Разработка методов исследования экстрагированных из раствора в газовую фазу ионов с помощью времяпролетного масс-спектрометра высокого разрешения, снабженного молекулярно-ионным реактором тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

Введение

1. Описание прибора

1.1 Ионный источник и система транспорта ионов

1.2 Время-пролетный масс-анализатор

1.3 Молекулярно-Ионный Реактор (МИР)

1.4 Большой ионно-траиспортный радиочастотный (КР-оп1у) квадруполь

1.5 Одиночная линза

1.6 Ортогональный время-пролетный накопитель-модулятор ионного пучка

1.7 Рефлектор масс-спектрометра

1.8 Детектор ионов

1.9 Резюме

2. Параметры Орто-ВПМС высокого разрешения.

2.1 Введение

2.2 Разрешающая способность

2.3 Примеры масс-спектров различных веществ

2.4 Точность определения массы

2.5 Анализ причин, ограничивающих разрешение Орто-ВПМС

2.6 Моделирование формы пика в масс-спектре численным методом

2.7 Выводы

3. Молекулярно-Ионный Реактор (МИР)

3.1 Введение и обзор литературы

3.2 Подходы к описанию свойств (ЯР-оп1у) квадруполей с газом (теория)

3.3 Экспериментальные данные по фокусировке ионов в МИР

3.4 Выводы 43 :4. Метод измерения подвижностей ионов в МИР :

4.1 Введение и обзор литературы

4.2 Теория

4.3 Ограничения метода

4.4 Экспериментальные результаты 47 5. Исследование фрагментации и превращений ионов, движущихся в 52 ;МИР под действием электрического поля при давлениях ~1торр

5.1 Введение и обзор литературы

5.2 Движение ионов в разреженном газе под действием электрического поля

5.3 Определение энергии активации реакции распада ионов азида в МИР

6. Получение информации о структуре пептидных ионов с помощью 60 ¡фрагментации постоянным или переменным полями в МИР при давлениях ~1торр.

6.1 Введение

6.2 Фрагментация ионов пептидов в МИР, активированная продольным 61 электрическим полем. Получение информации о структуре.

6.3 Новый метод селективной фрагментации ионов в МИР

6.4 Эксперименты по анализу структуры ионов при фрагментации их 66 вблизи порога неустойчивости Матье в МИР.

6.5 Анализ движения и разогрева ионов в МИР с помощью компьютерного 69 моделирования.

6.6 Примеры секвенса различных пептидов при фрагментации ионов 71 продольным и переменным ЯР- полем в МИР

Выводы

Масс спектрометрия является одним из наиболее чувствительных и точных методов анализа газов, жидкостей, а также органических твердых веществ. Долгое время применение масс спектрометрии в биологии и медицине ограничивалось анализом небольших летучих органических молекул. Дело в том, что для масс-спектрометрического анализа необходимо создать газофазные ионы исследуемого образца и при определенных условиях (энергия ионов, время жизни) транспортировать их в масс-анализатор, работающий, как правило, в условиях высокого (~10"7торр) вакуума. Применение традиционного метода ионизации электронным ударом требует испарения образца в газовую фазу, что оказывается эффективным лишь для сравнительно небольших летучих органических молекул. Методы десорбции и ионизации нанесенной на матрицу пробы лазерным импульсом (Matrix assisted laser desorption/ionization (MALDI)) [1] и Экстракции Растворенных Ионов при Атмосферном Давлении (ЭРИАД [2] или Electrospray [3-5](ESI)) оказались чрезвычайно эффективными для анализа разнообразных биологических, а впоследствии и просто органических и неорганических молекул. Изобретение этих методов явилось своего рода вторым рождением масс-спектрометрии для биохимии, медицины, и координационной химии.

Метод экстракции растворенных ионов при атмосферном давлении был в одно и то же время независимо открыт советскими и американскими исследователями, однако ввиду преимущественного распространения в мире англоязычной научной литературы общепринятым стало название Electrospray (ESI), объединяющее множество различных модификаций данного метода.

