Определение суммарного содержания антиоксидантов в винах с применением железосодержащих индикаторных систем

Николаева, Наталья Александровна

Определение суммарного содержания антиоксидантов в винах с применением железосодержащих индикаторных систем тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Николаева, Наталья Александровна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Краснодар МЕСТО ЗАЩИТЫ

2011 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Определение суммарного содержания антиоксидантов в винах с применением железосодержащих индикаторных систем»

Автореферат диссертации на тему "Определение суммарного содержания антиоксидантов в винах с применением железосодержащих индикаторных систем"

На правах рукописи ф/^

Николаева Наталья Александровна

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ АНТИОКСИДАНТОВ В ВИНАХ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЖЕЛЕЗОСОДЕРЖАЩИХ ИНДИКАТОРНЫХ СИСТЕМ

02.00.02 - аналитическая химия

1 5 ДЬК 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

005006184

Краснодар, 2011

005006184

Работа выполнена на кафедре аналитической химии ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный университет»

Научный руководитель:

кандидат химических наук, доцент Цюпко Татьяна Григорьевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Рувинский Овсей Евелевич

кандидат технических наук Марковский Михаил Григорьевич

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»

Защита состоится 27 декабря 2011 г. в ауд. 231 в 14:00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.101.16 в ФГБОУ «Кубанский государственный университет» по адресу: 350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149, КубГУ

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Кубанского государственного университета: 350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149

о £

Автореферат разослан ноября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук,

доцент

Н.В. Киселева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы, В процессах обеспечения технологического контроля качества вин и виноматериалов необходимо выделить проблему - оценка суммарного содержания аналитов, родственных в структурном или функциональном отношении. С этой точки зрения актуальным является определение суммарного содержания антиоксидантов (АО) и близкого к нему интегрального показателя - антиоксидантной активности (АОА) исследуемого объекта, учитывающего не только содержание, но и удельную активность каждого компонента в нем. Антиоксидантов очень много, их строение и свойства весьма разнообразны, а механизм действия во многих случаях неизвестен. Весьма проблематичной является задача определения этих веществ на низком концентрационном уровне (10 -10~5М), а их разбавленные растворы неустойчивы из-за окисления кислородом воздуха. В настоящее время наиболее популярны методы оценки антиоксидантной активности, основанные на ингибировании окисления различных липидных субстратов с последующим определением продуктов окисления. Соответствующие методики длительны и дают плохо воспроизводимые результаты, поэтому разработка новых методик, сочетающих экспрессность с достоверностью и высокой воспроизводимостью данных, остается актуальной задачей. При оценке суммарного содержания антиоксидантов необходимо учитывать особенности состава анализируемого объекта.

АОА вин обеспечивается за счет биологически активных веществ, которые содержат в структуре молекул сходные фрагменты, являющиеся своего рода ловушками для свободных радикалов. Применяемые на практике методики определения суммы АО не всегда стандартизованы, а результаты, получаемые для одних и тех же объектов по разным методикам, несопоставимы. В ходе спектрофотометрического определения АО, например методом FRAP {ferric reducing/antioxidant power), проявляются все проблемы, которые обычно осложняют анализ неразделенных смесей, а именно: не полностью известный качественный состав, наложение сигналов разных аналитов или дериватов, разная чувствительность их определения, непредсказуемое влияние посторонних веществ, неаддитивность аналитического сигнала. В отличие от хорошо изученных аналитиками методов определения суммы углеводородов или фенолов, методы спектрофотометрического определения АО исследованы недостаточно. Неизвестны источники систематических погрешностей, а часто и метрологические характеристики методик. Из вышеизложенного следует, что исследования в области определения суммарного содержания антиоксидантов и антиоксидантной активности вин актуальны как в практическом, так и теоретическом плане.

Настоящая работа выполнялась при финансовой поддержке РФФИ (грант № 09-03-96529)

Цель работы. Оценка способов определения суммарного содержания антиоксидантов, теоретическое обоснование и реализация способов устранения систематических и случайных погрешностей при спектроскопическом определении суммарного содержания АО в винах с применением железосодержащих индикаторных систем.

В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи:

• Оценить влияние различных факторов при определении суммарного содержания антиоксидантов с использованием индикаторной системы Ре(Ш)-органический реагент (1,10-фенантролин или 2,2'-дипиридил), оптимизировать условия анализа;

• Разработать способ выявления отклонений от аддитивности аналитического сигнала для смесей антиоксидантов методом FRAP с использованием хемометрических подходов;

• Изучить взаимосвязь между суммарным содержанием антиоксидантов и величиной интегрального показателя -АОА, учитывающего не только содержание, но и удельную активность каждого компонента в исследуемом объекте.

Научная новизна. Изучены особенности оценки суммарного содержания антиоксидантов в винах с применением метода FRAP; установлено, что систематические погрешности формируются за счет разной чувствительности обобщенного аналитического сигнала к индивидуальным антиоксидантам, что обусловлено разной стехиометрией и разной скоростью однотипных фотометрических реакций; предложены способы снижения этих погрешностей.

Показана возможность определения суммарного содержания антиоксидантов в винах с использованием индикаторной системы на основе Fe(III) - 1,10-фенантролин (или 2,2'-дипиридил), установлена связь суммарного содержания антиоксидантов в винах с другими суммарными показателями их качества. Проведено обоснование выбора аскорбиновой кислоты в качестве вещества-стандарта при оценке суммарного содержания антиоксидантов в винах.

Практическая значимость. Предложен алгоритм выявления и прогнозирования статистически значимых отклонений от аддитивности при определении суммарного содержания антиоксидантов в винах по методу FRAP, а также способы снижения соответствующих систематических погрешностей.

Для красных сухих вин выведено уравнение, описывающее взаимосвязь антиоксидантной активности с другими суммарными

показателями (суммарное содержание полифенолов, интенсивность окраски вина, содержание лейкоантоцианов). Показана возможность использования показателя антиоксидантной активности / суммарного содержания полифенолов в схеме комплексной оценки качества вин. На защиту выносятся:

• результаты исследования аддитивности аналитических сигналов при определении суммы антиоксидантов методом FRAP;

• результаты исследований источников и способов устранения систематических и случайных погрешностей при спектроскопических определениях суммарного содержания АО в винах с применением железосодержащих индикаторных систем;

• экспериментальные данные по определению антиоксидантной активности вин и вкладу антоцианов в ее величину;

• выявленные корреляции антиоксидантной активности вин и других суммарных показателей их состава и качества.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (АР Крым, 2009); Ш Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России 2009» (г. Краснодар, 2009); международной научной конференции по аналитической химии и экологии (г. Йошкар-Ола, 2010); съезде аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (г. Москва, 2010); XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (г. Волгоград, 2011); Ш Всероссийском симпозиуме с международным участием «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (г. Краснодар, 2011).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 работ, в том числе 5 тезисов докладов и 5 статей. 4 статьи опубликованы в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ. Разработанная методика МУ 08-47/275 «Спектрофотометрический метод измерений антиоксидантной активности пищевых продуктов» внесена в Федеральный реестр методик измерений под № ФР.1.31.2011.09197.

Структура и объем работы. Диссертация представляет собой рукопись, изложенную на 130 страницах, состоящую из введения, 3 глав и выводов. Список использованной литературы включает 105 наименований. Диссертация иллюстрирована 20 рисунками, 25 таблицами.

Во введении обоснована актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы и представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе (обзор литературы) дана классификация антиоксидантов, рассмотрены основные антиоксиданты вина и методы определения показателя АОА. Обсуждаются аддитивность аналитических сигналов и методы выявления отклонений от аддитивности.

Во второй главе представлены данные об используемых методах и средствах измерений, описаны условия и методика эксперимента.

В третьей главе изложены основные результаты проведенных исследований, проведено обсуждение результатов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Спектроскопические измерения проводили с помощью спектрофотометров КФК-2МП (Россия) и Agilent 8453 (США). В работе использовали реактивы квалификации осч., х.ч., ч.д.а.

Объекты исследования: антиоксиданты фенольной природы (кверцетин (KB), рутин (РТ), галловая кислота (ГК), катехол (КТ), протокатеховая кислота (ПКК), феруловая кислота (ФК)) и нефенольной природы (аскорбиновая кислота (АК)). Объекты природного происхождения со сложной матрицей: красные вина, приобретенные в торговой сети и предоставленные Анапской зональной опытной станцией виноградарства и виноделия (АЗОСВиВ).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Основными компонентами вина, отвечающими за его качество, являются полифенольные соединения, содержание которых в красных винах значительно выше, чем в белых. В практике аналитических лабораторий винодельческих предприятий суммарное содержание полифенолов в винах определяют методом Фолина-Чиокальтео.. Существенным недостатком данного метода является то, что таким образом определяется не только общее содержание полифенолов, но и все восстановители, находящиеся в исследуемой пробе, например витамин С. Для определения АОА в настоящее время применяется ряд методов, в основе которых лежат реакции радикального или окислительно-восстановительного характера. К последним относится FRAP (ferric reducing antioxidant power) - метод, в котором под действием антиоксидантов железо(Ш) восстанавливается до железа(П), которое связывается в интенсивно окрашенный комплекс с органическим лигандом (трипиридилтриазином, феррозином и др.). Для определения АОА красных вин применяют методику, в которой в качестве лиганда используется 1,10-фенантролин или 2,2-дипиридил. [Цюпко Т.Г. и др.] Найденную по этой методике АОА выражают в мг вещества-стандарта на 1 дм3 вина. Однако величина АОА и суммарное содержание

антиоксидантов (полифенолов) в винах не всегда коррелируют. АОА характеризует суммарное воздействие антиоксидантов на индикаторную систему в условиях их конкуренции и/или непосредственного взаимодействия. Это может приводить к систематическим погрешностям анализа, возникающим вследствие ряда факторов (неаддитивности аналитического сигнала, разной чувствительности и разной скорости взаимодействия индивидуальных антиоксидантов с окислителем и др.), поэтому для снижения погрешностей необходимо модифицировать используемую методику.

