Реакционно-связанные композиты на основе фосфатов кальция для регенерации костных тканей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.21 ВАК РФ

На правах рукописи

ФИЛИППОВ ЯРОСЛАВ ЮРЬЕВИЧ

РЕАКЦИОННО-СВЯЗАННЫЕ КОМПОЗИТЫ НА ОСНОВЕ ФОСФАТОВ КАЛЬЦИЯ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНЫХ ТКАНЕЙ

02.00.21 - химия твердого тела

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

31 ОКТ 2013

Москва-2013

005536467

005536467

Работа выполнена на Факультете наук о материалах и в лаборатории неорганического материаловедения кафедры неорганической химии Химического факультета федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова"

Научный руководитель: Кандидат химических наук

Путлиев Валерий Иванович

Официальные оппоненты: Калмыков Степан Николаевич

Доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательного учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова", заведующий кафедрой радиохимии.

Фадеева Инна Вилоровна

Кандидат химических наук,

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Институт металлургии и материаловедения имени A.A. Байкова РАН", ведущий научный сотрудник.

Ведущая организация: Российский химико-технологический

университет им. Д.И. Менделеева

Защита состоится 15 ноября 2013 г. в 16.30 на заседании диссертационного совета Д 501.002.05 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, Лабораторный корпус Б (строение 73), факультет наук о материалах, ауд.235.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 15 октября 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.002.05,

кандидат химических наук, Еремина Е.А.

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Создание материалов для замены повреждённой костной ткани - одно из наиболее востребованных направлений в области медицинского материаловедения. Быстрое и своевременное восстановление целостности кости после переломов и прочих повреждений позволяет человеку в короткие сроки вернуться к нормальной жизни. Разработка и производство подобных биоматериалов чрезвычайно важны в плане оказания высокотехнологичной медицинской помощи. Рынок остеозамещающих материалов можно охарактеризовать как динамично растущий: к 2020 г. не менее 70 млн. человек в мире будут нуждаться в оперативном вмешательстве для установки подобных имплантатов.

Биосовместимые имплантаты на основе фосфатов кальция занимают особое место среди имплантатов искусственного происхождения. Наиболее широкое применение в настоящее время находят керамика на основе гидроксиапатита Саю(Р04)б(0Н)2 (ГАП) и/или трикальциевого фосфата Саз(Р04)г (ТКФ), металлические материалы с кальцийфосфатным покрытием. Подобные имплантаты выполняют в значительной степени опорную функцию, но не позволяют кости прорастать внутрь материала. В последнее время всё большее внимание уделяют т.н. регенеративному подходу, в рамках которого имплантату отводят роль не только материала с определенными механическими характеристиками, но и источника веществ, необходимых для роста костной ткани. Данный подход предполагает, что со временем имплантат должен быть полностью заменён нативной костью. Таким образом, заметным трендом в области остеопластики является получение деградируемых в организме материалов - биорезорбируемых материалов. Улучшения резорбируемости (растворимости в среде организма) можно добиться или за счет химической модификации фосфатов, или за счет варьирования морфологии кристаллов ГАП (в частности, уменьшения размера зерна керамики). Последнее может быть достигнуто, прежде всего, за счёт получения фосфатных имплантатов при комнатных или близких к ним температурах в водных средах.

Кальцийфосфатные цементы (КФЦ), рассматриваемые в последнее время в качестве основной альтернативы биокерамике, обладают большей растворимостью (а, следовательно, и резорбцией); технология их применения может быть совмещена с различными вариантами создания макроскопических пор в материале. Кроме того, относительно низкие температуры консолидации цементов позволяют сочетать их как с физиологически активными веществами (например, белками, инициирующими остеосинтез), так и с пролиферирующими клеточными культурами (стволовыми клетками). Подобные свойства раскрывают потенциал кальцийфосфатных цементов как основы для создания тканеинженерных конструкций в целях остеопластики. Простота процедуры получения позволяет медицинским работникам самостоятельно готовить и применять материал непосредственно во время операции (in situ), что значительно расширяет возможности данного класса имплантатов. Образование цементного камня связано с образованием и ростом кристаллов фосфатов кальция, а в дальнейшем - со взаимным перекрыванием. КФЦ состоит из плохо закристаллизованного ГАП или брушита

з

(Са1]Р04'2Н20) и остатков исходных реагентов. Слабые прочностные характеристики ограничивают область применения КФЦ заполнением тех дефектов, где кости не несут существенной нагрузки. Низкая прочность цементов вызвана значительной остаточной пористостью — фактором непервостепенной значимости в формировании их биологических свойств.

