Потенциометрические сенсоры на основе комплексов серебра (I) с некоторыми β-лактамными антибиотиками и катионами тетраалкиламмония тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Снесарев Сергей Владимирович

ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ КОМПЛЕКСОВ СЕРЕБРА® С НЕКОТОРЫМИ р-ЛАКТАМНЫМИ АНТИБИОТИКАМИ И КАТИОНАМИ ТЕТРААЛКИЛАММОНИЯ

02.00.02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1

Саратов - 2012

005017197

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»

Научный руководитель

Кулапина Елена Григорьевна

доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты

Евтюгин Геннадий Артурович

доктор химических наук, профессор, Казанский (Приволжский) федеральный университет, зав. кафедрой аналитической химии

Третьяченко Елена Васильевна

кандидат химических наук, доцент, Саратовский государственный технический университет ткни Гагарина Ю.А., доцент кафедры «Химия»

Ведущая организация

Башкирский государственный университет, г. Уфа

Защита состоится 25 мая 2012 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.07 при Саратовском государственном университете имени Н.Г. Чернышевского по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83, корп.1, Институт химии.

С диссертацией можно ознакомиться в ЗНБ им. В.А. Артисевич Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (410601, Саратов, ул. Университетская, 42).

Автореферат разослан «^¡9» апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук Т.Ю. Русанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность.

Определение р-лактамных антибиотиков, как одной из групп лекарственных соединений, получивших широкое распространение, но в то же время, обладающих потенциальной опасностью для здоровья человека, является одной из актуальных проблем современной аналитической химии. Объекты, в которых необходимо определять и контролировать содержание антибиотиков, весьма разнообразны: фармацевтические препараты, биологические жидкости организма человека и животных, продукты питания, сточные воды фармацевтических предприятий и др.

Для контроля за содержанием антибиотиков в различных объектах необходима разработка экспрессных методов их определения. Известные к настоящему времени р-лактамные сенсоры позволяют детектировать индивидуальные антибиотики или их суммарное содержание. Снижение предела обнаружения и повышение селективности определения р-лактамных антибиотиков с применением потенциометрических сенсоров является актуальным.

Развитие ионометрии органических соединений предполагает использование в составе активных компонентов мембран заряженных комплексов определяемых веществ с ионами металлов. Этот прием позволяет существенно повысить чувствительность определения органических веществ. Принципиально новый подход для раздельного определения р-лактамных антибиотиков может быть связан с использованием неселективных (слабоселективных) сенсоров, обладающих наибольшей перекрестной чувствительностью, в мультисенсорных системах типа «электронный язык». Известно применение таких систем для определения различных веществ в технологических растворах, природных водах, пищевых и биологических образцах. В литературе отсутствуют сведения о применении массивов сенсоров для раздельного определения Р-лактамных антибиотиков.

В связи с последним создание потенциометрических сенсоров на основе органических ионообменников тетраалкиламмония и комплексов серебра(1) с некоторыми р-лактамными антибиотиками, изучение их электродных, селективных свойств, оценка количественных характеристик мембранного транспорта актуально на современном этапе развития ионометрии антибиотиков.

Целью настоящего исследования является создание потенциометрических сенсоров на основе комплексов серебра(1) с некоторыми Р-лактамными антибиотиками и катионами тетраалкиламмония, определение их электроаналитических характеристик, оценка возможности применения в мультисенсор-ном анализе для раздельного определения антибиотиков в многокомпонентных модельных смесях, фармацевтических препаратах.

Для достижения поставленной цели в работе необходимо было решить следующие задачи:

• исследовать протолитические свойства ампициллина, оксациллина, це-фазолина, цефотаксима, цефапексина и цефтриаксона;

• провести количественную оценку устойчивости комплексных соединений серебра(1) с некоторыми (3-лактамными антибиотиками потенциометриче-ским и спектрофотометрическим методами;

• оценить физико-химические характеристики электродноактивных компонентов мембран в водных средах и в фазе мембран;

• установить влияние природы активных компонентов на поверхностные, селективные и объемные свойства мембран, чувствительных к (3-лактамным антибиотикам;

•создать массивы сенсоров для раздельного определения р-лактамных антибиотиков в многокомпонентных смесях;

•разработать методики раздельного и суммарного определения р-лактамных антибиотиков в модельных смесях, лекарственных формах и биологических жидкостях.

Объекты и методы исследования. В работе исследованы жидкокон-тактные сенсоры с пластифицированными поливинилхлоридными (ПВХ) мембранами. В качестве электродноактивных компонентов (ЭАК) мембран сенсоров, чувствительных к Р-лактамным антибиотикам использовали органические ионообменники комплексов серебра(1) с р-лактамными антибиотиками (Ag(P-lac)2~) и катионами тетраалкиламмония (ТАА) (табл. 1). Концентрацию активных компонентов в мембранах варьировали в интервале 0,5 - 3%, массовые соотношения ПВХ:ДБФ составляли 1:3.

Таблица 1. Формулы исследуемых Р-лактамных антибиотиков и катионов тетраалкиламмония

Название Формула

Пенициллины: о

Ампициллин (Аш) ►о?- М13

Амоксициллин (Атох) н= но-у—с- Ш;

Оксациллин (Ох)

Цефалоспорины: ° J

Цефазолин (Cef) fA / R,= -СНз hj n-n

Цефалексин (Ceflx) "СУ Г М12 R2=-сн3

Цефотаксим (Ceftx) XV/ Н2 / R2=-с —о—с сн3

Цефтриаксон (Ceftr) XV/ /N "-^АА,

Тетрадециламмония бромид (TDA) СюНги .С10Н21 \+/ CjoH2i С,0н2, Вг

Диметилдистеариламмония хлорид (DMDSA) Н3С .С17н35 \+/ /\ Н3С с17н35 С1

Лекарственные средства отвечали требованиям Государственной Фармакопеи.

Э.д.с. элемента измеряли с помощью иономера И-160, погрешность измерения э.д.с. ±1 мВ. В качестве электрода сравнения использовали стандартный хлоридсеребряный электрод ЭВЛ-1МЗ. Изучение состояния антибиотиков в водных средах проводили спектрофотометрическим методом на спектрофотометре Shimadzu UV-1800, совмещенным с ЭВМ типа IBM, с использованием

5

кварцевой кюветы (1=1 см). Контроль рН растворов проводили на рН метре рХ 150 мП с помощью стеклянного электрода ЭСЛ-63-07. Расчет констант образования и состава комплексов серебра(1) с Р-1ас проводили с помощью компьютерных программ «Равновесия vl.00 KCMSoft и математического пакета «Mathcad».

Транспортные свойства мембран изучали в условиях диффузионного массопереноса и постоянного тока. В условиях диффузионного массопереноса свойства изучали с помощью U-образной трубки, в которую помещалась жидкостная мембрана, состоящая из растворенного в хлороформе ЭАК. С одного конца трубки заливались растворы антибиотиков (источник), а с другой - дистиллированная вода (приемник). Фаза мембраны перемешивалась магнитной мешалкой. Для исследования транспортных процессов под током использована четырехэлектродная схема, состоящая из пары платиновых (токопроводящих) электродов и пары хлоридсеребряных (регистрирующих) электродов. Измерения проводили в гальваностатическом режиме (I = 5мкА) в течение 4 ч, меняя каждые 90 мин направление тока поляризации. Исследования проводили с растворами-источниками различной концентрации до установления постоянного значения потенциала и наступления равновесия; концентрации антибиотиков определяли способом градуировочного графика.

Селективность мембран на основе различных ЭАК оценивали методами биионных потенциалов и смешанных растворов. Для анализа коэффициентов селективности исследуемых сенсоров использовали анализ по главным компонентам. Обработку аналитических сигналов от массивов сенсоров проводили математическим методом распознавания образов с помощью искусственных нейронных сетей (ИНС). Определение антибиотиков в лекарственных формах и биологических жидкостях проводили способом добавок и градуировочного графика. Обработка фармакокинетических кривых проводилась с помощью программы «Borgia».

В работе использовали следующие методы исследования: прямая потен-циометрия, потенциометрическое титрование, спектрофотометрия, кондукто-метрия, титриметрия, математические методы обработки данных (искусственные нейронные сети, метод главных компонент).

Научная новизна полученных в диссертации результатов заключается в том, что:

• Проведена количественная оценка констант ионизации Р-лактамных антибиотиков, относящихся к кислотным, амфотерным с аминогруппами и ам-фотерным с аминотиазольными группами спектрофотометрическим и по-тенциометрическим методами. Установлены границы кислотности существования антибиотиков в катионной, анионной, цвиттер-ионной формах;

• Рассчитаны физико-химические параметры электродноактивных соединений (состав, растворимость, устойчивость) в водной среде и фазе мембраны.