1 Исследование аддитивности аналитического сигнала при определении суммы антиоксидантов полифенольного типа. Исследование аддитивности аналитического сигнала проводили с применением модельных растворов индивидуальных антиоксидантов фенольного типа (кверцетин, рутин, галловая кислота, катехол, эпикатехин, феруловая кислота, протокатеховая кислота) и нефенольного типа (аскорбиновая кислота) и их смесей. Все перечисленные антиоксиданты содержатся в винах.

При определении суммарного содержания веществ систематическая погрешность может возникать в результате их непосредственного взаимодействия. Для проверки этой возможности проводили спектроскопические исследования смеси антиоксидантов в УФ-области без внесения окислителя. В диапазоне длин волн от 210 до 390 нм с шагом 10 нм рассчитывали отклонение от аддитивности светопоглощения (ДА), сопоставляя обобщенный аналитический сигнал смеси (Аг) и сумму (2А) аналитических сигналов компонентов (табл.1). Проверка аддитивности светопоглощения смесей по 38-критерию показала, что в исследованной области спектра для всех исследованных систем отклонения от аддитивности статистически незначимы.

Таблица 1 - Результаты оценки отклонения от аддитивности светопоглощения некоторых смесей антиоксидантов (САо = Ю мкг/см3)

Состав смеси Хши смеси, нм Лх ХА ДА 5А,%

АК+КВ 253 1,161 1,181 0,020 1,7

АК+РТ 251 0,806 0,809 0,003 0,4

КВ+РТ 255 1,070 1,076 0,006 0,6

ГК+КТ 271 0,723 0,723 0 0

ЭП+КТ 277 0,255 0,251 -0,004 -1,6

АК+КВ+РТ+ЭП+ГК+КТ 256 1,936 1,831 -0,105 -5,4

При добавлении к смеси антиоксидантов окислителя протекают окислительно-восстановительные реакции, которые могут сопровождаться побочными процессами, приводящими к образованию нецелевых продуктов. Для изучения этих реакций нами проводились спектроскопические исследования взаимодействий между индивидуальными антиоксидантами (или смесями АО) и комплексным реагентом (0,06 ммоль/дм3 Ре(Ш) + 0,10 ммоль/см3 1,10-фенантролина; рН 3,6) в диапазоне длин волн 400-600 нм. Установленные коэффициенты корреляции для попарно взятых спектров составили 0,817-0,999, на основании чего был сделан вывод, что во всех случаях продуктом реакции является фенантролинатный комплекс железа (П). Высокие коэффициенты корреляции были получены и при использовании индикаторной системы железо(Ш)- 2,2'-дипиридил.

В спектроскопических методах анализа нет единого или общепринятого способа проверки аддитивности аналитического сигнала. Для выявления статистически значимых отклонений от аддитивности мы использовали два известных способа: 1) проверка значимости А А с помощью ЗБ-критерия (И.В.Власова); 2) сравнение средних значений А^ и ЕА по ^критерию Стьюдента.

При использовании ЗБ-критерия вывод о неаддитивности светопоглощения исследуемой смеси при выбранной длине волны делают при выполнении неравенства | ДА | > 3 Бд^, где Бд^ - стандартное отклонение обобщенного аналитического сигнала (оптической плотности раствора, содержащего смесь антиоксидантов, при его многократном приготовлении и фотометрировании).

При использовании ^критерия сравнивали средние значения двух выборок. В качестве первой брали выборку, содержащую аналитические сигналы повторно приготовленной смеси антиоксидантов. Вторая выборка содержит суммы аналитических сигналов всех антиоксидантов, входящих в смесь. Вывод о неаддитивности делают при выполнении неравенства I ,ксп = |АА | / ^ > /0,оь где ^ - средневзвешенное стандартное отклонение, найденное по формуле За = / £ ? + Б \ \

V т

км ~ табличное значение критерия Стьюдента для уровня значимости нуль-нипотезы, равного 0,01, при соответствующем числе степеней свободы.

С использованием 38- и ^критериев проверяли аддитивность обобщенного аналитического сигнала некоторых смесей антиоксидантов (табл. 2). Как видно, результаты проверки, полученные двумя статистическими способами, аналогичны.

Таблица 2 - Результаты проверки аддитивности смесей антиоксидантов

Смесь Состав, мкмоль/дм3 ДА 3S ^ЭКСП Значимость ДА

3S t

АК+КВ 3,0+1,0 0,006 0,009 1,16 - -

ГК+КТ 2,0+2,0 0,237 0,043 32,5 + +

КВ+ФК 0,5+3,5 0,017 0,032 3,0 - -

РТ+ГК+КТ 1,5+1,5+1,0 0,159 0,028 27,21 + +

АК+КТ+ПКК 1,5+1,5+1,0 0,018 0,021 3,68 - -

АК+КВ+ГК+КТ 1,3+0,5+1,0+1,2 0,078 0,049 20,88 + +

-to,о; =5,96

Статистическое сравнение средних значений YA и Лт показывает, что отклонения от аддитивности для некоторых смесей АО значимы. В некоторых случаях их величина может достигать 30-40%, например, для смеси аскорбиновой кислоты и кверцетина (10-10" и соответственно). При уменьшении концентраций антиоксидантов, входящих в состав этой смеси, значимых отклонений от аддитивности не наблюдается. Очевидно, с помощью t-критерия или 38-критерия можно выявить отклонения от аддитивности, однако причины таких отклонений требуют дополнительного изучения.

Для выяснения природы отклонений от аддитивности при определении антиоксидантов по методу FRAP мы использовали метод полного факторного эксперимента (ПФЭ). Готовили 2" модельных смесей с известными концентрациями п компонентов (факторы), вводили комплексный реагент-окислитель и измеряли оптическую плотность полученных растворов (параметр). Состав смесей рассчитывали по стандартному плану ПФЭ, включающему выбор центра плана и интервалов варьирования по каждому фактору. После получения числовых данных рассчитывали регрессионные коэффициенты, применяя компьютерную программу "PLAN" (ОмГУ). Отбраковывали незначимые коэффициенты и проверяли адекватность регрессий на уровне значимости а = 0,01. Полученные уравнения регрессий (в кодированных переменных) переводили в интерполяционные формулы (в концентрационных переменных), используя соотношение:

Xj = (ct - ci0)/It, где с, - значение /-го фактора

в данном опыте; с, о — значение i-го фактора в центре плана; I, - интервал варьирования фактора.

О неаддитивности обобщенного аналитического сигнала свидетельствует нелинейность полученной модели. В табл. 3 приведены результаты проверки аддитивности некоторых смесей антиоксидантов.

Таблица 3 - Результаты проверки аддитивности светопоглощения смесей антиоксидантов с применением ПФЭ _

Состав смеси, мкМ Количество реагента, см3 Уравнение регрессии

АК РТ КВ

5,0 4,0 - 1,0 У = 0,01719 + 0,02494Сак + 0,03100Срт

2.5 4,0 -

5,0 2,0 -

2,5 2,0 -

4,0 - 3,0 1,0 У = 0,09030 + 0,02239Сак + 0,08773СКВ - 0,009057СакСкв

4,0 - 1,0

10,0 - 3,0

10,0 - 1,0

4,0 - 3,0 2,0 У = -0,00035 + 0,02131Сак + 0,08675 Скв

4,0 - 1,0

10,0 - 3,0

10,0 - 1,0

5,0 1,2 4,0 3,0 У = -0,03335 + 0,02177Сак + 0,09877СКВ + 0,03521Срт

2,5 1,2 4,0

5,0 0,6 4,0

2.5 0,6 4,0

5,0 1,2 2,0

2,5 1,2 2,0

5,0 0,6 2,0

2,5 0,6 2,0

Наличие в уравнении регрессии статистически значимого слагаемого, произведения концентраций антиоксидантов свидетельствует о неаддитивности обобщенного аналитического сигнала. Достоверное отличие регрессионных коэффициентов в интерполяционной формуле от условных молярных коэффициентов поглощения (е), полученных для соответствующих индивидуальных антиоксидантов порознь, служило подтверждением неаддитивности обобщенного аналитического смеси антиоксидантов.

Как видно из табл. 3, аналитический сигнал смеси аскорбиновой кислоты и кверцетина при небольшом избытке комплексного реагента (1,0 мл) является неаддитивным. С учетом того, что индивидуальные антиоксиданты не взаимодействуют между собой, полученную неаддитивность сигнала можно объяснить конкуренцией антиоксидантов при нехватке комплексного реагента. Данное предположение было проверено при проведении серии ПФЭ в разных условиях формирования аналитического сигнала одной и той же смеси. Увеличение объема комплексного реагента в 2-5 раз приводило к получению аддитивного сигнала. При этом снижалась и систематическая погрешность

определения суммарного содержания антиоксидантов. При значительном избытке комплексного реагента для всех изученных смесей АО (кроме ГК + КТ) получены уравнения регрессий, которые свидетельствуют об аддитивности аналитического сигнала.

