Разработка комплекса хроматографических методов определения наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ в биологических жидкостях при токсикологических исследованиях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЗАОЧНЫЙ ИНСТИТУТ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

на правах рукописи

"РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАРКОТИЧЕСКИХ АНАЛЬГЕТИКОВ И ИМ СОПУТСТВУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ПРИ ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ".

Специальность 02.00.02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1996

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Московского Государственного Заочного Института Пищевой Промышленности и в кабинете аналитической диагностики острых отравлений КДЛ ГКБ N 33 ии. проф. A.A. Остроумова

Научный руководитель: Заслуженный деятель' науки и техники РФ, доктор химических наук, профессор В. А. Клячко

Научный консультант: кандидат биологических наук

С. И. Никуличева ¿¿{

Официальные оппоненты: доктор химических наук, проф. И. А. Ревельский доктор химических наук ^ проф. В. Н. Бочкарев о о л

Я

Ведущая организация: Московская Государственная Академия Пищевых Производств.

Защита состоится ^^, 199 часов на

заседании Диссертационного бювета по аналитической химии К. 003.45.02 в Московской государственном заочном институте пищевой промышленности по адресу 109В03 г. Москва, ул. Чкалова, 73. О0^' О^О^ЬСШЛ^^^

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГЗИПП.

Автореферат разослан ^^^^(С^Я^Ь^Я. 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

кандидат химических наук, доцент V/!/'//\/ Г. Р. Касьяненко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ И ЕЕ СОДЕРЖАНИЕ

Актуальность темы. Развитие современной аналитической хими» характеризуется значительным возрастанием роли физических и физи ко-химических методов при определении качественного и количественного состава исследуемых объектов. Ведущее место среди таки> методов занимает хроматография, которой присуща высокая экспресс ность и селективность разделения, а также возможность осуществле ния анализа при наличии небольших количеств анализируемых образцов. Следует отметить, что современная хроматография является гибридным методом анализа, поскольку включает не только стадию разделения, но и стадию количественного определения разделенных компонентов.

Среди хроматографических методов особое место занимает тонкослойная хроматография (7СХ), которая благодаря своей простоте, чувствительности и высокой разрешающей способности стала одним из самых распространенных методов при анализе биологических объектов, в частности, в скрининге мочи на наличие в ней наркотиков и им сопутствующих веществ. Проводя разделение при исследовании большого числа проб, можно очень быстро отсортировать пробы не содержащие наркотиков и получить представление о составе проб, давших положительные результаты. В последнее время все шире и шире для анализа лекарственных препаратов в судебно-химических и химико-токсикологических лабораториях используются новые виды хроматографии: высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ) и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЗЖХ). Эти виды хроматографического анализа постоянно совершенствуются, возрастает эффективность разделения, изыскиваются возможности для анализа новых веществ и получения большого объема информации об исследуемых образцах.

К наркотическим веществам относятся строго определенные средства и вещества, а именно: опий, морфин, кодеин, промедол, эфедрон, метадон, гашиш, омнопон, амфетамин, метиламфетамин,, фен-циклидин, ЛСД и другие.

Со времени введения в клиническую практику наркотических анальгетиков (морфин, кодеин, промедол, омнопон) эта группа препаратов характеризуется неуклонно возрастающим уровнем потребле-

ния и злоупотребления. Злоупотребление лекарственными препаратами, а также их дериватами, например героином, эфедроном или мети-ламфетамином широко распространено , а международный характер подпольной торговли наркотиками означает, что любая лаборатория, занимающаяся определением лекарственных и наркотических веществ в биологических пробах организма человека в своей работе может столкнуться с широким спектром этих соединений. Кроме того, в случае злоупотребления наркотическими анальгетиками они часто встречаются в смеси с другими лекарственными веществами или антидотами, т.е. возникает сложная аналитическая задача по выделению и идентификации специфических наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ.

Техническая база химико-токсикологических лабораторий активно пополняется современной аналитической техникой, однако отсутствие методического обеспечения вызывает значительные трудности при выполнении конкретных экспертиз и исследований.

Одним из путей решения этой задачи по нашему мнению является разработка комплекса хроматографйческих методов анализа наркотических средств и им сопутствующих веществ.

Для данного исследования выбраны некоторые наркотические анальгетики и им сопутствующие вещества, являющиеся в последние годы наиболее распространенным объектом анализа химико-токсикологических лабораториях г. Москвы; их структурные формулы приведены на рис. 1

При разработке методов анализа наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ для медицинских и правовых целей необходимо, чтобы отдельная методика не требовала больших затрат времени, использовала минимальное количество исследуемых объектов и давала хорошо воспроизводимые результаты, согласующиеся с данными контрольного анализа объекта другим методом.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка комплекса хроматографических методов идентификации и количественного определения наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ в биологических жидкостях при токсикологических исследованиях. Мы остановились на комплексировании методов тонкослойной и жидкостной хроматографии.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить

следующие основные задачи:

- установить оптимальные условия выделения к разделения наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ в режиме прямо-фазовой ТСХ;

- изучить хроматографическуо подвижность наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ методом обра-щенно-фаэовой ТСХ для разработки методики их идентификации в биологических жидкостях;

- разработать методики количественного определения наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ в биологических жидкостях;

- оптимизировать условия выделения и разделения наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ в биологических жидкостях методом ВЗХХ;

- разработать методики определения наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ в биологических жидкостях методом ВЭЖХ;