Поскольку ионный источник типа ESI принципиально дает квазинепрерывный ионный пучок, первоначально он использовался на магнитных и квадрупольных масс-спектрометрах. Соединение ESI с время-пролетным масс спектрометром считалось бесперспективным, т.к. традиционно это требовало стробирования ионного пучка, ограничивая эффективность использования ионного тока на уровне 0.1-й).0025% [6] (при разумном разрешении). Однако при более серьезном и внимательном подходе эта проблема была изящно решена изобретением и созданием нового типа времяпролетных масс спектрометров с ортогональным вводом ионов (Орто-ВПМС) [7]. Первый ВПМС типа рефлектрон с ортогональным вводом ионов от источника типа ESI (ESI Орто-ВПМС) был создан в нашей лаборатории в 1987 г. Прибор имел разрешение -1500-2000 на полувысоте пика при эффективной длине дрейфа - 2.15 м. Был проведен подробный анализ причин, влияющих на разрешение прибора такого типа и сделаны теоретические оценки максимально достижимой разрешающей способности [7-12].

Применение времяпролетного масс-анализатора имеет ряд преимуществ -неограниченный диапазон масс, возможность регистрации ионов всех масс с минимальными потерями и быстрота развертки масс спектров. Кроме того, в условиях регистрации полного масс-спектра за 200-300 микросекунд достигается чувствительность, близкая к режиму селективного ионного детектирования в кб адру по ль ных или магнитных масс спектрометрах. Поэтому Орто-ВПМС с ионным источником ESI очень быстро развиваются и на данный момент становятся незаменимыми инструментами для исследований в современной биохимии, имеющих дело с большими молекулами пептидов, белков и полинуклеотидов [1316].

Одним из направлений развития ESI Орто-ВПМС является повышение разрешающей способности и точности определения величины m/z (отношения массы m [а.е.м.] к зарядовому числу z) ионов, регистрируемых в масс-спектре. В этом направлении работают академические исследовательские группы и лаборатории ведущих фирм - производителей ESI Орто-ВПМС. Одним из основных направлений развития ESI Орто-ВПМС является повышение разрешающей способности и точности определения масс. На данный момент рабочая разрешающая способность большинства коммерческих приборов составляет -5000 на полувысоте пика, а точность определения массы ионов -10"4 -т-10"6. Точность определения массы иона оказывается гораздо выше, если измерить m/z моноизотопного пика. Молекулярная масса М ионов, изотопные пики которых могут быть разрешены в масс-спектре, ограничивается разрешающей способностью R (на полувысоте): т Повышение разрешающей способности до 15000-20000 позволило бы определять моноизотопную массу ионов до 10000-13000а.е.м. Кроме этого, по расстоянию между разрешенными пиками изотопного распределения легко и точно определяется зарядность иона. Этот способ определения зарядности необходим при наличии в образце смеси различных соединений. Высокое разрешение ESI Орто-ВПМС на уровне -20000 дает также возможность разделить в масс-спектре пики ионов изобарического состава, отличающиеся по весу на несколько десятков миллимасс. Точность определения массы на уровне позволяет эффективно подбирать и подтверждать элементный состав иона. Все эти задачи актуальны в свете современных применений ESI Орто-ВПМС в биохимии, фармакологии и химии металлокомплексов. Ряд опытных образцов таких приборов в настоящее время уже имеет разрешение >10000 на полувысоте пика, точность определения m/z ~10"5 [1722], причем отмечается чувствительность в фемтомольном диапазоне [5,8,22-24]. Характерно, что ведущими разработчиками и создателями ESI Орто-ВПМС ведущих фирм являются экс-сотрудники нашей лаборатории и их коллеги из российских НИИ.

Поскольку при экстракции растворенных ионов в ионном источнике типа ESI образуются молекулярные и квазимолекулярные ионы, для исследования структуры и превращений таких ионов интенсивно используются методы тандемной масс-спектрометрии (МС/МС), существует огромное количество работ, посвященных масс-спектрометрическому секвенсу протеинов, постоянно создаются новые чувствительные и эффективные методики [25-32]. Львиная доля работ по секвенсу и исследованию превращений ESI-ионов в камере столкновений МС/МС прибора была сделана на "тройных" квадрупольных масс-спектрометрах модели API III SCIEX.

Совсем недавно были созданы тандемы, где в качестве второго масс-анализатора применен Орто-ВПМС высокого разрешения [20,22,32]. Таким образом появилась возможность анализировать продукты превращений выделенных ESI-ионов при одиночных столкновениях с молекулами буферного газа в камере столкновений, с высоким разрешением и точностью определения m/z.

