Пространственная структура и конформационное состояние малых биологически активных молекул в растворах по данным одно- и двумерной спектроскопии ЯМР тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

005533134

На правах рукописи

Ходов Илья Анатольевич

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И КОНФОРМАЦИОННОЕ СОСТОЯНИЕ МАЛЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МОЛЕКУЛ В РАСТВОРАХ ПО ДАННЫМ ОДНО- И ДВУМЕРНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР

02.00.04 - Физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 ь СГН 2013

ИВАНОВО-2013

005533134

Работа выполнена в лаборатории «ЯМР-спектроскопия и численные методы ис следования жидких систем» Федерального государственного бюджетного учре ждения науки «Институт химии растворов им. Г.А. Крестова» Российской акаде мии наук.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Альпер Геннадий Аркадьевич

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

доцент

Титов Валерий Александрович (ФГБОУ ВПО «Ивановский государственный химико-технологический университет», профессор кафедры технологии приборов и материалов электронной техники)

доктор химических наук, доцент

Ноговицын Евгений Анатольевич

(ФГБОУ ВПО «Ивановский государственный университет», профессор кафедры общей и теоретической физики)

Ведущая организация: ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский)

федеральный университет» (г. Казань)

Защита состоится «7» октября 2013 г. в 10.00 на заседании диссертационного совета Д 212.063.06 при Ивановском государственном химико-технологическом университете по адресу: 153000, г. Иваново, пр. Ф. Энгельса, 7, ауд. Г-205. Тел.: (4932) 32-54-33, факс: (4932) 32-54-33, e-mail: dissovet@isuct.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Информационном центре Ивановског государственного химико-технологического университета по адресу: 15300 г. Иваново, пр. Ф. Энгельса, 10.

Автореферат разослан «6» сентября 2013г.

Ученый секретарь

совета Д 212.063.06

e-mail: Egorova-D6@yandex.ru

горова Елена Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Определение пространственной структуры и конформационного состояния молекул в растворах является одной та важнейших задач физической химии. Накопление и обобщение данных о «информационном состоянии молекул в растворе дает возможность подойти к фундаментальному пониманию процессов, протекающих на молекулярном уровне. Эта процессы определяют не только биологическую активность молекул, но также могут определять нуклеацию кристаллов данных соединений из их насыщенных растворов. Малые биологически активные молекулы входят в состав большого числа лекарственных средств, активно используемых в медицине. Так, парацетамол (ацегаминофен, N-(4-гидроксифенил)ацетамид, QH9O2N) обладает анальгегаческими и ангипирешческими свойствами; фелодипин (3-эт1Ш-5-метил-4-(23-Дихлорфенил)-2,6-диметш1-1,4-ди1тццюгафидин-3^^ дикарбоксил, C18H19G2NO4) получил широкое распространение благодаря своим атигипертен-зивным и ангиангиальным свойствам. Ибупрофен ((НБ)-2-(4-изобутилфенил)-пропионовая кислота, С13Н18О2) - нестероидный препарат, который обладает противовоспалительной активностью и применяется при ревматоидном артрите, деформирующем остеоартрозе и др. заболеваниях для облегчения бсши и уменьшения лихорадки.

Среди многообразия физико-химических методов, которые используются при решении указанных фундаментальных проблем, ключевыми являются одно- и двумерная спектроскопия ЯМР ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО). Методы спектроскопии ЯЭО в лабораторной (NOESY - Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) и вращающейся системах координат (T-ROESY—Transverse Rotating-frame Overhauser Enhancement Spectroscopy) дают возможность определять расстояния между ядрами, вплоть до 5 Á. Совместное использование экспериментальных данных ЯМР по межъядерным расстояниям и результатов квангово-химических расчетов позволяет определять относительные населенности конформаций. Однако спектроскопия ЯЭО недостаточно адаптирована к исследованию пространственной структуры малых конфор-мационно под вижных молекул, подпадающих под условие крайнего сужения линий (сооТс«1, где te - время корреляции молекулярного движения, cao - угловая скорость прецессии магнитных ядер). Основными факторами, затрудняющими такого рода измерения, являются слабая интенсивность кросс-пиков, длительное время эксперимента, дрейф экспериментальных параметров и др. Кроме того, процессы, обусловленные косвенными путями переноса намагниченности (спиновой диффузией), негативно влияют на спектральные характеристики изучаемых соединений, не позволяя корректно описать их конформационное состояние.

Таким образом, весьма важной задачей является разработка эффективного подхода получения информации о межъядерных расстояниях в малых молекулах с минимальной ошибкой измерения.

Целью диссертационной работы являлось определение пространственной структуры и конформационного состояния биологически активных веществ методами одномерной спектроскопии ЯМР 'Н, |3С и одно- и двумерной спектроскопии ЯЭО; разработка и реализация подхода ЯМР NOESY для количественного определения доли конформеров малых нежестких биологически активных молекул в растворах, а также решение задачи подавления эффекта спиновой диффузии при определении межпротонных расстояний методом двумерной спекхроскопии ЯМР NOES Y.

Методы исследования. При решении поставленных задач использовались современные методы спектроскопии ЯМР высокого разрешения; в частности, в качестве основных были использованы эксперименты по спектроскопии ЯЭО: 2D NOESY, 2D T-ROESY, ID NOE, ID Т*

ROE и модификация QUŒT-NOESY (Quenching Undesirable Indirect External Trouble in Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy). В качестве дополнительных методов использовались 2D TOCS Y (TOtal Correlation Spectroscopy), DOSYpifussion-Ordered SpectrocopY), HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation), HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation), COSY (Correlation SpectroscopY), ID TOCSY.

Эксперименты проводились с использованием ЯМР спектрометра «AVANCE Ш 500» фирмы «Bruker» (рабочая частота 500 МГц на ядрах 'Н и 125 МГц на ядрах

Научная новизна диссертационной работы состоит в следующем:

Впервые определены эффективные (усредненные по всем конформерам) межпротонные расстояния в молекуле парацетамола в его насыщенном растворе в ДМФА с помощью методов двумерной ЯМР спектроскопии ЯЭО. Проведены расчеты доли конформеров путем совместного анализа экспериментальных данных и результатов квангово-химических расчетов.

Впервые получены экспериментальные данные об относительных межпрсггонпых расстояниях в молекулах фелодипина методом одно- и двумерной ЯМР спектроскопии ЯЭО в его растворах в ДМСО при двух концентрациях.

Создана импульсная программа QUIET-NOESY, с использованием которой достигнуто подавление артефакшых эффектов переноса намагниченности косвенными путями (спиновой диффузии) в спектрах NOESY фелодипина в ДМСО. Результаты эксперимента QUIET-NOESY подтверждены путем сопоставления с данными NOES Y/T-ROESY эксперимента.

Определены доли конформеров молекулы фелодипина в ДМСО при малой концентрации (0,077 г/дм*) и в насыщенном растворе.

Получены эффективные межпрогонные расстояния в молекуле ибупрофена в его насыщенном растворе в хлороформе методами двумерной ЯМР спектроскопии ЯЭО. Рассчитаны доли конформеров молекулы ибупрофена.

Обнаружена инверсия распределения конформеров изученных малых нежестких молекул (ибупрофена, парацетамола, фелодипина) при переходе от разбавленных растворов к насыщенным.

Основные положения, выносимые на защиту:

Метод определения населенности конформационных состояний для малых нежестких молекул в растворах в случае нескольких конформационных равновесий (по данным 1D и 2D спектроскопии ЯМР)

Программы для импульсной последовательности QUIET-NOESY, реализующие подавление спиновой диффузии в 2D экспериментах NOESY.