Показана возможность прогнозирования состава мембран сенсоров с оптимальными электроаналитическими свойствами;

• Определены электроаналитические и операционные характеристики новых потенциометрических сенсоров на основе катионов тетраалкиламмония и анионных комплексов серебра(1) с ß-лактамными антибиотиками. Показано преимущество сенсоров, включающих заряженный комплекс серебро-р-лактам;

• Проведена количественная оценка селективности и перекрестной чувствительности сенсоров на основе различных ЭАК. Показано, что указанные параметры являются двумя различными подходами выбора сенсоров для мультисенсорных систем;

• Созданы массивы потенциометрических слабоселективных сенсоров с высокой перекрестной чувствительностью, стабильностью и воспроизводимостью электроаналитических характеристик для раздельного определения ß-лактамных антибиотиков в многокомпонентных смесях, фармацевтических препаратах

Практическая значимость работы состоит в том, что:

• Созданы потенциометрические сенсоры на основе комплексов серебра с ампициллином, оксациллином, цефазолином, цефотаксимом, цефалекси-ном и цефтриаксоном и катионами тетраалкиламмония с заданными электроаналитическими характеристиками.

• Показано, что для сенсоров на основе Ag(ß-lac)2TAA расширяется диапазон определяемых концентраций и значительно снижается предел обнаружения антибиотиков.

• Разработаны методики ионометрического определение ß-лактамов в лекарственных и биологических средах.

• Массивы сенсоров и метод ИНС применены для раздельного определения ß-лактамных антибиотиков в 2-3-компонентных модельных смесях и фармацевтических препаратах.

На защиту автор выносит:

• Физико - химические характеристики активных компонентов мембран на основе комплексов серебра(1) с ß- лактамными антибиотиками и катионами тетраалкиламмония в водных средах и фазе мембран.

• Электроаналитические свойства потенциометрических сенсоров, чувствительных к ß- лактамным антибиотиками.

• Массивы сенсоров и метод ИНС для раздельного определения пенициллинов и цефалоспоринов в модельных смесях и фармацевтических препаратах.

• Аналитическое применение разработанных сенсоров в анализе лекарственных и биологических сред.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на: II Международном форуме «Аналитика и Аналитики» (Воронеж, 2008); III Всероссий-

ской научной конференции «Аналитика России» (Краснодар, 2009); Всероссийской молодежной выставке-конкурсе прикладных исследований, изобретений и инноваций (Саратов, 2009); XVI, XVII, XIX Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009, 2010, 2012); Всероссийской конференции молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов «Инновации в химии» (Москва, 2009); Съезде аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Москва, 2009); VII, VIII Всероссийских конференциях молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2010, 2011); V Всероссийской конференции студентов и аспирантов «Химия в современном мире» (Санкт-Петербург, 2011); XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011); III Всероссийском симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2011); Молодежной конференции «Международный год химии» (Казань, 2011);

Публикации. Всего опубликовано 20 работ, по материалам диссертации - 19, в том числе 5 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, 5 статей в сборниках, 10 тезисов докладов Международных и Всероссийских конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 207 страницах машинописного текста, содержит 36 таблиц, 53 рисунка. Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов и списка литературы. Библиография включает 241 источник.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении рассмотрена актуальность исследований по использованию потенциометрических сенсоров для определения (З-лактамных антибиотиков, сформулирована цель и задачи исследования, новизна и практическая значимость работы.

В главе 1 приведен обзор литературы по современным методам определения различных типов антибиотиков в лекарственных и биологических средах; по применению мультисенсорных систем типа «электронный язык» в фармацевтическом анализе. Данные систематизированы и табулированы.

В главе 2 представлена постановка задачи исследования, описаны объекты, методы исследования и аппаратура, используемые реактивы и материалы. Приведены методики синтеза электродноактивных компонентов (ЭАК) на основе комплексных соединений серебра(1) с Р-лактамными антибиотиками, техника изготовления жидкоконтактных сенсоров, условия подготовки их к работе. Рассмотрены принципы создания и функционирования мультисенсорных систем типа «электронный язык»

В главе 3 проведена оценка состояния исследуемых пенициллинов и це-фалоспоринов в водных средах; исследовано влияние кислотности среды на их

устойчивость. Проведена количественная оценка констант ионизации антибиотиков потенциометрическими и спектрофотометрическими методами.

Глава 4 посвящена определению физико-химических свойств электрод-ноактивных компонентов мембран потенциометрических сенсоров. Приведены основные физико-химические характеристики органических ионообменников катионов тетраалкиламмония и комплексов серебра с (3-лактамными антибиотиками: произведения растворимости А§(Р-1ас)2ТАА, состав и константы образования комплексных соединений. ,

В главе 5 рассматриваются поверхностные и объемные свойства мембран сенсоров, чувствительных к пенициллинам и цефалоспоринам. Определены основные электрохимические свойства сенсоров, приведены количественные характеристики транспортных процессов в условиях диффузионного массопере-носа и постоянного тока.

Глава 6 посвящена созданию массивов потенциометрических сенсоров для раздельного определения Р-лактамных антибиотиков. Оценена селективность сенсоров к неорганическим ионам, а также к пенициллинам и цефалоспоринам. Рассчитаны параметры перекрестной чувствительности сенсоров. В качестве способа обработки аналитических сигналов от массивов сенсоров использован метод искусственных нейронных сетей (ИНС).

В главе 7 рассмотрено аналитическое применение разработанных сенсоров для детектирования р-лактамных антибиотиков в лекарственных и биологических средах (смешанной слюне). Показана возможность раздельного определения антибиотиков с помощью массивов потенциометрических сенсоров и метода ИНС в модельных смесях и лекарственных препаратах.

Состояние иенициллинов и цефалосиоринов при различной кислотности среды

В настоящей работе для моделирования состава мембран предложены новые электродно-активные компоненты на основе катионов тетраалкиламмония и комплексов серебра(1) с Р-лактамными антибиотиками [А§(Р-1ас)2']ТАА+.

Беталактамные антибиотики имеют сложную структуру, содержат различные функциональные группы, способные к ионизации. Исследование поведения р-лактамных антибиотиков в водных средах позволяет выявить их формы существования при различной кислотности среды, что является важным при ионометрических определениях. Кислотно-основные свойства антибиотиков сказываются на процессах их комплексообразования с ионами металлов, обеспечении потенциометрического отклика в растворах антибиотиков и др.

В монографии В.Г. Алексеева «Бионеорганическая химия пенициллинов и цефалоспоринов» (Тверь, 2009) приведены сведения по протолитическим свойствам Р-лактамных антибиотиков, оценены величины их констант прото-низации, определенные, в основном, потенциометрическим методом.

9

В настоящей работе в качестве метода исследования наряду с потенцио-метрией применен спектрофотометрический метод, который позволяет исследовать устойчивость и деградацию антибиотиков в процессе их хранения.

Основываясь на особенностях строения молекул, исследуемые в настоящей работе пенициллины и цефалоспорины можно разделить на несколько типов: ам-фотерные с карбоксильными и аминотиазольными группами (цефотаксим и цеф-триаксон), амфотерные с карбоксильными аминными группами (ампициллин и цефалексин) и кислотные (оксациллин и цефазолин).

В качестве примера ниже рассматривается поведение цефотаксима и цеф-триаксона в водных растворах при изменении кислотности среды. Спектры поглощения 5-10"5 М растворов цефотаксима и цефтриаксона регистрировали через 0, 10, 15, 20, 25 и 30 мин при рН = 11.2. Установлено, что цефотаксим имеет два максимума светопоглощения при А.] = 232 нм и Х2= 266 нм (рис. 1), (цеф-триаксон - при А.) 241 нм и Х2 270 нм). Максимумы при 266 и 270 нм для цефотаксима и цефтриаксона соответственно зависят от целостности лактамного кольца, а так же от наличия двойного сопряжения между атомами СЗ и С4 в системе цефепемного ядра цефалоспоринов.

А

0,8

0,6

0,4

0,2 -

Рис. 1. Спектры поглощения 5-10"5 М раствора цефотаксима при рН = 11.2 во времени: 1- 0, 2 - 10, 5-20,4-30 мин.

X, нм

220 240 260 280 300 320 340

Установлено, что во времени происходит исчезновение максимумов светопоглощения при X = 266 (цефотаксим) и X = 271 нм (цефтриаксон), что позволило по этим данным вычислить константы скоростей деградации. В качестве примера, на рис. 2 представлена зависимость 1пА цефтриаксона от времени при различной кислотности среды.