- разработать комплексный метод определения распространенных наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ на основе гибридизации методов ТСХ ( адсорбционный и распределительный- варианты на отечественных пластинах Сорбтон RP2 и Сорбтон - Диол) и ОФ-ВЭЖХ, позволяющий

> надежно идентифицировать- и количественно определить исследуемые вещества в биологических жидкостях- ~ Научно■-- техническая новизна. ■ • -

Впервые в России на пластинах отечественного производства (Сорбтон RP2 и Сорбтон - Диол), полученных плазмохимическим методом, проведено комплексное исследование закономерностей хроматог-рафического удерживания некоторых наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ как в чистом виде, так и в модельных смесях и в биологических жидкостях в условиях ТСХ и ВЗЖХ. Проведены сравнительные исследования отечественных пластин на основе сили-кагеля с привитыми фазами, полученными плазмохимическим методом, и пластин фирмы Merck.

Установлено, что пластины отечественного производства Сорбтон RPZ и Сорбтон - Диол обеспечивают высокое качество проводимых анализов, в отличие от пластин фирмы Merck слой сорбента RP2 пол-

чостью смачивается водой, что позволяет использовать для разделения элюирующие системы с любым содержанием воды.

. Предложена новая унифицированная элюирующая система для ТСХ, обеспечивающая эффективное разделение всех исследуемых соединений и их количественную оценку.

Впервые предложены унифицированные методики идентификации нескольких наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ методом ТСХ на отечественных пластинах с различной химией поверхности - Сорбтон КР2 ( они могут быть использованы одновременно как в нормально - фазовом, так и в обращенно - фазовом вариантах ТСХ) и Сорбтон - Диол с привитой пропандиольной фазой.

Показана возможность переноса данных при разделении алкалоидов группы опия методом ОФ-ВЗЖХ на ОФ-ТСХ при использовании пластин Сорбтон ИР2.

Показана перспективность использования методов ОФ-ВЗЖХ и ОФ-ТСХ для количественной оценки наркотических анальгетиков и им сопутствующих вещества биологических жидкостях.

Практическая значимость работы.

Предложение методики гибридизации методов ОФ-ВЗЖХ и ТСХ на отечественных пластинах с различной химией поверхности, позволяют надежно идентифицировать и количественно определять наркотические анальгетики и им сопутствующие вещества в биологических жидкостях используются в практике различных хииико-токсикологических лабораторий . ' .

Методики анализа наиболее распространенных наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ, разработанные на отечественных пластинах с различной химией поверхности, внедрены в практику химико-токсикологических, лабораторий и судебно-химичес-нщ отделов Бюро судебно-медицинских экспертиз, занимающихся анализом этих соединений в биологических объектах.

На защиту выносятся:

- результаты теоретических исследований по изучению влияния подвижной фазы и сорбента на основе силикагеля с привитыми плазмохимическим путем фазами на воспроизводимость результатов анализа объектов исследования и разработки методик определения некоторых наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ в

биологических жидкостях.

Апробация работы. Основ: :ые результать работы докладывались и обсуждались на Республиканской научно-техническоч конференции по использованию современных методов при проведении экспертных исследований (Москва, 1995), на конференции секции сорбентов Научного Совета по хроматографии РАН по сорбентам, колонкам и методам хро-матографического анализа ( Москва, 1995), на VII Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии ( Москва 1996). Результаты работы испытаны и внедрены в практику химико-токсикологических лабораторий и судебно-химических отделов Евро судебно-медицинских экспертиз.

Публикация материалов диссертации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части в составе двух глав, посвященных соответственно разработке ТСХ - анализа наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ и комбинированию ТСХ и ВЗЖХ методов, общего обсуждения итогов работы и выводов. Диссертация завершается списком использованной литературы ( 129 литературных источников, из них 37 отечественных и 92 иностранных). Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и включает 27 таблиц, 10 рисунков и 4 схемы анализа.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

В обзоре литературы на основе анализа данных как отечественной, так и зарубежной литературы вплоть до 1995 года показано, что применявшиеся до сих пор методы рутинного анализа наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ базировались на ТСХ одного вида ( или адсорбционной, или распределительной), проводимой у нас на импортных пластинах: надежность получаемых результатов обязательно подтверждалась параллельным исследованием каким-либо независимым методом. Однако в реальных условиях небольших отечественных лабораторий не всегда есть техническая возможность подтверждения обнаруженных в процессе ТСХ - скрининга наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ иным инстру-

ментальным методом. В связи с этим в данной работе предпринято исследование возможности применения новых отечественных пластин Сорбтон RP2, позволяющих, в отличие от импортных пластин, реализовать 2 самостоятельных вида ТСХ - нормально-фазовый и обращен-но-фазовый, что обеспечивает "внутренний" контроль результатов и их надежность. Также целесообразно применение с той же целью комбинирование методов ТСХ и ВЭЖХ; это было второй задачей диссертации.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Поскольку основной задачей диссертации была разработка комплекса хроматографических методов определения наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ в биологических жидкостях, то в качестве объектов исследования использовались стандартные образцы лекарственных соединений, наиболее часто употребляемые наркоманами, а именно алкалоиды опия (морфин, кодеин, папаверин), _ --^етадои и димедрол.

При определении исследуемых веществ в биологических жидкостях объектом исследования являлись образцы мочи пациентов наркологических больниц и отделений по лечению острых отравлений.