Результаты экспериментов по определению эффективных межпротонных расстояний в молекулах парацетамола, фелодипина и ибупрофена в растворах.

Выявленный эффект инверсии распределения конформеров малых нежестких молекул (парацетамола, ибупрофена, фелодипина) при переходе от разбавленных к насыщенным растворам.

Обоснованность и достоверность результатов подтверждается согласием полученных данных с результатами исследований, проводимых другими методами, в частности, с данными численного моделирования и ИК спектроскопии; сравнением различных подходов в ЯМР спектроскопии (например, с данными анализа сопоставления констант скорости кросс-релаксации NOES Y/T-ROESY и одномерной селективной спектроскопии NOE, в тех случаях, когда это было возможно); использованием современного оборудования и методических подходов к исследованию.

Практическая значимость работы:

Предложенная методика позволяет эффективно исследовать структуру малых »информационно подвижных молекул лекарственных соединений в условиях предельного сужения (соо-тс«1).

Результаты имеют важное значение для понимания биологической активности малых нежестких молекул лекарственных соединений (ибупрофена, парацетамола, фелодипина) в растворах. Описание информационного состояния изученных молекул в растворах может использоваться при анализе межмолекулярных взаимодействий, которое во многом определяет их биологическую активность. Установленная закономерность инверсии населенности информационного состояния исследованных молекул может помочь выявить пути получения кристаллов д анных соединений тех или иных полиморфных форм из насыщенных растворов.

Личный вклад автора. Участие при постановке целей и задач исследования. Выполнение экспериментов ЯМР по изучению пространственной структуры малых конформационно подвижных молекул. Обработка, анализ и интерпретация теоретических и экспериментальных данных. Формулировка основных положений и выводов диссертации.

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на международной конференции «Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter. NMR in Heterogeneous Systems» (St Petersburg, Russia, 2010);V Всероссийской конференции «Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях» (Казань, 2011); XXV Международной Чугаевской конференции по координационной химии (Суздаль, 2011); XI Международной конференции «Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах» (Иваново, 2011); VI и VH конференциях молодых ученных «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем» (Иваново, 2011-2012); XVI Симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Иваново, 2011); XV международной молодежной научной школе «Actual Problems of Magnetic Resonance and its Applications» (Kazan, Russia, 2012); международной конференции «Kinetics and mechanisms of crystallization and next generation material» (Ivanovo, Russia, 2012); XIX Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Йошкар-Ола, 2012).

Диссертационная работа выполнена в ИХР РАН в соответствии с основными научными направлениями фундаментальных исследований РАН по теме «Молекулярные и ион-молекулярные жидкофазные системы в широком диапазоне параметров состояния, включая свсрхкритическое. Структура, динамика и сольватационные эффекты» (№ гос. регистрации 01200950825) (2010-2011 г.) и по теме «Развитие подходов и методов физической химии в исследовании многокомпонентных супрамолекулярных, молекулярных и ион-молекулярных систем как перспективных материалов» (№ гос. регистрации 01201260481) (2012-2013 г.). Работа была поддержана федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (TJC №02.740.11.0857), международной программой имени Марии Кюри (FP7-PEOPLE-2009-IRSES), грант № 247500, а также грантами Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ)(№ 12-03-31001 мол_аи№ 12-03-00775_а).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах и 13 работ в сборниках трудов и тезисов вышеперечисленных Международных и Российских научных конференций.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы, авторского списка литературы и приложений. Работа изложена на 170 страницах, содержит 69 рисунков и 31 таблицу. Список цитированной литературы содержит 320 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность диссертационной работы, сформулирована цель, приведены методы и объекты исследования, научная новизна и практическая значимость полученных результатов, представлены выносимые на защту научные положения.

В первой главе на основе литературных данных изложены положения теории одномерной спектроскопии ЯМР, теории релаксации, ядерного эффекта Оверхаузера. Описаны одномерные селективные методы с импульсным градиентом магнитного norra(gradient selective pulse-gs), такие, как gsTOCSY, gsNOESY, gsT-ROESY.

Во второй главе изложены основные особенности двумерной спектроскопии ЯМР, а также более подробно рассмотрено применение импульсной последовательности NOESY для определения пространственной структуры различных конформаций и расчета отдельных межпрогонных расстояний в органических молекулах.

В третьей главе рассмотрены объекты и методы исследования. Дано теоретическое описание основных типов конформаций и информационных переходов, а также известных полиморфных модификаций и их связь с конформерами для рассмотренных соединений. Изложены технические особенности проведения эксперимента и обработки результатов.

Четвертая глава посвящена анализу подходов к определению пространственной структуры и информационного состояния малых нежестких молекул в растворах на основе согласованного использования полученных экспериментальных данных спектроскопии ЯМР и результатов квантово-химического моделирования.

Изложены возможные подходы к определению межпротонных расстояний в растворах для информационно нежестких молекул на основе одно- и двумерной спектроскопии ЯМР ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) в лабораторной (NOESY) и вращающейся системах координат (T-ROESY), а также описаны модели усреднения расстояний, полученных на основе данных квангово-химических расчетов. Изложены подходы к определению доли конформеров в растворах путем совместного анализа экспериментальных данных и результатов квангово-химических расчетов.

Ключевым моментом одно- и двумерных экспериментальных подходов ЯМР является анализ зависимости значений интегральных ингенсивностей сигналов в спектрах ЯЭО от величины времени смешивания. На основе данной зависимости с использованием различных способов интерпретации и обработки экспериментальных данных получают информацию о скорости кросс-релаксации.

Известное в ЯМР спектроскопии приближение начальной скорости кросс-релаксации позволяет значительно упростил, анализ такого рода. В рамках данного приближения скорость изменения интенсивности кросс-пиков прямо пропорциональна значениям скорости кросс-релаксации о,. При этом сами скорости кросс-релаксации спиновых систем i и j обратно пропорциональны расстоянию /v в шестой степени между данными спинами: а;у ~ . При известном расстоянии г^ в одной калибровочной паре одер с соответствующей скоростью кросс-релаксации Grf можно из относительных значений констант »росс-релаксации определил, рас-

(1), где ntl -насе-

а «/

стояния между остальными взаимодействующими ядрами: г9 = гп, I-

пгчач

ленность спиновых состояний для данного сигнала в спектре исследуемого образца. Расстояние между протонами зависит от конформационного равновесия в растворе. Поэтому калибровом-

ные расстояния г^ подбиралась для каждого соединения индивидуально, а иногда использовались дополнительные калибровочные расстояния.

При исследовании малых конформационно подвижных молекул, которые характеризуются коротким временем корреляции (тс), данный подход не дает адекватных результатов из-за ряда экспериментальных особенностей, затрудняющих получение точных межпротонных расстояний.

Нами разработан подход к определению пространственной структуры и информационного состояния для малых нежестких молекул, который заключается в следующем:

1. На основе данных одномерной 'Н, 13С и двумерной TOCSY, HSQC, НМВС спектроскопии ЯМР растворов исследуемого соединения производится отнесение сигналов к соответствующим группам резонирующих ядер. В качестве дополнительного источника информации для отнесения линий используется двумерная обменная спектроскопия NOESY, двумерная диффузионная спектроскопия DOSY и одномерная селективная спектроскопия ID TOCSY.

2. Производится оценка времени корреляции(тс) на основе анализа результатов двумерного диффузионного эксперимента DOSY, после чего выбирается экспериментальный подход к определению скоростей кросс-релаксации с подавлением или без подавления косвенных путей переноса намагниченности.