Значения констант деградации рассчитаны по уравнению линейной регрессии InA = 1пА0 - kt и представлены в табл. 2.

Показано, что в нейтральной и слабощелочной среде (рН 7,3 - 9,1) эти антибиотики практически не разрушаются, что может быть использовано при определении основного вещества в свежеприготовленных препаратах спектрофо-тометрическим методом.

-0,3 -0,4

Рис. 2. Зависимость оптической плотности цефтриаксона "°'5 (А.=271 нм) от времени при рН: о б 7.3 (1); 8,2 (2); 9,1 (5); 10,2 (4); 11.2(5). -0,7

-0,8

-0,9

При рН 5-9 оптическая плотность остается практически постоянной, а при рН> 10 резко увеличивается, что может быть связано с отрывом протона от амидной группы и разрушением цефепемного ядра.

Таблица 2. Значение констант скоростей деградации цефотаксима и цефтриаксона при различной кислотности среды.

рН Цефотаксим Цефтриаксон

Ы04(тш') г2 % целостности к-104 (шш1) г' % целостности

7.3 1,6 0,932 99 0,2 0,992 99

8.2 2,4 0,913 98 8 0,995 97

9.1 15 0,997 96 12 0,977 94

10.2 71 0,999 81 69 0,994 81

11.2 138 0,996 66 141 0,991 65

Зависимости оптической плотности цефотаксима и цефтриаксона от кислотности среды положены в основу определения их констант ионизации (рис.

3).

Рис. 3. Зависимость оптической плотности 5 • 10"5 М раствора цефотаксима (1) и цефтриаксона (2) от кислотности среды.

1 ■ 0,9 ■ 0,8 ■ 0,7 ■ 0,6 ■ 0,5 ■ 0,4

0

10

рН

-I

12

Проведена количественная оценка констант ионизации ампициллина (2,61 ± 0,02; 7,12 ± 0,04), цефалексина (2,48 ±0,01; 7,31 ± 0,05), оксациллина (2,70 ± 0,01), цефазолина (2,70 ± 0,02), цефотаксима (2,23 ± 0,06; 3,14 ± 0,05; 10,64 ± 0,08) и цефтриаксона (2,37 ± 0,03; 3,36 ± 0,07; 10,76 ± 0,06) потенцио-метрическим и спектрофотометрическим методами. Установлены области кислотности существования катионной, анионной и цвиттер-ионной формы антибиотиков. Различие в строении этих соединений будет сказываться на формах их существования в водных средах при изменении кислотности среды, что является важным при потенциометрических определениях.

Наличие в структуре различных гетероатомных фрагментов указывает на потенциальные комплексообразующие свойства этих веществ. Зная форму существования р-лактамных антибиотиков в растворе можно сделать прогноз о типе комплексов, образующихся с ионами металлов при различной кислотности среды, что может быть непосредственно использовано для получения анионных комплексов пенициллинов и цефалоспоринов в составе активных компонентов мембран потенциометрических сенсоров.

Физико-химические свойства электродноактивных компонентов мембран

В настоящей работе с целью снижения предела обнаружения Р-лактамных антибиотиков предложено вводить в состав электродноактивных веществ комплексные соединения А§(Р-1ас)2", имеющих отрицательный заряд и образующие ионные ассоциаты с катионами тетраалкиламмония (ТАА+). В связи с последним нами подробно исследованы процессы комплексообразования ионов серебра с ампициллином, оксациллином, цефазолином, цефалексином, цефотаксимом и цефтриаксоном спектрофотометрическим и потенциометриче-ским методами при варьировании концентрации реагирующих веществ, кислотности среды, а также растворимость образующихся электродноактивных компонентов. На рис. 4 представлены спектры поглощения комплексов сереб-ра(1) с некоторыми Р-лактамными антибиотиками.

А

0,6 ■

0,2 ■

0,4 ■

Рис. 4. Спектры светопогло-щения комплексных соединений серебра с — ампициллином (1), цефтриаксоном (2), цефотаксимом (5); цефалек-

о

X, им

сином (4) Сант. = 1-Ю"5 М, Сдв+ = 5-Ю"5 М, 1 = 1 см, рН = 8,1,

240

260

280

300

320 раствор сравнения - вода.

Мольное соотношение серебра(1) и антибиотиков в комплексах устанавливали методами насыщения и изомолярных серий. На рис. 5, в качестве примера, представлена кривая насыщения системы серебро-цефотаксим, из которого следует, что мольное отношение компонентов в образующемся комплексе составляет 1:2. Аналогичное соотношение получено и для всех исследуемых систем.

. При pH = 8,1 - 8,3 образуются преимущественно комплексы состава AgL2", где L - Am, Ох, Cef, Ceftx, Ceflx (табл.2). Для цефтриаксона предпочтительно образование полиядерного комплекса вида Ag2L22', что согласуется с данными о существовании комплексов серебра с бизарядными лигандами.

Процессы комплексообразования серебра(1) с ß-лактамными антибиотиками исследованы также методом потенциометрического титрования. Для определения состава и устойчивости образующихся комплексов была проведена компьютерная обработка результатов титрования методом наименьших квадратов с использованием специальных программ для моделирования равновесий в растворах «Равновесия vi.00 KCMSoft» и математического пакета «Mathcad». Установлено, что в слабокислой среде Am-, Ox-, Cef-, Ceflx- и Ceftx" образуют комплексы стехиометрического состава 1:1, в условиях щелочной среды антибиотики взаимодействуют с серебром(1) с образованием билигандных заряженных комплексов.

В системах серебро(1)-р-лактамный антибиотик установлены области образования комплексов: AgL - pH 4,2-5,8; [AgL2]"-pH 8,1-9,5.

Наиболее устойчивые комплексы с серебром(1) образуют антибиотики цефа-лоспоринового ряда: цефалексин, цефотаксим и цефазолин. Это можно объяснить более выраженной способностью атома серы, входящего в цефемгруппу, образовывать донорно-акцепторные связи с ионом-комплексообразователем. Дополнительным фактором, увеличивающим устойчивость комплексов цефалоспоринов с серебром®, является наличие в их структуре различных гетероатомных фрагментов.

Значения 1§р, полученные потенциометрическим и спектрофотометриче-ским методами, представлены в табл. 3. Ионы серебра(1) с исследуемыми Р-лактамными антибиотиками образуют комплексы А§Ь и [А§Ь2]". Образование отрицательно заряженного комплекса энергетически более выгодно.

Таблица 3. Состав и константы образования (^Р) комплексных соединений серебра (I) с Р-лактамными антибиотиками (п = 3; Р = 0,95).

Комплекс 18 3

рН-метрия спектрофотометрия

А§Аш 3,42±0,02 -

Афх 3,28±0,03 -

4,41±0,03 -

АеСейх 4,14±0,05 -

[А§Аш2]" 6,28±0,05 6,36±0,07

[АёОх2]" 6,22+0,04 6,16±0,03

[АЕСеУ 7,56+0,03 7,58+0,05

[АёСейх2]" 7,35±0,04 7,27±0,06

Отрицательно заряженные комплексные соединения серебра с оксацил-лином, ампициллином, цефазолином, цефалексином, цефотаксимом, цефтриак-соном использованы в составе активных компонент мембран потенциометриче-ских сенсоров, чувствительных к Р-лактамным антибиотикам.

Стехиометрическое соотношение компонентов и растворимость органических ионообменников определяли методом потенциометрического титрования 1-10"3 М растворов тетрадецил- и диметилдистеариламмония растворами соответствующих комплексов серебра(1) с р-лактамными антибиотиками. В качестве индикаторных электродов использовались сенсоры на основе соответствующих комплексных соединений серебра(1) с р-лактамными антибиотиками и катионами тетраалкиламмония. Обработку данных кривых титрования проводили по методу Грана (рис. 6).

Рис. 6. Зависимость параметра Грана от объема титранта при титровании 1 мл 1-10"3 М раствора ТО А 1-10"3 М растворами комплексов серебра® с: ампициллином (7), цефалексином (2), цефотаксимом (5).

0 0,5 гяимЛ 1,5

V™, мл

Величины произведений растворимости исследуемых комплексов серебра® с Р-лактамными антибиотиками и катионами тетраалкиламмония приведены в табл. 4.

Таблица 4. Произведения растворимости комплексных соединений серебра® с Р-лактамными антибиотиками и катионами тетраалкиламмония (п=3; Р=0,95).