Созданный при участии автора и описанный в диссертации прибор представляет собой ESI Орто-ВПМС высокого разрешения с уникальным Молекулярно-Ионным Реактором (МИР). МИР позволяет исследовать структуру и превращения экстрагируемых из раствора в источнике типа ESI ионов, и является одновременно интерфейсом такого ионного источника к времяпролетному масс-спектрометру с ортогональным вводом ионов. Он представляет собой секционированный радиочастотный квадруполь, с постоянным электрическим полем вдоль оси, работающий при давлении ~1торр. Переменное радиочастотное напряжение подается на квадруполь в симметричной квадрупольной моде, и для таких квадруполей в международной научной литературе принят термин RF-only. Этот термин далее используется в тексте диссертации.

При работе с МИР было обнаружено новое явление фрагментации исследуемых ионов переменным радиочастотным (RF) полем . Вместе с фрагментацией продольным электрическим полем это явление можно эффективно использовать для определения структуры (секвенса) пептидов. Высокая разрешающая способность и точность определения массы с помощью Орто-ВПМС делает эту методику весьма надежной.

Интерес к изучению свойств больших квазимолекулярных ESI ионов и их продуктов постоянно растет, и исследования кинетики превращений таких ионов проводились также различными другими методами [33,34,68-70]. Удобной является их уникальная стабильность в газовой фазе - они обладают практически неограниченным временем жизни в газовой фазе, в вакууме и при атмосферном давлении. Как показано в диссертации, одним из ключевых параметров, определяющих разогрев иона при движении в газе под действием электрического поля является его подвижность. Увеличивающийся интерес к измерению подвижностей [57-61] связан также с применением дрейф-спектрометра в качестве ионного хроматографа, для предварительного разделения ионов больших нековалентно-связанных белковых комплексов, пики которых часто перекрываются в масс-спектрах. Предложенный в диссертации метод определения подвижности ионов позволяет измерять коэффициенты подвижности непосредственно в условиях эксперимента по анализу кинетики фрагментации ионов.

Цель работы:

Разработка методов исследования экстрагированных из раствора в газовую фазу ионов с помощью время-пролетного масс-спектрометра высокого разрешения, снабженного молекулярно-ионным реактором (МИР). Теоретический анализ и численное моделирование для изучения возможностей повышения разрешающей способности Орто-ВПМС. Теоретическое и экспериментальное исследование процессов фокусировки ионов переменным электрическим полем в RF-only квадруполе с газом при давлении ~1торр. Исследование разогрева ионов и реакций их распада (фрагментации) при движении в газе под действием постоянного (продольного) и переменного электрического поля в RF-only квадруполе. Исследование возможности получения структурной информации (секвенса) с помощью фрагментации ESI ионов пептидов.

Диссертационная работа состоит из введения, шести глав и трех приложений.

Выводы

1. Создан времяпролетный масс-спектрометр высокого разрешения с ортогональным вводом ионов, ионным источником типа ESI(Electrospray), и Молекулярно-Ионным Реактором (МИР). На примерах зарегистрированных масс-спектров продемонстрирована разрешающая способность на полувысоте пика до 20000(FWHM), точность определения величины m/z до 2-Ю"5. Приведены зарегистрированные масс-спектры белков с молекулярным весом до 150000 а.е.м.

2. Получены простые соотношения, связывающие фазовый объем (аксептанс) входного ионного пучка с достижимой разрешающей способностью прибора для различных типов ВПМС с ортогональным вводом ионов. Создана программа на IBM PC для моделирования формы пика в масс-спектре позволяющая учесть множество различных реальных причин, ограничивающих разрешение прибора. Полученные из моделирования величины разрешающей способности близки к экспериментально наблюдаемым (рабочим).

3. Впервые экспериментально исследована и подтверждена возможность фокусировки ионов переменным радиочастотным полем в RF-only квадруполе при давлениях буферного газа ~1торр. Из простой физической модели получены выражения для распределения ионов по радиусу и величины ионного тока, проваливающегося в отверстие на выходе квадруполя. Анализ экспериментальных кривых фокусировки ионов с помощью полученных соотношений дает разумные результаты.