На основании вышеизложенного можно утверждать, что изучение аддитивности светопоглощения смесей с помощью статистических моделей дает важную информацию о процессах, протекающих в растворах, и позволяет оптимизировать методики спектроскопического анализа.

2 Выявление влияние различных факторов при определении суммарного содержания антиоксидантов методом FRAP. На

правильность определения суммарного содержания антиоксидантов с использованием индикаторной системы железо(Ш)-1,10-фенантролин или 2,2'-дипиридил могут влиять ряд факторов: рН раствора, разная скорость окисления антиоксидантов, неаддитивность светопоглощения и др. Для минимизации этого влияния нами проводились исследования по оптимизации условий получения воспроизводимого и максимального значения аналитического сигнала.

Оптимизация условий анализа при определении антиоксидантов. Антиоксиданты могут определяться с разной чувствительностью, даже если имеют одинаковую стехиометрию взаимодействия с комплексным реагентом, что может быть связано с разной скоростью реакции между антиоксидантами и окислителем. Зависимости аналитического сигнала от времени экспозиции, полученные для разных начальных концентраций одного и того же антиоксиданта (рис. 1а), как и зависимости, полученные для разных антиоксидантов при одинаковой начальной концентрации (рис. 16), однотипны, но различны по наклону.

Формы зависимостей аналитического сигнала от времени реакции указывают на сложный механизм взаимодействия антиоксидантов с окислителем. Процесс включает три стадии:

1. Быстрый и постепенно замедляющийся рост оптической плотности в первые минуты после смешивания растворов, за первые 10 мин. процесс протекает на 40-70%, в зависимости от природы антиоксиданта и его концентрации.

2. Медленный рост оптической плотности в последующие 5 часов. Через 60 мин. после смешивания процесс протекает на 70-90% от максимально достигаемого значения.

3. Приблизительное постоянство оптической плотности в течение последующих 24 часов. К концу третьего этапа для ряда АО, например кверцетина, наблюдается небольшое снижение оптической плотности.

Рисунок 1 -Зависимости аналитического сигнала от времени экспозиции для разных начальных концентраций кверцетина (а), для разных антиоксидантов при начальной концентрации 3 мкМ (б). Система Ре(Ш)-1,10-фенантролин Для смесей восстановителей зависимость изменения аналитического сигнала от времени имеет тот же характер. Анализ зависимостей изменения аналитического сигнала во времени для индивидуальных восстановителей и их смесей позволил предположить, что при времени экспозиции 60 мин. вклад кинетического фактора в формируемый аналитический сигнал проявляется только за счет конкурирующего взаимодействия антиоксидантов с окислителем. Относительное отклонение от аддитивности светопоглощения с увеличением времени экспозиции изменяется незначительно (и в основном определяется составом смеси). Поскольку воспроизводимость аналитического сигнала при увеличении экспозиции возрастает, все дальнейшие исследования проводили при времени экспозиции 60 мин. (табл. 4).

Таблица 4 - Рассчитанные величины отклонения от аддитивности светопоглощения (8,%) при различном времени экспозиции_

Состав смеси 5,%

Ре(Ш)-1,10-фенантролин Ре(Ш)-2,2'-дириридил

АО С, мкМ 10 мин 60 мин 10 мин 60 мин

АК 3,0 -1,7 -5,2 2,3 7,2

КВ 1,0

АК 2,0 0,0 -1,1 5,8 2,7

ГК 2,0

КВ 0,5 0,5 -6,6 1,5 -3,3

ФК 3,5

АК 2,0 4,5 5,2 -6,8 -4,5

КВ 0,5

РТ 1,5

АК 1,5 10,6 -9,9 3,8 1,8

КТ 1,5

ПКК 1,0

При изучении влияния ионной силы на аналитический сигнал индивидуального антиоксиданта варьировали концентрацию индифферентного электролита (КЖ)з) в реакционной смеси в диапазоне от 0,02 до 0,60 моль/дм3. Учитывая тот факт, что изменение аналитического сигнала в этих условиях незначительно, представляется возможным не учитывать ионную силу раствора при определении суммарного содержания АО в реальных образцах.

Полифенолы активно вступают в окислительно-восстановительные реакции в диапазоне рН 2,0-4,0. В случае взаимодействия изучаемых индивидуальных восстановителей с индикаторной системой железо(Ш)-1,10-фенантролин максимальный (при прочих равных условиях) аналитический сигнал регистрируется в интервале рН от 3,2 до 4,0, поэтому все дальнейшие исследования проводили при рН = 3,6.

С помощью статистических моделей было установлено, что уменьшение суммарного содержания антиоксидантов при одновременном увеличении объема реагента-окислителя приводит к снижению систематических погрешностей за счет устранения неаддитивности аналитического сигнала смеси. Дальнейшие исследования показали, что увеличение концентрации комплексного реагента в 2-3 раза приводит к возрастанию аналитического сигнала антиоксидантов, для которых характерен многостадийный процесс окисления (например, для рутина и кверцетина сигнал возрастает на 10-15%). Дальнейшее увеличение содержания комплексного реагента в реакционной смеси нецелесообразно, т. к. требуемая при этом операция доведения рН до

оптимального значения может привести к дополнительной погрешности и затрудняет анализ.

Ожидалось, что увеличение температуры реакционной смеси должно увеличивать скорость окисления антиоксидантов и их аналитические сигналы. Однако в диапазоне температур от 20 до 30 °С при колебаниях ±1°С величина аналитического сигнала меняется лишь в пределах погрешности измерений.

Чувствительность определения антиоксидантов и стехиометрия реакций. Известно, что разная чувствительность определения индивидуальных соединений может приводить к неточному определению их суммарного содержания. Чувствительность определения антиоксидантов по методу FRAP зависит от стехиометрии и скорости соответствующих реакций. Для установления коэффициентов чувствительности (наклоны соответствующих градуировочных графиков) изучали зависимости аналитических сигналов АО от их концентраций. Найденные коэффициенты чувствительности (наклоны соответствующих графиков) достоверно различаются, снижаются в ряду КВ>ГК>ПКК>РТ>АК=ФК>КТ и объясняются различной стехиометрией взаимодействия антиоксидантов с окислителем (рис. 2).

Рисунок 2 - «Веер» градуировочных графиков при выражении концентраций АО в мкмоль/дм3 Для уточнения стехиометрических коэффициентов реакций окисления полифенолов использовали методы спектрофотометрического насыщения и титрования. Для построения кривой насыщения проводили реакцию между комплексным реагентом и антиоксидантами при разном времени экспозиции. При использовании метода спектрофотометрического титрования в качестве титранта использовали растворы антиоксидантов, а титруемым веществом являлся комплексный реагент с разными концентрациями окислителя. В обоих случаях получены близкие результаты. В общем случае, найденные стехиометрические коэффициенты соответствуют количеству ОН-групп в молекуле антиоксиданта. Для «быстрых» антиоксидантов (например, АК, КТ, ПКК)

количество отданных электронов равно числу ОН-групп. Для некоторых антиоксидантов, взаимодействующих с окислителем ступенчато (КВ, РТ), с изменением времени экспозиции наблюдается увеличение стехиометрических коэффициентов (п). Они приближаются к количеству ОН-групп молекулы антиоксиданта только при длительной экспозиции. Найденные значения п в дальнейшем использовали для пересчета молярных концентраций растворов АО в «нормальные» (табл. 5).

Влияние разной стехиометрии окисления индивидуальных АО может быть нивелировано, если выражать содержание антиоксидантов в «нормальных» концентрациях с учетом отдаваемых ими электронов, при этом происходит сближение градуировочных графиков (рис. 3).

О 5 Й 15 Ж & го 35 С

Рисунок 3 - «Веер» градуировочных графиков при выражении концентраций АО в мкмоль-экв/дм3 Нормирование коэффициентов чувствительности индивидуальных АО по АК и КВ, соответственно имеющих среднее и высокое значения п, также указывает на возможность уменьшения систематической погрешности при переходе к выражению концентраций в моль-экв/дм3 (табл.5).

Таблица 5 - Нормированные по аскорбиновой кислоте и кверцетину коэффициенты чувствительности__

АО п Коэффициент чувствительности (К) Нормирование КАО

по АК по КВ

АК 2 0,021±0,001 1 0,6

ГК 3 0,043±0,0002 1,7 1,2

КТ 2 0,024±0,001 1,1 0,7

ПКК 2 0,033±0,0001 1,6 0,9

РТ 2 0,029±0,0004 1,4 0,8

ФК 2 0,021±0,003 1,0 0,6

КВ 4 0,035±0,003 2,0 1,0

Анализ модельных смесей показал, что в ряде случаев выражение суммарного содержания антиоксидантов в «нормальных» концентрациях приводит к снижению относительной погрешности в 1,5-2 раза (табл. 6).

Таблица 6 - Погрешности определения суммарного содержания антиоксидантов в модельных смесях при различных способах выражения концентраций и использовании АК в качестве стандартного вещества.

Состав смеси Найдено

АО с, мкмоль/дм3 1Сао, мкмоль-экв/дм3 £ао мкмоль/дм3 8С, % > ХАО мкмоль-экв/дм3 5С, %

АК 3,0 10,0 5,6 ±0,2 40 12,5 ± 0,5 25

КВ 1,0

АК 1,0 8,0 4,6 ±0,1 15 9,4 ±0,3 17

РТ 3,0

ПКК 2,0 8,0 4,6 ± 0,5 15 9,3 ±0,9 16

КТ 2,0

АК 1,5 8,0 5,6± 0,2 40 10,9 ± 0,9 36

КТ 1,5

ПКК 1,0

Учет стехиометрии реакции не приводит к абсолютной тождественности градуировочных графиков и полному исключению систематических погрешностей при оценке суммарного содержания антиоксидантов.