ЭАК КХ±АК, ЭАК К^ДК, 8,

[Аё(Аш)2]-ТОА (1,5±0,2)-10"8 0,05 [Ав(Аш)2]-ОМБ8А (2,9±0,2)-10'7 0,03

[А8(Ох)2]-ТОА (1,8±0,3)-10"8 0,06 [Ag(Ox)2]-DMDSA (4,3±0,6)'10"7 0,06

[А§(Сеад-ТОА (1,9±0,2)-10"8 0,04 [А§(Се02]-БМО8А (6,3±0,1)-10"7 0,01

^(Сейх)2]-ТОА (2,1±0,2)-10"8 0,04 [А§(Сейх)2]-В1УГО8А (б,8±0,4)-10"6 0,02

[ А§(Сейх)2] -ТЭ А (1,5±0,3)-10"8 0,08 [Ag(Ceflx)2]-DMDSA (3,5±0,2)-10"7 0,02

В сравнении с ранее полученными данными о растворимости ионных ас-социатов тетраалкиламмоний-Р-лактамный антибиотик, можно ожидать снижения предела обнаружения антибиотиков с сенсорами, в состав мембран которых входят электродноактивные соединения [А§(Р-1ас)2]"ТАА+, что было подтверждено дальнейшими исследованиями электроаналитических свойств сенсоров.

Поверхностные и объемные свойства мембран потенциометрических сенсоров, чувствительных к пенициллинам и цефалоспоринам

Проведены исследования поверхностных, объемных и операционных свойств мембран при варьировании концентрации электродноактивных компонентов. Установлено, что оптимальные концентрации ЭАК в мембране составляют 0,5-2,0%

В табл. 5 приведены сравнительные характеристики электроаналитических свойств сенсоров на основе р-1ас-ТАА и А§(Р-1ас)2-ТАА в растворах исследуемых антибиотиков.

Таблица 5. Сравнительные электроаналитические характеристики жидкокон-тактных сенсоров на основе ЭАК различной природы в растворах соответствующих антибиотиков СЭдк = 1,5%; (п=3; Р=0,95).

ЭАК Линейная зависимость Е=ЦС,),М 8, мВ/рС с„,„, М ЭАК Линейная зависимость Е = А(С0, М 8, мВ/рС С ^//7» М

Аш-ТБА 5-Ю"5 - 1-Ю"1 53 + 3 2-Ю-5 Ag(Am)2-ТБА 1-10"5- 54 + 4 8-Ю"6

Ох-ТБА 3-Ю-4-1-Ю"2 52 ±2 9- 10"5 АВ(Ох)2-ТБА 1-10"1 56 + 3 6-10"6

Продолжение табл. 5

Сейх-ТБА мо"4 - 1-ю"1 50 ± 1 8- 10"5 ag(ceftx)2-ТБА 1-10"5-1-10"1 55 + 3 7-ю"6

Сейх-ТБА 1-ю"4- 1-ю"1 48 ±2 1-ю"4 Аё(СеПх)2-ТБА 56 + 2 8-ю"6

Сейг-ТБА2 5-ю"4 - мо-1 28+1 2-10"4 Аё2(Сейг)2- тба2 29 ± 1 8-10"6

Аш-БМББА 1-ю"4 - 1-ю-1 49 ±2 6-10"5 ag(am)2-вмоба 2-ю"5 -мо"1 52 + 3 мо"5

Ох-ОМОЯА 5-ю"4 - 1-ю"1 50 + 2 3-ю"4 Аё(Ох)2-ОМЭБА 5-10'5 -1-ю"1 56 + 2 2-10"5

СеГ-бмбза мо-4 - 1-ю"2 49 + 3 8-10"5 Аё(Се02-бмбза 52 + 2 3-ю"5

Сейх-омбба 5-10"4 —ыо"1 37 + 3 мо"4 Аё(Сейх)2-бмоба 53 + 3 2-ю"5

Сейх-омэза 1-ю"4-мо"1 49 ± 1 8-10"5 Аё(Сейх)2-бмоза 54 ±2 4-10"5

Сейг-БМОЗОАз 8-ю"4 - мо"1 27 + 2 6-10"4 Аё2(Сейг)2-ВМББАг 1-10"5-1-10"1 25 ±2 7-10"6

Потенциалопределяющей является реакция ионного обмена на границе мембрана/раствор:

А§(р-1ас)2" • ТАА+ <->Аё(Р-1ас)2" + ТАА+ (диссоциация ионообменника и комплекса в фазе мембраны),

Р-1ас"м Р-1ас"р, Е=Е0- 2,ЗЯТЯ71§Ср_1ас.

Показано, что при введении в состав мембран комплексов серебра с Р-лактамными антибиотиками угловые коэффициенты электродных функций соответствуют теоретической нернстовской величине для одно- или двухзарядных ионов (цефтриаксон), расширяется диапазон линейности электродных функций, снижается предел обнаружения антибиотиков. Время отклика составляет 25 - 60 сек; срок службы 2-3 мес. Наиболее оптимальным являются электродноактивные компоненты на основе комплексов серебра(1) с ампициллином, оксациллином, цефотаксимом, цефтриаксоном и катионами тетрадециламмония.

Жидкоконтактные потенциометрические сенсоры на основе катионов тет-раалкиламмония и комплексов серебра(1) с р-лактамными антибиотиками проявляют чувствительность ко всем изученным пенициллинам и цефалоспоринам: коэффициенты потенциометрической селективности (К^) близки к единице.

Объемные (транспортные) свойства мембран на основе А§(Р-1ас)2-ТАА исследованы в условиях диффузионного массопереноса(жидкостные мембраны, ЭАК+растворитель хлороформ) и постоянного тока (пластифицированные мембраны) при варьировании концентрации ЭАК, концентрации примембран-ных растворов. При этом оценивалось стационарное сопротивление мембран,

скорости переноса, проницаемость и потоки ионов, константы диссоциации ЭАК в фазе мембраны.

На рис. 7, в качестве примера, представлены зависимости потока ионов и проницаемости от концентрации примембранных растворов ампициллина и це-фазолина для жидкостных мембран на основе А§(Ат)2-ТОА и А§(Се1)2-ТВА.

Р-107 м/с .МО7 моль/м2с

Рис. 7. Зависимости потока ионов (1,2) и проницаемости (3,4) от концентрации примембранных растворов ампициллина и цефазолина для мембран на основе Ag(Am)2-TDA (1,3) и А§(СеГ)2-ТОА (2,4) соответственно.

4 3 2

При увеличении концентрации антибиотика в источнике происходит снижение скорости переноса, проницаемости ионов и увеличение потока ионов. Концентрация определяемого вещества в приемнике увеличивается в среднем на порядок, что указывает на протекание процессов переноса ионов через жидкостные мембраны. Уменьшение проницаемости при увеличении концентрации антибиотиков в источнике, вероятно, связано с более быстрой насыщаемостью жидкостной мембраны. Это в свою очередь приводит к ослаблению переноса ионов через межфазную поверхность. Для величины потока характерно в целом возрастание с увеличением концентрации примембранного раствора. Последнее свидетельствует о том, что лимитирующей стадией процесса переноса является диффузия антибиотика через водный пограничный раствор, формирующийся на поверхности мембраны при ее контакте с водой.

Для получения информации о функционировании пластифицированных поливинилхлоридных мембран на основе А§(Р-1ас)2ТАА были проведены исследования в условиях постоянного тока при варьировании концентрации ЭАК в мембранах, концентрации примембранных растворов.

Установлено, что исследуемые мембраны характеризуются устойчивым током проводимости в течение продолжительного периода времени, даже после изменения направления тока (рис. 8).

Стационарные значения потенциалов устанавливаются через 90 минут после пропускания через ячейку тока в том или ионом направлении; величина падения напряжения на мембране не меняется при изменении направления тока. Это указывает на то, что происходит обратимый ионный обмен на границе мембрана-раствор антибиотика.

R, МОм

t, мин

Рис. 8. Зависимости сопротивления мембран со сменой поляризации на основе [А§(СеАх)2]ТАА от времени контакта с 1-Ю"3 М раствором цефотаксима. Концентрация ЭАК в мембране, %: 7 -3; 2-2; 5- 1; 4-0,5; 5 - фоновая.

Введение в состав электродноактивных компонентов комплексов серебра с ß-лактамными антибиотиками приводит к понижению общего сопротивления мембран (0,5-1,2 МОм) по сравнению с мембранами, не содержащие серебро(1) (1,2-1,6 МОм). Ион серебра повышает проводимость мембраны, облегчая мембранный транспорт.