При разработке методик определения наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ в биологических жидкостях использовались отечественные пластины на основе силикагеля с привитыми фазами Cz и CN и диольной, для сравнения использовались отечественные пластины Сорбфил, пластины Силуфол производства Чехии и пластины RP2 F254 S, фирмы Merck. Детектирование пятен осуществляли на денситометре фирмы Shimadzu CDS - 920 в режиме отражения при длине волны х » 254 нм.

ВЗЯХ анализ алкалоидов опия (морфин, кодеин, папаверин) проводили на жидкостном хроматографе "Waters" модель 440 с УФ-детек-тором_,,>:ллонка 300 х 4,0 мм, заполненная сорбентом Zorbax 0DS (5 ^ • чггх/; температура колонки 20± 3° С, подвижная фаза - ацетонитрил + 0,1М аммиачно-фосфатный буферный раствор (рН 5,8) в соотношении 65:35, скорость потока элюента 1,5 мл в минуту, интегратор Chrora-pak R-34( Ялфшя }, определение спектрофотометрическое, длина волны х =254 нм.

Структурные формулы исследуемых соединений.

ы-сн,

Морфин

0\ /Г0Л

НаС'

Метадон

/ ч

9~с»н.

сн,

—сн,

Кодеин

н3с-о

V

с-с—сн,

сн,

ЕМОР

ЕРОР

ХРОМАТОГРАФИЯ НАРКОТИЧЕСКИХ АНАЛЬГЕТИКОВ И ИМ СОПУТСТВУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ В ТОНКОМ СЛОЕ.

Оптимальные условия разделения алкалоидов группы опия в адсорбционном варианте ТСХ на отечественных пластинах

Сорбтон RP? и Сорбтон - Диол. Идентификация наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ также как и их количественное определение в биологических жидкостях имеет важное практическое значение. Использование пластин с различной химией поверхности сорбента позволяет надежно идентифицировать исследуемые вещества в сложных смесях. Пластины для ТСХ отечественного производства Сорбтон RPZ и Сорбтон - Диол представляют собой силикагель с привитыми фазами С? и диольной, нанесенный на лавсановую подложку. Зернение силикагеля 5-12 мкм ( ВЭТСХ) и 5-17 (АТСХ), толщина слоя - 125 мкм; В качестве связующего используется гель кремниевой кислоты. Поскольку пластины Сорбтон RP2 и Сорбтон - Диол являются новой продукцией, на первом этапе эксперимента было проведено изучение хроматогра-фической подвижности исследуемых соединений. Подвижность оценивалась на основе величины RfxlOO. Было приготовлено и исследовано 7 систем растворителей, рекомендованных в литературе для разделения основных лекарственных средств.

1 Хлороформ 5 Ацетон 4 Диэтиламин 1

2 Бензол 17 Зтилацетаг 9 Диэтиламин 1

3 Циклогексан 5 Хлороформ 4 Диэтиламин 1

4 Циклогексан 75 Толуол 15 Диэтиламин 10

5

Этилацетат 17 Метанол 2 25% аммиак 1

6 Толуол 45

Ацетон 45

Этанол 7,5 25% аммиак 2,5

7 Метанол 100 25% аммиак 1,5

Установлено, что лучшей для разделения исследуемых веществ является система этилацетат - метанол - 25% аммиак, причем

токсичный и дефицитный метанол может быть с успехом заменен на этанол, (см. табл. 1). При использовании этой системы на хроматог-раммах как на пластинах Сорбтон ЯР2. так и Сорбтон - Диол, образуются четкие, компактные пятна, что позволяет проводить количественную оценку хроматограмм .

Таблица 1

Хроматография исследуемых веществ на пластинах Сорбтон Р2 и Сорбтон - Диол в системе этилацетат - метанол - 25* раствор аммиака (17:2:1)(I) и этилацетат -этанол - 25% раствор'аммиака в том же соотношении компонентов (II)

Наименования соединений и пластин I II

Сорбтон ЯР-2 Сорбтон-Диол Сорбтон ЯР-2 Сорбтон-Диол

ИГхЮО в ЯГхЮО а 1?Гх100 а ИГхЮО в

Морфин Кодеин Дионин Папаверин Метадон 16 0.11 30 0.30 36 0.45 72 0.36 76 0.24 20 0.15 30 0.25 34 0.13 76 0.18 80 0.21 14 0.24 26 0.27 32 0.30 70 0.22 76 0.20 16 0.25 30 0.40 34 0.42 74 0.32 78 0.28

Оптимальные условия отделения метадона от алкалоидов группы опия.

Метадон относится к синтетическим наркотическим анальгетикам морфиноподобного действия. Он способен смягчать болезненные последствия отмены наркотиков группы опия, поэтому часто присутствует в биологических объектах наркоманов одновременно с этими веществами. Учитывая возможные пути превращения метадона в организме, а также его совместное с опийными алкалоидами присутствие в моче наркоманов, необходимо было разработать методы определения микроколичеств этих веществ. С целью наилучшего отделения метадона от опийных алкадоидов, исследовали 6 систем, известных по литературным данным и предложенных нами.

Наиболее подходящей оказалась система этилацетат - этанол - 2Ь% аммиак (17 : 2 : 1). На рис. 2 приведены денситограммы

модельной смеси алкалоидов группы опия, метадона и димедрола, который часто присутствует в иоче наркоманов. Как видно на рис. 2, все исследуемые вещества четко разделены. Значения ИГ х 100 хро-матографируемых веществ определяли как среднее арифметическое из 7 определений и вычисляли доверительные интервалы при Р»0,95. Нижний предел обнаружения для исследуемых опийных алкалоидов, ме~ талона и димедрола составляет 200 нг/мл.

