Поляризационная пикосекундная лазерная микроспектрофлуорометрия гематопорфина в биологических объектах тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.21 ВАК РФ

. МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗЕАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Физический факультет

На правах рукописи УДК

535.822.5:621.373.826

ЛОБАНОВ Олег Владимирович

ПОЛЯРИЗАЦИОННАЯ ПИКОСЕКУНЦНАЯ ЛАЗЕРНАЯ МИКРОСПЕКТРОФЛУОРОМЕТРИЯ ГЕМАТОПОРФИРИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

01.04.21 - Лазерная физика

• Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук "

Москва - 2992

Работа выполнена на кафедре общей физики и волновых процессов физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель Официальные оппоненты

Ведущая организация

- доктор физ.- мат. наук, профессор Н.И. Коротеев

- доктор химических наук, ведущий научный сотрудник, зав. лабораторией А.П. Савицкий

- кандидат физ.- мат. наук, старший научный сотрудник В.В. Квач

- Государственный оптический институт им. С.И. Вавилова, Санкт-Петербург

Защита состоится "<?с?" ОКГЯОрЯ_1992 г. в № часов в аудитории _ КНР _на заседании Специализированного Совета

К.053.05.21 по адресу: 119899, ГСП, Москва, Воробьевы горы, МГУ, физический факультет, корпус нелинейной оптики.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физическогофакультета МГУ.

Автореферат разослан " СвНТЯ&рЯ

. 1992 г.

Ученый секретарь у '„ | * „ I с?

Специализированного Совета БС.(1>53Л5:21 % & у /■; Ц, кандидат физ.- мат. наук,

\-V.J '; А.И. Гомонова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы.

Развитие в последнее десятилетие техники счета одиночных фотонов с временным разрешением позволило добиться значительного прогресса в изучении быст-ропротекающих процессов.Одним из наиболее чувствительных и информативных методов исследования короткоживуших возбужденных состояний органических молекул является кинетическая флуоресцентная спектроскопия, предоставляющая информацию о структуре электронных уровней и релаксации энергии электронного возбуждения. Благодаря высокой чувствительности флуоресцентной спектроскопии оказывается возможным изучение структуры органических молекул в возбужденных электронных состояниях не только в растворах, но и непосредственно в биологических объектах. Это открывает широкие возможности для флуоресцентной диагностики биологически важных молекул в тканях, клетках и других модельных системах, что имеет важное значение для медицинских приложений. Применение методов поляризационной флуоресцентной спектроскопии позволяет получать информацию о размерах и форме флуорофоров, а также оценить вязкость их микроокружения.

Существенно расширяются возможности таких применений благодаря интенсивному развитию в последние годы техники лазерной микроскопии, которая позволяет фокусировать излучение в предельно малые, дифракционно ограниченные длиной волны света, размеры. Представляет большой интерес объединение такой фокусировки в пространстве и времени с возможностями поляризационной спектроскопии. Плодотворным оказалось использование методов флуоресцентной мик-роспектрофлуорометрии, и в особенности ее поляризационного варианта, при исследовании взаимодействия, локализации!! агрегации молекул фотосенсибилизаторов в различных биосистемах. Несмотря на интенсивные исследования, проводимые впоследние 10 лет, до сих пор не существует единого понимания фотохимических реакций, протекающих при использовании порфиринов в фотодинамической терапии рака (ФДТ). Наиболее вероятным является путь фотодинамического разрушения, сопровождающийся генерацией синглетного кислорода, эффективность которой зависит от квантового выхода триплетного состояния красителей. Различия в механизмах проникновения мономерной, димерной и олигомерной фракций порфириновых препаратов в клетки, неоднородность их распределения, процессы агрегации и дезагрегации при взаимодействии с клеточным субстратом вкупе с различной эффективностью генерации синглетного кислорода создают сложную и противоречивую картину механизма сенсибилизированной фотодеструкции.

Вследствие этого, изучение влияния агрегации и дезагрегации на фотопроцессы порфиринов является важным и актуальным.

Наиболее адекватной экспериментальной методикой для решения этой задачи является стационарная поляризационная микрофлуорометрия, дающая пространственную картину распределения различных компонет" порфириновых препаратов в клетке, дополненная более детальной информацией о динамике вращения молекул порфирина различной степени агрегации, полученной на лазерном поляризационном микрофлуориметре с пикосекудным временным разрешением.

Цель и задачи диссертационной работы.

Целью диссертационной работы было создание адекватной экспериментальной техники с высоким пространственным и временным разрешением и развитие метода лазерной пикосекундной поляризационной микрофлуорометрии для изучения сложных органических молекул в растворах, клетках и модельных биологических системах. Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:

1. Создание автоматизированного пикосекундного лазерного поляризационного микроспектрофлуориметра на основе метода счета одиночных фотонов для исследования биологически важных молекул методами флуоресцентной спектроскопии.

