //Science. 2005. 307(5708); P. 4331436;

50. Frank II. A. etal; The lifetimes and encrgies ofthe first excited singlet'states of diadinoxanthin-and' diatoxanthin. the; role ofi these; moliecules in; excess< energy dissipatiorii in; algae // Biochim; Biophys. Acta. 1996: 1277(3): P: 243-252.

51. Young A. J., Frank H. A. Energy transfer reactions involving carotenoids. quenching'of chlorophyll fluorescence II J. Photochem. Photobiol. B; 1996. 36(1). P. 3-15. .

52. Frank II. A. et al. Mechanism of nonphotocHemical quenching ingrcenplants: energies of the lowest excited4 singlet states of violaxanthin and zeaxanthin // Biochemistry . 2000. 39(1T). P. 2831-2837.

53. Crouchman S., Ruban A., I lorton P. PsbS enhances nonphotochemical fluorescence quenching in the absence of zeaxanthin// FEB STLett. 2006. 580(8). P. 2053-2058.

54. Bonente G. etal: Interactions between the photosystem II subunit PsbS and xanthophylls studiedi/n v/vo andim;v//ro //J: Biolf Ghem; 20081283(13): P: 8434-8445: • .

55. Kereiche S. et al. The PsbS protein controls the macro-organisation of photosystem II complexes in the grana membranes of higher plant chloroplasts // FEBS Lett. 2010. 584(4). P. 759-764.

56. Ishida S. et al. Allocation of absorbed light energy in PSII to thermal dissipations in the presence or absence of PsbS subunits of rice // Plant. Cell. Physiol. 2011. 52(10). P. 1822-1831.

57. Lakowicz J. R: Principles of Fluorescence Spectroscopy // 2006. XXVI. 954 P.

58. Garcia-Mendoza E. et al. Non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence in Chlorella fusca acclimated to constant and dynamic light conditions // Photosynth. Res. 2002. 74(3). P. 303-3151 ' •

59. Rohacek K. Method for resolution and quantification of components of the non-photo-chemical*quenching (q (N)) //Photosynth. Res. 2010. 105(2): P. 101-113:

60. Hungate B. A. et al: Atmospheric science. Nitrogen and climate change // Science. 2003. 302(5650).-P. 1512-1513.

61. Kerr R. A. Global change. A slowing cog in the North Atlantic ocean's climate machine // Science. 2004. 304(5669). P. 371-372.

62. Tazoe Y., Noguchi K., Terashima I. Effects of growth light and nitrogen nutrition on the organization of the photosynthetic apparatus in leaves of a C4 plant Amaranthus cru-entus II Plant. Cell. Environ. 2006. 29(4). P. 691-700.

63. Plumley F. G., Schmidt G.- W. Nitrogen-dependent regulation- of photosynthetic gene expression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. 86(8). P. 2678-2682.

64. Moisander P., McClinton H. E., Paerl H. W. Salinity effects on growth photosynthetic parameters and nitrogenase activity in estuarine planktonic cyanobacteria // Microb. Ecol. 2002. 43(4). P. 432-442.

65. Kargul J. Photosynthetic acclimation: molecular mechanisms of short and long-term acclimation*//FEB S J. 2008. 275(6).-P. 1055.

66. Kolber Z., Zehr J., Falkowski P. Effects of1 Growth Irradiance and Nitrogen Limitation on Photosynthetic Energy Conversion in Photosystem II // Plant. Physiol.' 1988. 88(3). P. 923-929.

67. Cai. X. et all High-nitrogen and low-irradiance can restrict energy utilization in photosynthesis of successional tree species in low subtropical forest // Sci. China. C. Life. Sci. 2008. 51(7). P. 592-603.

68. Ziska L. H., Seemann.J. R., Dejong T. M. Salinity Induced Limitations on Photosynthesis in.Prunus salicina> a Deciduous Tree Species // Plant. Physiol. 1990. 93(3). P. 864-870.

69. Berkelmans R., van Oppen M. J. The role of zooxanthellae in the thermal tolerance of corals: a 'nugget of hope' for coral reefs in an era of climate change // Proc. Biol. Sci. 2006. 273(1599). PI 2305-2312.

70. La Fontaine S. et al. Copper-dependent iron assimilation pathway in the model photosynthetic eukaryote Chlamydomonas reinhardtii II Eukaryot. Cell. 2002. 1(5). P. 736757.

71. Trick C. G., Wilhelm S. W., Brown C. M. Alterations in cell pigmentation protein expression and photosynthetic capacity of the cyanobacterium Oscillatoria tenuis grown under low iron conditions // Can. J. Microbiol. 1995. 41(12). P.* 1117-1123.

72. Yruela I. et al. Photoinhibition of photosystem II from higher plants. Effect of copper inhibition // J. Biol. Chem. 1996. 271(44). P. 27408-27415.

73. Bernal M. et al. Copper effect on cytochrome b of photosystem II under photoinhibitory conditions //Physiol. Plant. 2004. 120(4). P. 686-694.

74. Patsikka E. E., Aro M., Tyystjarvi E. Increase in the quantum yield of photoinhibition contributes to copper toxicity in vivo // Plant. Physiol. 1998. 117(2). P. 619-627.

75. Jegerschold C. et al. Effects of copper and zinc ions on photosystem II studied1 by EPR spectroscopy//Biochemistry. 1999.38(38). P. 12439-12445.

76. Mohanty N., Vass I., Demeter S. Copper Toxicity Affects Photosystem II Electron-Transport at the Secondary Quinone Acceptor Q(B) >// Plant. Physiol 1989. 90(1). P. 175-179.

77. Гостев Т. С., Кузьминов Ф. И., Горбунов М. Ю., Фадеев В. В. Биофотоника водных фотосинтезирующих организмов: флуоресцентные методы диагностики // Фотоника. 2011. №2. С. 72^81.

78. Li Y. et al. Light-saturated photosynthetic rate in,high-nitrogen rice (Oryza sativa L.) leaves is related to chloroplastic CO2 concentration // J. Exp. Bot. 2009. 60(8). P. 23512360.

79. Khosravinejad F., Heydari R., Farboodnia T. Effects of salinity on photosynthetic pigments respiration and water content in two barley varieties // Pak. J. Biol. Sci. 2008. 11(20). P. 2438-2442.

80. Gostev Т., Kouzminov F., Gorbunov M., Fadeev V. Phytoplankton as a fluorescent bio-indicator of ecotoxicants in natural waters// SPIE Photonics Europe 12-16 April 2010 Brussels Belgium. Proceedings of SPIE. 2010.- V. 7715. P. 771520.

81. Гостев Т. С., Кузьминов Ф. И., Моисеев С. А. Лазерный сенсор загрязнений природных вод использующий фотосинтезирующие организмы в качестве флуоресцентных биоиндикаторов//Краткие сообщения по физике ФИАН. 2011. Т. 38. № 1. С. 19-22.

82. Brain R. A., Cedergreen N. Biomarkers in aquatic plants: selection and utility // Rev. Environ. Contam. Toxicol. 2009. V. 198. P. 49-109.

83. Lombardi А. Т., Maldonado M. T. The effects of copper on the photosynthetic response of Phaeocystis cordata II Photosynth. Res. 2011. V. 108(1). P. 77-87.