Сравнительное исследование индикаторов, используемых при анализе алкалоидов группы опия и метадона.

Для обнаружения и последующего количественного определения некоторых наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ важное значение имеет выбор оптимального индикатора. В соответствии с задачами работы было проведено сравнительное исследование при тождестве всех условий анализа главных из ранее предложенных индикаторов.

Для обнаружения исследуемых веществ на хроматограммах использовали УФ-спектрометрию на длине волны 254 нм. Были также изучены некоторые общегрупповые реактивы: реактив Драгендорфа; реактив Марки; реактив Мандолина; раствор иодплатината калия.

Наиболее чувствительным методом является УФ - облучение хро-иатограмм при длине волны 254 нм. При этом пластина, у которой при изготовлении в сорбент был добавлен специальный флуоресцииру-ющий индикатор ( силикат цинка ), светится равномерным светло-зеленым цветом. Места, где находятся вещества,поглощающие в этой области спектра (в т.ч. исследуемые соединения), выглядят как розово - сиреневые пятна на зеленом фоне. Метод является хотя и высокочувствительным, но не специфичным, так как в этой области спектра поглощают многие другие лекарственные и даже эндогенные вещества и велика вероятность ложно-положительного результата.

Общегрупгювые реактивы, содержащие комплексы тяжелых металлов - реактив Драгендорфа и раствор иодплатината калия - чувствительны к соединениям, содержащим третичный атом азота (часто в гетероцикле); более специфичны, но менее чувствительны.

Наиболее удачными для исследуемых веществ оказались реактивы, содержащие концентрированную серную кислоту, а именно, реактив Марки и реактив Манделина. Эти реактивы наносятся капельно на

хромагографическую пластину по ходу хроматограммы (дорожкой) и. взаимодействуя с исследуемыми веществами, дают характерные окрашивания. При этом реактив Марки, взаимодействуя с алкалоидами опия, дает окрашивания с морфином - лилового цвета; с кодеином -сине-фиолетового цвета; с папаверином - винно-красного цвета, димедрол, который часто присутствует в кустарно изготовленных препаратах опия, окрашивается в ярко-желтый цвет. Реактив Манд&пина такие дает окрашивания с алкалоидами опия, но они менее специфич ны, однако метадон образует соединение ярко-синего цвета, что позволяет идентифицировать его в сложных смесях.

В дальнейшем использовали ультрафиолетовое облучение и реак тив Марки, дакщий специфические окраски с опиатами, а реактив Манделина для детектирования метадона. Определяемый минимум для всех исследуемых соединений порядка 200 нг в миллилитре.

Изучение хроматографического поведения наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ в режиме обращенно-фазовой ТСХ на пластинах Сорбтон RP? и RP? Р?^ S фирмы Merck.

Согласно литературным данным [ Березкин В. Г. с соавт. 1988 ) более 70% работ по ТСХ за рубежом выполнено на пластинах фирмы Merck . Поэтому работу по сравнении хроматографических характеристик отечественных пластин необходимо было провести на пластинах этой фирмы. Ниже приводятся характеристики пластин Сорбтон RPZ и RP2 FZ54 S Merck.

Сорбтон RPj RPZ F25 4 S фирмы Merck

Сорбент силикагель с привитой фазой Сг

Подложка полиэтилентере- стекло

фталат(лавсан) Зернение 5-17 мкм 5-8 мкм

Толщина слоя 120 мкм 250 мкм

Основное преимущество пластин Сорбтон RPZ состоит, в том, что они могут использоваться в двух вариантах - для обращенно-фазовой ТСХ (с полярными элюентами) и нормально-фазовой ТСХ (с неполярными элюентами). Изменение порядка выхода исследуемых соединений позволяет увеличить надежность идентификации наркотиков и им сопутствующих веществ в биологических жидкостях.

Обычно подвижная фаза, используемая в сбращенно-фазовой хроматографии, содержит до 50 % органического растворителя [ Шатц В. Д. с соавт. 1988 ]. Поэтому исследование зависимости значений Rf х 100 от состава подвижной проводили в системах вода - ацетонит-рил, вода - ацетон с различным соотношением компонентов, а также в отдельных растворителях.

В результате эксперимента выяснилось, что в воде все исследуемые соединения остаются на старте, в органическом растворителе они двигаются практически с фронтом подвианой Фазы. В системах с соотношением компонентов 50:50 практически не делятся морфин и кодеин; наиболее приемлемыми являются системы с соотношением ацетонитрила и ацетона с водой для пластин Merck 80 : 20, а для пластин Сорбтон RPZ 60 : 40.

Однако при использовании этих систем несмотря на то, что удовлетворительное разделение было достигнуто, необходима была дополнительная оптимизация, связанная с образованием "хвостов" у исследуемых соединений. Это объясняется тем, что остаточные сила-нольные группы могут взаимодействовать по ионообменному механизму с соединениями, обладающими основными свойствами. Такое взаимодействие предотвращают путем добавления в элюент соединений с основными свойствами (диэтипамин, 25% аммиак). Лучшее разделение морфина, кодеина и метадона наблюдалось при добавлении в подвижную фазу 0,5 мл диэтиламина для пластин фирмы Merck. Для пластин Сорбтон RPZ лучшее разделение морфина, кодеина и метадона наблюдалось при добавлении в подвижную фазу 1, 5 мл диэтиламина.