2. Разработка методики обработки экспериментальных результатов, полученных методами поляризационной флуоресцентной спектроскопии и счета одиночных фотонов с временным разрешением с учетом ошибок и погрешностей последнего.

3. Исследование агрегационных процессов гематопорфирина при помоши разрешенной во времени кинетической поляризационной спектроскопии в растворах, липосомах и одиночной живой клетке.

Научная новизна.

Разработан новый экспериментальный подход к исследованию динамики вращательного движения биомолекул непосредственно внутри одиночной живой клетки, основанный на использовании пикосекундного лазерного поляризационного флуоресцентного микроскопа.

Экспериментально обоснована возможность проведения поляризационных измерений с высоким пространствеш'шш разрешением. Разработана методика компенсации искажений, вносимых основными элементами оптической схемы, и выработан критерий оценки достоверности полученных результатов.

Впервые экспериментально измерена кинетика затухания поляризованных компонент флуоресценции гематопорфирина в различных частях живой клетки,-плазматической и ядерной мембранах и цитоплазме.

Разработано и использовано программное обеспечение для обработки экспериментальных результатов, использующее квазинепрерывное распределение времен затухания флуоресценции и метод неотрицательных наименьших квадратов для обработки кривых затухания флуоресценции и метод градиентного спуска для нахождения параметров анизотропии флуоресценции многокомпонентной смеси флуорофоров.

На основе теории деполяризации флуоресценции, обусловленной вращательной диффузией молекул, имеющих форму эллипсоида вращения, получена количественная оценка степени агрегации гематопорфирина в различных частях живой клетки.

Практическая ценность.

Полученные в настоящей диссертации результаты носят в основном прикладной характер. Полученные результаты и методика могут быть использованы в различных областях химии, биологии и медицины. Развитый в работе подход, основанный на поляризационной флуоресцентной спектроскопии с высоким временным и пространственным разрешением с последующим применением компьютерной обработки результатов и теории вращательной диффузии флуорофоров, открывает новые методические возможности для применения пикосекундной спектроскопии для решения широкого круга задач фотохимии и фотобиологии, в первую очередь позволяя по изменению времени вращательной корреляции получать информацию об изменениях размеров и формы молекул, вязкости микроокружения и подвижности флуоресцентно меченых белков.

Практическая ценность выполненной работы состоит в экспериментальной реализации лазерного поляризационного микроспектрофлуориметра, основанного на пикосекундном ЖЛ'АС-лазере с килогерцовой частотой повторения импульсов и системе регистрации по методу время-коррелированного счета фотонов, имеющего широкое применение для исследования широкого круга проблем, связанных с пространственным и временным разрешением, определением размера и формы флуорофоров, микровязкости липидных мембран, а также для задач диагностического характера в медицине.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оказалось возможный проведение измерений поляризованных компонент флуоресценции фотосенсибилизаторов с пикосекундным временным и микронным пространственным разрешением непосредственно в отдельной живой клетке при сохранении жизнеспособности исследуемого объекта.

2. Теория деполяризации флуоресценции, обусловленная вращательной диффузией флуорофоров, имеющих форму эллипсоида вращения, адекватно описывает процесс агрегации гематопорфирина в водных растворах и липидных мембранах.

3- Разработанное программное обеспечение позволяет обрабатывать экспериментальные кривые затухания флуоресценции, используя квазинепрерывное распределение экспоненциальных компонент и определяя их количество, на основе метода неотрицательных наименьших квадратов. Метод градиентного спуска позволяет определить значения параметров анизотропии флуоресценции для многокомпонентно» системы флуорофоров.

4. При отсутствии систематических ошибок, вносимых системой регистрации, ошибка, с которой определяются параметры анизотропии флуоресценции разработанным программным обеспечением, однозначно определяется амплитудой накопления экспериментальных кривых затухания.

5. Установлено, что водный раствор гематопорфирина представляет собой смесь мономеров, димеров и агрегатных форм большей степени, соотношение которых определяется концентрацией раствора. При проникновении в плазматическую мембран)' клетки в ней происходит преимущественное накопление мономеров, которые затем начинают вновь агрегировать. К концу 2-го часа инкубации в плазматической мембране устанавливается стационарное распределение мономеров, димеров и агрегатов третьей степени. В цитоплазме присутствуют в основном распределенные диффузно мономеры. В ядерной мембране к 6-му часу инкубации начинается агрегация мономеров с образованием димерных форм.

6. Результаты кюветных измерений анизотропии флуоресценции гематопорфирина в суспензии липосом указывают на определяющую роль липидного бислоя на процессы проникновения, локализации, агрегации и дезагрегации гематопорфирина в живой клетке.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на следующих конференциях, совещаниях и школах:

1. На научно-техническом семинаре "Лазеры в народном хозяйстве" (Москва,

1989).

2. На И Республиканской школе-семинаре "Методы лазерной биофизики и их применение в медицине" (Тарту, 1989).

3. На научно-техническом семинаре "Применение лазеров в биологии и медицине" (Москва - Ростов- Великий, 1990).