4. Найдено новое явление порогового разогрева и фрагментации ионов в RF-only квадруполе с газом при приближении к пределу неустойчивости Матье. Экспериментально показана возможность использования такого способа фрагментации для анализа структуры исследуемых ионов (секвенса).

5. Предложен новый способ определения коэффициентов подвижности ионов, движущихся в RF-only квадруполе с газом, основанный на измерении параметров RF-only квадруполя с газом при развитии неустойчивости Матье (пропадании пика исследуемого иона в масс-спектре).

6. Предложена простая физическая модель для определения внутренней температуры ионов, движущихся в газе под действием электрического поля. Величина квазистационарной внутренней температуры определяется коэффициентом подвижности иона в газе, напряженностью электрического поля и теплоемкостью молекул газа. Полученное в рамках модели из экспериментальных данных значение энергии активации разрыва азидной связи для исследуемого иона N-метил парафенилазида акридиния составляет ЗОккал/моль, что согласуется с данными полуэмпирических компьютерных расчетов.

7. Возможности созданного масс-спектрометра высокого разрешения с молекулярно-ионным реактором (МИР) продемонстрированы на примере определения первичной структуры (секвенса) нескольких пептидов. Масс-спектры фрагментов имеют четкую лестничную структуру, что значительно облегчает их интерпретацию. Благодаря высокой точности определения т/г анализ разностей точных масс фрагментов в большинстве случаев позволяет надежно определить сответствующий аминокислотный остаток. Высокое разрешение Орто-ВПМС дает возможность практически однозначного определения зарядности пиков в масс спектре по их изотопным распределениям. * *

В заключение автор выражает благодарность своему научному руководителю, профессору, д.ф.м.н. Александру Федоровичу Додонову, за постановку задач, чуткое руководство и помощь в работе.

Автор искренне благодарен к.ф.м.н. Игорю Вадимовичу Чернушевичу, к.ф.м.н. Александру Владимировичу Лободе, Илье Вячеславовичу Сулименкову, д-р. Андреасу Крафту, Мареку Андрессену и проф. Герману Вольнику за помощь в работе, ценные советы и замечания при обсуждении результатов, д.ф.м.н. Валерию Владиславовичу Разникову и к.ф.м.н. Алексею Владимировичу Толмачеву и Элле Викторовне Шардаковой за предоставление программ для обработки масс-спектров и моделирования движения ионов в ЯГ-оЫу квадруполе.

Автор благодарит д.х.н. Михаила Федоровича Будыка за расчеты энергий связей с помощью программы молекулярного моделирования, к.б.н. Сергея Георгиевича Клочкова и к.х.н. Марка Моисеевича Кантора за предоставленные для работы образцы.

Автор благодарен всему коллективу лаборатории масс-спектрометрии в энергетике и экологии за теплое отношение и дружеское участие.

1. Hillenkamp,F.; Karas M.; Beavis R.C.; Chait B.T. Matrix-Assisted Laser Desorption/1.nization Mass Spectrometry of Biopolymers.-Analythical Chemistry 1991, 63, 1193A-1202A.

2. Александров M.JI., Галль Л.Н., Краснов H.B.,Николаев В.И.,Павленко В.А., Шкуров В.А. Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении -метод масс-спектрометрического анализа биоорганических веществ. ДАН СССР, 1984,277, №2, стр.379-383.

3. Jamashita М., Fenn J.B. Electrospray Ion Source. Another variation of the free-jet theme. J.Phys.Chem., 1984, 88, №20, p.4451-4459.

4. Thomson B.A., Iribarne J.V., Dziedzic P.J. Liquid ion evaporation/mass spectrometry/ mass spectrometry for the detection of polar and labile molecules. Anal.Chem.,1982, 54, №13, p.2219-2224.

5. Fenn J.B., Mann M.,Wang C.K., Wong S.F., Whitehouse C.M. Science, 1989, 246, p.64-71

6. Pinkston J.D., Rabb M., Watson I. Th., Allison I., New time-of-flight mass spectrometer for improved mass resolution versatility and mass spectrometry/mass spectrometry studies. -Rev. Sci. Instr. 1986,57,583-592.