По стационарным сопротивлениям рассчитаны кажущиеся константы диссоциации органических ионообменников Ag(ß-lac)2TDA в мембранной фазе, получено, что К^ электродноактивных компонентов имеют близкие значения и составляют: (4,7±0,2)-10"4; (1,4±0,2)-10"4; (2,8±0,4)-10-4 для Ag(Am)2-TDA, Ag(Ceflx)2-TDA, Ag(Ceftx)2-TDA соответственно. Это свидетельствует о том, что природа антибиотика в составе электродноактивных компонентов практически не влияет на свойства мембран на их основе.

Массивы потенциометрических сенсоров для раздельного определения ß-лактамных антибиотиков

Исследуемые сенсоры являются неселективными к ß-лактамным антибиотикам, коэффициенты селективности близки к единице (К^- «1).

Оценены параметры перекрестной чувствительности: средний наклон электродных функции сенсора - Scp., фактор неселективности - F, фактор воспроизводимости - К. Для расчета параметров перекрестной чувствительности были использованы угловые коэффициенты электродных функций в шести растворах ß-лактамных антибиотиков: ампициллина, оксациллина, цефазолина, цефалексина, цефотаксима и цефтриаксона.

Известно, чем больше величина среднего наклона электродных функций сенсора, тем выше его перекрестная чувствительность (Власов Ю.Г., Легин A.B., Рудницкая A.M. Электронный язык — мультисенсорная система на основе массива неселективных сенсоров и методов распознавания образов // Ионный обмен и ионометрия. №. 10: Межвузов, сб. С-Пб.: Изд-во С-Пб. ун-та. 2000. С.145-160).

18

Для исследуемых сенсоров величина Scp изменяется в диапазоне 25 < Scp< 48, мВ/рС; фактор неселективности F для данных электродов принимает значения от 0,77 до 9,68; фактор воспроизводимости К меняется в интервале от 108 до 193.

Неселективность сенсоров и высокие значения параметров перекрестной чувствительности положены в основу создания мультисенсорных систем для раздельного определения Р-лактамных антибиотиков.

Проведен количественный анализ двух- и трехкомпонентных модельных смесей р-лактамных антибиотиков (ампициллин-оксациллин; цефазолин-цефотаксим, цефалексин-ампициллин; амоксициллин, ампициллин и оксацил-лин; оксациллин, ампициллин и цефалексин; цефазолин, ампициллин и окса-циллин). Для анализа использовали массив, содержащий от 3 до 6 сенсоров с различными составами мембран. Использовали тестовое и обучающее множество. Концентрации антибиотиков изменялись в интервалах 1 • 10"5 - 1 • 10"2 М. Отклики электродов измеряли три раза в каждой смеси. Аналитические сигналы (э.д.с., мВ) от массива сенсоров обрабатывали методом ИНС. Использовалась искусственная нейронная сеть с обратным распространением ошибок (активаци-онная функция — сигмоида, скорость обучения 0,1; момент 0,9; число эпох 20000). Использовалась трехслойная нейронная сеть, состоящая из 10 нейронов в первом слое, 6 - во втором слое, 1 - в третьем.

На рис. 9 а, б представлены диаграммы, иллюстрирующие примеры раздельного определения р-лактамных антибиотиков в двух- и трехкомпонентных модельных смесях. Анализируя полученные результаты, можно заключить, что погрешность определения Р-лактамных антибиотиков в трехкомпонентных смесях составляет (5-7%); в двухкомпонентных (3-5%).

Рис. 9. Результаты раздельного определения р-лактамных антибиотиков в двух-(а) и трехкомпонентных (б) модельных смесях с использованием мультисен-сорной системы «электронный язык».

Таким образом, показана возможность раздельного количественного определения (3-лактамных антибиотиков в многокомпонентных смесях с использованием массивов слабоселективных потенциометрических сенсоров на основе А§((3-1ас)2ТАА и метода математической обработки аналитических сигналов ИНС.

Результаты обучения нейронной сети в многокомпонентных смесях антибиотиков можно использовать при последующих анализах контрольных смесей, содержащих равное или меньшее число компонентов, анализе фармацевтических препаратов.

Аналитическое применение потенциометрических р-лактамных сенсоров

Разработаны методики потенциометрического определения Р-лактамных антибиотиков в лекарственных и биологических средах, раздельного определения р-лактамных антибиотиков в фармацевтических препаратах и модельных растворах с использованием массивов слабоселективных сенсоров и метода искусственных нейронных сетей.

Проведено определение содержания антибиотиков в 9 фармацевтических препаратах различного срока хранения методом прямой потенциометрии (способ градуировочного графика). Для препаратов 2009-2011 г. выпуска найденные содержания антибиотиков соответствуют заявленным, тогда как препараты более раннего года выпуска содержат значительно меньшее количество действующего вещества. Оценку правильности определения проводили фармакопейным методом йодометрического титрования. Сравнение результатов по Р- и 1-критериям показало отсутствие систематической погрешности.

Определены коэффициенты потенциометрической селективности сенсоров на основе А§(Р-1ас)2ТАА к ряду неорганических ионов (СГ, Вг", НС03", НР042" и др.), которые могут оказывать существенное влияние на отклик сенсора в биологических жидкостях. Полученные коэффициенты селективности свидетельствуют о возможности определения антибиотиков при 10-100 кратных избытках мешающих неорганических ионов, что важно при определении антибиотиков в биологических жидкостях.

Для ионометрического анализа жидкости ротовой полости (ЖРП) сенсоры предварительно кондиционируют в ЖРП. Сенсоры на основе А§(Р-1ас)2ТАА на фоне ЖРП имеют достаточно большой диапазон линейности (1-10^ - 1-10"2М), высокий угловой коэффициент (46-49 мВ/рС), поэтому возможно их применение для определения пенициллинов и цефалоспоринов в биологических средах.

Проведено ионометрическое исследование жидкости ротовой полости доноров с внесенными добавками ампициллина, оксациллина и цефазолина (табл. 6).

Таблица 6. Результаты определения антибиотиков в пробах жидкости ротовой полости здоровых людей с внесенными добавками (п=3; Р=0,95).

№ пробы Антибиотик Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл D, %

1 Am 12,4 11,7±0,5 5,6

2 Ох 11,9 10,8 ± 0,4 9,2

3 Cef 20,3 19,1 ±0,8 5,9

Исследована фармакокинетика препарата «Флемоксин-солютаб» (действующее вещество - амоксициллин) у больных с инфекцией верхних дыхательных путей. Больные однократно получали перорально 500 мг «Флемоксин-солютаб» вечером.

Анализ фармакокинетических кривых был проведен с помощью компьютерной программы Borgia (НПП «Наука Плюс»). Рассчитывались значения основных фармакокинетических параметров: Стах - максимальная концентрация, мкг/мл; Vdss - стационарный объем распределения, л, CLt - общий клиренс, мл/мин; Туг - период полувыведения, ч (табл. 7).

Таблица 7. Сравнительная характеристика экспериментальных и литературных данных по фармакокинетике «Флемоксин-солютаб» (доза 500 мг).

Параметры Экспериментальные данные Литературные данные1

Сщах, МКГ/МЛ 21,5 ± 1,5 18

Vdss, Л 13,1 ±0,3 12,8

Ке1 0,0101 0,0142

CL,, мл/мин 133 ±5 130

1*1/2, Ч 1,1 ±0,1 1-2

Scaglione F., Caronzolo D., Pintucci J. Measurement of Cefaclor and Amoxicillin-Clavulanic Acid Levels in Middle Ear Fluid in Patients with Acute Ottis Media Antimicrob //Agents Chemother. -2003. Vol.47, №9. - P.2987 - 2989.

Показано, что препарат амоксициллин достаточно быстро всасывается и распределяется по всему организму, что способствует достижению устойчивых концентраций антибиотика в организме больного. Полученные данные по фармакокинетике препарата соответствуют литературным. Предел определяемых содержаний антибиотиков составляет 4 мкг/мл. Методика характеризуется экс-прессностью и простотой.

Массивы сенсоров и метод ИНС применены для оценки качества лекарственных препаратов «Оксамп-натрий», представляющих собой смесь Ох : Агп = 1 : 2 (2003, 2008 гг выпуска) при варьировании массовой концентрации растворов от 0,05 до 0,2%.

Для обработки аналитических сигналов использовалась трехслойная нейронная сеть с обратным распространением ошибок. Обучение нейронной сети проводили на модельных двухкомпонентных смесях оксациллина и ампициллина при варьировании соотношения и концентрации компонентов.