4. На V Координационном семинаре "Исследование структуры, физических свойств и энергетики биологичеки активных молекул" (Кошице - Прага, ЧСФР,

1990).

5. На V Международной школе по применению лазеров *ISLA'90" (Вильнюс, 1990).

6. На III Международной кон ференции "Применение лазеров в науках о жизни LALS'90" (Москва, 1990).

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 8 научных работах, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, четырех глав и заключения. Работа изложена на 148 страницах, включающих 27 рисунков, 5 таблиц и список литературы из 152 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Во введении сформулированы цель и задачи работы, кратко изложено содержание диссертации.

В первой главе дан аналитический обзор работ, относящихся к флуоресцентной спектроскопии сложных молекул в биологических системах. Приведен обзор методов оптической спектроскопии с временным и пространственным разрешением, используемых в настоящее время для изучения быстропротекающих процессов в различных биологических системах. Особое внимание уделено учету возможных искажений и погрешностей экспериментальных данных, полученных методом счета одиночных фотонов с временным разрешением. Обсуждается совремегаюе состояние исследований в области спектроскопии порфиринов, активно используемых в фотодинамической терапии рака (ФДТ). Подчеркивается роль и влияние процессов агрегации и дезагрегации порфиринов на эффективность ФДТ, а также описана экспериментальная методика регистрации внутриклеточного распределения различных фракций порфириновых препаратов стационарным микрофлуори-метром [9,101.

Во второй главе рассмотрены теоретические основы поляризационной флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением. При анализе кинетики затухания компонент флуоресценции, поляризованных параллельно I „(О и перпендикулярно 1Х(0 поляризации импульсного возбуждения, возможно наблюдение их

различия, называемого анизотропией флуоресценции: гШ =-. Изме-

1ц(Г) + 21хи)

рения анизотропии выявляют динамику углового смещение флуорофора, которое происходит между поглощением и последующим испусканием фотона. Она определяется вращательной диффузией за время жизни возбужленного состояния, а та в свою очередь зависит от вязкости микроокружения и размеров и формы флуоро-форов. Кроме характеристик диффузионного движения можно определить поворачивается ли флуорофор свободно па любой угол или окружение накладывает на флуорофор ограничения в его угловых смешениях. Многоэкспоненциальное затухание г(0 может быть следствием анизотропии вращения, т.е. вращения молекулы с разными скоростями вокруг трех молекулярных осей.

Рассмотрена динамика релаксации функции распределения дипольных моментов сферически симметричной молекулы. Полученные результаты использовались для определения влияния вращательной броуновской диффузии на деполяризацию флуоресценции. Показано, как с помощью экспериментально измеренной анизотропии флуоресценции можно оценить размеры и форму флуорофоров.

Третья глава посвящена подробному описанию экспериментальной техники, используемой для пикосекундных поляризационных микрофлуориметрических ис-

следований сложных многоатомных молекул в растворах, клетках и других биологических системах. Приводятся описание лазерной системы, флуоресцентного поляризационного микроскопа и измерительно-вычислительного комплекса на базе персонального компьютера IBM PC и интерфейсов в стандарте КАМАК, а также методики обработки экспериментальных результатов.

На рис. 1 приведена оптическая схема лазерного поляризационного микрофлу-ориметра. В качестве задающего генератора используется Nd:YAG лазер с непрерывной накачкой, акустооптической модуляцией добротности и синхронизацией мод. Выходное излучение лазера с длиной волны Л = 1064 нм представляет собой цуги пикосекундных импульсов, следующие с частотой 5 кГц. Каждый цуг длительностью 300 не по полувысоте состоит из 25-30 импульсов, разделенных временным интервалом 10 не. Средняя мощность излучения - до 10 Вт. Выходное излучение далее удваивается по частоте в кристалле йодзта лития LilOj с эффективностью преобразования 14-15%. Для увеличения динамического диапазона измеряемых времен затухания флуоресценции осуществляется выделение одиночного импульса из цуга с помощью низковольтного электрооптического модулятора МЛ-102 А (ЭОМ). Запуск схемы управления (СУ) осуществляется лавинным транзистором КТбОЗ (ФТ). Контраст выделения одиночного импульса (ослабление соседних импульсов) при двойном проходе достигает = 100.

Возбуждающее излучение направляется далее при помощи отклоняющего элемента, которым могут быть селективное зеркало или микропризма, на объектив микроскопа и фокусируется на объект. Пространственное разрешение микрофлу-ориметра определяется диаметром сфокусированного пятна и составляет при использовании объектива Reichert (xl60, N.A.=1.25) - 0.7-1.7 мкм. Непосредственно перед микроскопом расположены двойной ромб Френеля (РФ), с помощью кото-рог^ осуществляется поворот плоскости поляризации возбуждающего излучения, и длиннофокусная линза (Л), которая используется для совмещения плоскости изображения объекта с фокальной плоскостью лазерного пятна. Двухкоординатиый сканирующий столик позволяет направлять сфокусированный лазерный пучок на нужную точку объекта, измерять пространственное распределение интенсивности флуоресценции с шагом 15 мкм или избежать фотоповреждения образца при большей мощности возбуждения в случае, когда пространственное разрешение являлось несущественным. Флуоресцентное излучение, собираемое объективом проходит через отклоняющий элемент (селективное зеркало или частично теряется на призме), через съемный светофильтр и через анализатор состояния поляризации, который можно установить в два взаимно перпендикулярных положения ("А" или "Р").