7. Додонов А.Ф., Чернушевич И.В., Додонова Т.Ф., Разников В.В., Тальрозе В.Л. Патент СССР №1681340А1(февраль 1987).

8. Dodonov A.F., Chernushevich I. V., Laiko V.V. Time-of-Flight Mass Spectrometer with athmospheric pressure ionization. 12 Int. Mass Spectrom. Conference, Amsterdam, August 1991, Extended Abstracts p. 153.

9. Чернушевич И.В. Разработка, создание и исследование характеристик масс-рефлектрона с ионизацией микропримесей в газах и жидкостях при атмосферном давлении. -Диссертация на соиск. уч.степ. к.ф.м.н., Черноголовка,ФИНЭПХФ РАН, 1992.

10. Dodonov A.F., Chernushevich I.V., Laiko V.V. Time-of-flight Mass Spectrometry, Cotter R. J., ACS Symposium Series, American Chemical Society, Washington, DC, 1994, p. 108.

11. A. Mirgorodskaya, A.A. Shevchenko, I.V. Chernushevich, A.F. Dodonov, A.I. Miroshnikov, Electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry in protein chemistry. Anal.Chem. V.66, p.99-107, (1994).

12. V. V.Laiko and A.F.Dodonov. Resolution and Spectra-line Shapes in the Reflecting Time-of-flight Mass Spectrometer with Orthogonally Injected Ions. RCM,1994, V.8,p.720-726

13. Fenn J.B.; Mann, M.; Meng, C.K.;Wong, S.K.; Whitehouse, C.; Mass Spectrom. Rev. 1990, 9, 37-70.

14. Richard D. Smith, Joseph A. Loo, Rachel R. Ogorzalek Loo, Marc Busman, and Harold R. Udseth, Principles and practice of electrospray ionization mass spectrometry for large polypeptides and proteins. Mass Spectrometry Reviews 1991, 10, 359-451.

15. Igor V. Chernushevich, Werner Ens and Kenneth G. Standing Electrospray Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, In: Electrospray Ionization Mass Spectrometry, Cole R.B., Ed.; John Wiley & Sons: New York, 1997.

16. Igor V. Chernushevich, Werner Ens and Kenneth G. Standing Orthogonal-Injection Time-of-Flight Mass Spectrometry for Analysis of Biomolecules, Anal. Chem. 1999,.

17. Verentchikov, A.N.; Ens, W.; Standing, K.G. Reflecting time-of-flight mass spectrometer with an electrospray ion source and orthogonal extraction.- Anal. Chem.1994, 66, 126-133.

18. Krutchinsky, A.N., Chernushevich I.V., Spicer V., Ens, W., Standing, K.G. Proceedings of the 43 rd ASMS Conference of Mass Spectrometry and Allied Topics;1995, p. 126.

19. Andrien, B.A.; Banks J.F., Boyle J.G., Dresch, T.; Haren, P.J., Whitehouse, C.M., Procedings of the 43 rd ASMS Conference of Mass Spectrometry and Allied Topics, 1995, p.999.

20. Kristina Hakansson, Roman Zubarev and Per Hakansson. Combination of Nozzle-skimmer Fragmentation and Partial Acid Hydrolysis in Electrospray Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry of Synthetic Peptides, RCM, 12, 705-711 (1998).

21. Chernushevich I.V; Shevchenko A.A.; Thomson, B.A.; Mann, M. Identification of Parent Ions on a Hybrid QqTOF Mass Spectrometer, Proceedings of the 46th ASMS Conference 1998.

22. Boyle J.G., Whitehouse C.M. Anal.Chem., 1992, 64, 2084.

23. Batemann, R.H., Green, M.R., Scott, G. Procedings of the 42nd ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics; 1994, p. 1034.

24. Ioannis A. Papayannopoulos.- The interpretation of collision-induced dissociation tandem mass spectra of peptides., Mass Spectrometry Reviews, 1995, 14, p.49-73.

25. Matthias Mann and Matthias Wilm.- Electrospray mass spectrometry for protein characterization., Trends in Biochemical Sciences 20-June 1995, p.219-224.

26. An. Shevchenko, M. Wilm, O. Vorm, O. N. Jensen, A. V. Podtelezhnikov, G. Neubauer, AI. Shevchenko, P. Mortensen and M.Mann.- A strategy for identifying gel28