Нами проводились исследования влияния вещества-стандарта (антиоксидантов с высокой и средней чувствительностью) на величину погрешности определения суммарного содержания антиоксидантов. В качестве вещества-стандарта с высокой чувствительностью выбрали КВ, а со средней чувствительностью - АК (табл. 7).

Таблица 7 - Погрешность определения суммарного содержания антиоксидантов в пересчете на разные вещества-стандарты (п соответствует количеству ОН-групп в молекуле АО)

Состав смеси

ХСТ = АК

Хст — КВ

АО

КВ РТ АК РТ КТ ПКК АК КВ РТ

Сдо, мкмоль/дм3

1,0

3,0 1,0

3,0 2,0 2,0 2,0 0,5 1,5

£Сао, мкмоль-экв/дм3

17,0

14,0

мкмоль-экв/дм3

15,5

8,0

12,5

9,4 9,3

9,2

5С, %

-9

-33 16

-26

мкмоль-экв/дм3

12,6

8,0

7,9

7,3

5С, %

-26 -43 -1

-42

Как видно из табл. 7, погрешность определения суммарного содержания антиоксидантов в зависимости от выбранного вещества-стандарта может быть как положительной, так и отрицательной.

Для повышения точности оценки суммарного содержания антиоксидантов в реальных объектах желательно выражать эти содержания в моль-экв/дм3, а градуировочные графики строить, используя растворы стандартного вещества с известными нормальными концентрациями. Для определения суммарного содержания АО в винах в качестве такого вещества нами рекомендуется аскорбиновая кислота.

В оптимизированных условиях определения суммарного содержания антиоксидантов, с учетом предложенных принципов выражения найденных концентраций, были проанализированы различные образцы вин. Для доказательства правильности определения суммарного содержания антиоксидантов в винах в образец вводили добавку вещества-стандарта - аскорбиновую кислоту. Погрешность определения введенной добавки составила не более 20%.

Выявлена корреляция результатов определения суммарного содержания антиоксидантов по предлагаемому методу с аналогичным показателем - суммарным содержанием полифенолов, определяемым по общепринятому методу Фолина-Чиокальтео относительно вещества-стандарта - галловой кислоты. Для образцов белых сухих вин величина коэффициента корреляции составила 0,941, для образцов сухих красных вин - 0,943 (п = 10, Р = 0,95). Особо следует отметить, что при выражении концентраций в обоих методах в ммоль-экв/дм3 относительно соответствующих веществ-стандартов происходит практически полное совпадение сравниваемых величин, что является косвенным доказательством правильности предлагаемой методики (табл.8).

Таблица 8 - Сопоставительный анализ результатов определения суммарного содержания антиоксидантов по предлагаемому и общепринятому методу Фолина-Чиокальтео_

Образец АО, ммоль-экв АК/дм3 Полифенолов, ммоль-экв ГК/дм3

"Château Tamagne" "Каберне Тамани" Урожай 2009 38 ±5 34 ±3

"NR Каберне Фанагории" Урожай 2010 40 ±4 36 ± 7

"Звезда Тамани" Каберне Совиньон Урожай 2009 42 ±3 43± 3

"Вина Тамани" Мерло 36±3 34± 4

Проведенная оптимизация условий определения суммарного содержания антиоксидантов и выбор вещества-стандарта позволяют говорить, что определяемый в этих условиях показатель характеризует суммарное содержание восстановителей фенольного типа в винах и по значению близок к величине АОА - интегральному показателю, характеризующему не только содержание, но и удельный вклад индивидуальных антиоксидантов.

3 Определение антиоксидантной активности вин. Вина представляют сложную сбалансированную систему, компоненты которой (фенольные соединения и другие биологически активные вещества) находятся в определенных соотношениях и обуславливают их антиоксидантные свойства.

Нами проводились исследования по оптимизации условий определения АОА на примере сухих, полусухих, полусладких и крепленых вин. Введение верификационных компонентов (добавка белого и красного сухих вин) в растворы при построении градуировочного графика по веществу-стандарту не влияет на величину тангенса угла наклона, что подтверждает отсутствие влияния матрицы продукта на величину АОА. С другой стороны, большое содержание антиоксидантов в анализируемых продуктах может оказать влияние на правильность определения АОА, что приводит к необходимости оптимизации объема пробы, вводимой в реакцию с индикаторной системой. При изучении влияния разбавления образца на величину АОА было установлено, что оптимальным является разбавление в 200-500 раз (при введении 1 см3 разбавленного образца на 100 см3 реакционной смеси) (рис. 4). С учетом установленного оптимального разбавления была определена АОА образцов вин.

Рисунок 4 - Зависимость величины антиоксидантной активности красного сухого вина от степени его разбавления

4 Изучение АОА антоцианов, выделенных из виноградного вина.

Среди активных компонентов красного вина особое место занимают антоцианы, в основном это 3-гликозиды антоцианидинов (моногликозиды мальвидина, петунидина, пеонидина, дельфинидина, цианидина и их эфирные формы), которые, взаимодействуя с другими компонентами вина, изменяют его свойства. Качественный и количественный состав смеси антоцианов, присутствующих в вине, а также их суммарное содержание зависят от множества факторов, характеризующих сорт винограда, накопление антоцианов в ягоде и технологию получения вина. Изменение рН приводит к переходам антоцианов в новые формы, отличающиеся структурой соответствующих молекул. Такие переходы влияют на хроматические характеристики вина и, возможно, на его антиоксидантные свойства. Однако взаимосвязь антиоксидантной активности компонентов вина (в том числе антоцианов) и

кислотности вина практически не изучена. Неизвестен также вклад антоцианов в величину суммарной антиоксидантной активности виноматериалов.

Для изучения вклада влияния антоцианов на величину суммарной антиоксидантной активности виноматериалов проводились исследования на примере сухого виноматериала «Каберне». Сумму антоцианов селективно выделяли сорбционным методом, используя способность антоцианов адсорбироваться на тальке. О составе и свойствах выделенного препарата антоцианов судили по цветовым характеристикам, измеряя их при различных рН. Установлено, что зависимости показателя интенсивности от величины рН (в интервале от 3,0 до 10,0) для исходного виноматериала и для выделенного препарата антоцианов однотипны; однотипными были и зависимости показателя оттенка (14) от значения рН. Данный факт свидетельствует о сохранении свойств и состава смеси антоцианов в ходе ее выделения из виноматериала.

Структуры основных антоцианов вина отличаются количеством ОН-групп в кольце В, которые участвуют в окислительно-восстановительных реакциях и обуславливают их антиоксидантные свойства. Для единичного антоциана изменение рН раствора всегда приводит к изменению формы его существования в растворе, что, в свою очередь, может приводить к изменению его активности как восстановителя. Для суммы разных антоцианов прогнозировать изменения АОА при различных рН затруднительно.

Изменение рН не только меняет восстановительные свойства антоцианов, но и влияет на чувствительность их детектирования за счет возможного протекания побочных реакций с участием окислителя индикаторной системы. Для исключения влияния второго фактора

определение АОА антоцианов проводили при постоянной величине рН, при которой обеспечивалась максимальная чувствительность измерений (рН = 3,6).

Для образцов выделенного препарата антоцианов с установленным значением рН от 3,0 до 6,0 антиоксидантная активность практически не изменялась. Доминирующие в этих условиях структуры антоцианов являются равновесными, в ходе измерения антиоксидантной активности антоцианы находились в формах, характерных для рН = 3,6. Однако для препарата антоцианов с установленным значением рН > 9,0 антиоксидантная активность достоверно снижалась по сравнению с данными, полученными при рН = 3,6 (рис. 5). Данный факт обусловлен, по-видимому, необратимыми изменениями в молекулах антоцианов, которые происходят в щелочной среде и инициируются ионизацией фенольных гидроксилов. Аналогичная зависимость АОА от рН наблюдалась и для проб исходного виноматериала, которые некоторое время выдерживали при разных значениях рН. Однотипность изменения АОА при изменении рН виноматериала и препарата антоцианов подтверждает установленный с помощью хроматических характеристик факт отсутствия побочных реакций, меняющих состав смесей антоцианов в ходе их сорбционного выделения.

а и

——Г-

б рН

—г-

25 3

24 ' с.

23 §

22 §

С 21 <

Рисунок 5 - Зависимость величины антиоксидантной активности препарата антоцианов (кривая 1) и исходного виноматериала (кривая 2) от рН

Таким образом, в интервале значений рН, характерных для красных сухих вин, антиоксидантная активность антоцианов практически не зависит от величины рН. Сопоставление величин антиоксидантной активности виноматериала и препарата антоцианов позволило оценить вклад антоцианов в суммарный показатель АОА исследуемого виноматериала, который составил (35 ± 5)%. Разработанная методика

оценки вклада антоцианов может быть использована и для других разновидностей виноматериалов.

5 Аитиоксидантная активность вин. Прикладные аспекты.

Вина в своем составе содержат широкий круг биологически активных веществ, таких как дубильные вещества, флавоноиды, катехины, антоцианы, витамины, некоторые органические кислоты, которые имеют сходные фрагменты в структуре своих молекул и обеспечивают их антиоксидантную активность. С другой стороны отдельные группы веществ (органические кислоты, антоцианы, полифенолы), формирующие качество вина, могут определяться по общепринятым для виноделов суммарным показателям.