Установлено, что в препарате 2003 года выпуска соотношение компонентов оксациллина и ампициллина в препарате составляет 1:1,97. Средняя погрешность определения ампициллина - 7%, оксациллина - 6%. Наблюдается общее уменьшение содержания как ампициллина, так и оксациллина. В препарате 2008 года выпуска соотношение антибиотиков оксациллина и ампициллина по массе составляет 1:2. Средняя погрешность определения ампициллина составила 4%, оксациллина - 5%.

Таким образом, показана возможность использования массива сенсоров и метода искусственных нейронных сетей для количественного анализа двух-трехкомпонентных модельных смесей р-лактамных антибиотиков и лекарственных препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Созданы новые потенциометрические сенсоры на основе комплексов сереб-ра(1) с р-лактамными антибиотиками и катионами тетраалкиламмония. Установлено, что введение в состав активных компонентов мембран соединений А£(Р-1ас)2" приводит к увеличению диапазона определяемых содержании (1-Ю"5 -1-Ю"1 М) и снижению предела обнаружения антибиотиков (7-10"6 М).

2. Оценены основные физико-химические параметры электродноактивных компонентов водной среде и фазе мембраны. Показано, что наиболее устойчивые комплексы с серебром(1) образуют антибиотики цефалоспоринового ряда: ^р равны 7,39±0,07; 7,29±0,08; 7,24+0,06 для цефалексина, цефотаксима и цефазолина соответственно. Наименее растворимыми являются соединения комплексов серебра(1) с Р-лактамными антибиотиками и катионами тет-радециламмония (К5 = п-10"), которые рекомендованы в качестве оптимальных ЭАК.

3. Проведена количественная оценка констант ионизации ампициллина (2,61 ± 0,02; 7,12 ± 0,04), цефалексина (2,48 ±0,01; 7,31 ± 0,05), оксациллина (2,70 ± 0,01), цефазолина (2,70 ± 0,02), цефотаксима (2,23 ± 0,06; 3,14 ± 0,05; 10,64 ± 0,08) и цефтриаксона (2,37 ± 0,03; 3,36 ± 0,07; 10,76 ± 0,06) потен-циометрическим и спектрофотометрическим методами. Установлены области кислотности существования катионной, анионной и цвиттер-ионной формы антибиотиков.

4. По результатам исследования транспортных свойств жидкостных и пластифицированных мембран в условиях диффузионного массопереноса и при постоянном токе показана обратимость ионообменных процессов между мембранами и внешними растворами антибиотиков. Введение в состав электродноактивных компонентов комплексов серебра(1) с р-лактамными антибиотиками приводит к уменьшению общего сопротивления мембран

(0,5-1,2 МОм) по сравнению с мембранами, не содержащие серебро(1) (1,21,6 МОм). По стационарным значениям сопротивления мембран рассчитаны кажущиеся константы диссоциации ЭАК (п-10"4 М).

5. По коэффициентам потенциометрической селективности (Ку~1) и параметрам перекрестной чувствительности р-лактамных сенсоров (средний наклон электродных функций 25<Scp<48 мВ/рС; фактор неселективности 0,77<F<9,68; фактор воспроизводимости 108<К< 193) показано их применение в мультисенсорных системах типа «электронный язык».

6. Массивы потенциометрических сенсоров и метод ИНС применены для раздельного определения антибиотиков в двух- и трехкомпонентных модельных смесях, фармацевтических препаратах. Диапазон определяемых содержаний 5-10"5 - 1-Ю'1 М, погрешность определения - 5- 7%.

7. Разработаны методики экспрессного ионометрического определения Р-лактамных антибиотиков в фармацевтических препаратах различного срока хранения, жидкости ротовой полости практически здоровых лиц и больных с инфекцией верхних дыхательных путей. Результаты подтверждены методом «введено-найдено».

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Кулапина Е.Г., Снесарев C.B. Потенциометрические сенсоры на основе органических ио-нообменников теграалкиламмония и комплексов серебра(1) с ампициллином, оксацилли-ном, цефазолином // Журн. аналит. химии. 2012. Т.67, №2. С.198-202.

2. Кулапина Е.Г., Снесарев C.B., Макарова Н.М., Погорелова Е.С. Массивы потенциометрических сенсоров для раздельного определения антибиотиков пенициллинового ряда с использованием метода искусственных нейронных сетей // Журн. аналит. химии. 2011. Т.66, №1. С.82-87.

3. Снесарев C.B., Кулапина Е.Г. Комплексообразование серебра (I) с ампициллином, окса-циллином, цефазолином и цефотаксимом в водных растворах // Известия Саратовского университета. Новая серия. Т. 12. Серия Химия. Биология. Экология. 2012. Вып.1. С. 17-21.

4. Кулапина Е.Г., Снесарев C.B., Кулапина О.И., Утц. И.В. Экспрессное определение цеф-триаксона в смешанной слюне практически здоровых лиц и больных с инфекционно-соматической патологией // Антибиотики и химиотерапия. 2011. Т.56, №7-8. С.30-33.

5. Кулапина Е. Г., Баринова О. В., Кулапина О. И., Утц И. А., Снесарев С. В. Современные методы определения антибиотиков в биологических и лекарственных средах // Антибиотики и химиотерапия. 2009. № 9-10. С.53-60.

6. Кулапина Е.Г., Макарова Н.М., Михалева О.В., Погорелова Е.С., Снесарев C.B. Мульти-сенсорный анализ гомологов ПАВ и антибиотиков пенициллинового ряда // Материалы П Межд. форума «Аналитика и Аналитики». Воронеж. 2008. T.I. С.211.

7. Кулапина Е.Г., Снесарев C.B. Массивы сенсоров для раздельного определения р-лактамных антибиотиков // III Всерос. конф. с межд. участием. «Аналитика России». Краснодар. 2009. С.138

8. Снесарев C.B., Погорелова Е.С. Массивы потенциометрических сенсоров для раздельного определения антибиотиков пенициллинового ряда методом ИНС // Материалы межд. молодежного форума «Ломоносов-2009». Секция «Химия», 13-18 апреля 2009 г., Москва, 2009. С.60.

9. Снесарев C.B., Погорелова Е.С., Кулапина Е.Г. Мультисенсорные системы типа «электронный язык» для раздельного определения р-лактамных антибиотиков в лекарственных формах // Всерос. молодежная выставка-конкурс прикладных исследований, изобретений и инноваций. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2009. С.36.

10. Снесарев C.B., Михайлова М.С. Новые потенциометрические сенсоры для определения Р-лактамных антибиотиков // Материалы межд. молодежного форума «Ломоно-сов-2010». Секция «Химия», 12-15 апреля 2010 г., Москва, 2010. С.66.

11. Снесарев C.B., Михайлова М.С. Сенсоры для определения антибиотиков пеницилли-нового и цефалоспоринового ряда // Материалы Всерос. конф. молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов «Инновации в химии - достижения и перспективы». 19-23 апреля 2010 г., Москва, 2010. С.32.

12. Кулапина Е.Г., Снесарев C.B. Потенциометрические сенсоры на основе комплексных соединений металлов с р-лактамными антибиотиками и катионов тетраалкиламмония // Съезд аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности», 26-30 апреля 2010 г., Москва, 2010. С.167-168.

13. Снесарев C.B., Кулапина Е.Г. Комплексообразование р-лактамных антибиотиков с ионом серебра(1) // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Межвуз. сборник науч. трудов VII Всерос. конф. молодых ученых с межд. участием. Саратов: Изд-во«КУБиК». 2010. С.220-222.

14. Снесарев C.B. Мультисенсорные системы для раздельного определения Р-лактамных антибиотиков // Материалы V Всероссийской конференции студентов и аспирантов «Химия в современном мире», СПб., 2011. С.55-56.

15. Снесарев C.B., Косырев С.С., Кулапина Е.Г. Определение констант ионизации цефотак-сима методом УФ-спектроскопии // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Межвуз. сборник науч. трудов VIII Всерос. конф. молодых ученых с межд. участием. Саратов: Изд-во«КУБиК». 2011. С. 138-140.

16. Снесарев C.B., Кулапина Е.Г. Влияние устойчивости комплексных соединений цеф-триаксона и цефазолина на электроаналитические свойства сенсоров на их основе. // Материалы докладов XIX Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, 2530 сентября 2011 г., Волгоград, Т.4. С.413.

17. Кулапина Е.Г., Снесарев C.B. Раздельное определение Р-лактамных антибиотиков с использованием массивов потенциометрических сенсоров и метода искусственных нейронных сетей. // Материалы III Всероссийского симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии», 2-8 октября 2011г., Краснодар, 2011. С.252.

