Разработка метода тонкослойной гельпроникающей хроматографии и его применение к анализу полимеров зерна и продуктов его переработки тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

всероссийсий заочный институт' пищевой прашшлЕнности ■

На правах рукописи

ГУРКОВСКАЯ Елена Александровна

УДК 543:678.012:614.3

■ - • -- РАЗРАБОТКА МЕТОДА ТОНКОСЛОЙНОЙ ГЕПЬПРСШЖАЩЕЙ -------------

ХРОМАТОГРАФИИ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ К АНАЛИЗУ ПОЛИ-- ■■ ■ ' МЕР ОБ ЗЕРНА И ПРОДУКТОВ ЕГО ПЕРЕРАБОТКИ

Специальность 02.00.02 - Аналитическая

химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1992

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Всероссийского заочного института пищевой промышленности.

' Научный руководитель - доктор химических наук, профессор

Ю.А.Клячко

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Ведущая организация - Институт повышения квалификации Комитета хлебопродуктов при Министерстве торговли и материальных ресурсов РФ.

Защита диссертации состоится 19 марта 1992 г. в 14 часов на заседании Специализированного совета К063.45.02 во Всероссийском заочном институте пищевой промышленности (Москва 2-4, ул.Земляной вал, д.73) в ауд. И 24.

С диссертацией монно ознакомиться в библиотеке институте-(Ульяновская ул., д.32).

Автореферат разослан 19 февраля 1992 г.

Ученый секретарь Спецсовета, кандидат химических наук.

Султанович Ю.А.; кандидат химических наук Болотов С.Л.

доцент

Касьяненко Г.Р.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Белки являются ваякеЛтлей составной частью пищи человека и кормов сельскохозяйственных анвотних. 0ш1 - главный фактор биологической и пищевой' ценности хлеба, крупы, макаронных изделий'. От содержания белков а их качества з кормах зависит продуктивность сельскохозяйственных животных.

Особое внимание исследователей биохимиков и технологов привлекают белковые вещества злаков, в изучении которых достигнуты значительные успеха. На основе применения нове1'шшх методов исследования высокополимерных соединений в зерноведенип показана видовая и сортовая специфичность белковых компонентов ряда злаков и роль их в процессах переработки на конечные пищевые продукты. Питательная ценность зернопродуктов зависит от состава и технологии переработки зерна. Свойства их обусловлены не только генетическими особенностями, но и влиянием внешних факторов - почвы, климата, агротехники. По химическому составу и свойствам отдельных компонентов зерна злаков различных триб (колен) отличаются друг от друга ; особенно заметны различия в белковых веществах, свойства которых характеризуют представителей отдельных триб не меньше, чем их морфологические признаки.

Основными аналитическими параметрами белков в пищевых продуктах являются их молекулярная масса, аминокислотный состав, структура и количественное соотношение различных фракций. Одним из главных методов выделения, разделения и определения белковых фракций служит сравнительно новый метод гельпроникающей хроматографии (ГПХ, гель-фильтрация, эксклюзивная хроматография), Обычно применяется колоночный вариант этого метода, отличающийся громоздкостью аппаратуры, употреблением больших количеств дорогих ■ и труднодоступных реактивов, длительностью аналитической процедуры (порядка нескольких суток на один анализ). Предложен и используется в некоторых странах друтой вариант метода ГПХ - тонкослойный оланарный (ТС-ГПХ). Он отличается достоинствами во всех тех отношениях, в которых имеет недостатки колоночный метод, но и сам содержит ряд трудностей.

В нашей стране метод ТС-ГПХ практически не применялся. В анализе белков злаков и хлебопродуктов в нашей стране, да и за

!

рубежом, метод ГПХ, вероятно вследствие слоаноста колоночного варианта, фактически не использовался. А необходимость в исследовании белкового состава этих материалов, особенно в связи с современными проблемами технологии хлебопечения, макаронного и кондитерского производства, велика.

Задачи диссертационной 'работы заключались в создании простой аппаратуры для ТС-ГПХ, ^разработке техники аналитической работы по этому методу, включая методику получения устойчивого тонкого слоя геля на пластинах,' методику элюцли и количественного -анализа", и-в использовании разработанного метода для анализа бел: ковых компонентов в зерне основных злаковых культур нашей страны •(пшеницы, ржи, кукурузы) и получаемой из них муки.

Научная новизна диссертации заключается в разработке технологии анализа белков методом тонкослойной гельпрокиканцей хрома---------тографшг;-предоюнен удобный, простой и компактный прибор ТС-ГПХ;

установлены принципы изготовления эффективных тонких слоев и осуществления методики анализа ; впервые методом ГПХ осуществлено исследование белков з сортовых и рядовой пшеницах нашей страны, . .. . _ржи и кукурузы.

Практическое значение работы. Впервые в нашей стране метод ТС-ГПХ доведены до возможности его непосредственного применения - для анализа высокомолекулярных соединений и в особенности биопо-----------лимеров в пищевом сырье и в пищевых продуктах ; разработаны методика определения низкомолекулярных и высокомолекулярных белковых фракций в зерне злаков И муке. Разработан метод анализа клейковины и прогностической оценки качества зерна и муки по составу образующих ее белков. Установлено, что метод ТС-ГПХ один может заменить сложные комбинированные методы ГПХ и электрофореза.