Целью данной работы является разработка низкотемпературного метода получения компактных биоматериалов, сочетающих достоинства фосфатных цементов и высокую прочность керамики. Требование к низким температурам получения (не выше 100°С) связано с тем, что будущее применение подобных материалов допускает возможность их предварительного наполнения биологически активными веществами и/или соответствующими клеточными культурами. В основе низкотемпературных методов получения лежат гетерогенные химические реакции между фосфатами кальция и раствором. Продукты этих реакций связывают частицы исходного порошка в прочный монолит. Подобные материалы называют реакционно-связанными (или «химически связанными»), чтобы подчеркнуть особенности метода их получения. В процессе интеграции в костную ткань такой материал выполняет первоначальную опорную функцию, а по мере прорастания кости имплантат постепенно растворяется (резорбируется) и способствует росту нативной кости. Таким образом, две характеристики данного типа материала -механическая прочность и резорбируемость, играют ключевую роль.

Основными объектами исследований выступали водные дисперсии различных фосфатов кальция, твердеющие в результате протекания химических реакций. Фундаментальную проблему, в рамках которой была поставлена данная работа, можно сформулировать как взаимосвязь между условиями синтеза, химическим и фазовым составом и физико-химическими свойствами твердофазных материалов; использование выявленных закономерностей для разработки и создания новых методов синтеза твердофазных соединений и материалов.

Для достижения указанной цели в ходе работы были поставлены и решены следующие задачи:

1) исследовать условия протекания реакций кислотно-основного взаимодействия, которые способствуют превращению свободнодисперсной системы в связнодисперсную с максимальным количеством прочных фазовых контактов между частицами фосфатов кальция, и разработать составы порошковых смесей, содержащих фосфаты, в водных дисперсиях которых развиваются упомянутые реакции и приводят к «схватыванию» дисперсной системы в монолит;

2) выявить природу контактов между частицами в реакционно-связанных материалах на основании исследования их структуры (кристаллогеометрии) и энергетики;

3) предложить эффективные добавки, малые количества которых могут модифицировать свойства как исходных водно-кальцийфосфатных дисперсий, так и конечных реакционно-связанных компактных материалов;

4) разработать приемы изготовления макропористых реакционно-связанных материалов (с размерами макропор 50 — 500 мкм) как прототипов

для использования в качестве костных имплантатов; предложить приемы упрочнения (армирования) реакционно-связанных материалов;

5) получить образцы резорбируемых реакционно-связанных кальцийфосфатных материалов и провести их механические и биологические испытания для выявления взаимосвязи состав - микроструктура - свойства.

Научная новизна работы состоит в следующих положениях, которые выносятся на защиту:

1) предложена оригинальная схема получения компактных кальцийфосфатных материалов методом реакционного (химического) связывания, которая наследует принцип разделения стадий формования и консолидации от керамики; для формования используются реакционно-твердеющие пасты, а их консолидация осуществляется при помощи гетерогенных реакций, протекающих в водных растворах при температурах не выше 100°С;

2) исследована кинетика основной реакции ТКФ + Н20 —► ГАП, протекающей в реакционно-связанных композитах ТКФ/ГАП, в диапазоне температур 20-90°С в водной среде, содержащей добавки-модификаторы (цитрат натрия, гидрокарбонат натрия). Увеличение температуры проведения основной реакции приводит к изменению характера агломерации зародышей ГАП, вызывая смену габитуса кристаллов с пластинчатой на игольчатую в случае реакции в воде. Использование модификаторов приводит к существенному замедлению основной реакции, а также существенно изменяет морфологию зародышей ГАП и приводит к более плотной микроструктуре с иным характером агломерации кристаллитов;

3) объяснение прочностных характеристик материала дано в рамках представлений физико-химической механики о фазовых контактах ГАП/ГАП -сростках кристаллов, имеющих межкристаллитную границу. Предложена аналогия между атомным строением границы контакта и строением межзеренной границы в керамике. Для описания атомного строения контакта и его взаимосвязи с энергией границы применены геометрические модели соединения плотноупакованных плоскостей в структуре ГАП;

4) объяснение воздействия добавок-модификаторов на микроструктуру и прочностные свойства композитов дано с учетом их адсорбционных и комплексообразующих свойств.