Далее расположено съемное отклоняющее зеркало, с помощью которого изображение объекта (во внешней подсветке или собственная флуоресценция) направлялось на светочувствительную матрицу ПЗС-камеры "Ивика" для проведения

СУ

/?. ri

\> <У ' V

Делительное РФ " [J зеРкал° Л

Nd:YAG

Объектив ] />

Рис. 1. Экспериментальная схема пикосекундного поляризационного лазерного

микроспектрофлуориметра. CP - система регистрации; 1 - крейт-контроллер KAMAK-IBM PC/XT; 2 - дискриминатор со следящим порогом; 3 - время - амплитудный преобразователь; 4 - аналого-цифровой преобразователь; 5 - счетчик; 6 - модуль управления шаговым двигателем; ЭОМ - электрооптический модулятор; П - поляризаторы; СУ - схема управления модулятором; ФТ - фототранзистор запуска схемы управления; ИФ - интерференционный фильтр; Д - диафрагма; РФ - двойной ромб Френеля; JI - линза; М -монохроматор; "А" и "Р" - анализаторы

стационарных измерений. При регистрации флуоресценции с временным разрешением сигнал флуоресценции поступал на спектрально- селективный элемент оптической схемы, которым был либо встроенный монохроматор (М) при неполяризационных измерениях, либо ингерференционый светофильтр (ИФ) при поля-ризационно- чувствительных экспериментах. Сигнал флуоресценции регистрировался фотоэлектронным умножителем на микроканальных пластинах ФЭУ-165, работающим в одноэлектронном режиме. Импульсы с ФЭУ поступают затем на систему регистрации, основанную на методе счета одиночных фотонов с временным разрешением.

Возможность количественных поляризационных измерений, существующая вследствие высокой степени поляризации возбуждающего лазерного излучения, открывает новую область исследования объектов, имеющих размеры порядка нескольких микрометров. Для проведения таких измерений на пути возбуждающего пучка располагают полуволновую пластину или двойной ромб Френеля, а между исследуемым образцом и входной щелью спектрометра на пути флуоресцентного излучения располагают анализатор.

Однако, микрофлуориметр содержит два оптических элемента, которые отличают его от обычного спектрометра: полупрозрачное (делительное) зеркало и объектив микроскопа. Эта два элемента располагаются на пути как возбуждающего излучения, так и флуоресцентного сигнала, и вносят возмущения в поляризационные измерения. Если поляризационные измерения проводятся с целью получения количественных результатов, необходимо учитывать их влияние или применять методику измерений, позволяющую скомпенсировать или минимизировать это возмущение.

Сравнение возможных оптических схем лазерного поляризационного микроскопа показало, что пригодными для практического применения оказываются: 1)схема с призмой - для спектральных измерений флуоресценции молекул, обладающих достаточно высоким квантовым выходом и 2)схема с дихроичным зеркалом - для регистрации кинетики затухания флуоресценции на определенных длинах волн, для которых коэффициенты пропускания для различных поляризаций равны.

Рассмотрена методика, объединяющая методы чередования поляризаций возбуждения и регистрации и позволяющая избежать употребления корректирующих факторов и получить выражение для некоего безразмерного коэффициента, значение которого контролируется в ходе эксперимента и позволяет оценить достоверность получаемых данных. Обычно при поляризационных измерениях представляют интерес не сами компоненты флуоресценции, а их комбинации: поляризация флуоресценции Р = (1ц-1.1.)/(1в+1х) и анизотропия флуоресценции г = (1ц-1±у(1|,+21х). Результаты эксперимента можно считать достоверными,

если полученные экспериментально функции Риге точностью до постоянного

где И = т„ / г 4 и Т=г„ / хь - отношения коэффициентов отражения на длине волны возбуждения и пропускания на длине волны флуоресценции соответственно для двух различных состояний поляризации.

Из полученного выражения ясно следует условие достоверности экспериментальных данных: К » (КТ + 1)/(И + Т) должно быть равно 1. В ходе реальных экспериментов значение К изменялось от 0.97 до 1.03. Причем значительные отклонения (>1.5%) свидетельствуют о недостатках юстировки оптической схемы: несовпадении направления распространения пучка возбуждающего излучения и оси вращения двойного ромба Френеля, или неаксиальному распространению возбуждающего излучения и сигнала флуоресценции в микроскопе.