18. Снесарев C.B., Кулапина Е.Г. Спектрофотометрическое и потенциометрическое изучение комплексообразование ионов серебра® с некоторыми Р-лактамными антибиотиками. // Сборник материалов молодежной конференции «Международный год химии», 5-7 октября 2011 г., Казань, 2011. С.125-126.

19. Косырев С.С., Снесарев C.B. Потенциометрические сенсоры, чувствительные к це-фотаксиму // Материалы межд. молодежного форума «Ломоносов-2012». Секция «Химия», 9-13 апреля 2012 г., Москва, 2012. С.70

Подписано в печать 20.04.2012 г. Формат 60x84 1/16. Печать цифровая. Гарнитура «Тайме» Объем 1,5 усл.печл. Тираж 100 экз. Заказ № 114-Т

Типография Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского 410012 г. Саратов, ул. Большая Казачья, д.. 112 а Тел.: (8452) 27-33-85

61 12-2/544

САРАТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.Г. ЧЕРНЫШЕВСКОГО

На правах рукописи

Снесарев Сергей Владимирович

ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ КОМПЛЕКСОВ СЕРЕБРА(1) С НЕКОТОРЫМИ р-ЛАКТАМНЫМИ АНТИБИОТИКАМИ И КАТИОНАМИ ТЕТРААЛКИЛААМОНИЯ

02.00.02 - аналитическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор,

Кулапина Елена Григорьевна

Саратов - 2012

Работа выполнена на кафедре аналитической химии и химической экологии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................. 6

Глава 1 МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ. ПУТИ ПОВЫШЕНИЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОСТИ И СНИЖЕНИЯ ПРЕДЕЛА ОБНАРУЖЕНИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)............................................................... Ю

1.1. Методы определения антибиотиков в биологических и лекарственных средах............................................................................. 10

1.2. Мультисенсорные системы типа «электронный язык» в решении задач раздельного определения лекарственных веществ..................... 27

Глава 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ......................................... 46

2.1. Объекты исследования, реактивы и синтезы.............................. 48

2.2. Синтез электродно-активных компонентов, получение мембран и электродов......................................................................... 52

2.3. Методы исследования........................................................... 56

Глава 3 СОСТОЯНИЕ ПЕНИЦИЛЛИНОВ И ЦЕФАЛОСПОРИНОВ ПРИ РАЗЛИЧНОЙ КИСЛОТНОСТИ СРЕДЫ.................................................. 67

3.1. Строение молекул пенициллинов и цефалоспоринов................... 68

3.2. Устойчивость амфотерных антибиотиков с карбоксильными и ами-нотиазольными группами при различной кислотности среды.......... 71

3.3. Состояние в водных средах амфотерных антибиотиков с карбоксильными и аминными группами............................................ 78

3.4. Поведение антибиотиков кислотного типа в водных средах............ 82

Глава 4 ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭЛЕКТР О ДНО АКТИВНЫХ КОМПОНЕНТОВ МЕМБРАН.................................................. 88

4.1. Комплексообразование ионов серебра(1) с некоторыми |3-лактамными антибиотиками.................................................. 89

4.1.1. Особенности комплексообразования серебра (I) с некоторыми органическими лигандами................................................. 90

4.1.2. Спектрофотометрическое исследование комплексообразования в системе серебро(1) - (3-лактамный антибиотик................. 91

4.1.3. Исследование комплексообразования в системе серебро(1) -(3-лактамный антибиотик потенциометрическим методом............. 96

4.2. Растворимость электродноактивных компонентов мембран на ос-

нове [Ag(p-lac)2]TAA................................................................. 104

Глава 5 ПОВЕРХНОСТНЫЕ И ОБЪЕМНЫЕ СВОЙСТВА МЕМБРАН ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИХ СЕНСОРОВ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ К ПЕ-НИЦИЛЛИНАМ И ЦЕФАЛОСПОРИНАМ......................................... 112

5.1. Поверхностные свойства мембран........................................... 113

5.1.1. Электрохимические характеристики сенсоров на основе [Ag((3-lac)2]TAA.................................................................. 114

5.2. Объемные (транспортные) свойства мембран на основе [Ag(p-lac)2]TAA........................................................................ 123

5.2.1. Транспортные процессы в условиях диффузионного массопереноса. 124

5.2.2. Количественные характеристики транспортных процессов в условиях постоянного тока............................................................. 128

Глава 6 МАССИВЫ ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИХ СЕНСОРОВ ДЛЯ РАЗДЕЛЬНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ р-ЛАКТАМНЫХ АНТИБИОТИКОВ.... 136

6.1.Селективность потенциометрических сенсоров на основе [Ag(P-lac)2]TAA...................................................................... 136

6.1.1. Селективность к неорганическим ионам......................... 137

6.1.2. Селективность к пенициллинам и цефалоспоринам............ 142

6.2. Перекрестная чувствительность сенсоров на основе Ag(P-lac)2TAA. 146

6.3. Мультисенсорные системы типа «электронный язык» для раздельного определения |3-лактамных антибиотиков в двух- и трехкомпо-нентных смесях........................................................................ 150

Глава 7 АНАЛИТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИХ р-ЛАКТАМНЫХ СЕНСОРОВ................................................ 163

7.1. Определение р-лактамных антибиотиков в фармацевтических формах методом прямой потенциометрии....................................... 165

7.2. Ионометрическое определение Р-лактамных антибиотиков в жидкости ротовой полости............................................................... 170

7.3. Раздельное определение р-лактамных антибиотиков в модельных смесях и лекарственных препаратах с использованием массивов сенсоров и метода искусственных нейронных сетей............................... 176

ВЫВОДЫ................................................................................... 180

ЛИТЕРАТУРА............................................................................. 182

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИСЭ - ионоселективный электрод;

ПВХ - поливинилхлорид;

ДБФ - дибутилфталат;

ТАА - тетраалкиламмоний;

TDA - тетрадециламмоний;

DMDSA - диметилдистеариламмоний;

ИА - ионный ассоциат

КПАВ - катионные поверхностно-активные вещества;

Hai - галоген

ß-lac - беталалактам

Реп - бензилпенициллин;

Am - ампициллин;

Ох - оксациллин;

Cef - цефазолин;

Ceftx - цефотаксим;

Ceflx - цефалексин;

Ceftr - цефтриаксон;

ЭАС - электродно-активное соединение;

ЭАК - электродно-активный компонент;

ЭАВ - электродно-активное вещество;

ЖК - жидкоконтактный электрод;

ИНС - искусственная нейронная сеть;

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Определение (3-лактамных антибиотиков, как одной из групп лекарственных соединений, получивших широкое распространение, но в то же время, обладающих потенциальной опасностью для здоровья человека, является одной из актуальных проблем современной аналитической химии. Объекты, в которых необходимо определять и контролировать содержание антибиотиков, весьма разнообразны: фармацевтические препараты, биологические жидкости организма человека и животных, продукты питания, сточные воды фармацевтических предприятий и др.

Для контроля за содержанием антибиотиков в различных объектах необходима разработка экспрессных методов их определения. Известные к настоящему времени Р-лактамные сенсоры позволяют детектировать индивидуальные антибиотики или их суммарное содержание. Снижение предела обнаружения и повышение селективности определения |3-лактамных антибиотиков с применением потенциометрических сенсоров является актуальным.

Развитие ионометрии органических соединений предполагает использование в составе активных компонентов мембран заряженных комплексов определяемых веществ с ионами металлов. Этот прием позволяет существенно повысить чувствительность определения органических веществ. Принципиально новый подход для раздельного определения (3-лактамных антибиотиков может быть связан с использованием неселективных (слабоселективных) сенсоров, обладающих наибольшей перекрестной чувствительностью, в муль-тисенсорных системах типа «электронный язык». Известно применение таких систем для определения различных веществ в технологических растворах, природных водах, пищевых и биологических образцах. В литературе отсутствуют сведения о применении массивов сенсоров дня раздельного определения [3-лактамньгх антибиотиков.

В связи с последним создание потенциометрических сенсоров на основе органических ионообменников тетраалкиламмония и комплексов серебра(1) с некоторыми Р-лактамными антибиотиками, изучение их элек-

тродных, селективных свойств, оценка количественных характеристик мембранного транспорта актуально на современном этапе развития ионометрии антибиотиков.

Цель работы создание потенциометрических сенсоров на основе комплексов серебра(1) с некоторыми (3-лактамными антибиотиками и катионами тетраалкиламмония, определение их электроаналитических характеристик, оценка возможности применения в мультисенсорном анализе для раздельного определения антибиотиков в многокомпонентных модельных смесях, фармацевтических препаратах.