3. Производится запись рада двумерных спектров ЯМР NOESY с различным значением времени смешивания Тщ. Диапазон изменения значений тга выбирается так, чтобы последние Тщ позволяли получать наибольшие значения интегральной интенсивности кросс-пиков. При соблюдении данного условия величина отношения сигнал/шум получается максимальной. Релаксационная задержка выбирается равной 2-Ть где Ti -время спин-решеточной релаксации исследуемой группы протонов. Все спектры записываются за один проход для рационального использования времени эксперимента и уменьшения эффектов, связанных с дрейфом параметров.

4. На основе анализа данных теоретического моделировании молекул и предварительных экспериментов 2D NOESY производится оценка отношения количества экспериментально определяемых межпротонных расстояний, меньших 5 А, к числу возможных конформеров. В случае большего числа возможных конформеров в сравнении с количеством экспериментально определяемых расстояний следует проводить дополнительные эксперименты T-ROESY и ID NOE, T-ROE с аналогичными параметрами. Это позволяет получить более детальную информацию о пространственной струьауре и »информационном состоянии исследуемого соединения.

5. Путем последующего анализа записанных спектров определяются значения абсолютных интегральных интенсивностей пиков одно- и двумерных спектров исследуемого соединения для всех времен смешивания

6. Дня двумерных спектров вычисляются усредненные значения (с предварительным отнесением интегральных интенсивностей) кросс-пиков atJ, aJt к диагональным пикам ам, аа. В случае вычисления межъядерных расстояний между протоном и метальной группой необходимо использовать в расчете отношение населенности спиновой системы 1/3.

7. Полученные усредненные интегральные интенсивности 7 при малых значения времени тт аппроксимируются линейно. По наклону линейной аппроксимации экспериментальных данных определяются скорости кросс-релаксации.

8. На основе полученных таким образом констант скорости кросс-релаксации вычисляются величины межпротонных расстояний в молекуле с использованием соотношения (1).

В случае недостаточного количества межьядерных расстояний или в отсутствие подходящего калибровочного расстояния необходимы данные дополнительного эксперимента

Ю + 42а2т1.-Псо*т' -32Й/г*, Т-ЯОЕБУ с использованием формулы: = - ^ < ? ^ „ ? ДО*

О-Т-коезу 10 + 63шЧ^ + 96<»\^+1ба,<г вычисления локальных времен корреляции . Применяя соотношения:

£2г,г

1 + (и cozti) t

I (где J" - функция

IU V47r J mj*j rij

спектральной плотности n-го порядка, S - обобщенный параметр порядка), ft - постоянная Дирака, у -гиромагнитное отношение, - магнитная постоянная, а - циклическая частота резонанса) вычисляют абсолютные межпротонные расстояния. 10. Производится вычисление усредненных расстояний по данным квангово-химических рас-

4 (2), где гц, щ - насеяен-

четов для всех конформеров согласно выражениям: гчт ш

_Ly±

носга спиновых состояний - для пары протонов ^ , =

(3) - для протон-

метиленовых групп атомов ,

51—2 3 л'-i }

(4) гдеУ^О!-) - сфери-

ческие функции второго порядка, -доя прогон-мепшьных групп атомов .

11. Производится оценка населенности конформеров на основе совместного анализа экспериментально полученных значений межпротонных расстояний с усредненными теоретическими расстояниями для каждого отдельного конформера В случае одного информационного равновесия доля конформеров ¡-ой компоненты рассчитывается по формуле

1 1 _ Аг6-г< )

_1_= _ 'Л' = 1 - а,, а в случае двух и более конформационных

6 6 6 V ' 1 6 16 6 I *

Гехр Л 2 М )

равновесий применяется ридж-регрессионный анализ.

Предложенная методика, основанная на вычислении межпротонных расстояний из отношения скорости кросс-релаксации, позволяет определял, не только относительные значения расстояний между взаимодействующими труппами протонов, но и оценить населенность конформеров. Основным преимуществом предложенного подхода является существенное увеличение точности в определении межпротонных расстояний, что в значительной степени сказывается на конформационном состоянии.

Пятая глава посвящена описанию и обсуждению основных экспериментальных результатов работы. Предложенная и описанная нами методика определения конформационного состояния и пространственной структуры была апробирована и отработана на ряде соединений. Первой изученной системой стал раствор парацетамола в Ы,Ы-диметилформамиде (ДМФА).

Молекула парацетамола (рисунок 1) имеет нежесткую структуру, ее конформационная подвижность связанна с внутренним вращением амидного фрагмента и падроксильной группы, причем вращение метальной группы в амидном

НО'

Рисунок 1. Сгругаурная формула парацетамола.

фрагменте рассматривают отдельно. В работе [1] Ли и соавторами было показано, что молекула парацетамола имеет транс- и цис- конформеры (рисунок 2, структуры А и В, соответственно), отличающиеся поворотом гидроксильной группы относительно карбонильной. В литературе также указывается на существование конформермеров, которые различаются поворотом амид-ной группы относительно бензольного кольца (рисунок 2, структуры С и D, соответственно) [2].

Выбор растворителя был обусловлен высокой растворимостью парацетамола в ДМФА Экспериментальные и расчетные величины межпротонных расстояний в молекуле парацетамола в ДМФА приведены в таблице 1. Для протонных пар Н4 - NH и NH - Н6 (рисунок 2) в кон-формациях А и В различия в экспериментальных и расчетных значениях довольно малы (2,60 и 2,52 А; 2,73 и 2,87 А, соответственно), тогда как в конформациях С и D расчет дает значительное несоответствие с экспериментом (усредненное расстояние 2,99 А в сравнении с экспериментальным 2,60 А, и усредненное 3,98 А в сравнении с экспериментальным 2,87 А). Для прогонных пар Н6 - Н4 (рисунок 2) согласие с экспериментом значительно хуже для всех конформа-ций (4,99 и 3,53 А вместо 4,11 А в эксперименте). Такое расхождение связано с увеличением погрешности эксперимента при больших межьядерных расстояниях (>4 А). Учет влияния спиновой диффузии на экспериментальные значения расстояний, получаемые анализом спекгров 2D NOESY, должен приводить к возрастанию этих расстояний, что приближает их величины к расчетным значениям для конформаций А и В (рисунок 2).

Таблица 1 • Экспериментальные гэксп (2D NOES Y в ДМФА) и эффективные расчетные расстояния (М06 63 l++g(d,p) с учетом растворителя) конформеров A-D молекул парацетамола.