Автор выносит на защиту:

- Разработанный прибор1 для ТС-ГПХ и способ создания устойчивых тонких слоев для проведения гель-хроматографии ;

- Методику анализа реперкых эталонов-стандартов ПЗГ и белков по методу ТС ГПХ ; ¡,

- Методику анализа белковых составляющих пшеницы, ран, кукурузы, а также муки ;

- Результаты анализа белков (определения молекулярных масс, количества и состава основных белковых фракций) пшеницы, разных

сортов, пшеничной муки, ржи ы кукурузы.

Апробация работы. Материалы диссертациидокладывались и обсуждались на Всесоюзной конференции "Применение хроматографии в пищевой, микробиологической и медицинской промышленности" (Геленджик, 1990 г.), Всесоюзной конференции по аналитической химии органических веществ (Москва, Г991 г.), на семинаре РЦ Дома знаний "Аналитические методы контроля пищевых продуктов" (Москва, 1992 г.), на ежегодных научных конференциях ВЗИППа в 1990 и - • 1991 гг.

Публикации. Основные результаты работы изложены в 4 публикациях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц, 47 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы по вопросам полимерного состава злаков а продуктов их переработки и методов .. исследования биополимеров в этих материалах, экспериментальной части в составе 10 глав, выводов и списка цитируемой литературы (94 наименования).

Содержание работы

Обзор литературы состоит из двух частей: первая посвящена вопросам химического (и особенно - полимерного) состава зерна основных злаковых культур - пшеницы, ржи, ячменя, кукурузы; вторая -состоянию и развитию гельпроникающей хроматографии. В самой аналитике биополимеров зерна и продуктов явно недостаточно используется такой мощный метод исследования полимерного вещества и макро-молекулярных реакций как гель проникающая хроматография. Причин для этого много, но одной из основных здесь несомненно является сложность и длительность, а такие в определенном смысле недостаточная чувствительность наиболее применяемой формы ГПХ - колоночной.1 Новые, еще вообще недостаточно оцененные преимущества имеет тонкослойная форма ГПХ, которая, к сожалению, и в других, чисто технических отраслях материаловедения не получила достаточного развития и применения и почти совсем не использовалась в химическом зерноведении и физикохимии технологии зерна.

ЭКСПЕИФЛЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Использовашше реактивы н материалы. В работе бшш использованы маркерные белки - рпбонуклеаза* (из подаелудочной келезы крушюго рогатого скота,(Beнгрия), хшотрипскн, бычий сывороточный альбумин (БСА), овальбушн, инсулин (uerai В) и маркерный декстран голубой 2000 (ширма "Серва" ФРГ) ; красители - ку-масси ярко голубой Р-250 и Г-250 (фирма "Серва"), ашдошварц ЮБ (фирма Реанал", Венгрия) ; полиэтиленгликоли ММ от 200 до 40000 фирма ""Мерк") ; декстрановые гели Сефадекс марки Г-50, Г-75, ■^F-100Г-200 сверхтонкие (фирма "Фармация", Упсала, Швеция) ; хроматографическая бумага ГДР марка Филътрак ФНЗ , ФН7. Осталь---ные использованные в работе реактивы - отечественного производства квалификации ч.д.а. и ос.ч.

Объекты исследования. В качестве объектов исследования были "'•"-^использованы пшеницы Мироновская 808 (I кл.), Саратовская 46 ' " "(П'кл.), рядовая (I кл.) урояая 1990 г., пшеничный зародыш, пшеничная мука высшего , первого и второго сорта, полученная на мельничной установке ФЕБ "Нагема", пшеничная хлебопекарная мука, кукуруза и кукурузная мука.

Методические и технические вопросы анализа

- — —-------белков способом ТС-ГПХ

Аппаратурно-технические вопросы.

В нашей работе используется герметичная камера.из полиэтилена высокой плотности с покрытием из органического стекла, в котором имеется щель для нанесения исследуемых образцов. Камера снабжена устройством для поднятия и фиксации ее под определенным углом к горизонтальной плоскости при движении элюента в нисходящем направлении. Внутри камеры в нижней и верхней части имеется два резервуара для заполнения их элюентом. Нижний резервуар заполняется ровно настолько чтобы увлажнить полосу "мостика" фильтровальной бумаги, а верхний заполняется почти полностью, но так,

- --.-чтобы не было перелива при наклоне камеры (рис.1).

Для ТС-ГПХ применяют такие же стеклянные пластины, как и для ■ обычной ТСХ. Нами использовались пластины размером 100 х 200 мм, 130 х 180 мм и 200 х 200 мм. Стеклянную пластину тщательно очищали посредством промывания ее с растворителем (ПАВ), прополаски-

-6" Ч: "

вали в дистиллированной воде и высушивали в сушильном шкафу при I Г20°С в течение нескольких часов. Непосредственно перед нанесением гелевой суспензии пластина опрыскивалась этанолом (96°)I Недостаточно очищенная пластина приводит к неудовлетворительному нанесению геля и обнаружению исследуемых веществ. При нанесении важным фактором является консистенция геля. Процесс набухания 1 можно проводить непосредственно в том буферном растворекоторый используется для хромагографироваяия. ; ' ;

Для каждой марки Сефадекса применяется определенное Мини-' 1мальное время набухания. , ; -I.