Эффект деполяризации, возникающий вследствие большого угла светосбора объективов с сильным увеличением и большой числовой апертурой, невелик для изотропных объектов, но увеличивается с ростом числовой апертуры объектива. Этот эффект был оценен теоретически [11], и может быть уменьшен закрыванием диафрагмы, расположенной в плоскости изображения образца. Такой пространственный фильтр изменяет эффективную числовую апертуру, не изменяя объема, возбуждаемого в образце фокусируемым лазерным пучком.

Воздействие монохроматора определяется различной отражательной способностью диффракционной решетки для различных поляризаций падающего излучения. В случае, когда применяется экспериментальная методика с фиксированной поляризацией возбуждающего излучения и сменой анализаторов, влияние монохроматора описывается зависимостью коэффициента коррекции Т от длины волны регистрируемого сигнала. При фиксированном положении анализатора и чередовании поляризации возбуждения влиянием монохроматора можно пренебречь, так как поляризация проходящего через монохроматор сигнала остается неизменной в процессе измерения. В случае же комбинированной методики, когда чередуются и поляризация возбуждающего излучения и поляризация регистрируемого сигнала, влияние монохроматора описывается вкладом в значение коэффициента К »(ЯТ+ 1)/(Я + Т), который в случае идеального поляризационного микрофлуо-риметра должен быть равен 1. Оказалось, что при правильной юстировке оптической схемы, когда направление распространения лазерного пучка совпадает с осью вращения двойного ромба Френеля и сигнал флуоресценции и возбуждающий пучок распространяются вдоль оптической оси микроскопа, основной причиной отклонения значения коэффициента К от 1 является монохроматор. Поэтому при из-

множителя совпадают с истинными функциями ги = (»и-»'л.)/(*! +Отсюда следует

_ (ИТ+ЩцЧК + Т)^

1Н+21Х ~ (етч-ш.+гск+Т)*^'

и

а

а

мерениях кривой затухания флуоресценции, кроме использования соотвествуюше-го делительного зеркала, целесообразно вместо монохроматора в качестве спектрально селектирующего элемента использовать интерференционный фильтр. Это приводит к уменьшению значения К от 1.5 -¡-2.5% ДО 0.5%.

Тестирование оптической схемы необходимо для оценки достоверности поляризационных измерений, проводимых на микрофлуориметре. В отличие от измерений анизотропии флуоресценции, при тестировании измеряется интенсивность пробированного во времени сигнала при равномерном вращении двойного ромба Френеля с частотой V вокруг своей оси. Для исключения вращательной деполяризации флуоресценции приготавливался твердый раствор органического красителя в гомогенизированном парафине.

При измерении интенсивности стационарной флуоресценции красителя, молекулы которого встроены в застывший парафин, ожидается следующая зависимость от угла поворота ромба Френеля (р:

К (р) - А • 51п(4 У(р) + В-$\п(У(р)+С (при наличии анализатора);

1(<р) = В • эшС уср) + С (в отсутствие анализатора), где частота 4 V соотвествует поляризованной компоненте, вращающейся вследствие вращения двойного ромба Френеля, V - следствие плохой юстировки ромба, С - деполяризованная, например объективом, компонента при наличии анализатора, а также и поляризованная компонента в его отсутствие.

Для описанного выше растворя красителя в парафине отношение А/С = т (коэффициент модуляции синусоиды) определяется только значением стационарной анизотропии г, а та в свою очередь, только углом а между дшольными моментами поглощения и излучения молекулы красителя:

. . Зсо5:а-1 т = Зг/(2 + г) =-;—.

3+соз*а

Таким образом, оказывается возможным не только проверить способность ми-крофлуориметра производить поляризационные измерения, но и предложен оригинальный способ точного определения угла между дипольными моментами поглощения и испускания в твердых растворах молекулярных красителей.

На рис.2(а,б) приведены экспериментальные результаты измерений зависимости интенсивности флуоресценции от угла поворота двойного ромба Френеля при наличии и отсутствии анализаторов "А" и "Р" в канале регистрации. Экспериментальные результаты обрабатывались по методу наименьших квадратов, когда каждая кривая аппроксимировалась трехкомпонентной суммой

К ф) = А ■ 5ш(4 уср) + В ■ зт( Уср) + С, где коэффициент В описывает неточность юстировки оптической схемы, отношение А/С в отсутствие анализатора соответствует наличию дополнительных поляри-зационно чувствительных элементов в канале регистрации, а то же отношение в

присутствии анализаторов "А" и "Р" позволяет сравнить эквивалентность двух каналов регистрации ("А" и "Р") и оценить деполяризующее влияние объектива микроскопа. Результаты обработки экспериментальных данных приведены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты обработки экспериментальных данных по измерению интесивности стационарной флуоресценции оксазина-17 в парафине при вращении поляризации возбуждения и различных состояниях поляризации регистрации.