Таблица 2

Значения RfxlOO исследуемых соединений на пластинах различных фирм

Соединения Merck Сорбтон RPZ RfxlOO &Rf RfxlOO Ш

Морфин Кодеин Метадон I»: 85 25 60 го 40 " 38 ; 45 7 80 11 50 3: 44 58 14

* метаболиты метадона

Как видно из таблицы 2 пластины отечественного производства по разделительным свойствам близки к химически модифицированным

пластинам на основе силикагеля с привитой фазой Сг фирмы "Merck", ио экономически более выгодны из-за меньшего расхода органических модификаторов и более короткого времени анализа.

На рис. 2 также представлена хроматограмма и денситограмма модельной смеси на пластинах Сорбтон RPZ; элюент - ацетонитрил -вода - диэтиламин в соотношении 60:40:1,5.

В выбранных оптимальных условиях разделения на пластинах Сорбтон RPj> в режиме обращенно - фазовой ВЭТСХ были проанализированы образцы мочи наркоманов. Результаты анализа показали, что образцы содержали еще два пятна. Необходимо было их идентифицировать и количественно определить. Согласно литературным данным ме-тадон в организме подвергается деметилированию с образованием соединений, которое спонтанно циклизуются в два важнейших метаболита: 2-зтилиден -1,5 диметил -3.3 дифенил - пирролидин (ЕДЦР) и 2 - этил - 5 метил - 3, 3 дифенил - пирролидин (ЕМДР). У человека от 20 до 60 % дозы выделяется с мочой в течение 24 часов, причем около 33% в нативном виде, около 43Ж в виде ЕДДР и на долю ЕМДР приходится от 5 до ЮЖ. Результаты экспериментальных данных согласуются с литературными, согласно которым в нашем случае на долю неизмененного метадона приходится около 3056, а сумма метаболитов составляет около 50%.

Таблица 3

Результаты количественного определения метадона и его метаболитов в образцах мочи.

Определяемый компонент Содержание исследуемых соединений, рассчитанное по высотам пиков, мкг/м. Sep. 1 St

ЕДЦР Метадон ЕЦДР RfxlOO 1 2 3 4 5 6 7 1.94 3,31 2,07 0.04 0, 05 0, 04

36 40 45 1,97 1,94 2,00 1.97 1.90 1.91 1,90 3,47 3,36 3,20 3,40 3,20 3,25 3,22 2,13 2,08 2,18 2,13 2,01 2.00 1,96

и

т

0 « i

© U

в

в i"

рис. 2

в € |§

« h*

©

0 ц-

©

ьЬ lip

¡k¡ rWPH

fc Ï5 ¡

b |s s Jç2x с •oap.s

ífllí

il

N « i I <!

и !

i

Ci

oí ас СО

о «

о ¿

Û

0

3 N

4

1

£ г

Оценка разделительной способности '¡ОХ -пластин на основе силикаголл.

При сравнении разделительной способности пластин на основе силикагеля производства России и Чехии использовали норфин, кодеин, папаверин и метадон. Наряду с величинами Rí х 100 использовали разницу значений Rf х 100 для двух соседних компонентов на хроматографической пластине (ARf х 100). В работе [ Березкин В.Г. с соавт. 1984 г.) в качестве критического критерия для разделения веществ даются значения Ш х 100 равные 5. С использованием этого критерия нами было установлено, что при равных условиях ( состав элюента, насыщение камеры парами, длина пробега фронта растворителя ) разделительная способность отечественных пластин на основе силикагеля Сорбфил, Сорбтон RP2 и Сорбтон - Диол существенно выше, чем пластин Силуфол ( Чехия ), за счет более мелкого зернения силикагеля.

Таблица 4

Значения величин Rf х 100 и & Rí исследуемых соединений на пластинах с различным типом поверхности в 3-х системах растворителей.

I толуол - ацетон - этанол - 25% аммиак (45: 45:7,5: 2,5)

II эгилацетаг - метанол - 25% аммиак (17 : 2 : 1)

III бензол - этанол' - диэтилашн (95 : 5 : 2 )

Тип пластин -Исследуемые вещества Системы рг ас творителей II III

RfxlOO т Rix100 ¿Rf Rfxloo m

Сорбтон* RP2 Морфин Кодеин Метадон 8 ;; 72 30 8 £ 78 °г 12 4 56 40

Сорбтон* -Диол Морфин Кодеин Метадон 11 » 76 32 32 » 80 48 »4 6 20 40 60 40

Сорбфил* Морфин Кодеин Метадон 18 0 26 Л 82 56 32 10 80 48 10 t 62 38

Силуфол** Морфин Кодеин Метадон 22 6 28 с с 84 56 20 8 28 52 80 5Z 12 4 56 40

« длина пробега фронта растворителей - 7 см ** длина пробега фронта растворителей - 12 си

Количественное определение наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ в биологических жидкостях методом ТСХ

При диагностике острых отравлений и в судебно - химических исследованиях требуется определить концентрацию вещества в 1 л биологической жидкости или на 1 кг органа трупа, чтобы оценить степень интоксикации организма. Поэтому необходимо было разрабо-. тать методики количественного определения исследуемых соединений.