Для нанесения гелевой суспензии на пластину нами применя-_ется простое размазывавшее устройство в виде стеклянного стержня с диаметром 10 мм. По краям пластины закреплена липкая лента, .толщина которой не превышает 0,5 мм. Гелевая масса кладется на пластину посередине и размазывается стержнем равномерно назад и вперед. Когда слой намазан, он прилипает мгновенно к пластине без необходимости дополнительного фиксатора. Толщина слоя между 0,5-I мм является подходящей для разделения. Готовая пластина помещается в камору и соединяется с резервуарам, заполненными, элю-ентом, бумажными мостиками и после этого камера наклоняемся на угол для проведения опыта. Перед нанесением образцов готовую : пластину следует промыть буферным раствором в течение' ночи. Образец наносят капилляром в виде капли, так как слой не должен быть поврежден. Скорость потока жидкости регулируется посредством изменения угла наклона пластины. Наиболее подходящий угол наклона должен быть 10-20°. Вещества при этом будут мигрировать со скоростью 1-5 см/час. ; '

В компактной структуре прибора ТС-ГПХ большое значение имеет узел регулировки угла наклона камеры. Угол наклона камеры является своеобразным и мощным фактором управления процессом хромато-графирования в методе ТС-ГПХ. Вместе с тем фактор этот и очень чувствителен, а поэтому при установлении любой конкретной методики необходимо исследовать его роль и оптимизировать его|. Такая работа была наш проведена при установлении методики анализа сначала на полиэтиленгликолях, а затем при.анализе пшеницы, на стандартных белках. На рис.2 и 3 представлены результаты исследования, проведенного с теш реперными белками, которые были нами избраны при анализе пшеницы. Кроме показанных был проверен еще

1 8

к О

И см п X

-

М

А*,5

[д ММ

5,0

Рис.2.¡Зависимость длины пробега от логарифма МЫ стандартных белков на Г-50, время разделения 2 часа 25 шнух, угол наклона 12°. И - инсулин ММ-6000, Р - рибонуклеаза Ш-13700, X - химотрипсин Ш-25000, ОБА - овальбумин ¡Ш-45000, БСА -бычий сывороточный альбумин Ш1-68СЮО.

а

8

I

ь

1

о

и см . ОЗА^ ^СА

,1 : И ^ Р/ 1 <

1 1 > 1

М

4,5

1д ММ

5,0

Рис.3. Зависимость длины пробега от логарифма ММ стандартных белков наГ-200, время разделения 3 часа 30 минут, угол наклона 15°.

угол 10° ; опиты были проведены и на непосредственно анализируемых белках. Но типичные и определившие оптимум результаты дало поведением реперных белков. Критерии выбора - скорость процесса и наклон градуировочного графика в увязке с маркой сорбента. По-видимому, угол наклона 15° лучше при использовании больших номеров сефадекса, для меньших номеров более подходит угол 12-13°.

Для выбора оптимального угла наклона и проведения экспериментов в условиях наиболее эффективного разделения'и определения молекулярных масс исследуемых объектов мы провели экспериментальные изыскания с поллэтиленгликоляыи (ПЭГ). В|качестве аналита использовали растворы ПЭГ, сорбентами служили Сефадексы - Г-50 и Г-100 - сверхтонкие. Угол наклона менялся от;5 до 25°. Была установлена прямая зависимость скорости миграции веществ от угла наклона. При одинаковом угле наклона скорость(на слабо сшитых Сарадексах Г-100, Г-150 и Г-200 сверхтонких меньше¡чем на Сеша-—:дексаг с более высокой степенью сшивки, таких как Г+25, Г-50 и Г-75 - сверхтонкие. '

Поскольку при элшровании фронт растворителя неразличим, скорость движения регулируют с шпощью соединений - маркеров. _____Наиболее подходящими и хорошо различимыми маркерами являются бычий сывороточный альбумин и альбумин человека, окрашенный амидо-черным ЮБ.

В настоящее время полиэтаяенгликоли (ПЭГ) с fffl 200-40000 находят широкое применение в качестве стационарных фаз в кидкост-ной хроматографии. В целях применения их в качестве стандартов мо- лекулярных масс нами, были проведены методические разработки. Сорбентами служили Сефадексы Г-50, Г-75, Г-100, Г-150, Г-200 сверх. тонкие. Элюирующими система!,ш были дистиллированная вода и щелоч-—ной буферный раствор (рН 8,5). На приготовленную пластину размером 200 х 200 мм стеклянным капилляром наносили пробы растворов ПЭГ в количестве 1-5 шел двух концентраций, приготовленные растворением 0,1г анализируемого ПЭГ в 4 мл дистиллированной воды и 0,2 г - в том же объеме растворителя. Результаты переснимали на . хроматограрическую бумагу Фильтрак рН ФН7 и детектировали параш йода после высушивания в сушильном шкафу при температуре Ю0°С в течение 30 минут. Общее сопоставление результатов показывает, что наблюдается линейная зависимость между пробегом фракции и ее мо-—лекулярной массой, выраженной через логарифм, независимо от при-

роды элюеята. Совершенно очевидно, что наилучшие результаты дает Сефадекс средней степени пористости - Г-50 и Г-75. Сеоадекс меньших номеров дает плохое разрешение для относительно высоких Ш. Сесоадекск более высоких марок даит плохое разрешение, так как и низкомолекулярные и высокомолекулярные фракции выходят недостаточно дифференцированно.

Растворители белка а элюенты

При изучении офракцаонного состава белков зерна пшеницы была прозедена экстракция образцов 0,2,^-ншл раствором Na ОН в 50;?-ком этаноле.