Пары атомов Гжсп ^ Расчетные расстояния А

Конф. А Конф. В Конф. С Конф. D

(СУ и2 И (<й>2 И1 И {а? (--'У И ыг И2 И

ОН-Н5 Калибровка 2.56 2.56 2.56 2.56

NH-Н4 2.60 ±0.05 2.52 2.52 2.99 2.99

NH-Н6 гял ±0.08 2.73 2.68 2.53 2.73 2.68 2.53 3.98 3.81 3.82 3.98 3.81 3.82

Н6-Н5 4.11 ±0.09 4.99 4.86 4.81 4.99 4.86 4.81 3.53 3.39 326 3.53 3.39 3.26

Учет внутреннего вращения метальной группы СНз в молекуле парацетамола был произведен на основе формулы (4). Количественные различия между результатами, полученными с использованием соотношений (2), (3) и (4), оказались весьма существенными. Наиболее корректный способ учета внутреннего вращения метальной группы, основанный на применении формулы (4), дает процентный состав конформеров А и В парацетамола в ДМФА приведенный на рисунке 3

Таблица 2. Населенности конформационных состояний А+В (выражены в мольных долях), полученные путем сравнения экспериментальных расстояний с теоретическими в различных расчетных базисах

NH-H4 NH-H6 H6-H5

6-31++g(d,p) in vacuum 0.69 0.71 0.69

М06 6-31++Hfd.D) in vacuum 0.73 0.73 0.66

aug-CC-pVTZ in vacuum 0.65 0.69 0.78

M06 6-3 1++яГ4р) in DMF 0.70 0.73 0.68

(в данной работе неразличимыми являются конформации А и В, а также СиО (рисунок 2)). Также были проведены расчеты совместно с объединенным физико-химическим центром растворов ИХР РАН и ИГХТУ на основе различных базисов без учета растворителя. Менее существенное влияние на результаты расчетов оказывает учет влияния растворителя, проводимый в рамках континуальной модели. Заметное___

изменение в значениях расстояний наблюдается лишь для пары Н6-Н4

Наиболее значимым представляется влияние растворителя на энергию образования кон-формеров. Изменение энергии образования конформеров при учете влияния растворителя достигает 2 кДж/моль. На основе сравнения экспериментальных значений межпротонных расстояний, найденных методом 2В ШЕБУ, с расчетными значениями (квантово-механические методы) определены населенности конформационных 98 58 % (®) (б) состояний парацетамола в ДМФА согласно формуле

(5). Однако различие долей конформеров в зависимости от расчетных базисов, приведенных в таблице 2, 70.23 % незначительно. Итоговое распределение конформеров,

представленное на рисунке 3, бралось как среднее по расчетным базисам. Проведаны также сравнения экспериментальных долей с расчетными данными полученными на основе распределения Больцмана (рису-29.77 % нок 3). Отклонение экспериментальных значений населенности конформеров от теоретических связано не только с влиянием растворителя (расчеты приведены для вакуума), но и, как мы предполагаем, с частич-А+В С-Ю А+В С+Э ной инверсией конформационного состояния при пе-

реходе от разбавленных растворов к насыщенным. Следу- е

i.

шж 1.42 %

Рисунок 3. Дали конформеров молекул працегамсша в вакууме рассчитанные на оснве энергии конформеров в базисах А^-СС-рУГС (а) и полученное из эксперимента ЯМР в растворе (б).

ющеи системой, изученной нами, является раствор

фелодипина в ДМСО. Выбор растворителя был обусловлен не только высокой растворимостью фелодипина в этом растворителе, но и практической значимостью применения ДМСО при нуклеации из насыщенного раствора.

Конформационная подвижность молекулы фелодипина определяется двумя двугранными углами: (СЗ-С4-СГ-С2'), который задает вращение 2,4-дихлорфениловой группы вокруг связи СГ-С4, и (СЗа-О-СЗЬ-СЗс), связанным с вращением этиленовой группы вокруг связи О-ЗЬ (рисунок 4). Теберекидис и Сигала в 2007 году опубликовали результаты теоретического исследования фелодипина с использованием метода гибридного функционала плотности ВЗЬУР [3]. В данной работе выделяют шесть конформеров с очень

Рисунок 4. Структурная формула фелодипина

близкими энергиями (в пределах 4,2 кДж/моль), начиная с А (глобальный минимум) до F (с максимальной энергией). Огметим, что для конформеров А, В, и Е атомы хлора повернуты в том же направлении, что и протоны NH1, тогда как в конформерах С, D, и F кольца дихпорфе-нила повернуты на 180° и атомы хлора находятся ближе к протонам Н4 (рисунки 4 и 5).

В таблице 3 при-

Таблица 3. Экспериментальные гжсп (2D NOESY в ДМСО) и усредненные расчетные расстояния для конформеров фелодипина [3].

Пары атомов г А э ксп Расчетные расстояния А

Конф. А Конф. В Конф С Конф. D Конф. Е Конф. F

НЗЬ-НЗс Калибровка 2,69 2,69 2,69 2,69 2,69 2,69

Н4-Н6' 2,21 ±0,03 2,12 2,12 3,73 3,73 2,12 3,73

ведены экспериментальные межь-ядерные расстояния, определенные методом 20

ЫОЕБУ и значения расстояний,

полученных из квантово-химических расчетов при малой концентрации (0,077 г/дм3). Из таблицы видно, что для пары ядер Н4-Н6' расчетные значения расстояний близки к экспериментальным доя конформаций А, В и Е (2,12 и 2,21 А, соответственно).

В то же время расчетные значения расстояний (3,73 А) для конформаций С, О и Р далеки от экспериментальной величины. Расстояния, полученные на основе анализа Ш НОЕ для малой концентрации, приведены в таблице 4. Результаты эксперимента Ш ЫОЕ говорят в пользу существования в растворе некоторого количества конформеров С, О и Р. Обращает на себя внимание хорошее согласие Рисунок 5. Возможные конформеры фелодипина А-Р полученные из квангово-между эксперименталь- химических расчегов[3].

ными и расчетными значениями расстояний для прогонов N11-116' (таблица 4). Соответствующие расстояния для конформаций А, В и Е являются слишком большими, так как превышают

чувствительность экс-

Таблица 4. Экспериментальные гшсп (1DNOESY вДМСО с селективным облучением сигналов NH) и усредненные расчетные расстояния конформеров фелодипина [3].

Пары атомов гжп А Расчетные расстояния А

Конф А Конф В Конф С Конф D КонфЕ Конф F

NH-H2a калибровка 2,48 2,48 2,48 2,48 2,48 2,48

NH-H6a 2,50 ±0,08 2,48 2,4« 2,48 2,48 2,48 2,48

NH-H6' 3,44 ±0,06 - - 3,50 3,48 - 337

перимента ЫОЕ (>6А), и они не приведены в таблице 4. Результаты эксперимента ООвУ позволили получить приближенное значение времени корреляции Тс и,

44.62 %

таким образом, провести оценку выполнения условия крайнего сужения (cùoTc « 1). Было установлено, что величина тс соответствует некоторому отклонению от данного условия в сторону режима спиновой диффузии (сотс » 1).

Для подавления влияния спиновой диффузии была применена импульсная последовательность QUEET-NOESY с использованием созданной нами программы для спектрометра Bruker Avance III. Величина межъядерною расстояния Н4-Н6', определенная по данным эксперимента QUIET-NOESY, составила д ля малой концентрации 2,31 Â (в сравнении со значением 2,21 А в стандартном эксперименте NOESY, таблица 3). Дополнительная проверка корректности результатов эксперимента QUIET-NOESY проводилась с использованием экспериментов NOESY/T-ROESY.

Полученные значения для расстояний НЗЬ-НЗс и Н4-Н6' составили 2,68 А (в сравнении с расчетным 2,67 А, таблица 3) и 2,38 À (расчетное рас-

17.86 %

11.9011.89%

6.86%s-87%] 1

! | J

Рисунок 6. Распределение конформеров фелоди-пина в ДМСО при малой концентрации.

стояние составило 2,31 А, таблица 3), соответственно. Одномерный эксперимент с импульсным

92.48% (б)

(а)

90.07 % (б)

77.15 %

22.85

9.93%

(3) 58.35 %

1.65%

191

ШВ

7.52%

А+В+Е C+D+F

А+В+Е C+D+F

А+В+Е C+D+F

А+В+Е C+D+F

Стандартный ШЕБУ (ЗШЕГ-ШЕЗУ

Рисунок 7. Распределения конформеров фелодипина в ДМСО при малой концентрации (а) и в насыщенном растворе (б) по данным спектроскопии ЯЭО.