Для установления взаимосвязи между АОА и другими суммарными показателями использовали образцы красных сухих вин («Мерло», «Каберне»). Цветовые характеристики вин определяли по экспресс-методике Международной организации виноградарства и виноделия, содержание полифенолов - по методу Фолина-Чиокальтео (вещество-стандарт - ГК), содержание лейкоантоцианов - по методике, основанной на их способности переходить в антоцианы (вещество-стандарт -мальвидин), АОА оценивали по предлагаемой нами методике (табл. 9).

Связь между вышеуказанными показателями устанавливали с применением корреляционного анализа. Найденные коэффициенты корреляции (не менее 0,899) подтверждают наличие связи между этими показателями. На основании этого предложено уравнение, связывающее величину АОА с другими суммарными показателями для сухих красных вин групп «Каберне» и «Мерло».

АОА = (9,87 ± 1,30) + (0,54 ± 0,14)ФЧ + (1,39 ± 1,19)ЛА + (0,40 ± 0,16)1.

Проверку адекватности данного уравнения проводили с использованием образцов сухих красных вин, не входящих в массив данных при его выводе, относительная погрешность определения при этом составила 10%.

Таблица 9 - Результаты определения АОА и других суммарных показателей вин (п=5, Р=0,95)

Образец АОА, ммольАК/дм3 Содержание фенольных веществ, ммольГК/дм3 Содержание пейкоантоцианов, г/ дм3 «Цветовые» характеристики

Интенсивность Оттенок

"NR Мерло Фанагории" Урожай 2009 18,5 ±2,3 9,1 ±2,3 0,7 ± 0,2 7,43 ±0,01 0,78 ±0,03

"NR Каберне Фанагории" Урожай 2009 19,2 ± 2,1 9,5 ± 0,3 0,9 ±0,1 7,08 ± 0,05 0,64 ± 0,01

"Cru Lermont" Каберне-Совиньон Урожай 2008 18,7 ±3,2 9,5 ± 1,1 0,7 ± 0,3 5,72 ± 0,06 0,68 ± 0,03

"NR Каберне Фанагории" Урожай 2010 19,8 ±2,1 11,0 ±2,2 1,1 ±0,2 5,22 ±0,03 0,67± 0,01

"Каберне Тамани" Урожай 2009 19,3 ± 2,7 11,5 ±1,0 1,0 ±0,2 5,64 ±0,05 0,56 ± 0,01

"Мерло Тамани" Урожай 2009 18,9 ±1,5 9,5 ± 2,4 0,8 ± 0,2 5,82 ± 0,05 0,60 ± 0,01

"Вина Тамани" Мерло 18,7 ± 1,6 11,2 ±1,5 0,7 ± 0,3 4,27 ± 0,03 0,66 ± 0,02

"Вина Тамани" Каберне 17,5 ± 2,4 9,0 ±1,9 0,8 ±0,4 5,01 ±0,02 0,60 ±0,01

"Звезда Тамани" Мерло Урожай 2009 23,2 ±2,6 16,0 ±1,3 1,5 ± 0,2 5,79 ±0,06 0,54 ± 0,03

"Звезда Тамани" Каберне Совиньон Урожай 2009 21,5 ±1,7 14,5 ± 1,0 1,3 ± 0,2 5,63 ± 0,03 0,52 ± 0,03

Формирование комплекса веществ в виноградной ягоде, обуславливающих качество вина, зависит не только от сорта винограда и технологии изготовления вина, но и воздействия почвенных и микроклиматических факторов. Влияние последних приводит к появлению специфических характеристик, позволяющих оценить региональную принадлежность вин. Возможность использования показателя АОА для оценки региональной принадлежности вин отрабатывали на образцах «Каберне» и «Мерло», изготовленных из винограда, выращенного в Темрюкском и Анапском районах Краснодарского края (образцы предоставлены АЗОСВиВ). Выбор образцов обусловлен тем, что для них известны технология производства, сорт винограда и место его произрастания.

Анализ полученных результатов позволил выявить следующие зависимости: значения АОА для групп вин «Каберне» выше по сравнению с группой вин «Мерло», а внутри каждой группы данный показатель выше для вин, приготовленных из винограда, выращенного в предгорной части. Подобная зависимость наблюдалась также при анализе результатов суммарного содержания полифенолов по Фолину-Чиокальтео (рис. 6). Исходя из вышеизложенного можно предположить, что величина АОА может быть использована при комплексной оценке вин по региональной принадлежности.

■ АОА

8 1 шПолифено...

6 1 ш Я

2 О

м М М м М К- К- К- к- К-8 к-3 4 1 6 9 2 2К 3 5 7 г.Р Равнинная Предгорная Равнинная Предгорная часть часть часть часть

Мерло Каберне

Рисунок 6 - Изменение АОА и суммарного содержания полифенолов для групп вин «Каберне» и «Мерло» в зависимости от территории возделывания винограда

Выводы:

1. На основе анализа существующих подходов и проведенных экспериментальных исследований выявлены особенности оценки суммарного содержания антиоксидантов в винах с применением метода FRAP. На модельных смесях антиоксидантов изучена природа спектроскопического аналитического сигнала, обусловленная взаимодействием АО с комплексным реагентом с образованием одного и того же продукта реакции - фенантролинатного или дипиридильного комплекса железа (П).

2. Установлено, что систематические погрешности анализа формируются за счет разной чувствительности обобщенного аналитического сигнала к индивидуальным антиоксидантам и обусловлены разной стехиометрией и разной скоростью однотипных фотометрических реакций взаимодействия антиоксидантов с окислителем; предложены способы их снижения. Установлена стехиометрия реакции антиоксидантов с индикаторной системой, найдены коэффициенты чувствительности определения антиоксидантов и показано, что они снижаются в ряду КВ>ГК>ПКК>РТ>АК~ФК~КТ.

3. Обоснованы и реализованы способы выявления статистически значимых отклонений от аддитивности при определении суммарного содержания антиоксидантов в винах по методу FRAP. Показана возможность использования t-критерия для проверки аддитивности светопоглошения (на примере смесей антиоксидантов). Изучение аддитивности светопоглошения смесей АО с помощью статистических моделей, полученных при проведении полного факторного эксперимента, дает информацию о процессах, протекающих в растворах, и позволяет оптимизировать соответствующие методики спектроскопического анализа. Установлено, что отклонения от аддитивности для некоторых смесей связаны с нехваткой окислителя.

4. Исследовано влияние различных факторов при определении суммарного содержания антиоксидантов в винах и установлено, что при времени экспозиции 60 мин вклад кинетического фактора в формирование аналитического сигнала определяется конкурирующим взаимодействием антиоксидантов с окислителем; найдены оптимальные содержания комплексного реагента и диапазон рН, при которых формируется максимальный аналитический сигнал.

5. Показана возможность снижения систематической погрешности за счет выражения суммарного содержания антиоксидантов в винах в «нормальных» концентрациях и использования в качестве вещества-стандарта - АК. Установлено, что для вин определяемый показатель

характеризует суммарное содержание восстановителей фенольной природы и близок по значению к АОА.

6. Установлена связь между АОА и другими суммарными показателями (суммарным содержанием полифенолов, интенсивностью окраски, содержанием лейкоантоцианов) состава и качества вин. Оценен вклад антоцианов, выделенных из сухого красного виноматериала, в суммарный показатель АОА.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Цюпко, Т.Г. Оценка суммы биологически активных веществ фитоматериалов по величине их антиоксидантной активности / Т.Г. Цюпко, З.А. Темердашев, О.Б. Воронова, H.A. Николаева, H.A. Фролова // «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения»: тез. докл. научно-практической конф - Украина, АР Крым, п. Новый Свет. - 25-30 мая 2009. - С. 479.

2. Николаева, H.A. Определение суммарной величины антиоксидантной активности вин и виноматериалов / H.A. Николаева, Т.Г. Цюпко, О.Б. Воронова, З.А. Темердашев // "Аналитика России»: тез. докл. Ш Всероссийской конференции с международным участием - Краснодар. -28 сентября - 3 октября 2009. - С. 410.

3. Цюпко, Т.Г. Оценка суммы биологически активных веществ фитоматериалов по величине антиоксидантной активности / Т.Г. Цюпко,

3.А. Темердашев, О.Б. Воронова, H.A. Николаева, H.A. Фролова // Вестник Казахского национального университета. Серия Химия. - 2010. -Т.60, №4. - С. 343-345.

4. Цюпко, Т.Г. Изучение аддитивности аналитического сигнала смесей антиоксидантов в ред-окс системе железо(Ш)-фенантролин / Т.Г. Цюпко, H.A. Николаева, З.А. Темердашев, О.Б. Воронова // «Аналитическая химия - новые методы и возможности»: материалы съезда аналитиков России - Москва. - 26-30 апреля, 2010. - С. 90-91.

5. Вершинин, В.И. Методология спектрофотометрического анализа смесей органических соединений. Применение статистических моделей / В.И. Вершинин, И.В. Власова, Т.Г. Цюпко, H.A. Николаева, М.А. Харькова // Журн. аналит. химии. - 2011. - Т. 66, № 7. - С. 708-715.

6. Цюпко, Т.Г. Определение суммарного содержания антиоксидантов методом FRAP / Т.Г. Цюпко, И.С. Петракова, Н.С. Бриленок, H.A. Николаева, Д.А. Чупрынина, З.А. Темердашев, В.И. Вершинин // Аналитика и контроль. - 2011. - Т. 15, № 3. - С. 287-298.