Разбавленные растворы щелочей не только растворяют клеыковп-ну, но извлекают клейковинные б ежи непосредственно из пшеничного шрота и муки. В результате экстрагирования муки в течение часа 0,2/ь-кым раствором NciQH в 50% этаноле удается перевести з раствор 94-98$ всех белков зерна.

Для определения молекулярной массы суммарного белка зерна пшеницы Мироновской 808, полученный экстракт был подвергнут разделению на Сефадексе Г-50 сверхтонком.- В качестве свидетелей попользовали белки с известной молекулярной массой « инсулин, рибо-нукл!зу, хдмотрипскн, овальбушн и бычий сывороточный альбумин. При хроматографировании были обнаружены фракции с молекулярной массой от 6300 до 84000 при элшровании фосфатным буферным раствором (рН 6,88) з течение I часа 10 минут. При элюировашш дистиллированной водой за такое не зреш были получены фракции с молекулярной массой от 5600 до 80000.

При разделении белков на Сефадексе Г~75 сверхтонком и элшрс-вашш з фосфатном буферном растворе (рН 4,5) были получены 6 фракций с молекулярной массой от 7000 до 350000 (продолжительность разделения I час. 30 минут), а при элшровании дистиллированной водой было получено 7 фракций с молекулярной массой от S000 до 51000 (за 2 часа).

Хроматограйпрозанпе суммарного белка зерна паенаца на Сефадексе Г-100, дало 8 фракций с молекулярной массой от 5500 до 81000 при элшровании фосфатным буферным раствором в течение 2 часов 30 г.шнут, а при элаировании дистиллированной водой были получены фракции с молекулярной массой от 5000 до 48000 (длительность разделения 2 часа 15 минут). Разделение белков зерна пшеницы на Сефадексе Г-200 дало 8 фракций с молекулярной массой от 10500 до

76000 в фосфатном буферном растворе (рН 6,86), длительность разделения - 5 часов, а при том же времени разрешения в дистиллированной воде было получено 5 фракций с мол.массами от 5500 до 57000. Аналогичная картина наблюдалась при определении молекулярных масс суммарного белка зерна пшеницы Саратовской 46 и рядовой, экстрагированного при тех же условиях и разделенного на сефадексах Г-50, Г-75, Г-Ю0 и Г-200 сверхтонких. Затем в соответствии с классификацией белков по их растворимости для изучения содержания фракций белковых веществ в зерне пшеницы и пшеничной муки была применена последовательная экстракция измельченного материала различными растворителями.

После выделения белков по их растворимости нами было проведено хроматографирование альбуминов, глобулинов, проламинов и глютелинов пшеницы Мироновской 808 на Сефадексах Г-50 и Г-100 сверхтонких. Элюирование проводилось в фосфатном буферном растворе. На Сефадексе Г-50 было получено 4 фракции альбуминов, экстрагированных дистиллированной водой со значениями молекулярной массы от 8000 до 21500; 6 фракций глобулинов, экстрагированных 0,5 М раст-воромГ|(1С£, с мол-"- ..тлярной массой от 10000 до 32000; 6 фракций глиаданов, экстрагированных 70%~тш раствором этанола, с молекулярными массами от 19800 до 78000; 4 фракции глютелинов, экстрагированных раствором 0,1 М уксусной кислоты, с молекулярными массами от 40000 до 100000. Продолжительность разделения I час 15 минут, что видно на рис. 4.

На Сефадексе Г-100 при тех же условиях извлечения белков было получено 5 фракций альбуминов с мол. массой от 6200 до 26000; 5 фракций глобулинов с мол. массой от 7000 до 28500; 6 фракций глиадкнов с мол. массой от 18500 до 56000 и 4 фракции глютелинов с мол. массой от 40000 до 100000; длительность разделения 2 часа 30 минут.

Хроматографирование суммарных белков муки пшеничной высшего сорта в тонком слое Сефадекс Г-50 дало 7 фракций с молекулярными массами от 10800 до 75000 при элюировании дистиллированной водой и 8 фракций с молекулярными массами от 2000 до 81000 в фосфатном буферном растворе при длительности элюирования I час 15 минут.

Белки пшеничной муки первого сорта на том же сорбенте дали в фосфатном буфере 6-8 фракций с молекулярной кассой от 6000 до 81000, а в дистиллированной воде такое же количество фракций с

4,0 4,5 5,0

. Рис.4. Зависимость длины пробега от логарифма молекулярной массы различных по растворимости белков пшеницы Мироновской 808,на Г-50. Время разделения I час, угол наклона 12°. О--альбумины, глобулины, А -глиадины,V - глютенины.

liüil

: - V •■■■ с.-: ! 'I: ! ; - 12 - I |

молекулярной массой от5500 до 670С0. ' I

' Разделение различных по' растворимости белков Шеничной муки проводили на Сесрадексак Г-50' и Г-100 сверхтонких в фосфатном буфере (рй 6,86). На ¿ефадексе Г^-50 было получено 4 фракции й^ьбумшов с Молекулярной'кассой от '9000 до 21500; 5 фракций глобулийов с'молекулярной массой1 !от ;100С10 дЬ 31000; 7 фракций г.Уадинов: ¿ молеку-

лярными.мае сами o'i 18000 !до [76000; 4 фракций глю1 Блинов с| молеку-^ лярными массамй от 40000 до X000Q. Продолжительность[разделения I kac.J5 минут.' ' ! I. ' ' '''■•■"" " ' 1

основе С'