градиентом магнитного поля проводился также с подавлением спиновой диффузии. Полученные значения для расстояний МН-Н2а, МН-Н6а и 1ЧН-Н6' составили 2,47 А (хорошо коррелирует с расчетным значением 2,48 А, таблица 4), 2,56 А (подтверждает расчетное значение 2,50 А, таблица 4) и 3,46 А (в сравнении с расчетным значением 3,44 А, таблица 4). Благодаря наличию данных о расстояниях из дополнительных экспериментов ГО МЗЕ и Ж)Е8У/Т-КОЕ8У при малой концентрации получена детальная информацию о конформационном состоянии, которое приведено на рисунке 6. Из рисунка видно, что доли конформеров А и В равны и составляют 6,87%, доли С и Б также равны и составляют 11,90%. Преобладающей конформацией для молекул фелодипина является Е - 44,62% а доля конформера Р составляет 17,86%. В насыщенном растворе фелодипина в ДМСО наблюдается противоположная ситуация. Так, экспериментальное расстояние 2,98 А для пары ядер Н4-Н6' близко к экспериментальному для конформа-ций С, Б и Р (2,98 и 3,37 А, соответственно). Для насыщенного раствора были также проведены эксперименты ОиТЕТ-КОЕБУ. Полученные значения для расстояний Н4-Н6' составили 3,08 вместо 2,98 А. Необходимость подавления спиновой диффузии демонстрирует рисунок 7: раз-

Рисунок 8. Структурная формула ибупрофена

ница в населенностях конформационных состояний, определенных стандартным методом и методами с подавлением спиновой диффузии, оказывается существенной для малой концентрации (около 20%) и относительно небольшой (2-3%) в насыщенном растворе. Также обращает на себя внимание тог факт, что доли конформеров, которые преобладали при малой концентрации, становятся малы в насыщенном растворе, и наоборот.

Последней изученной системой был ибупрофен в хлороформе. Молекулы ибупрофена имеют хирапьный центр на Н сн3

а-углеродах и могут существовать в Я (-) и Б (+) энантио- Н 0Н

мерных формах. Коммерческая форма ибупрофена является ^ СН3 ^гг"^ || || рацемической смесью энантиомеров. Стоит отметить, что О

только Б(+) форма является фармакологически активной. нзс | | н Однако неактивная форма Я(-) может подвергаться в есте- СН2 н

ственных условиях однонаправленной хиральной инверсии на активную 8(+). Молекула ибупрофена имеет нежесткую структуру, связанную с внутренним вращением как целого

фрагмента пропионовой кисло-д ^ ты, так и изобутилыюго остатка.

™ „а ш я Причем вращение метальных

_ л а % /У не ™ » он Я г _ 1

иг Мвал у н* я\\ Н1° или карбоксильной групп, вхо-

н9 т дящих в эти фрагменты, можно

т У—\ £ X рассматривать независимо друг

С не м н [-, Н5 Нм от друга. В результате образует-

нз н5 ся несколько конформеров для

""Чг-'н,^./ не "9 I Н5 Т°"Й одной молекулы, которым соог-

Ш X Н7 лг™^ Ш\' ню ветствуют минимумы полной

А лгтг41 (\ энергии. В работе [6] на основе

Н9 С/1|он гад квантово-химических расчетов

н5 ж н5 было предсказано 8 возможных

не ж различных конформаций

не "л ,/* Я ня ф ¿Г н7 %......-У 146 ибупрофена (рисунок 9). Срав-

Н7 м\\т0 ^ нивая результататы колебагель-

Ь^в но® спеироскошш и квантово-

9 не Нэ $1 химических расчетов, авторы

в н5 ш Н Н5 ж 1 ^о* о^ечщо,- возможность ограни-

он на н5 н4 чения только 4 различными

I » конформерами, на что указьшает

нв^С«7 I"» "" ■ Д-,,»7 и незначитеяьная разница в

"ю^Г* и в & \ Анализ спектров 2Т) МЖЗУ

Н5%/ и нэ £ Н4 ^'ОН г

ш ибупрофена в растворе хлоро-

форма по предложенной нами схеме показал преобладание конформеров й, Н, доли которых составляют 43,13% и 43,87% (рисунок 10), соответственно; населенность остальных конформеров А-Р в сумме составляет 13,34%. Распределение данных конформеров по Больиману в вакууме: 75%(А+В), 14%(С+0), 9%(Е+Р) и 2%(Ш-Н) при ком-

Рисунок9. Возможные конформеры ибупрофена (А-Н), полученные из квантово-химических расчетов [6].

натной температуре [4] (рисунок 11). Также были проведены сравнения экспериментальных в личин с расчетами (рисунок 11 а). На рисунке 11 также сравниваются экспериментальные вели чины с расчетами в вакууме. Как и в случае с фе- <з п%4з.вгя

лодипином в ДМСО, наблюдается инверсия распределения конформационных состояний при переходе от разбавленного раствора к насыщенному.

Таким образом, нами обнаружена инверсия распределения конформеров малых нежестких молекул при переходе от разбавленных к насыщенным растворам.

При этом для фелодипина и ибупрофена инверсия является существенной (практически полной), а для парацетамола менее значительной (частичной).

ABCDgFGH Рисунок 10. Распределение конформеров ибупроф на в насыщенном растворе в ДМСО

75% M 86.66% (6>

Рисунок 11. Распределения конформеров ибупрофена, рассчитанные из данных кванговохимического модешфования

(а) и полученных по д анным анализа спектров 2D NOES Y в хлороформе в насыщенном растворе (б)

Выводы

1. Разработан подход к определению населенностей конформационных состояний малых н J жестких молекул в растворах в случае нескольких конформационных равновесий, основан ный на совместном использовании данных квантово-химических расчетов и экспериме. тально определенных (ЯМР NOESY) меисьадерных расстояний.

2. Созданы импульсные программы QUŒT-NOESY для спектрометров Bruker Avance, кота рые применены для регистрации одно- и двумерных спектров ЯЭО с подавлением эффекта спиновой диффузии. Показано, что в относительно вязких растворителях (ДМСО, ДМФА' эффект спиновой диффузии оказывает существенное влияние при определении межпрото ных расстояний и расчета параметров конформационного равновесия малых нежестких молекул.

3. Методом двумерной спектроскопии NOESY определены межпротонные расстояния да молекулы парацетамола в растворе ДМФА. Показана необходимость учета внутренней-вращения метальной группы, и определены населенности конформеров.

4. На основе согласованного анализа результатов одно- и двумерной спектроскопии ЯМР (Щ 2D NOESY, T-ROESY) найдены доли конформеров фелодипина в растворах ДМСО (в pas

бавленном растворе и в растворе, близком к насыщению). Показано согласие с результатами эксперимента QUIET-NOESY.

5. Определены межпротонные расстояния для молекулы ибупрофена в растворе хлороформа методом двумерной спектроскопии NOESY.

6. Обнаружена инверсия распределения конформеров малых нежестких молекул при переходе от разбавленных к насыщенным растворам. При этом для фелодипина и ибупрофена инверсия является полной, а для парацетамола частичной.

Цитируемая литература

1. Lee SJ. и др. Conformational ly resolved structures of jet-cooled acetaminophen by UV-UV hole-burning spectroscopy.// Physical chemistry chemical physics. 2011.T. 13.№37.C. 16537-16541.