7. Цюпко, Т.Г. Оценка региональной принадлежности вин по комплексу обобщенных показателей / Т.Г. Цюпко, О.Б. Воронова, H.A. Николаева, Д.А. Чупрынина // XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной

химии: тез. докл. в 4т. - Волгоград. - 25-30 сентября 2011г. - Т 4. - С. 431.

8. Цюпко, Т.Г. Изучение антиоксидантной активности антоцианов, выделенных из виноградного вина / Т.Г. Цюпко, H.A. Николаева, О.Б. Воронова, Д.А. Чупрынина // «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии»: тез. докл. Ш Всероссийского симпозиума с международным участием - Краснодар. - 2-8 октября 2011. - С. 280.

9. Цюпко, Т.Г. Изучение антиоксидантной активности антоцианов, выделенных из виноградного вина / Т.Г. Цюпко, H.A. Николаева, О.Б. Воронова, Д.А. Чупрынина // Известия высших учебных заведений. Пищевая технология. - 2011. - № 5-6. - С. 13-16.

10. Цюпко, Т.Г. Оценка антиоксидантной активности пищевых продуктов с использованием индикаторной системы на основе фенантролинатных комплексов железа / Т.Г. Цюпко, Д.А. Чупрынина, H.A. Николаева, О.Б. Воронова, З.А. Темердашев // Известия высших учебных заведений. Пищевая технология. — 2011. - № 5-6. - С.84-87.

11. МУ 08-47/275 «Спектрофотометрический метод измерений антиоксидантной активности пищевых продуктов». Внесена в Федеральный реестр методик измерений под № ФР.1.31.2011.0197.

Автор выражает благодарность док. хим. наук Темердашеву З.А., док. хим. наук Вершинину В.И. и канд. хим. наук Вороновой О.Б. за интерес, проявленный к работе, и участие в обсуждении результатов.

Николаева Наталья Александровна ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ АНТИОКСИДАНТОВ В ВИНАХ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЖЕЛЕЗОСОДЕРЖАЩИХ ИНДИКАТОРНЫХ СИСТЕМ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 12.11.2011. Формат 60 * 84 1 ,б. Бум. тип. № 1. Печать трафаретная. Тираж 100 экз. Заказ № 918.

350040 г. Краснодар, ул. Ставропольская, 149 Центр «Универсервис», тел. 2199-551

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Николаева, Наталья Александровна

Введение.

1 Аналитический обзор.

1.1 Антиоксиданты и их классификация.

1.2 Антиоксиданты вина. Фенольные соединения.

1.3 Методы спектрофотометрической оценки суммарного содержания антиоксид антов.

1.3.1 Спектрофотометрические методы определения антиоксидантной активности вин.

1.4 Неаддитивность светопоглощения многокомпонентных систем при спектрофотометрическом анализе.

2 Экспериментальная часть.

2.1 Исходные реактивы, материалы и оборудование.

2.2 Приготовление рабочих растворов.

2.2.1 Приготовление комплексного реагента.

2.2.2. Приготовление стандартного и рабочего раствора Fe(II) с концентрацией 0,01 моль/ дм.

2.2.3. Приготовления стандартного раствора нитрата калия с концентрацией 2 моль/дм.

2.2.4 Приготовление стандартных (головных) и рабочих растворов антиоксидантов.

2.3 Методика определения антиоксидантной активности вин.

2.4 Методика определения фенольных соединений в вине.

2.5 Методика определения лейкоантоцианов.

2.6 Методика определения цветовых характеристик вина.

3 Результаты и их обсуждение.

3.1 Исследование аддитивности аналитического сигнала при определении суммы антиоксидантов полифенольного типа.

3.2 Выявление влияние различных факторов при определении суммарного содержания антиоксидантов методом FRAP.

3.2.1 Оптимизация условий анализа при определении антиоксидантов

3.2.2 Чувствительность определения антиоксидантов и стехиометрия реакций.

3.3 Определение антиоксидантой активности вин.

3.4 Изучение антиоксидантной активности антоцианов, выделенных из виноградного вина.

3.5 Антиоксидантная активность вин. Прикладные аспекты.

Выводы.

Введение диссертация по химии, на тему "Определение суммарного содержания антиоксидантов в винах с применением железосодержащих индикаторных систем"

В процессах обеспечения технологического контроля качества вин и виноматериалов необходимо выделить проблему - оценка суммарного содержания аналитов, родственных в структурном или функциональном отношении. С этой точки зрения актуальным является определение суммарного содержания антиоксидантов (АО) и близкого к нему интегрального показателя - антиоксидантной активности (АОА) исследуемого объекта, учитывающего не только содержание, но и удельную активность каждого компонента в нем. Антиоксидантов очень много, их строение и свойства весьма разнообразны, а механизм действия во многих случаях неизвестен. Весьма проблематичной является задача определения этих веществ на низком концентрационном уровне (10 -а их разбавленные растворы неустойчивы из-за окисления кислородом воздуха. В настоящее время наиболее популярны методы оценки антиоксидантной активности, основанные на ингибировании окисления различных липидных субстратов с последующим определением продуктов окисления. Соответствующие методики длительны и дают плохо воспроизводимые результаты, поэтому разработка новых методик, сочетающих экспрессность с достоверностью и высокой воспроизводимостью данных, остается актуальной задачей. При оценке суммарного содержания антиоксидантов необходимо учитывать особенности состава анализируемого объекта.

АО, например методом FRAP {ferric reducing/antioxidant power), 5 проявляются все проблемы, которые обычно осложняют анализ неразделенных смесей, а именно: не полностью известный качественный состав, наложение сигналов разных аналитов или дериватов, разная чувствительность их определения, непредсказуемое влияние посторонних веществ, неаддитивность аналитического сигнала. В отличие от хорошо изученных аналитиками методов определения суммы углеводородов или фенолов, методы спектрофотометрического определения АО исследованы недостаточно. Неизвестны источники систематических погрешностей, а часто и метрологические характеристики методик. Из вышеизложенного следует, что исследования в области определения суммарного содержания антиоксидантов и антиоксидантной активности вин актуальны как в практическом, так и теоретическом плане.

Настоящая работа выполнялась при финансовой поддержке РФФИ (грант № 09-03-96529)

В соответствии с целью исследования в работе решались следующие задачи: ,

- оценить влияние различных факторов при определении суммарного содержания антиоксидантов с использованием индикаторной системы Ре(Ш)-органический реагент (1,10-фенантролин или 2,2'-дипиридил), оптимизировать условия анализа;

- разработать способ выявления отклонений от аддитивности аналитического сигнала для смесей антиоксидантов методом FRAP с использованием хемометрических подходов;

- изучить взаимосвязь между суммарным содержанием антиоксидантов и величиной интегрального показателя - АОА, 6 учитывающего не только содержание, но и удельную активность каждого компонента в исследуемом объекте.

В ходе решения поставленных задач в диссертационной работе изучены особенности оценки суммарного содержания антиоксидантов в винах с применением метода FRAP; установлено, что систематические погрешности формируются за счет разной чувствительности обобщенного аналитического сигнала к индивидуальным антиоксидантам, что обусловлено разной стехиометрией и разной скоростью однотипных фотометрических реакций; предложены способы снижения этих погрешностей.

Предложен алгоритм выявления и прогнозирования статистически значимых отклонений от аддитивности при определении суммарного содержания антиоксидантов в винах по методу FRAP, а также способы снижения соответствующих систематических погрешностей.

Для красных сухих вин выведено уравнение, описывающее взаимосвязь антиоксидантной активности с другими суммарными показателями (суммарное содержание полифенолов, интенсивность окраски вина, содержание лейкоантоцианов). Показана возможность использования показателя антиоксидантная активность / суммарное содержание полифенолов в схеме комплексной оценки качества вин.

Заключение диссертации по теме "Аналитическая химия"

Выводы

3. Обоснованы и реализованы способы выявления статистически значимых отклонений от аддитивности при определении суммарного содержания антиоксидантов в винах по методу FRAP. Показана возможность использования t-критерия для проверки аддитивности светопоглошения (на примере смесей антиоксидантов). Изучение аддитивности светопоглощения смесей АО с помощью статистических моделей, полученных при проведении полного факторного эксперимента, дает информацию о процессах, протекающих в растворах, и позволяет оптимизировать соответствующие методики спектроскопического анализа. Установлено, что отклонения от аддитивности для некоторых смесей связаны с нехваткой окислителя.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Николаева, Наталья Александровна, Краснодар

1. Pszczola, Donald Е. Antioxidants; from preserving food quality to quality of life/DonaldE. Pszczola//FoodTechnol.-2001. Vol. 55, № 6. - P. 51-59.

2. Huang, Dejian The chemistry behind antioxidant capacity assays / Dejian Huang, Boxin Ou, Ronald L. Prior // J. Agric. Food Chem. 2005. - Vol 53, № 6. -P. 1841-1856.

3. Кузнецов, В.В. Физиология растений / В.В. Кузнецов, Г.А. Дмитриева. -М.: Высш. школа. 2005. - 736 с.

4. Максимова, Т. Еще раз об антиоксидантной терапии / Т. Максимова // журн. наука и жизнь. -2000, №8. С. 3-6.

5. Биохимия: Учеб. для вузов / Под ред. Е.С. Северина. 2003. - 779с.

6. Mimica-Dukic, N. М. Antioxidant activity of plant phenolic. Flavonoids and phenolic acids / N. M. Mimica-Dukic, M. M. Budincevic, B. A. Mihajlovic, O. S. Gasic // J. Serb. Chem. Soc. -1994. Vol. 59. - № 11. - P. 823-828.