Содержание морфина, кодеина, папаверина и метадона определялось методом абсолютной градуировки. На основе экспериментальных данных составлено описание методики количественного определения исследуемых соединений и даны градуировочные графики для каждого из них. Определены метрологические характеристики методики: правильность по способу "введено - найдено": воспроизводимость - путем статистической обработки результатов для п - 4. Р - 95%, Кр, Г) * 2,78. Относительная ошибка определения для морфина не ■— превью^ет 4 3,48%. для кодеина ± 2,16, папаверина ± 3,44%, для ' * метадона ± 3,73%. Методика была использована для установления фактического содержания наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ в образцах мочи наркоманов.

Разработка схемы выделения из биологических жидкостей алкалоидов группы опия и метадона .

Основная и наиболее важная, а в некоторых случаях и решающая стадия подготовки образца - это наделение определяемого соедине-, -I гз -»'мо логической матрица При выборе методов выделения и оп-—. - - -редеЛения необходимо учитывать такие физико-химические характеристики анализируемых соединений, как липофильность, величина рКа, растворимость в водных и органических средах, значение ди-польного момента, устойчивость к действию света, температуры, кислорода, рН среды, спектральные характеристики.

Поскольку моча является наиболее распространенным объектом исследования на лекарственные, наркотические и токсические соединения и наиболее простым для анализа вследствие низкого содержа-

ниа белковых компонентов, в нашей работе мы использовали именно этот объект.

Наиболее распространенным методом изолирования наркотических, лекарственных и токсических веществ из биологических жидкостей остается жидкость-жидкостная экстракция. Унифицированные методики выделения лекарственных соединений из биологических объектов практически отсутствуют, а существующие общие схемы обладают рядом недостатков.

Согласно литературным данным, для извлечения алкалоидов опия в качестве экстрагентов используются чаще всего диэтиловый эфир и хлороформ, а также смеси растворителей, например смеси га-логензамещенных углеводородов ( хлороформ, дихлорметан, дихлорэтан) с полярными экстрагентами ( изопропанол, н-бутанол ) в различных соотношениях.' Поэтому на первом этапе нашего исследования было проведено сравнительное изучения полноты извлечения морфина, кодеина и метадона из мочи смесью хлороформ - изопропанол в различных соотношениях. Растворители хлороформ и изопропанол были выбраны из-за их доступности и относительно малой токсичности. Был изучен на модельной смеси выход исследуемых веществ по методике, приведенной ниже, с использованием в качестве экстрагента хлороформа, смеси хлороформ - изопропанол 95 : 5 и смеси хлороформ - изопропанол 90 : 10. Концентрацию искомых веществ определяли по градуировочным кривым. Результаты исследования приведены в табл. 5

Таблица 5

Влияние концентрации изопропанола в экстрагенте на выход исследуемых веществ

Выход ( % )

Исследуемые Концентрация изопропанола ( % )

вещества 0 10

Морфин 98 97 96

Кодеин 62 75 92 '

Метадон 82 85 92

Метаболиты метадона частично экстрагируются эфиром при рН=1-2, при этом в водном слое, используемом для выделения алкалоидов и метадона при рН = 8 - 9 и, соответственно, в экстракте

из подщелоченной мочи уменьшается концентрация метадона.

Поэтому, при целенаправленном исследовании биологической жидкости на алкалоиды опия и ые?адон, экстракция диэтиловым эфиром при рН"1-2 не проводится. Морфин является а^Фолитом, величины рКа1 - 9,9 и рК^г - 8.0 , рКй кодеина - 8,2 ; рК^ папаверина -5,0 ; рКа метадона г £.6. Оптимальное ?"ачение рН водной фазы, при котором происходит максимальная экстракция исследуемых веществ в органический растворитель, определяется формулой рН - рКй ± 2.

Следовательно, максимальная степень извлечения для морфина достигается в интервале рН от 6,0 до 7,9, однако в этом же интервале рН лежит и изоэлектрическая точка белков, при которой они также экстрагируются в органический растворитель и органический экстракт получается загрязненным. Поэтому для максимальной экстракции морфина предложено экстрагировать биологические жидкости при рН « 8.5 - 9., но рКа метадона - 8, 6, а рК« кодеина - 8,2 и оптимум рН для максимальной экстракции этих веществ лежит в интервале 30,5 - 11. Хотя в методических рекомендациях указано, что для проведения исследований на наркотические вещества минимальный объем мочи должен быть не менее 200 мл, практически пациенты сдают 50 - 80 мл, а часто и до 20 мл мочи. В этих случаях перед исследователем стоит задача максимального извлечения всех искомых веществ из одной порции мочи.

Ниже представлена разработанная нами схема выделения исследуемых веществ из объекта ( схема 1 ), в которой достигается максимальная степень извлечения исследуемых веществ при следующих условиях: объем мочи - 20 мл; двукратная экстракция равным объемом экстрагента; экстрагент - хлороформ - изопропанол ( 9:1 ); 1-ая экстракция при рН = 8,5-Э, 2-ая экстракция при рН - 11-12.