Практическая значимость работы обусловлена: 1) разработкой низкотемпературной технологии изготовления композитных биоматериалов с максимальной прочностью на сжатие до 180 МПа и невейбулловским распределением предела прочности; 2) предложены эффективные добавки-модификаторы высококонцентрированных кальцийфосфатных дисперсных систем на основе биосовместимых карбоксилатов (цитраты) и полифосфатов (триметафосфат натрия); 3) полученные в работе реакционно-связанные материалы являются биосовместимыми и могут применяться в работах по тканевой инженерии; схема получения материала не требует сложного оборудования и при детально описанном протоколе может быть реализована непосредственно в медицинском учреждении силами персонала.

Личный вклад автора в защищаемую работу заключается в критическом обзоре имеющихся литературных данных, синтезе всех использованных в

работе соединений и подготовке образцов к исследованиям, самостоятельном проведении рентгенографического исследования, электронной микроскопии, механических испытаний, обработке и осмыслении экспериментальных данных, обобщении результатов и формулировке научных выводов.

Представленная работа - часть плановых исследований биоматериалов, проводимых на Факультете наук о материалах МГУ и кафедре неорганической химии Химического факультета МГУ в рамках приоритетной научной темы "Создание новых типов функциональных материалов". Работа выполнена в лаборатории неорганического материаловедения кафедры неорганической химии Химического факультета МГУ. Представленные в работе результаты является частью исследований, проведенных в рамках ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы" (мероприятие 1.2.2, государственный контракт № 14.740.11.0277) и при поддержке грантов РФФИ 10-03-00866, 11-03-12179-офи-м-2011, 12-03-01025, 12-08-00681 и 11-08-01015а. При выполнении работы было использовано оборудование, приобретенное за счет средств программы развития Московского университета.

Публикации и апробация работы. По теме работы имеется 15 публикаций, включая 6 статей в российских и международных журналах. Отдельные части работы представлены на 8 конференциях в виде устных и стендовых докладов, в том числе на X, XI, XII конференции молодых ученых (Звенигород - 2010, 2011, 2012), V Всероссийской конференции по наноматериалам НАНО 2013 (Звенигород), Ломоносовских чтениях (Москва, 2013), Всероссийской молодежной научной школе "Химия и технология полимерных и композиционных материалов" (Москва 2012), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград 2011), III Международном форуме по нанотехнологиям «ГШ5ЫАМОТЕСН-2010» (Москва).

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста, иллюстрирована 73 рисунками и 16 таблицами, а также содержит приложения. Список цитируемой литературы содержит 162 ссылки. Работа состоит из 8 глав, включая список используемых обозначений, введение, литературный обзор, описание методов синтеза и исследования материалов, обсуждение результатов, заключение, а также выводы и список литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении кратко обоснована актуальность работы, сформулированы цели и задачи, показаны научная новизна и практическая значимость работы.

В главе, посвященной литературному обзору, рассмотрены структура, состав и свойства костной ткани, достаточно подробно описаны существующие типы имплантатов для замещения костной ткани, способы получения, их преимущества и недостатки. Особое внимание уделено биорезорбируемым материалам, представленным в основном различными фосфатами кальция, описаны их основные физико-химические свойства. Подробно рассмотрены процессы в высококонцентрированных дисперсных системах, приводящих к их схватыванию, уделено внимание строению

межкристаллитного контакта между кристаллами новой фазы. Рассмотрены способы создания пористых материалов с улучшенными биологическими характеристиками, а также композиционные материалы, содержащие различные типы биосовместимых волокон.

Экспериментальная часть содержит описание различных методик, использованных в данной работе.

Брушитные цементы получали в результате кислотно-основного взаимодействия а) гидроксиапатита (х.ч.); б) р-трикальциевого фосфата с жидкой фазой. В качестве жидкой фазы (жидкости затворения) использовали раствор фосфорной кислоты (х.ч.). Соотношение твердая фаза/жидкая фаза (тв/ж) варьировали от 0,6 до 0,8 г/мл для цементов из ГАП и от 0,8 до 0,9 г/мл для цементов из (5-ТКФ. Были получены как цементы без добавок, так и цементы с использованием замедлителей: лимонной кислоты (Sigma-Aldrich, х.ч.), триметафосфата натрия и гексаметафосфата натрия (Sigma-Aldrich, х.ч.). Добавки-замедлители предварительно растворяли в жидкости затворения -фосфорной кислоте.