7. Абдулин, И.Ф. Органические антиоксиданты как объекты анализа / И.Ф. Абдулин, Е.Н. Турова, Г.К. Будников // Зав. лаборатория. Диагностика материалов. 2001. - Т.67, №6. - С. 3-13.

8. Зайцев, В.Г. Связь между химическим строением и мишенью действиякак основа действия классификации антиоксидантов прямого действия / В.Г.87

9. Зайцев, О.В. Островский, В.И. Закревский // Эксперим. клин, фармакол. -2003. Т.66, № 4. - С. 66-70.

10. Лапин, А. А. Антиоксидантные свойства продуктов растительного происхождения / А. А. Лапин, М. Ф. Борисенков, А. П. Карманов и др. // Химия растит, сырья 2007. - № 2. - С. 79-83.

11. Будников, Г.К. Антиоксиданты как объекты биоаналитической химии / Г.К. Будников, Г.К. Зиятдинова // журн. аналит. химии. 2005. - Т. 60, № 7. -С. 678-691.

12. Чугасова, В. А. Антиоксиданты природные и синтетические / В. А. Чугасова //Косметика и мед. 1998. - № 2. - С. 18-23.

13. Antolovich, М. Methods for testing antioxidant activity / M. Antolovich, P. D. Prenzler, E. Patsalides, S. McDonald, K. Robards // Analyst. 2002. -V. 127, №1. -P. 183-198.

14. Базарова, Ю.Г. Ингибирование радикального окисления пищевых жиров флавоноидными антиоксидантами / Ю.Г. Базарова, Б.Я. Веретнов // Вопросы питания. 2004. - №3. - С. 35-42.

15. Wright, J.S. Predicting the activity of phenolic antioxidants: theoretical methods, analysis of substituent effects, and application to major families of antioxidants'/ J.S. Wright et. al. // J. Am. Chem. Soc. 2001. - Vol. 123, № 6. -P.1173-1183/

16. Валуйко, Г.Г. Биохимия и технология красных вин / Г.Г. Валуйко. М.: Пищ. промышленность, 1973.- 295с.

17. Кишковский, 3. Н. Химия вина / З.Н. Кишковский. М.: Пищ. промышленность, 1976. - 311с.

18. Тутельян, В.А. Биологически активные вещества растительногопроисхождения. Фенольные кислоты: распространенность, пищевые88источники, биодоступность / В.А. Тутельян, Н.В. Лашнева // Вопросы питания. 2008. - Т. 77, № 1. - С. 4-19.

19. Tomas-Baberian, F.A. Dietary hydroxybenzoic acid derivatives-nature, occurrence and dietary burden/ F.A. Tomas-Baberian, M. N. Clifford // J. Sci. Food. Agric. 2000. - Vol. 80. - P. 1024-1032.

20. Глонти, T.A. Антиоксидантная способность вин, приготовленных из белого сорта винограда кахури мцвивани / Т.А. Глонти, З.Т. Глонти // Магарач. Виноградарство и виноделие. 2010. - №3. - С. 36-38.

21. Блажей, А Фенольные соединения растительного происхождения / А. Блажей, Л. Шутый. -М.: Мир. 1977. - 240с.

22. Георгиевский, В. Г. Биологически активные вещества лекарственных растений / В.Г. Георгиевский, Н.Ф. Комиссаренко, С.Е. Дмитрук. -Новосибирск:Наука. -1990. 350с.

23. Lapidot, T. pH-dependent forms of red wine anthocyanins as antioxidants / T. Lapidot, S. Harel, B. Akiri, R. Granit, J. Kanner // J. Agric. Food Chem. -1999. -Vol. 47.-P. 67-70.

24. Дурмишидзе, C.B. Дубильные вещества и антоцианы виноградной лозы и вина / С.В. Дурмишидзе. М.: Изд. академии наук СССР, 1955. - 326с.

25. Семенов, А.А. Очерк химии природных соединений / А.А. Семенов. -Новосибирск: «Наука», 2000. 664 с.

26. Pietta, Pier-Giorgio Flavonoids as Antioxidants / Pier-Giorgio Pietta // J. Nat. Prod. 2000. - Vol.63, № 7. - P. 1035-1042

27. Franke, A.A. Quantitation of phytoestrogens in legumes by HPLC / A.A. Franke, L. J. Custer, С. M. Cerna, К. K. Narala // J. Agric. Food Chem. -1994-V. 42, №9. P. 1905-1913.

28. Justus V. Verhagen, Guido R. M. M. Haenen, Aalt Bast. Nitric Oxide Radical Scavenging by Wines // J. Agrie. Food Chem. 1996 - V. 44 - P. 3733 - 3734.

29. Aruoma, O.I. Characterization of food antioxidants, illustrated using commercial garlic and ginger preparations / O.I. Aruoma, J.P.E. Spencer, D. Warren, P. Jenner, J. Butler, B. Halliwell // Food Chem. 1997. - V.60, №2. -P. 149-156.

30. Y.H. Chu, C.L. Chang, H.F. Hsu // J. Agrie. Food Chem. 2000. - Vol. 48, №2. - P. 561.

31. Fernández-Pachón, M.S. Antioxidant activity of wines and relation with their polyphenolic composition / M.S. Fernández-Pachón, D. Villaño, M.C. Garcaía-Parrilla, A.M. Troncoso // Analytica Chim. Acta. 2004. - V.513. -P.l 13-118.

32. Гелетий, Ю.В. Определение суммарной концентрации и активности антиоксидантов в пищевых продуктах / Ю.В. Гелетий, Ж.Ж.А. Балавуэн, О.Н. Ефимов, B.C. Куликова // Биоорганическая химия. 2002. - Т. 28, № 6. — С. 551-566.

33. Rice-Evans, С.Е. Total antioxidant status in plasma and body fluids/ C.E. Rice-Evans, N.J. Miller //Methods enzymol. 1994. -V. 234. - P. 279-293.

34. Gramza, A Tea extracts as free radical scavengers / A. Gramza, K. Pawlak-Lemancska, J. Korczak, E. Wsowicz, M. Rudzinska // Polish J. of Environmental Studies.-2005.-Vol. 14,№ 16.-P. 861-867.

35. Kaur, С. Antioxidants in fruits and vegetables the millennium's health / C. Kaur, H. C. Kapoor // International Journal of Food Science and Technology. -2001.-V.36, №7.-P. 703-725/

36. Leonardi, C. Antioxidative activity and carotenoid and tomatine contents in different typologies of fresh consumption tomatoes / C. Leonardi, P. Ambrosino, F. Esposito, V. Fogliano // J. Agric. and Food Chem. 2000. - Vol. 48. - № 10- P. 4723-4727.

37. Prior, Ronald L. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements / Ronald L. Prior, Xianli Wu, Karen Schaich // J. Agric. Food Chem. 2005. - V. 53, №10. - P. 4290-4302.

38. Strube, M. Pitfalls in a methods for assessment of total antioxidant capacity /. M. Strube, G.R.M. Haenen, H. van den Berg, A. Bast // Free Radical Research. -1997.-V.26.-P. 515-521.

39. Re, R. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay / R. Re, N. Pellegrini, A. Proteggente, A. Pannala, M. Yang, C. Rice-Evans // Free Radical Biol. Med. 1999. - V.26. - P. 1231-1237.

40. Хасанов, B.B. Методы исследования антиоксидантов / B.B. Хасанов, Г.Л: Рыжова, Е.В. Мальцева // Химия растительного сырья. 2004. - №3. — С. 63-75. !

41. Yen, G.-C. Antioxidant and pro-oxidant properties of ascorbic acid and gallic acid / G.-C. Yen, P.-D. Duh, H.-L. Tsai // Food Chem. 2002. - Vol. 79. - № 3 -P. 307-313.

42. De Gaulejac, N. S.-C. Comparative study of polyphenol scavenging activities assessed by different methods / N. S.-C. de Gaulejac, C. Provost, N. Vivas -II J. Agric. and Food Chem. 1999. - Vol. 47.-№ 2 - P. 425-431.

43. Fukumoto, L. R. Assessing antioxidant and prooxidant activities of phenolic compounds / L. R. Fukumoto, G. Mazza // J. Agrie, and Food Chem. 2000. - Vol. 48.-№8.-P. 3597-3604.

44. Villano, D. Comparison of antioxidant activity of wine phenolic compounds and metabolites in vitro / D. Villaño, M. S. Fernández-Pachón, A. M. Troncoso, M. C. García-Parrilla//Anal. Chim. Acta. -2005. Vol. 538. -№ 1-2 - P. 391-398.

45. Rapisarda, P. Antioxidant effectiveness as influenced by phenolic content of fresh orange juices / P. Rapisarda, A. Tomaino, R. Lo Cascio, F. Bonina, A. De Pasquale, A. Saija // J. Agrie, and Food Chem. 1999. - Vol. 47. - № 1.1. -P. 4718-4723.

46. Shyamala, B. N. Leafy vegetable extracts antioxidant activity and effect on storage stability of heated oils / B. N. Shyamala, S. Gupta, A. J. Lakshmi, J. Prakash // Innov. Food Sci. and Emerg. Technol. - 2005. - Vol. 6. - № 2 -P. 239-245.

47. Choi, H.-S. Radical-scavenging activities of citrus essential oils and their components: detection using l,l-diphenyl-2-picrylhydrazyl / H.-S. Choi, H.'S. Song, H. Ukeda, M. Sawamura // J. Agrie, and Food Chem. 2000. - Vol. 48. - № 9-P. 4156-4161.