атистиче-

ilil

ia !на оснойе сред-

.' :Метрологические доследования на |! ¡'y ской обработки; данных ,эксперимекта

; I1 | бценка'пб^реишостей'измёрений была пройеде------ -------

неквадратичного отклонения (по кавдой серии измерений)1 аЬсолют-нуУ погрешности определяли cji учетом коэффициента ¿тью&ента при! вь -бранном! уровн^''коверит^ной| вероятностй Р 4 О^Ьб! ji !Н I« ¡;'1! [ | 1 || В ЬриводиДоЙ|таблиц^ I 'представлены результаты статистической .обработки данных по пшенще Мироновской. 808, изученной в нашей работе. В качестве проверочного материала1 при разработке методики были использованы ПЭГи. Молекулярные массы ПЭГов определены условиями их синтеза и являются реперными характерис-гиками. Статистическая обработка результатов экспериментов в первую очередь прове-..дена в отношении непосредственных экспериментальных данных в пер-;.вичных единицах длин хроматографических,путей.' Данные1 качественного анализа (т.е. по молекулярным массам белковых компонентов зерна и продуктов переработки (мука) обработаны по материалам конечных оценок, основанных на градуировочных графиках'и выражены в .единицах молекулярной массы. Данные количественного анализа белко--вых-компонентов, проведенного способами денситометрии и измерения площадей пятен, выражены в процентах от общего количества белка, извлеченного соответствующими методами из исследуемого материала.

Обобщая результаты статистической обработки, можно констатировать, что относительная погрешность максимальна для сравнительно низкомолекулярных компонентов, где она может достигать 20% (для растворимых белков iüria альбуминов и глобулинов) и"ниже 10% для . более йысокомолекулярных, фракций (глиадин, глютелин). Количественный анализ, погрешность которого обусловлена уже| ке!самой хроМатс}-■ графической процедурой, а именно способом определения^ значительно точнее и дает погрешность в|пределах 2-5%. И 1

- Ь Г!

IОпределение белкового | екая 808 (Г-50), |

I : .■• Таблица I;; состава, пшеницы Миронов- .1

|.Т

I

) !

№№ пп

Средней значение Молекулярных! масс

Стандартное

отклонение

1

Относитель- | Доверительный ная погрёш- } интервал

НОСТЬ ^рГ, % } ± ; Д 1

I. 8^00

2. 13500

3. 16900

4. 1 24600

5. ! З2600

6. 45060

7. ! 56180

8., 64940

9. 81480

10. ' 98700

500 1 р И,' ! . ¡520

400 ; И : 2,3: , :490 ,

400 | :, .490 '

750 ! :■■ ' 3,1; ,930

750 | !;) ,, ; ! ! 930

690| ? | ' I» 5г. . ;; 850

520 ! . ¡640

| 840; , ' , 1.3 : , 1 та

800 ; , ?00

1300 ! 1,3 1600

Обсуждеш-! результатов аналитического исследования белков пшеницы (зерно)

Обсуждение большого материала по аналитическому исследованию белков зерна пшеницы двух сортов и рядовой основывается на том основном выводе, что- все исследованные образца пшеницы имеют одинаковый характер по фракционному составу - в качественном отношении. Различия заключаются в количественном соотношении фракций.

Наш обнаружены в суммарном белйе, не разделенном с помощью разных растворителей, 8 фракций, тогда как ранее исследователи о помощью обычной колоночной ПК находили только 4 фракции. При использовании дифференцирующих растворителей мы обнаружили 30 фракций, тогда как ранее некоторые исследователи, пользуясь дифференциальным растворением, последующими ГОХ, электрофорезом и другими дополнительными методами получали в сумме около 35 франций, причем речь идет о|сумме работ нескольких исследователей, а не одного или одной отдельной группы. Таким'образом, очевидно, что разрешающая способность метода ТСгГПХ значительно больше, чем метода коло-

1 I , 1 'I • • 1

ночной ШХ, и вместе с тем ТС-ШХ^Дна может.заменить совокупность 2-х-З-х других методов разделения ¡и[определения белковых веществ.

Количественный анализ (таблица 2) показывает, что имеется заметное сходство в оценке долей высокомолекулярных белков в обеих сортовых пшеницах - Мироновской и Саратовской - и заметное различие в доле этих фракций в рядовой пшенице (примерно порядка 10%). ■ ■ - ( - • -

Таблица 2

Количественное распределение белковых фракций пшеницы Мироновской 808,(Саратовской 46 и рядовой

¡ "Молекулярные массы! Й°н$вская I Сватовская | Рядовая

_ I ! I !

-'■ЭЕт— 6008-15000 5,9 . 6,8 "6,7

2. 16000-30500 ?,5 9,6 11,2

3. 31000-40500 9,2 11,9 15,6

4. 41000-58000 ' 15,6: , 16,7 19,9

5. 59000-78000 , 25,0 22,7 20,8

80000-100000 36,8 . ,' 32,5 25,8 '

Рассмотрим далее полученные результаты по отдельным группам белковых веществ. .

Альбумины и глобулины ;

"Белкит~растворимые в воде и солевых растворах, образуют группу альбуминов и глобулинов. Методом экстракции дистиллированной водой и 0,1 М раствором были получены растворы пшениц I и

П класса, которые затем хроматографировали в тонких слоях с применением Сефадекса. Наши результаты, полученные методом 1С-ГХП даны в сравнении с литературными данными в таблице 3,

Из данных таблицы видно, что молеулярная масса альбуминов, — полученная методом ТС-ГПХ, практически не отличается от величин, .