Состояние поляризации А в С ш-А/С г

вертикальное "А" 452 97 1000 0.45Ю.05 0.35±0.05

горизонтальное, "Р" 447 102 1000 0.45i0.05 0.35Ю.05

анализатор отсутствует - 99 1000 - -

Импульс возбуждения, регистрируемый лавинным фотодиодом ЛФД-2 фиксирует начало отсчета. Выходные импульсы с фотодиода и усиленные широкополосным усилителем РУЗ-ЗЗ импульсы ФЭУ-МКП поступают на дискриминаторы постоянной составляющей 4ФСП-163 (2). Дискриминаторы формируют импульсы стандартной амплитуды и длительности, которые подаются на входы "Старт" и "Стоп" преобразователя временного интервала в амплитуду - Г1ВЛ322А (3), выполненного в стандарте КАМАК, для измерения времени запаздывания однофотопного импульса. Число импульсов запуска и флуоресценции контролируется при помощи счетчиков (5).

Амплитуда выходного импульса ПВА преобразуется в цифровой код с помощью аналого-цифрового преобразователя АЦП-712 (4). Этот код используется как смещение в памяти ЭВМ для инкрементирования значения этой ячейки памяти. После многократного повторения этого цикла участок памяти ЭВМ, связанный с АЦП, представляется на дисплее в виде гистограммы, которая отображает распределение поступивших одноэлектронных импульсов ФЭУ по временам их задержек относительно лазерного импульса.

Контроллер крейта (1) в стандарте КАМАК собран на комплекте микросхем к микропроцессору серии 580. Микропроцессор работает с тактовой частотой 2 МГц, имеет внутренний таймер и встроенный набор микропрограмм обработки прерываний от модулей. В котроллере имеется ОЗУ объемом 16 кбайт. Процедуры обработки прерывания, написанные на языке Ассемблера 88/86 и Турбо-Си, выполняются (без циклов ожидания готовности контроллера к обме!гу) за 85 мкс в фоновом режиме и за 120-140 мкс в режиме наблюдения в реальном времени. Оцифровка импульсов время-амплитудного преобразователя с помощью АЦП-712 ограничена 9 разрядами, что обеспечивает 512 каналов регистрации при разрешении менее 80 пс/канал.

Рис.2а. Зависимость интенсивности флуоресценции оксазина-17 в парафине от угла поворота ромба Френеля в отсутствие анализатора (2) и при анализаторе, пропускающем вертикально поляризованное возбуждающее излучение (1).

Рис.2б. Зависимость шгтенсивности флуоресценции оксазина-17 в парафине от угла поворота ромба Френеля в отсутствие анализатора (2) и при анализаторе, пропускающем горизонтально поляризованное возбуждающее излучение (1).

Для обработки экспериментальных результатов было написано программное обеспечение на языке Си, осуществляющее нахождение параметров затухания флуоресценции и анизотропии флуоресценции на основе метода наименьших квадратов. На первом этапе находились параметры затухания полной флуоресценции 10 = I ц+21 х в предположении квазинепрерывного распределения времен затухания флуоресценции. С помощью метода наименьших квадратов с неотрицательными решениями находились положительные амплитуды распределения экспоненциальных компонент затухания флуоресценции. При этом определялось число таких компонент и их относительный вклад. Затем каждой экспоненциальной компоненте ставился в соответствие моноэкспоненциальный закон затухания анизотропии, параметры которого определялись на втором этапе методом градиентной минимизации среднеквадратичного отклонения.

В четвертой главе, посвященной разрешенной во времени кинетической поляризационной спектроскопии гематопорфирина в клетках и липосомах. Приводятся результаты экспериментов по кинетическим измерениям анизотропии флуоресценции в липосомах и одиночной живой клетке. На основании данных, полученных при обработке экспериментальных результатов делаются выводы об особенностях процесса агрегации гематопорфирина при проникновении и локализации его в плазматической мембране живой клетки.

Результаты обработки экспериментальных данных с помощью программы, описанной выше, приведены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты обработки флуоресценции гематопорфири- на, локализованного в плазматической и ядерной мембранах и цитоплазме живой клетки СПЭВ.

Область Количество Время Относи- Время

локализации компонент жизни, НС тельный вращательной ГО

вклад, % корреляции

Плазматичес- 0.6 3 7.6 -0.07

кая мембрана 3 2.1 80 1.8 -0.11

13.6 17 0.2 -0.02

Цитоплазма 1 14.1 100 0.3 -О.ОЬ

Ядерная 3.2 75 0.8 -0.12

мембрана 2 13.8 25 0.2 -0.02

Следует обратить внимание на различное число компонент флуоресценции ГП в различных субклеточных структурах. Так, наибольшее число, относящееся к флуоресценции мономеров (13.6 не), димеров (2.1 не) и агрегатов (0.6 не), проявляется в плазматической мембране в первые два часа инкубации. В цитоплазме зарегистрирован вклад только мономерной формы, а в ядерной мембране, начиная с 4-го часа инкубации появляется вклад мономеров, а затем и димерной формы.