2. Binev I.G, Vassileva-Boyadjieva P, Binev YJ. Experimental and ab initio MO studies on the IR spectra and structure of 4-hydroxyacetanilide (paracetamol), its oxyanion and dianion // Journal of Molecular Structure. 1998. T. 447. № 3. C. 235-246.

3. Teberekidis V.I., Sigalas MP. Theoretical study of hydrogen bond interactions of felodipine with polyvinylpyrrolidone and polyethyleneglycol // Journal of Molecular Structure: THEOCHEM. 2007. T. 803. № 1-3. C. 29-38.

4. Vueba MJL., Pina M£., Carvalho L A£B. De. Conformational Stability of Ibuprofen: Assessed by DFT Calculations and Optical Vibrational Spectroscopy // Journal ofPharmaceutical Sciences. 2008. T. 97. № 2. C. 845-859.

Публикации автора по теме диссертации:

1. Ходов ИА, Кумеев Р.С., Никифоров MJO, Голубев В А, Альпер ГА Гурьянов АВ. Ком-плексообразование 5,10,15,20-тетра(4 - хлорфенил) порфирината цинка с DAB СО по данным ЯМР 'Н в бензоле и хлороформе // Жидк. крист. и их практ. исп. 2012, Вып. 3, С. 37-42.

2. Ходов И А., Кумеев Р.С., Никифоров MJO., Голубев В А, Альпер ГА Крестьянинов М А Пространственная геометрия парацетамола в ДМФА-Е)6 по данным 2D NOESY ЯМР спектроскопии // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2013, Т.56, Вып. 3, С. 108-109.

3. Khodov LA., Nikiforov M.Yu, Alper GA, Blokhin D.S., Efimov S.V., Klochkov V.V., Georgi N. Spatial structure of felodipine dissolved in DMSO by ID NOE and 2D NOESY NMR spectroscopy //J. Mol. Str. 2013, V. 1035, P. 358-362.

4. Khodov IA, Kumeev R.S, Nikiforov M.Yu, Alper GA. Molecular association in the systems methanol - DMF, methanol - butyl acetate by NMR spectroscopy !H // Bode of Abstracts. Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Mattа 7й1 meeting: "NMR in Heterogeneous Systems". Saint Petersburg, Russia. June 28 - July 2,2010. P. 86.

5. Ходов ИА, Голубев В А, Кумеев Р.С., Никифоров MJO., Альпер ГА Температурная зависимость скорости спин — решеточной релаксации и химические сдвиги ядер 'Н молекул DABCO и комплексов DABCO с 5,10,15,20 - тетра(4 - хлорфенил) порфиринатом цинка в бензоле. // Тез. докл. V Всероссийская конференция «Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях» Казань 20-22 апреля 2011 г. С148

6. Ходов И А, Кумеев Р.С, Никифоров MJO, Альпер ГА, Мамардашвили НЖ Комплексо-образование 5,10,15,20 — тетра(4 - хлорфенил) порфирината цинка с DABCO по данным

измерений химических сдвигов ЯМР и времен релексации ядер // Тез. докл. XXV Меж-

дународная Чугаевская конференция по координационной химии. Суздаль, 6-11 июня 2011 г, С. 288.

7. Ходов ИА, Голубев В А, Кумеев Р.С., Никифоров MJO., Альпер ГА Пространственное строение Ы-(4-гидроксифенил) ацегамида (парацетамола) в растворе N,N-димешлформамвда - D6 на основе 2D NOESY ЯМР спектроскопии. // Тез. докл. XI Международная конференция «Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах» Иваново, 10-14 октября 2011 г, С. 147.

8. Ходов ИА, Альпер Г. А, Никифоров MJO. Конформационный ЯМР-анализ N-(4-Гидроксифенилацетамида в растворе ДМФА на основе 2D NOESY. // Тез. докл. VI конференция молодых ученных «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем», Иваново, 8-12 ноября 2011 г, С.143.

9. Ходов ИА, Альпер Г. А, Никифоров MJO. Конформационный ЯМР-анализ молекул фе-лодипина в растворе Димегштсульфоксида-Е)6. // Тез. докл. XVI Симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, Иваново, 18-22 июня 2012 года, С. 73

10. Khodov IA„ Nikiforov M.Yu, Alper GA, Blokhin D.S., Efimov S.V., Klochkov V.V., Geoigi N. Spatial structure of felodipine in DMSOd6 solution by 1-D NOE and 2-D NOESY NMR spectroscopy // XV Internationa] Youth Scientific School «Actual Problems of Magnetic Resonance and its Applications», Kazan, Russian, 22-26 October, 2012, P. 122.

11. Kiselev M, Khodov I., Nikiforov M, Alper G., Oparin R, Frolov A., Agapov A, Idrissi A. Towards screening of polymorphism at supercritical parameters of state // 7th International Scientific Conference Kinetics and mechanisms of crystallization, crystallization and next generation material Ivanovo, Russia, 25-28 September, 2012, P. 277.

12 Ходов ИА, Кумеев P.C, Никифоров MJO, Голубев BA, Альпер ГА Определение межпротонных расстояний конформеров парацетамола в ДМФАч16 по данным 2D NOESY ЯМР спектроскопии // Сб. статей XIX Всерос. конф. Структура и динамика молекулярных систем: Т2-М: ИФХЭ РАН, 2012, С. 149-151.

13. Ходов ИА, Ефимов СВ., Блохин Д.С. Конформации молекул фелодипина в растворе ди-метилсульфоксида-Ш на основе данных ЯМР // VII Всероссийская школа- конференция молодых ученых «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем» (Крестовские чтения) .Иваново, 12-16 ноября, 2012, С. 39.

14. Бичан HP, Ходов ИА Химическая структура р-оксодимерной и мономерной фермы тет-рафенилпорфинового комплекса рения (V) на основе кросс-корреляционного 2D ЯМР анализа // VII Всероссийская школа- конференция молодых ученых «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем» (Крестовские чтения) .Иваново, 12-16 ноября, 2012, С. 27.

15. Kiselev М, Khodov I., Nikiforov М., Alper G, Oparin R, Frolov A, Agapov A, Idrissi A The conformational manifolds of drug-like molecules as studied in combination of experimental and computational techniques // Molecular association in fluid phases and at fluid interfaces. EMLG/JMLG Annual Meeting, Eger, Hungary. 5-9 September, 2012. P. 35

16. Kiselev M, Khodov I, Nikiforov M, Alper G, Oparin R., Frolov A, Agapov A, Idrissi A. Solvation of conformationally flexible molecules. Experiment and computer simulations // International school-conference «Molecular aspects of solid-state and interfacial electrochemistry» (MoIE-2012). Dubna, Russian, 26-31 August, 2012, P. 23.

Подписано в печать 1.07.2013. Формат 60x84 '/16. Печать плоская. Печ. л. 1. Усл. печ. л. 0,93. Уч.-изд. л. 1. Тираж 100 экз. Заказ № 186т.