полученных методом ультрацентрифугирования и гельфильтрации на ДЭАЭ-целлюлозе, но несколько больше величин, рассчитанных по аминокислотному составу.

Таблица 3

Сравнение молектаяшшх масс альбуминов пшеницы, полученных методом ТС-ГПХ*и литературных данных

Методы определения ! Молекулярная масса

I Альбумин 13-А | Альбушн 13-Б

Метод ультрацентрифугирования 24800, 26000 13950

Метод электрофореза з присутствии дсн _ 13200

Рассчитанный по аминокислотному составу 20000 12900

Гельфильтрация на ДЭАЗ-цел-люлозе и ульграцентрифуги-ровании 19800 23000 11200

Метод ТС-ШХ:

на Г-50 2200+ 26100+ 930 930 13800+ 490

на Г-75 26000+ 930 11000+ 550

на Г-100 19200+ 490 П000+ 550

на Г-200 24000± 930 13400+ 490

При общем незначительном содержании альбуминов и глобулинов з зерновке пшеницы наиболее богат ими зародыш, из которого водой и солевыми растворами можно экстрагировать около 20% общего белка. Около 85$ его составляет альбуминовая фракция.

В наших опытах пшеничный зародыш, предварительно, измельченный, экстрагировали дистиллированной водой и 0,5 М раствором МйСЗ.. Полученные экстракты белковых соединений хроматографировали методом тонкослойной ШХ с применением Сефадекса. В белках пшеничного зародыша было обнаружено 6-Ю фракций с молекулярной массой от 6000 до 26100 на Сефадексе Г-50 сверхтонком при элюировании дистиллированной водой, а при элшровании фосфатным буферным раствором (рН 6,86) - белки пшеничного зародыша дали 8-Ю фракций на Сефадексе Г-75 сверхтонком. Полученные фракции белков имели молекулярные массы от 6600 до 23500.

TC-mX пшеничного зародыша, экстрагированного раствором 0,5Ы ЫаС? при элшровании фосфатным буферным раствором СрН 6,86) на Сефадексе Г-100 дала 6-8 фракций с молекулярной массой от 6000 до 25000. При экстракции 0,2^-ной ЫаОМ - в 50%-ном этаноле по Г-100 было получено всего 2 фракции с молекулярной массой 20000 и 26000, что очевидно указывает на присутствие в пшеничном зародыше низкомолекулярного глиадина, но его содержание в нем очень незначительно, На Г-200 при тех se условиях элюирования было получено 6 фракций альбуминов, экстрагированных 0,5 м раствором NclCíL , с молекулярными массами от 6700 до 23500 и 3 фракции с молекулярной массой 20500, 22000 и 24000, полученных экстракцией 0,2%-шш раствором NaOH в 50^-ном этаноле.

При изучении двух разных элщрующих систем бьшо отмечено, что в фосфатном буферном растворе исследуемые белки делятся на большее количество компонентов, чем в тех se условияххря элшровании дистиллированной водой.

Глиадины и глютенины пшеницы Мироновской 808 и муки пшеничной первого сорта

Белки глиадин и глатенин составляют основную часть клейковины. Для глиадина наиболее, характерной особенностью является способность растворяться в водных растворах спиртов - этанола, метанола при концентрации 60-70%. Именно на этом основании глиадин пшеницы и других злаковых культур выделен в особую группу спирто-растворшлых белков, проламинов, наличие которых отличает зерно злаковых культур от семян растений других семейств.

Несомненным достоинством метода ТС-ГПХ является возможность одновременного сравнения нескольких образцов.

Используя эту возможность, мы провели разделение глиадинов и глютешшов пшеницы и муки на одной пластине.

Глиадины были получены экстракцией 70^-ным раствором этанола, а глютенины - 0,1 М раствором уксусной кислоты.

При хроматографировании на Сефадексе Г-50 было получено 6 фракций глиадинов пшеницы Мироновская 808 с молекулярной массой от 25000 до 64000 и 5 фракций глиадинов муки первого сорта с молекулярной массой от 26000 до 56000. Глютенины пшеницы дали 4 фракции с молекулярной массой от 58500 до ЮОООО, а глютенины муки да-_ли 4 фракции с молекулярной массой от 63000 до 100000. Элюирование.

было проведено в фосфатном буферном растворе (рН 6,86). Результаты разделения глиадпнов и глютелннов на Сефадексе Г-100 при тех не условиях элюированпя были следующими: глиадпны зерна и муки дали по 4 фракции с молекулярными массами от 18500 до 67000, а глютошп-ы пшеницы л муки разделились на 4 фракции с молекулярной массой от 56000 до 100000.

Продолжительность разделения 2 часа 30 минут. Сравнение результатов гельхроматографии в тонком слое спирто- и кислотораст-воримых белков зерна пшензщы и муки пшеничной первого сорта на одной пластике с применением Сефадексов Г-50 и Г-100 сверхтонких показало практически аналогичную картину разделения. Белок, остакн щий на старте, можно идентифицировать как высокомолекулярный глю-тенин.

По существу полученных в этом разделе работу результатов по белковым веществам пшеш;цы и пшеничной муки и по предложенной наш методике можно сделать заключение, что, во-первых, применяемые в качестве элюирующей системы щелочной и фосфатный буферные растворы с разным значением рН являются более подходящими для гельхроматографии в тонком слое, нежели ; "цитированная вода ; во-вторы::, полученные молекулярные массы исследуемых объектов лежат в пределах от 5000 до 150000. Следует также указать, что для более четкого разделения и стабилизации скорости мигрируемых веществ большое значение имеет угол наклона камеры.