Схема 1

I-—| Подщелачивание

| Моча 20 мл | 25% аммиак

1-1 рН 8-9

+

|-1

| Хлороформ-изопро-| Встряхивание 60 колеб/мин - 5 мин, центрифу-| панол (9:1) 20мл | гирование 4000 об/мин -10 мин, декантация. |___1

| Хлороформный слой | фильтрование через безводный сульфат натрия

Водный слой сброс

| Водный слой |

Подщелачиванио

•--1 №0Н кенц. рН 11-12

+

,-, Встряхивание 60 колеб/мин - 5 мин,

| Хлороформ-изопро-| центрифугирование 4000 об/мин - 10 | панол (9:1) 20мл | мин, декантация. ■-,-1

I--1

| Хлороформный слой|- фильтрование через '-1-1 безводный сульфат натрия

| Экстракт 8-9 +■ 11-12

I_I

Хроматографическое исследование

Разработка методик идентификации и количественного определения наркотических анальгетиков методом ВЭЖХ.

Определение оптимальных условий хроматографического разделения алкалоидов группы опия основывается на исследовании хроматографического поведения при применении подвижных фаз разных составов. Согласно литературным данным наиболее часто для определения алкалоидов группы опия в биологических жидкостях используют градиентное элюирование на обращенно-фазнкх сорбентах. Однако элюирование в изократическом режиме имеет ряд преимуществ перед градиентным: хорошая воспроизводимость, особенно после смены колонки, удовлетворительное разделение большого числа проб и, самое важное, высокая стабильность нулевой линии детектора.

Изучена зависимость факторов емкости анализируемых веществ от концентрации аммиачно - фосфатного буферного раствора, используемого при приготовлении подвижной фазы. Факторы емкости рассчитывали по формуле - Ь0 где Ц - время удерживания

К « -, анализируемого соединения

к

^ - время появления на хроматограмме пика " растворителя"

I В. Д. Шатц с соавт. 1988 г.]. Было установлено, что концентрация буфера 0,05 или 0,1М существенно не влияет на фактор емкости, в дальнейшем использовали 0,1 М аммиачно - фосфатный буферный раствор. Для дальнейшего изучения условий разделения исследуемых веществ необходимо было выбрать концентрацию органического модификатора (ацетонитрила). Были исследованы элюенты с различным содержанием ацетонитрила (35, 40, 45, 50%). При содержании ацетонитрила в подвижной фазе 45 и 50% морфин и кодеин практически не удерживались. При концентрации ацетонитрила 40% морфин практически не удерживался, а кодеин имел приемлемое время удерживания. При уменьшении содержания ацетонитрила в подвижной фазе до 35% наблюдалось оптимальное разделение компонентов исследуемой смеси. При исследовании разделения двух компонентов на хроматограмме и его оценке важным параметром является расширение (¡?б), которое рассчитывается по формуле [В.Д.Шатц с соавт. 1988 г.] и определяется как отношение расстояния между максимумами двух соседних пиков к среднему арифметическому их ширины по нулевой линии

1 с(-1 к'

^ » — * - х - * N

4 а 1+ К' При полном расширении пиков » 1. Основную роль в данной ситуации играет коэффициент разделения (с(), который необходимо предельно увеличивать при помощи соответствующего подбора подвижной и неподвижной фаз и условий разделения. К - градуировочный множитель, который расчитывается по Формуле:

С* >< V

К - - . где

^ * 100

Сх - содержание стандартного образца во вводимой пробе (г),

V - объем вводимой пробы (мкл),

Б, - площадь пика стандартного образца (отн.ед.)

Внутренний стандарт - раствор налорфина 1 мГ/мл; V - 10 мкл

В табл.6 представлены данные основных хроматографических параметров для модельной смеси исследуемых соединений.

Таблица 6

Основные хроматографические параметры разделения модельной смеси алкалоидов опия на сорбенте 2огЬах ООБ (5 мкм) [ Подвижная фаза - 0,1М аммиачно-фосфатный буферный раствор рН 5,8 с ацетонитрилом в соотношении 65:35 )

Анализируемые соединения К а Rs

Морфин Кодеин Папаверин 0.54 1,80 5,71 1,0 3, 33 2, 33 1,24 4,90

Как видно из табл.6, разрешение пиков и удерживание исследу емых соединений приемлемо для практического использования метода

Количественное определение в биологических жидкое¡нх прово дили методом внутреннего стандарта. В качестве внутреннего стан дарта использовали раствор налорфина концентрации 20 мкг/мл.

Точность и воспроизводимость разработанной методики опреде лялась на модельных смесях. Относительная ошибка определения мор фина не превышает i. 1,9356, кодеина 2,71%, папаверина ± 2,51 56.

Сочетание адсорбционного и распределительного вариантов ТСХ для расширения информационной- возможности и -надежности идентификации -наркотических анальгетиков.

- -у. " ""'• ••. ,-'■•< - ■ - "'-•Таблица V Сочетание адсорбционного и распределительного вариантов ТСХ в анализе наркотических анальгетиков на пластинах- Сорбтон" "

Название соединения Значение Rf х 100 Окраска пятен

адсорбционный распределительный

Метадон 80 50 ярко-синий »*

Морфин 14 80 лиловый *

Кодеин 28 70 сине-фиолетовый*

Папаверин 76 44 красно-фиолетовый»

Димедрол 72 36 . желтый *

* - реактив Марки - \% раствор формалина в Н2S0.t

»» - реактив Манделина 0,5 % раствор ванадата аммония в Нг

Как видно из табл. 7, изменение порядка выхода позволяет идентифицировать эти вещества с большей достоверность» и служит дополнительным фактором надежности идентификации этих соединений.