Для достижения поставленной цели в работе необходимо было решить следующие задачи:

• исследовать протолитические свойства ампициллина, оксациллина, це-фазолина, цефотаксима, цефалексина и цефтриаксона;

• провести количественную оценку устойчивости комплексных соединений серебра(1) с некоторыми Р-лактамными антибиотиками потенцио-метрическим и спектрофотометрическим методами;

• оценить физико-химические характеристики электродноактивных компонентов мембран в водных средах и в фазе мембран;

• установить влияние природы активных компонентов на поверхностные, селективные и объемные свойства мембран, чувствительных к р-лактамным антибиотикам;

•создать массивы сенсоров для раздельного определения Р-лактамных антибиотиков в многокомпонентных смесях;

•разработать методики раздельного и суммарного определения р-лактамных антибиотиков в модельных смесях, лекарственных формах и биологических жидкостях.

Научная новизна полученных в диссертации результатов заключается в том, что:

• Проведена количественная оценка констант ионизации Р-лактамных антибиотиков, относящихся к кислотным, амфотерным с аминогруппами и

амфотерным с аминотиазольными группами спектрофотометрическим и потенциометрическим методами. Установлены границы кислотности существования антибиотиков в катионной, анионной, цвиттер-ионной формах;

• Рассчитаны физико-химические параметры электродно-активных соединений (состав, растворимость, устойчивость, степень ионизации) в водной среде и фазе мембраны, и показана возможность прогнозирования состава мембран сенсоров с оптимальными электроаналитическими свойствами;

• Определены электроаналитические и операционные характеристики новых потенциометрических сенсоров на основе катионов тетраалкиламмония и анионных комплексов серебра(1) с р-лактамными антибиотиками. Показано преимущество сенсоров, включающих заряженный комплекс серебро-Р-лактам;

• Проведена количественная оценка селективности и перекрестной чувствительности сенсоров на основе различных ЭАК. Показано, что указанные параметры являются двумя различными подходами выбора сенсоров для мультисенсорных систем;

• Созданы массивы потенциометрических слабоселективных сенсоров с высокой перекрестной чувствительностью, стабильностью и воспроизводимостью электроаналитических характеристик для раздельного определения р-лактамных антибиотиков в многокомпонентных смесях, фармацевтических препаратах

Практическая значимость работы состоит в том, что:

• Созданы потенциометрические сенсоры на основе комплексов серебра с ампициллином, оксациллином, цефазолином, цефотаксимом, цефа-лексином и цефтриаксоном и катионами тетраалкиламмония с заданными электроаналитическими характеристиками.

• Показано, что для сенсоров на основе Ag(p-lac)2TAA расширяется диапазон определяемых концентраций и значительно снижается предел обнаружения антибиотиков.

• Разработаны методики ионометрического определение [3-лактамов в лекарственных и биологических средах.

• Массивы сенсоров и метод ИНС применены для раздельного определения Р-лактамных антибиотиков в 2-3-компонентных модельных смесях и фармацевтических препаратах.

На защиту автор выносит;

• Физико - химические характеристики активных компонентов мембран на основе комплексов серебра(1) с Р- лактамными антибиотиками и катионами тетраалкиламмония в водных средах и фазе мембран.

• Электроаналитические свойства потенциометрических сенсоров, чувствительных к р- лактамным антибиотиками.

• Массивы сенсоров и метод ИНС для раздельного определения пени-циллинов и цефалоспаринов в модельных смесях и фармацевтических препаратах.

• Аналитическое применение разработанных сенсоров в анализе лекарственных и биологических сред.

Глава 1

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОВ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ. ПУТИ ПОВЫШЕНИЯ ИЗБИРАТЕЛЬНОСТИ И СНИЖЕНИЯ ПРЕДЕЛА ОБНАРУЖЕНИЯ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Методы определения антибиотиков в биологических и лекарственных средах

В настоящее время антибиотики занимают ведущее место в медицине и ветеринарии при лечении различных инфекционно-воспалительных заболеваний, для противоинфекционной профилактики в хирургии [1-5]. Широкое применение антибиотиков привело к развитию резистентных штаммов основных патогенов. Исследователи и клиницисты стараются решить эту проблему следующими путями: синтезом антибиотиков новых поколений, созданием ингибиторов (3-лактамаз, комбинированием уже известных антибиотиков, созданием новых лекарственных форм и изменением режима дозирования [2-4], что в свою очередь требует определения концентрации антибиотиков в различных объектах.

Кроме медицинских целей, антибиотики широко применяются для улучшения качества и сохранности кормов, в процессе производства изделий из мяса, молока, овощей и т.д.[5]. Источниками поступления антибиотиков в окружающую среду являются сточные воды фармацевтических предприятий и клиник.

Следовательно, определение антибиотиков, как одной из групп лекарственных соединений, получивших широкое распространение, но в то же время, обладающих потенциальной опасностью для здоровья человека, является актуальной проблемой современной клинической, аналитической химии, ветеринарии, фармацевтической и пищевой промышленностей.

Значительное число публикаций по определению лекарственных веществ, в том числе и антибиотиков, в различных объектах обобщены в обзорах [6-14].

IIa рис, 1 представлены основные источники поступления антибиотиков в окружающую среду.

Отходы жизнедеятельности

Утилизация эрм. препарата Удобрения

Биоотходы

Внутренние

стоки

Поля

i

Луга

| Отстой-

Водоочистные /* НИКИ сооружения

'•А

Утилизация отходте

:

Почва

/

А

Поверхностные воды

Грунтовые воды

~Г

/

Аква-культура

Производства антибиотиков

Питьевая вода

Рис. 1. Пути поступления и источники остатков антибиотиков в окружающей среде.

Для количественного определения [3-лактамных антибиотиков в биологических жидкостях и лекарственных формах при оценки физиологических и биохимических процессов, протекающих в организме, а также для контроля качества лекарственных средств, используются различные биологические и физико-химические методы анализа ¡11].

Особенность методов электрохимического анализа состоит в том, что в анализируемую систему не вводятся какие-либо химические реагенты, а используются процессы, связанные с переносом ионов или электронов. Из

электрохимических методов для определения антибиотиков в биологических жидкостях и фармацевтических формах чаще всего применяются вольтампе-рометрия и потенциометрия.

Различные варианты вольтамперометрии (циклическая, адсорбционная, инверсионная, дифференциальная импульсная) используются для определения основных групп антибиотиков.

Метод катодной и анодной инверсионной вольтамперометрии был предложен для определения бензилпенициллина, макролидных антибиотиков [15], пефлоксацина [16], стрептомицина и азитромицина [17]. Пенициллин в концентрируют из анализируемой пробы на стационарном ртутно-пленочном электроде при заданном потенциале в течение 2-5 мин. в виде малорастворимого соединения с ртутью. Затем регистрируют ток электрорастворения этого соединения при катодной линейной развертке потенциала. Определения макролидов в фармацевтических препаратах, а также плазме крови человека и моче возможно в рабочем интервале рН 7-12.

Разработана методика электрокаталитического определения стрептомицина, новобиоцина и неомицина с использованием Ки02 - модифицированного эпоксиграфитового композитного электрода при низких потенциалах (+0,2В). Предел обнаружения составил 1,5-10 мкг/мл.

Метод анодной вольтамперометрии на стеклоуглеродных электродах предложен для определения тетрациклина. На вольтамперных кривых, снятых до электрохимической обработки индикаторных электродов, наблюдается две слабо выраженные анодные волны с потенциалом полуволны +0,50 В и +0,80 В. После электрохимической обработки на анодных кривых наблюдалась одна четкая волна окисления тетрациклина с потенциалом полуволны +0,70 В. Нижняя граница определения тетрациклина составила 2,3-10"9 М, хлор- и окси- тетрациклинов - 510"9 М [18].

Определение гентамицина с помощью амперометрического иммуно-ферментного сенсора проведено авторами [19]. Биочувствительная часть им-муноферментного сенсора включает совместно иммобилизованные фермент

холинэстеразу и антитела против гентамицина. Нижняя граница определяемых содержаний 1 • 10"9 мг/мл.

Потенциометрия с ионоселективными электродами является перспективным, экспрессным, простым, доступным и дешевым методом определения пенициллиновых и цефалоспориновых антибиотиков. Потенциометрические (3-лактамные сенсоры позволяют детектировать как индивидуальные антибиотики так и их суммарное содержание в различных объектах.

Ионометрическое определение (З-лактамных антибиотиков предложено авторами [20]. Исследован