Изд. лицензия JIP № 010221 от 03.04.1997

Отпечатано в ОАО «Издательство «Иваново». 153012, г. Иваново, ул. Советская, 49. Тел.: 32-47-43, 32-67-91. E-mail: riaivan37@mail.ni

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химии растворов им. Г.А. Крестова Российской академии наук

. На правах рукописи

04201361651

Ходов Илья Анатольевич

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА И КОНФОРМАЦИОННОЕ СОСТОЯНИЕ МАЛЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МОЛЕКУЛ В РАСТВОРАХ ПО ДАННЫМ ОДНО- И ДВУМЕРНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР

02.00.04 - физическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель: д.х.н., проф. Г. А. Альпер

V \

ИВ АНОВО-2013

Введение...........................................................................................................................4

1. Возможности импульсной ЯМР спектроскопии......................................................8

1.1 Явление ядерного магнитного резонанса............................................................9

1.2 Импульсная Фурье-спектроскопия ЯМР...........................................................11

1.3 Ядерная магнитная релаксация...........................................................................13

1.4 Ядерный эффект Оверхаузера.............................................................................13

1.5 Уравнение Соломона...........................................................................................14

1.6 Перенос когерентности........................................................................................15

1.7 Селективная одномерная спектроскопия ЯМР с импульсным полевым градиентом..................................................................................................................17

1.7.1 Селективные импульсы.................................................................................17

1.7.2 Импульсные полевые градиенты..................................................................18

1.7.3 Селективная lD-gsTOCSY............................................................................20

1.7. Селективная lD-gsNOESY..............................................................................21

1.7.5 Селективная lD-gsTROESY..........................................................................24

2. Двумерная спектроскопия ЯМР..............................................................................26

2.1 Основные принципы двумерной спектроскопии ЯМР....................................27

2.2 Двумерные корреляционные методы.................................................................29

2.3 Двумерная гомоядерная спектроскопия............................................................30

2.3.2 Двумерная спектроскопия 'Н-'HTOCSY....................................................31

2.3.3 Двумерная многоквантовая спектроскопия 13С-13С INADEQUTE...........32

2.4 Двумерная гетероядерная корреляционная спектроскопия.............................34

2.4.1 Одно- и многоквантовая спектроскопия 'н-13с HSQC, HMQC.................35

2.4.2 Многосвязная спектроскопия НМВС...........................................................39

2.5. Двумерная диффузионная спектроскопия DOSY............................................40

2.6 Двумерная спектроскопия ЯЭО в лабораторной системе координат.............44

2.6.1 Внутримолекулярная дипольная релаксация в NOESY.............................45

2.6.2 Нестационарный ЯЭО....................................................................................47

2.6.3. Процессы кросс-релаксации в NOESY.......................................................48

2.6.4. Случай крайнего сужения (тс «1)............................................................50

2.6.5. Случай медленного движения {сотс »1).....................................................51

2.7 Двумерная спектроскопия ЯЭО во вращающейся системе координат..........52

2.7.1 Спин-лок (Spin-lock)......................................................................................52

2.7.2. Процессы кросс-релаксаци...........................................................................53

2.7.3 T-ROESY.........................................................................................................53

2.8 Непрямые пути переноса намагниченности в ЯЭО (явление спиновой диффузии)....................................................................................................................56

3. Объекты и методы исследования............................................................................57

3.1 Структура и конформации исследованных соединений.................................57

3.1.1 Парацетамол....................................................................................................57

3.1.2 Фелодипин.......................................................................................................60

3.1.3 Ибупрофен.......................................................................................................63

3.2 Экспериментальная техника и обработка результатов....................................66

4. Пространственная структура малых конформационно нежестких молекул

методом 1D и 2D ЯЭО..................................................................................................70

4.1 Измерение констант скорости кросс-релаксации.............................................70

4.1.1 Анализ полной кросс-релаксационной матрицы........................................70

4.1.2 Приближение начальной скорости...............................................................73

4.2 Подходы к определению пространственно структуры малых

конформационно подвижные молекулы..................................................................78

4.2.1 Нормировка интенсивностей кросс пиков...................................................78

4.3.2 Количественное измерение межпротонных расстояний NOESY/ROESY ..81

4.3 Подавление эффектов спиновой диффузии в спектроскопии ЯЭО................84

4.4 Усреднение межъядерных расстояний...............................................................88

4.5 Расчет конформационного равновесия..............................................................89

4.6 Разработанный подход к определению конформационного состояния малых

биологически активных молекул в растворах............................................................93

5. Пространственная структура и конформационное состояние малых биологически активных молекул в растворах............................................................98

5.1 Парацетамол в ДМФА.........................................................................................98

5.2 Фелодипин в ДМСО...........................................................................................106

5.3 Ибупрофен в хлороформе..................................................................................116

Выводы.........................................................................................................................124

Литература...................................................................................................................125

Приложение 1..............................................................................................................149

Приложение 2..............................................................................................................154

Приложение 3..............................................................................................................161

Приложение 4..............................................................................................................170

Введение

Актуальность темы. Определение пространственной структуры и конформационного состояния молекул в растворах является одной из важнейших задач физической химии. Накопление и обобщение данных о конформационном состоянии молекул в растворе дает возможность подойти к фундаментальному пониманию процессов, протекающих на молекулярном уровне. Эти процессы определяют не только биологическую активность молекул, но также могут определять нуклеацию кристаллов данных соединений из их насыщенных растворов. Малые биологически активные молекулы входят в состав большого числа лекарственных средств, активно используемых в медицине. Так, парацетамол (ацетаминофен, N-(4-гидроксифенил)ацетамид, C8H9O2N) обладает анальгетическими и антипиретическими свойствами; фелодипин (3-этил-5-метил-4-(2,3-дихлорфенил)-2,6-диметил-1,4-дигидропиридин-3,5-дикарбоксил, C18H19CI2NO4) получил широкое распространение благодаря своим антигипертен-зивным и антиангиальным свойствам. Ибупрофен ((К8)-2-(4-изобутилфенил)-пропионовая кислота, С13Н18О2) - нестероидный препарат, который обладает противовоспалительной активностью и применяется при ревматоидном артрите, деформирующем остеоартрозе и др. заболеваниях для облегчения боли и уменьшения лихорадки.

Среди многообразия физико-химических методов, которые используются при решении указанных фундаментальных проблем, ключевыми являются одно- и двумерная спектроскопия ЯМР ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО). Методы спектроскопии ЯЭО в лабораторной (NOESY - Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) и вращающейся системах координат (T-ROESY - Transverse Rotating-frame Overhauser Enhancement Spectroscopy) дают возможность определять расстояния между ядрами, вплоть до 5 А. Совместное использование экспериментальных данных ЯМР по межъядерным расстояниям и результатов квантовохимических расчетов позволяет определять относительные населенности конформаций. Однако спектроскопия ЯЭО недостаточно адаптирована к исследованию пространственной структуры малых конфор-мационно подвижных молекул, подпадающих под условие крайнего сужения линий (соо-тс <<с 1 > где Тс - время корреляции молекулярного движения, СОо - угловая скорость прецессии магнитных ядер). Основными факторами, затрудняющими такого рода измерения, являются слабая интенсивность кросс-пиков, длительное время эксперимента, дрейф экспериментальных параметров и др. Кроме того, процессы, обусловленные косвенными путями переноса намагниченности (спиновой диффузией), негативно влияют на спектральные характеристики изучаемых соединений, не позволяя корректно описать их конформационное состояние.

Таким образом, весьма важной задачей является разработка эффективного подхода получения информации о межъядерных расстояниях в малых молекулах с минимальной ошибкой измерения.

Целью диссертационной работы являлось определение пространственной структуры и конформационного состояния биологически активных веществ методами одномерной спектроскопии ЯМР 'Н, 13С и одно- и двумерной спектроскопии ЯЭО; разработка и реализация подхода ЯМР NOESY для количественного определения доли конформеров малых нежестких биологически активных молекул в растворах, а также решение задачи подавления эффекта спиновой диффузии при определении межпротонных расстояний методом двумерной спектроскопии ЯМР NOESY.