Если при гельхроматографии на колонке с применением Сефадек-са мы получаем при выходе четыре порции элюата, что соответствует альбуминам, глобулинам, проламинам и глюте-япнам зерна пшеницы, то при хроматограшировании в тонком слое Сефадекс каждая из фракций белков гапешщц и пшеничной муки, имещая определенную степень растворимости и определенный размер молекул, гложет разделиться на дополнительные фракции, тогда как при колоночной ГПХ подобного эффекта можно достичь только з сочетании с другими методами разделения - такими, как электрофорез в полпакриламидном или ультрацентрифугирование .

Это позволяет еще раз сделать вывод, что ТС-ГПХ по своей информативности, разрешающей способности, точности и быстроте разделения намного превосходит колоночный метод.

В таблицах 4 и 5 приводятся данные, суммирующие наши результаты определения молекулярных масс глиадиновых и глютеНиновых

■Кг

Таблица 4

| Сравнение молекулярных масс глиадинов пшеницы, определенных ! методом' ТСГПХ и литературных данных 'I '

Методы определения

'лиадин

* Молекулярная масса

, --------(---------—)——------1----------

¡СС-глиа- ,6-глиад. У"-глиад. ¡(¿)-глиад I. ___I___[ ^

[___3_____[____1„__1„„И1-И1---_1__.

1. Ультрацентрифугирование, если исключить агрегирование молекул

2. Суммарный глиадин по Осборну

3. Колонка Сефадекс Г-ТОО

4. По данным Войчика и Джонса

25000

100000

|

26000

5.

6.

Гюбнера, Ротфуса, Уолла Бернардена, Казарда, Мичема

7. Электрофорез в полиакриламидном геле

в присутствии ДОН после гельфильтрации на колонке

м 00

4900055000

6 полос от 30000 до 75000 преобладали Фракции с м.м. 32000 до 36000

3 компонента с м.м. от 33000 до 44000

2600037000

1600016000

2 компонента от 38000 до 44000

Продолжение таблицы 4

8. Электрофорез в полиакрилашдном геле в присутствии ДСЁ,

по данным Хамаузи ,Джоне-зава и др.

33000

38000

два компонен- 3 компонента с м.м. та о м.м.

38000 и 46000

50000 54000 64000

9. Метод седиментационного равновесия показал однородность всех операций по м.м.

10.Метод ТСГПХ Г -50

на

на на

Мироновская 808

Г -100 Г -100

Саратовская 46

27000

16500+ 500"

27000

25000+ 930"

32000+ 930"

28000

36000+ 930"

45000+ 860 48000+ 860" 32 ООО*-930

на Г - 200

19500*-500

24000+930

24000+ 930 34000+930

35000+930 380001-860

27000

45000+ 860

56000+■ 650"

67000+1040

52000640 64000+1040 47000+ 860

57000+650

650001-1040

м иэ

•"< !1 ¡1 I .:

Таблица 5

Сравнение молекулярных масс глютенинов¡пшеницы, определенных методом ТСГПХ, и литературных данных

Методы определения

Глютенин, молекулярная масса I ------------Г"---------Г-------

■ I <

1 сС"

I. Электрофорез в полиакоиламидном " геле в присутствии ДСЙ невосстановленный (контрольный) глютенин в основном остается на старте

2. с помощью метода ТСГПХ:

ТЕ

Т---

¡00-

25000^930

4100044000

90000-15000

40000+850 90000+900 52000+640

го о

Г-50 Г -100

пшеница Миронов.808

20000^,900 48000+850 ЮООООЙ600 51000+6^0

Г-50

г -юо

Саратовская 46

гюоо+до о 32000+дзо 24000+930

64000+1200 98000+1500

38000+85 0 97000+4500 45000+ 6^+0

фракций пшеницы двух сортов в сравнении с литературными данными, полученными разными методами, в том числе и колоночным методом ГПХ. Нам представляется, что эти данные - самое определенное подтверждение вышеприведенных выеодов.

ТС-ГПХ Пшэ!шчн0й муки

Для сравнения результатов разделения муки пшеничной высшего и первого сортов с мукой пшеничной хлебопекарной, которую употребляем для выпечек, мы проделали хроматографирование в тонком слое Сефадекса Г-50, Г-75 и Г-100 суммарных белков муки пшеничной хлебопекарной экстрагированной 0,2^-ным раствором N0.04 в 50то-ном этаноле.

На Сефадексе Г-50 при элюированин дистиллированной водой было получено 7 фракций с молекулярной массой от 9600 до 76000, в фосфатном и щелочном буферных растворах (рН 6,86), (рН 8,0) -по 7 фракций с молекулярной массой от 10800 до 76000. На Сефадексе Г-75 при элшровании дистиллированной водой было получено 5 фракций с молекулярной массой от 8700 до 65000, а на Сефадексе Г-ГОО при тех не условиях элшрования белки разделились на 6 фракций с молекулярной массой от 9800 до 71000.