48. Choi, Y. M. Antioxidant and antimicrobial activities of propolis from several regions of Korea / Y. M. Choi, D. O. Noh, S. Y. Cho, H. J. Suh, K. M. Kim, J. M. Kim//LWT. 2006. - Vol. 39. - № 7 - P. 756-761.

49. Yu, L.' Antioxidant properties of hard winter wheat extracts / L. Yu, Scott Haley, J. Perret, M. Harris // Food Chem. 2002. - Vol. 78. - № 4 - P. 457-461.

50. Karadag, A. Review of methods to determine antioxidant capacities / A. Karadag, B. Ozcelik, S. Saner // Food Anal. Methods. 2009. - №2. - P. 41-60.

51. Gorinstein, S. Characterization of blond and Star Ruby (red) Jaffa grepefruits using antioxidant and electrophoretic methods / S. Gorinstein, J. Drzewiecki, Y.-S. Park // Int. J. Food Sci. and Technol. 2006. - Vol. 41, № 3. - P. 311-320/

52. Fogliano, V. Method for measuring antioxidant activity and its application to monitoring the antioxidant capacity of wines / V. Fogliano, V. Verde, G. Randazzo, A. Ritieni //J. Agrie. Food Chem. 1999. -V. 47, №3. - P. 1035-1040.

53. Benzie, I.F.F. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of "antioxidant power": the FRAP assay / I.F.F. Benzie, J.J. Strain // Anal. Biochem. -1996. V.239 - P.70-76.

54. Katalinic, V. Antioxidant effectiveness of selected wines in comparison with (+)-catechin / V. Katalinic et. al. // Food Chem. 2004. - Vol. 86 , № 4. -P. 593-600.

55. Berker, K.I. A novel antioxidant assay of ferric reducing capacity measurement using ferrozine as the colour forming complexation reagent / K.I.' Berker, K. Guclu, B. Demirata, R. Apak // Anal. Methods. 2010. - №2. -P. 1770-1778.

56. Kleszczewsky, T. Flow injection spectrophotometric determination of L-ascorbic acid in biological matters / T. Kleszczewsky,E. Kleszczewsky // J. of pharmaceuticaland biomedical analysis. 2002. - Vol. 29, № 4. - P. 755-759.

57. Логинова, Л.П. Метрологические характеристики обнаружения восстановителей с реагентами, иммобилизованными в желатиновой пленке / Л.П. Логинова, О.Ю. Коновалова // Вюник Харювського национального университету. -2007. Т. 15(38), № 770. С. 90-98.

58. Kosar, М. Antioxidant activity and phenolic composition of sumac (Rhus coriaria L.) exstracts / M. Kosar, B. Bozan, F. Temelli, K.H.C. Baser // Food Chem. 2006.

59. Pulido, R. Antioxidant activity of dietary polyphenols as determined by a modified ferric reducing / antioxidant power assay / R. Pulido, L. Bravo, F. Saura-Calixo // J. Agric. Food Chem. 2000. - V.48. - P. 3396-3402.

60. Arnous, A. Correlation of pigment and flavanol content with antioxidant properties in selected aged regional wines from Greece / A. Arnous, D. P. Makris, P. Kefalas //J ofFood Comp. and Anal. 2002. - Vol. 15. -№ 6 - P. 655-665.

61. Benzie, I.F.F. Total antioxidant capacity of teas by the ferric reducing / antioxidant power assay / I.F.F. Benzie, Y.T. Szeto // J. Agric. Food Chem. 1999. - V.47, №2. - P. 633-636.

62. Shui, G Residue from star fruit as valuable source for functional food ingredients and antioxidant nutraceuticals / G. Shui, L. P. Leong // Food Chem. -2006. Vol. 97. - № 2 - P. 277-284.

63. Hinneburg, I. Antioxidant activities of extracts from selected culinary herbs and spices / I. Hinneburg, H.J. D. Dorman, R. Hiltunen // Food Chem. 2006. - Vol. 97. -№ 1 -P. 122-129.

64. Apak, R. Comparative evaluation of various total antioxidant capacity assaysapplied to phenolic compounds with the CURPAC assay / R. Apak, K. G. Guclu,. » / ■

65. B. Demirata, M. Ozyiirek, S.E. Celik, B. Bektasoglu, K.I. Berker, D. Ozyurt // Molecules. 2007. - №12. - P. 1496-1547.

66. Zaporozhets, O.A. A new test method for the evaluation of total antioxidant activity of herbal products / O.A. Zaporozhets, O.A. Krushynska, N.A. Lipkovska, V.N. Darvinchenko // J. Agric. Food Chem. 2004. - V. 52. - P. 21-25.

67. Singleton, V.L. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents / V.L. Singleton, J.A. Rossi // Amer. J. of Enology and Viticulture. -1965.-V.16, №3.-P. 144-158.

68. Stratil, P. Comparison of the phenolic content and total antioxidant activity in-wines as determined by spectrophotometric methods / P. Stratil, V. Kuban, J. Fojtova // Czech. J. Food Sci. 2008. - V. 26, №4 - P. 242-253.

69. Mitic, M.N. Antioxidant capacities and phenolic levels of different varieties of Serbian white wines / M.N. Mitic, M.V. Obradovic, Z.B. Grahovac, A.N. Pavlovic7/ Molecules. 2010.-№15.-P. 2116-2027.

70. Villaño, D. The antioxidant activity of wines determined by the ABTS+ method influence of sample dilution and time / D. Villaño, M.S. Fernández-Pachón, A.M. Troncoso, M.C. García-Parrilla // Talanta. 2004. - V.64, №2. - P. 501-509

71. Girotti, S. Comparicon of analytical methods in determining total antioxidant capacity in red wine / S. Girotti, L. Bolelli, R. Budini, G. Arfelli // Anal. Lett -2002.- Vol. 35, №4. P. 747-758.

72. Carlsen H. M. The total antioxidant content , of more than 3100" foods, beverages, spices, herbs and supplements used worldwide / H. M. Carlsen, B.L. Halvorsen et. al. // Nutrition J. 2010. - 9:3.

73. Власова, И.В. Спектрофотометрический анализ смесей витаминов с применением метода множественной линейной регрессии / И.В. Власова, А.С. Шелпакова, Е.Н. Масякова // Аналитика и контроль. 2009. -Т. 13, № 2. ' -С. 86-90.

74. Бернггейн,И.Я., Каминский, Ю.А. Спектрофотометрический анализ в органической химии. Д.: Химия, 1986. - 200 с.

75. Антонова, Т.В. Трифенилметановые красители как аналитические реагенты для фотометрического определения полимерных флокулянтов / Т.В. Антонова, В.И. Вершинин, Ю.М. Дедков //Журн. аналит. химии. 2005. Т.60, ' №3.-С. 278-283.

76. Кац, М.Д О количественном критерии для выбора оптимальных спектральных позиций при анализе многокомпонентных смесей по спектрам поглощения / М.Д. Кац, М.Я. Розкин // Зав. лаборатория 1972. - Т. 38, № 6. -С.688-690

77. Власова. И.В. Возможность определения компонентов бинарных смесей методом Фирордта с погрешностями не превышающими заданный предел / И.В. Власова, В.И. Вершинин // Журн. аналит. химии. 2009. - Т.64, №6. - С. 571-576.

78. Власова, И.В. Предельно допустимые отклонения от аддитивности при фотометрическом анализе двухкомпонентных смесей методом Фирордта / И.В. Власова, H.A. Исаченко, A.B. Шилова // Журн. аналит. химии. 2010. — Т.65, №5. - С. 481-487.

79. Илларионова, Е.А. Применение модифицированного метода Фирордта в анализе таблеток «Ибуклин» / Е.А. Илларионова, А.Н. Теплых // сибирский мед. журн. 2008. - №8. - С. 29-32.

80. Родионова, O.E. Хемометрика в аналитической химии/ O.E. Родионова, A.JI. Померанцев// Институт химической физики им. H.H. Семёнова РАН. -М., 2008.-61с.

81. Родионова, O.E. Хемометрика: достижения и перспективы/ O.E. Родионов, А.Л. Померанцев// Успехи химии. 2006. - №75. - С.302-317.

82. Мехузла, H.A. Сборник международных методов анализа и оценки вин и сусел.// Пищевая промышленность. М. - 1993. - 320с.

83. Власова, И.В. Повышение точности определения компонентов в двухкомпонентных смесях по методу Фиррордта// Вестник Омского университета. 2006. - №2. - С.53-55.

84. Власова, И.В. Методология спектрофотометрического анализа смесей органических соединений. Проблема неаддитивности светопоглощения / И.В. Власова, В.И. Вершинин, Т.Г. Цюпко // журн. аналит. химии. 2011.- Т. 66, № 1.-С. 25-33.

85. Цюпко, Т.Г. Определение суммарного содержания антиоксидантов методом FRAP / Т.Г. Цюпко, И.С. Петракова, Н.С. Бриленок, H.A. Николаева, Д.А. Чупрынина, З.А. Темердашев, В.И. Вершинин // Аналитика и контроль. 2011. - Т. 15, № 3. - С. 287-298.

86. Цюпко, Т.Г. Изучение антиоксидантной активности антоцианов, выделенных из виноградного вина / Т.Г. Цюпко, H.A. Николаева, О.Б. Воронова, Д.А. Чупрынина // Известия высших учебных заведений. Пищевая технология.-2011.-№5-6.-С. 13-16.