Методы исследования. При решении поставленных задач использовались современные методы спектроскопии ЯМР высокого разрешения; в частности, в качестве основных были использованы эксперименты по спектроскопии ЯЭО: 2D NOESY, 2D T-ROESY, ID NOE, ID T-ROE и модификация QUIET-NOESY (Quenching Undesirable Indirect External Trouble in Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy). В качестве дополнительных методов использовались 2DTOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY), DOSY(Difussion-Ordered SpectrocopY), HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation), HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation), COSY (Correlation SpectroscopY), ID TOCSY.

Эксперименты проводились с использованием ЯМР спектрометра «AVANCE III 500» фирмы «Bruker» (рабочая частота 500 МГц на ядрах !Н и 125 МГц на ядрах 13С).

Научная новизна диссертационной работы состоит в следующем:

Впервые определены эффективные (усредненные по всем конформерам) межпротонные расстояния в молекуле парацетамола в его насыщенном растворе в ДМФА с помощью методов двумерной ЯМР спектроскопии ЯЭО. Проведены расчеты доли конформеров путем совместного анализа экспериментальных данных и результатов квантовохимических расчетов.

Впервые получены экспериментальные данные об относительных межпротонных расстояниях в молекулах фелодипина методом одно- и двумерной ЯМР спектроскопии ЯЭО в его растворах в ДМСО при двух концентрациях.

Создана импульсная программа QUIET-NOESY, с использованием которой достигнуто подавление артефактных эффектов переноса намагниченности косвенными путями (спиновой диффузии) в спектрах NOESY фелодипина в ДМСО. Результаты эксперимента QUIET-NOESY подтверждены путем сопоставления с данными NOESY/T-ROESY эксперимента.

Определены доли конформеров молекулы фелодипина в ДМСО при малой концентрации (0,077 г/дм3) и в насыщенном растворе.

Получены эффективные межпротонные расстояния в молекуле ибупрофена в его насы-

щенном растворе в хлороформе методами двумерной ЯМР спектроскопии ЯЭО. Рассчитаны доли конформеров молекулы ибупрофена.

Обнаружена инверсия распределения конформеров изученных малых нежестких молекул (ибупрофена, парацетамола, фелодипина) при переходе от разбавленных растворов к насыщенным.

Основные положения, выносимые на защиту:

Метод определения населенности конформационных состояний для малых нежестких молекул в растворах в случае нескольких конформационных равновесий(по данным Ш и 20 спектроскопии ЯМР)

Программы для импульсной последовательности (ЗШЕТ-МОЕБУ, реализующие подавление спиновой диффузии в 2Б экспериментах ТМОЕБУ.

Результаты экспериментов по определению эффективных межпротонных расстояний в молекулах парацетамола, фелодипина и ибупрофена в растворах.

Выявленый эффект инверсии распределения конформеров малых нежестких молекул (парацетамола, ибупрофена, фелодипина) при переходе от разбавленных к насыщенным растворам.

Обоснованность и достоверность результатов подтверждается согласием полученных данных с результатами исследований, проводимых другими методами, в частности, с данными численного моделирования и ИК спектроскопии; сравнением различных подходов в ЯМР спектроскопии (например, с данными анализа сопоставления констант скорости кросс-релаксации КОЕ8У/Т-1ЮЕ8У и одномерной селективной спектроскопии ЫОЕ, в тех случаях, когда это было возможно); использованием современного оборудования и методических подходов к исследованию.

Практическая значимость работы:

Предложенная методика позволяет эффективно исследовать структуру малых конфор-мационно подвижных молекул лекарственных соединений в условиях предельного сужения (ш0-Хс « 1).

Результаты имеют важное значение для понимания биологической активности малых нежестких молекул лекарственных соединений (ибупрофена, парацетамола, фелодипина) в растворах. Описание конформационного состояния изученных молекул в растворах может использоваться при анализе межмолекулярных взаимодействий, которое во многом определяет их биологическую активность. Установленная закономерность инверсии населенности конформационного состояния исследованных молекул может помочь выявить пути получения кристаллов данных соединений тех или иных полиморфных форм из насыщенных растворов.

Личный вклад автора. Участие при постановке целей и задач исследования. Выполнение экспериментов ЯМР по изучению пространственной структуры малых конформационно подвижных молекул. Обработка, анализ и интерпретация теоретических и экспериментальных данных. Формулировка основных положений и выводов диссертации.

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на международной конференции «Nuclear Magnetic Resonance in Condensed Matter. NMR in Heterogeneous Systems» (St. Petersburg, Russia, 2010);V Всероссийской конференции «Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях» (Казань, 2011); XXV Международной Чугаевской конференции по координационной химии (Суздаль, 2011); XI Международной конференции «Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах» (Иваново, 2011); VI и VII конференциях молодых ученных «Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем» (Иваново, 2011-2012); XVI Симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Иваново, 2011); XV международной молодежной научной школе «Actual Problems of Magnetic Resonance and its Applications» (Kazan, Russia, 2012); международной конференции «Kinetics and mechanisms of crystallization and next generation material» (Ivanovo, Russia, 2012); XIX Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Йошкар-Ола, 2012).

Диссертационная работа выполнена в ИХР РАН в соответствии с основными научными направлениями фундаментальных исследований РАН по теме «Молекулярные и ион-молекулярные жидкофазные системы в широком диапазоне параметров состояния, включая сверхкритическое. Структура, динамика и сольватационные эффекты» (№ гос. регистрации 01200950825) (2010—2011 г.) и по теме «Развитие подходов и методов физической химии в исследовании многокомпонентных супрамолекулярных, молекулярных и ион-молекулярных систем как перспективных материалов» (№ гос. регистрации 01201260481) (2012-2013 г.). Работа была поддержана федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (Г.К. №02.740.11.0857), международной программой имени Марии Кюри (FP7-PEOPLE-2009-IRSES), грант № 247500, а также грантами Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) (№ 12-03-31001 мол_а и № 12-03-00775_а).

1. Возможности импульсной ЯМР спектроскопии

Информация о пространственной структуре и конформационном состоянии имеет первостепенное значение для понимания конформационной активности молекул лекарственных соединений, лежащей в основе их биологической активности [1], а также механизмов их действия на организм [2], в том числе биодоступности [3]. Более того, такого рода информация может применяться для описания сложного поведения нуклеации полиморфных модификаций кристаллов биологически активных конформационно подвижных соединений [4].

Существует ряд экспериментальных методов, которые используются для таких целей, например, колебательная молекулярная спектроскопия (ИК и Раман-спектроскопия) [5], рентгеновская спектроскопия поглощения[6,7], ЯМР спектроскопия [8-10]. Каждый из методов имеет свои достоинства и ограничения, так ИК и Раман-спектроскопия из-за достаточно большой ширины полос поглощения в данных методах часто возникает трудность спектрального разделения вкладов. Такую проблему предлагают решать при помощи новой двумерной методики ИК спектроскопии. А в рентгеновской спектроскопии поглощения используется сложный математический аппарат для преобразования результатов рентгеноструктурного анализа в структурные параметры, и именно такой тип обработки сомнителен и является предметом дискуссий. При таком анализе структуры требуется более точная калибровка метода математической обработки диаграмм рентгеновского рассеивания. Более того, все эти методы могут дать лишь качественную информацию в определении конформационного равновесия. В этом отношении ЯМР спектроскопия высокого разрешения является одним из наиболее эффективных методов определен