Наш результаты и проблемы клейковины

Наши результаты свидетельствуют о том, что разработанный метод ТС-ГПХ глокет слуккть для характеристики клейковины зерна пшеницы и пшеничкой муки посредством определения отношения глиа-дин: глютеш!Н. Они дают четкие представления о молекулярном составе глютенина и о "размазывании" глиадиновой (проламиновой) фрак-. ции мевду низкомолекулярными и высокомолекулярными составляющими белка. Совершенно четкие результаты дает и сравнительные анализ молекулярного состава белков двух сортовых пшениц и рядовой хлебопекарной пшеницы, что видно из таблицы 2. Они дают характеристику клейковинных белков и самой клейковины, основанную на содержании в зерне наиболее высокомолекулярной фракции. По простоте оборудования и процедуры, быстроте анализа и определенности результатов разработанный метод, вероятно, доляен быть вне конкуренции.

ТС-ПК зерна ржи

Фракционный состав белковых растворов ржи и ржаной муки исследовали гельфильтрацней на Сефадексах Г-75 и Г-200 сверхтонких. Исследование фракций показало закономерное распределение белков по их молекулярным массам.

Гельхроматографией в тошом слое на Сефадексе Г-75 было получено 4 фракции альбуминов с молекулярной массой от 6000 до 16000 в дистиллированной воде и 5 фракций с молекулярной массой от 6000 до 17000 з щелочном буферном растворе (рН 8,5). Пролами-" ны ржи разделились на 4-5 фракций в разных буферных средах с молекулярной массой от 44000 до 90000. Гельфильтрация глютенннов -ржи дала на Сефадексе Г-75 2 фракции с молекулярной массой 90000 и 120000, а на Сефадексе Г-200 - 3 фракции с молекулярной массой --- -от-86-ООО до 14000. Сопоставление глютенннов ржи и пшеницы пока-—^—-зывает-их-раз личный состав особенно в области высокомолекулярных компонентов, хотя и отмечено определенное сходство качественного состава.

Белки кукурузы

Биополимеры кукурузы.ыало исследовались методы ГПХ - в основном здесь были использованы методы электрофореза в его различных формах . Белки кукурузы представлены специфическими формами глобули--"- - нов, один из которых имеет видовое название - зеин, другая - обще принятый глютелин. По классификации Осборна зеин принадлежит к группе спиргорастворимых проламинов.

В нашей работе при определении молекулярной массы белков

__кукурузы..альбумины и глобулины извлекали 0,2М раствором ^аСЕ

Экстракцию проламинов проводили 60%-вим раствором этанола, а глютелин кукурузы извлекали 0,Ш раствором едкого натра. При хрома-тографировании на "Сефадексе Г-100 пролашн кукурузы - зеин дал 4 фракции белка с молекулярной массой от 32000 до 170000, на Сефадексе Г-200.было получено 5 фракций зеина с молекулярной массой от 20000 до 170000. Глютенпн кукурузы дал по 2 фракции белка на том и другом сорбенте. Молекулярная масса фракций составляла 6300 ' и 78000 - на Г-100 и 67000 и 81000 - на Г-200.

выводы

1. В данной работе впервые в нашей стране представлены детальные аналитические исследования тонкослойной гельхроматогра-фии, имеющей ряд преимуществ по сравнению с колоночной ПК: быстрота проведения исследований (экономия времени), экономия дорогих реагентов, технических анализируемых материалов, возможность осуществления строго параллельных анализов нескольких проб или нескольких взаимно связанных объектов анализа ; большая чувствительность анализов.

2. Разработано простое аппаратурное оформление ТС-ГП-хрома-тографии, доступное для изготовления в любой лаборатории.

3. Разработана методика изготовления устойчивого и надежного тонкого слоя сорбента, что является узловым моментом применения ТС-ГПХ.

4. Разработанный метод ТС-ГПХ впервые применен для исследования белкового состава и количественных отношений компонентов белкового комплекса зерна пшениц различных отечественных сортов, ржи и кукурузы. Показана равноценность данного метода комплексу нескольких методов, обычно применяемых для решения вопросов анализа биополимеров злаков и продуктов их переработки.

5. Разработанные методики охарактеризованы с метрологических позиций и показано, что по показателям воспроизводимости,правильности и чувствительности метод ТС-ГПХ превосходит колоночную ГПХ.

Публикации по материалам диссертации

1. Е.А.Гурковская, Ю.А.Клячко. "Тонкослойная гельпрокикащая хроматография биополимеров и пищевых продуктов". Материалы

. Всесоюзной конференции "Применение хроматографии в пищевой, микробиологической и медицинской промышленности". Тезисы докладов. 1990 г., стр.84-85.

2. Е.А.Гурковская, Ю.А.Клячко. "Определение поллэтиленгляколей и белковых соединений с помощью тонкослойной гельпроникающей хроматографии". Материалы 71 Всесоюзной конференции по аналитической химии органических веществ. Тезисы докладов. М., 1991, стр.154.

3. Е.А.Гурковокая, Ю.А.Клячко. "Тонкослойная гельпроникающая хроматография биополимеров". Научно-производственное объединение "Медбиоэкономика". Научно-технический информационный сборник статей. Выпуск I, ГЛ., 1991, стр.19-23.

4. Е.А.ГУрковская, Ю.А.Клячко, Л.Д.Лондарь. "Определение молекулярной массы белковых соединений пищевых продуктов". Научно-производственное объединение "Медбиоэкономика"

"Передовой производственный опыт в медицинской промышленности, ■ - -— -рекомендуемый для внедрения. Научно-технический информацион-щц} сборник статей. Выпуск 5. М., 1991, стр.19-22.