Что касается анизотропии флуоресценции, то время вращательной корреляции агрегированной формы в плазматической мембране (7.6 не) значительно превосходит значение для мономеров, что свидетельствует или о сильной агрегации (до 10-ой степени) или об образовании жесткой связи с молекулами мембраны. Однако в последнем случае должна проявляться постоянная составляющая анизотропии г_, однако она отсутствует.

Обращает на себя внимание зависимость начального значения анизотропии г0 от степени агрегации. Если значениег0 для мономеров отрицательно и мало по абсолютной величине (-0.06), чго соответствует углу 60° между дипольными моментами поглощения и излучения, то для димеров значениег0 = -0.11, что соответствует углу между диполями = 70°.

Представляет интерес анализ эволюции разности поляризованных компонент флуоресценции. Программа, контролирующая ход измерений после каждого цикла измерений, т.е. каждые 10 минут выводит на экран изображение разности параллельной и перпендикулярной компонент флуоресценции. Из выражения I= 10(О- г(/) видно, что разность содержит информацию как о флуоресценции, так и о анизотропии. В частности, при экспоненциальном характере затухания флуоресценции и анизотропии разность также затухает экспоненциально с временем затухания меньшим, чем меньшее из времен. Таким образом, для мономерной формы ГП характерное время затухания разности 1ц-1х определяется временем вращательной корреляции, т.е. 0.2 не, а для димерной и агрегированной форм - временем жизни флуоресценции (2+3 не и 0.6 не соответственно). В плазматической мембране в первые два часа инкубации разность растет очень интенсивно и характеризуется временем затухания < 0.2 не. Затем скорость роста разности падает, и изменяется форма: появляется и увеличивается вклад с характерным временем = 2 не. Подобное поведение разности I, - можно объяснить следующим образом: с начала инкубации из раствора, окружающего клетку и состоящего из смеси мономеров, димеров и агрегатов высших степеней, в плазматическую мембрану клетки проникают только мономеры с относительно высоким квантовым выходом и малым временем вращательной корреляции. По мере повышения локальной концентрации мономеров ГП в мембране начинается процесс их повторной агрегации. Образующиеся димеры имеют значительно меньший квантовый выход, меньшее время жизни флуоресценции, определяющее теперь основной прирост разности I, — , и большее время вращательной корреляции. Вклад мономеров во флуоресценцию уменьшается вследствие понижения их общего количества за счет перехода в димеры. Дальнейшая агрегация на разности отражается очень слабо, т.к. агрегаты высших степеней имеют еще меньший квантовый выход флуоресценции, а время жизни флуоресценции близко к времени вращательной корреляции мономеров и на вклад высших агрегатов в разность теряется на фоне

сильного вклада мономеров. Последующее прекращение роста разности связано с внутриклеточным распространением ГП и уменьшением его локальной концентрации в плазматической мембране.

Рассуждая аналогичным образом, можно объяснить поведение разности поляризованных компонент флуоресценции ГП из области ядерной мембраны, схожее с разностью, описанной выше, за исключением времени появления вклада мономеров, приходящегося на 3-4 час инкубации. Такая задержка связана с диффузионными процессами, приводящими к распространению ГП из плазматической мембраны через цитоплазму, содержащую в основном мономеры, к ядерной мембране. Проведенный анализ разностных данных позволил сделать вывод о том, что к концу 6-го часа инкубации процессы внутриклеточного перераспределения ГП приводят к стационарному распределению.

В заключении сформулированы основные результаты работы:

1. Разработан автоматизированный пикосекундный лазерный поляризационный микрофлуориметр с временным разрешением = 300 пс и пространственным разрешением ~ 1 мкм. В качестве задающего генератора использовался Nd:YAG лазер с активной модуляцией добротности и синхронизацией мод с высокой частотой повторения импульсов (до 5 кГц). Система регистрации основана на методе счета одиночных фотонов с временным разрешением и выполнена в стандарте КАМАК под управлением персонального компьютера IBM PC/XT.

2. Разработана экспериментальная методика измерения поляризации флуоресценции с пространственным разрешением и проведено тестирование лазерного поляризационного флуоресцентного микроскопа на достоверность получаемых результатов. При использовании иммерсионного объектива (Reihert, ЮОх, числовая апертура 1.25) суммарная погрешеность, вносимая объективом и делительным зеркалом не превышает 3%.

3. Разработано программное обеспечение для обработки экспериментальных результатов, полученных методом время-коррелированного счета фотонов с учетом ошибок о погрешностей последнего. Программное обеспечение, использующее метод наименьших квадратов с неотрицательными решениями, позволяет находить квазинепрерывное распределение времен затухания флуоресценции, оценить количество флуоресцентных компонент. Затем каждой компоненте флуоресценции ставится в соответствие анизотропия, параметры которой определяются методом градиентного спуска.

4. На основании численного эксперимента получены оценки достоверности компьютерной обработки результатов. Показано, что при отсутствии систематических ошибок, вносимых системой регистрации, ошибка определения параметров флуоресценции и анизотропии однозначно определяется величиной накопления экспериментальных кривых затухания флуоресценции.