От сопоставления результатов аналитических стадий исследования биологических образцов со сведениями справочно - информационного характера в значительной степени зависит обоснованность и полнота выводов химика - токсиколога. При этом необходимо четко представлять, что использование одной, пусть даже весьма информативной методики не позволяет в большинстве случаев при исследовании биологических объектов решать задачи диагностического и идентификационного характера. Если метод ТСХ применяют на стадии скринингового исследования или в случае отсутствия в распоряжении химика - токсиколога другого хроматографического оборудования . то метод ВЗЖХ является подтверждающим при производстве экспертиз. В небольших лабораториях, где отсутствуют приборы для проведения подтверждающих исследований ( ВЗЖХ и ГЯХ ) можно использовать для подтверждения скрининговых результатов анализа образцов мочи наркоманов в адсорбционном варианте ТСХ на пластинах Сорбтон ЙРг и Сорбтон - Диол распределительный вариант ТСХ на пластинах Сорбтон ПРг. Последовательность применения методов и методик и выявление на этой основе диагностических и идентификационных признаков наркотических веществ зависит от характера решаемых вопросов. Ниже представлена разработанная нами комплексная схема идентификации наркотических анальгетиков в биологических жидкостях ( схема 2 )

образец

схема выделения

адсорбционный вариант ТСХ

распределительный вариант ТСХ

адсорбционный вариант ТСХ

адсорбционный вариант ТСХ

пластины Сорбтон ИРг.

метод ОФ-ТСХ

метод ТСХ

пластины Сорбтон-Диол

пластины Сорбфил

метод ОФ-ВЭЯХ

Таким образом, разработанная нами схеиа комплексного исследования наркотических анальгетиков в биологических жидкостях определяет общее направление исследования с учетом применяемых методов.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

Основной задачей работы являлось комплексное исследование хроматографическими методами ( ТСХ и ВИХ ) некоторых наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ с цель» создания методик, доступных химико - токсикологическим лабораториям.

1. Установлены оптимальные условия разделения практически значимых наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ в режиме адсорбционной тонкослойной хроматографии на отечественных пластинах Сорбтон RPZ и Сорбтон - Диол.

2. Исследованы особенности хроматографнческого разделения наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ в режиме распределительной тонкослойной хроматографии на пластинах RPZ F254 S Фирмы Merck и отечественных пластинах Сорбтон RP2. Установлено, что отечественные пластины Сорбтон RP2 по разделительным свойствам близки к пластинам RPZ F25< S фирмы Merck, но требуют меньшей концентрации органического модификатора в составе подвижной фазы.

3. Проведен сравнительный анализ характеристик пластин массового применения на основе силикагеля. Установлено, что отечественные пластины Сорбтон RP2, Сорбтон - Диол и Сорбфил по разделительным свойствам существенно лучше пластин чешского производства (Силуфол).

4. Разработана методика идентификации и количественного анализа наиболее распространенных наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ методом ТСХ. Относительная ошибка определения морфина не превышает 4 3,48 %, кодеина ±2.16 56, папаверина ± 3, 44 %, метадона * 3, 43 %.

5. Разработана методика количественного определения методом ТСХ опийных алкалоидов, метадона и его метаболитов в биологических жидкостях на отечественных пластинах Сорбтон RP2 и Сорбтон -Диол.

6. Проведены исследования по оптимизации условий хроматогра-

Фического разделения методом ОФ-ВЭЖХ смеси алкалоидов опия (морфина, кодеина, папаверина). Установлены значения коэффициентов емкости, селективности и разделения для модельной смеси исследуемых соединений.

7. Предложена методика качественного и количественного анализа морфина, кодеина и папаверина в биологических жидкостях методом ВЭЖХ. Относительная ошибка определения морфина не превышает 1,93%, кодеина * 2,71 %. папаверина ± 2,51 %.

8. Усовершенствован метод выделения исследуемых веществ из биологических жидкостей, заключающийся в том, что из ограниченного объема аналита при различных значениях рН дважды проводится жидкость-жидкостная экстракция .

9. В результате проведенных исследований предложен комплексный метод идентификации и количественного определения наиболее распространенных наркотических анальгетиков и им сопутствующих веществ в биологических жидкостях на основе гибридизации двух методов ТСХ (адсорбционный и распределительный варианты) на отечественных пластинах Сорбтон ЯРг и Сорбтон - Диол и ОФ-ВЗЯХ, который обеспечивает необходимый контроль надежности полученных данных.

Основные положения диссертационной работы были представлены в следующих публикациях:

Журнал Судебно - медицинская экспертиза N 4 с. 24-26 М. 1995 -

Определение метадона в биологических жидкостях методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии.

Сб. научных трудов." Актуальные проблемы фармации. Биологическая доступность. М. 1981 с. 42-44

Определение границ обнаружения некоторых лекарственных соединений в биологическом материале при использовании ТСХ - скрининга.

Журнал Судебно - медицинская экспертиза N 3 с. 30-32 М. 1995

Сочетание хроматографических методов анализа при определении наркотических анальгетиков в биологических жидкостях.

Тезисы докладов VII Всероссийского симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии Москва. 1996г. с. 16

" Определение наркотических анальгетиков в биологических жидкостях методом ТСХ"

Республиканская Научно-техническая конференция " Использование современных методов при проведении экспертных исследований" Москва 1995.

" Определение метадона и его метаболитов на ТСХ-пластинах разных типов поверхностей".

МГЗШШ.Ротапринт,иад.205,т.75,зак.1665 - Г396