5. Применительно к гематопорфирину (ГП) развита методика поляризационной флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением. Численно рассчитаны времена вращательной корреляции при аппроксимации формы молекулы ГП эллипсоидом вращения.

6. Измерены пикосекундные кинетики анизотропии флуоресценции ГП в растворах, липосомах и различных компонентах одиночной живой клетки СПЭВ. Получена оценка степени агрегации ГП в этих средах. Установлено, что водный раствор гематопорфирина представляет собой смесь мономеров, димеров и агрегатных форм большей степени, соотношение которых определяется концентрацией раствора. При проникновении в плазматическую мембрану клетки в ней происходит преимущественное накопление мономеров, которые затем начинают вновь агрегировать, причем стационарное распределение устанавливается за 2 часа. При этом в мембране наблюдается мономеры, димеры и агрегаты третьей степени. К началу 4-го часа инкубации происходит распределение ГП по клетке. В цитоплазме присутствуют в основном мономеры, распределенные диффузно. В ядерной мембране к 6-му часу инкубации начинается агрегация мономеров с образованием димерных форм.

7. Результаты кюветных измерений анизотропии флуоресценции гематопорфирина в суспензии липосом иллюстрируют преимущество измерений с пространственным разрешением, так как интепретация результатов затруднена наличием вклада сигнала как из раствора, так и из липидного бислоя. Однако совпадение основных закономерностей агрегационных процессов указывает на определяющую роль липидного бислоя на процессы проникновения, локализации, агрегации и дезагрегации гематопорфирина в живой клетке.

Материалы диссертации отражены в следующих публикациях:

1. А.Г. Варданян, В.Ф. Каналов, H.H. Коротеев, О.В. Лобанов. Лазерный микроскоп для флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением.//Квантовая электроника,-1989. T.l6,N9, с.1920-1924.

2. Chernyaeva Е.В., Vardanyan A.G., Koroteev N.I., Kamalov V.F., Lobanov O.V., Mironov A.F., Rumyanzeva V.D. Laser picosecond microspectrofluorimetry of hematoporphyrin in cells and liposomes.//J.Photochem.PhotobioI. B:Biol. -1991. V.10, pp.239-248.

3. Варданян А.Г., Боболева H.A., Коротеев Н.И., Лобанов О.В., Черняева Е.Б. Применение поляризационной флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением для определения степени агрегации гематопорфирина в липидном бис-лое.//Оптика и спектроскопия. -1990. Т.69, вып.2, с.475-478.

4. Н.А. Боболева, О.В. Лобанов, Е.Б. Черняева. Исследование агрегации биологически активных молекул методами пикосекундной динамики анизотропии флуо-ресценции.//Исследование структуры, физических свойств и энергетики биологически активных молекул: Тез. докл. V координационного семинара. - Кошице-Прага, -1990. С.12-15.

5. Boboleva N.A., Chernyaeva Е.В., Koroteev N.I., Lobanov O.V., Vardanyan A.G. //Laser application in Life Sciences: Int. Conf., the book of abstr. - M. -1990. P.56.

6. Chernyaeva E.B., Golubeva N.A., Koroteev N.I., Lobanov O.V., Vardanyan A.G. Time-resolved polarization luminescence spectroscopy of hematoporphyrin in liposomes.//Proceedings of USSR-CSFR Joint Seminar on Nonlinear Optics in Control, Diagnostics, and Modeling of Biophysical Processes /Eds. S.A. Akhmanov, V.N. Zadkov). - SP1E. -1991. - V.1402, pp.7-10.

7. Боболева H.A.,Варданян А.Г., Лобанов О.В. Лазерный микроскоп для разрешенной во времени флуоресцентно)! спектроскопии гематопорфирина в клетках и липосомах. // Мат. научно-техн. конференции "Разработка и применение лазеров в медицине. - М. - Ростов - Великий. -1991. Сс.14,119-132.

8. А.Г. Варданян, Н.И. Коротеев, О.В. Лобанов. Лазерная пикосекушная микро-спектрофлуорометрия гематопорфирина в клетках и липосомах. // Мат. семинара "Лазеры в народном хозяйстве". - М. -1989. Сс.87-92.

Цитированная литература:

9. Н.К. Seidlitz, Н. Schneckenburger, К. Stettmaier. Time-resolved polarization measurements of porphyrin fluorescence in solution and in single cells.// J.Photochem.Photobiol. B: Biology. - 1990. -V.5, No.3H pp.391-400.

. ' 10. H. Schneckenburger, A. Ruck, B. Bartos, R. Steiner. Intracellular distribution of photosensitizing porphyrins measured by video-enhanced fluorescence microscopy.// J.Photochem.Photobiol. B: Biology. - 1988. - V.2, pp.355-363.

И. С. Bremard, J. Laureyns, J.C. Merlin, G. Turrell. Polarization measurements in Raman microspectroscopy. I. Isotropic samples.// J.Raman Spectrosc. - 1987 - V.18, No. 5, pp. 305-313.