Для получения апатитного реакционно-связанного материала порошок а-ТКФ затворяли различными жидкостями (вода, 0.5М раствор цитрата натрия, 1М раствор КаНС03), после чего полученную пасту переносили в разборную пресс-форму диаметром 8 мм и производили одноосное одностороннее прессование при давлении до 400 МПа в течение 1 минуты. Полученный столбик оставляли при комнатной температуре в течение 24 часов для первоначального схватывания, а затем выдерживали в воде или растворе, после чего окончательно высушивали и готовили к испытаниям (см. схему ниже).

Формование Консолидация

/ ^т1-17 /

Порошок а-ТКФ I lacra Спрессованная паста

3-5мкм Тв/Ж~ 1,5 (Рдо4ШМПа) {водн. растворы.

Т = 20-90 "С )

При формовании использовали как стандартную, так и четырехсекционную разборную пресс-форму для одноосного одностороннего формования, которая позволяет извлекать сформованный образец, не подвергая его дополнительным механическим нагрузкам.

Для получения макропористых материалов кристаллы KCI размером 280-450 мкм (классификация на ситах) смешивали с порошком а-ТКФ (доля хлорида кальция составляла 10, 20, 30, 40, 50 и 65% от общей массы), при этом в процессе реакции образования продукта гидролиза а-ТКФ протекало растворение частиц хлорида кальция с формированием макропор необходимого размера.

Гидратация

При получении волокнистых композитов в качестве армирующих волокон использовали кетгут (обычный, USP 5/0, Фарм-синтез), полигликолидную плетеную нить (USP 2, Фарм-синтез), а также пара-арамидное высокомодульное волокно (обычный кевлар, 58,8 текс). Схемы армирования включали как случайную ориентацию отрезков волокон (2-3 мм), так и спиралевидную укладку длинных волокон.

Методы исследования образцов. Рентгенографические исследования проводили на дифрактометре Rigaku D/Max-2500 с вращающимся анодом (Япония). Съёмку проводили в режиме на отражение с использованием Си К* излучения, в интервале углов 29 = 2 — 60°. Количественный рентгенофазовый анализ (РФА) смесей ТКФ/ГАП проведен методом градуировочного графика с использованием площадей аналитических пиков (21-31) ГАП и (034) а-ТКФ.

Электронномикроскопические исследования проводили на растровом электронном микроскопе с автоэмиссионным источником LEO SUPRA 50VP (Carl Zeiss, Германия; ускоряющее напряжение 2-20 kB, детекторы SE2 и InLens), просвечивающих электронных микроскопах JEM-2000FXII (JEOL, Япония) и Libra 200 (Carl Zeiss, Германия) при ускоряющем напряжении 200 кВ).

Инфракрасная спектроскопия (ИК) поглощения образцов проведена на спектрометре Spectrum One (Perkin Elmer, США) в диапазоне 400-4000 см"1 с шагом сканирования 1 см"1.

Термогравиметрический (ТГ) и дифференциальный термический анализ (ДТА) проводили на термоанализаторе STA 409 PC Luxx (Netzsch, Германия); скорость нагрева составляла 5-10 °С/мин, интервал температур 20 - 1200°С.

Ионометрия растворов. Исследование активностей ионов в растворах (pH и рСа) проводилось на многоканальном иономере Эконикс-Эксперт-001 (Россия).

Исследование распределения частиц по размеру проводили методом динамического рассеяния света на приборе Analysette-22 (Fritsch, Германия) в диапазоне 0.2 мкм - 100 мкм.

Измерения Q-потенциапа проводили с помощью Zeta-analyzer (Nano ZS, Malvern Instruments, Великобритания).

Время схватывания цементной пасты определяли методом Вика.

Плотность образцов определяли геометрическим методом.

ЯМР-спектроскопию проводили на спектрометре «AVANCE-II» 400МГц фирмы Bruker с рабочей частотой 400,1 и 161,98 МГц по ядрам 'Н и 3,Р, соответственно. Для получения спектров высокого разрешения использовался датчик с системой вращения под «магическим» углом (ВМУ); частота вращения образца составляла 10 кГц.1

Механические испытания. Определение прочности на сжатие проводили на цилиндрических образцах с отношением диаметра к высоте 1:2 (диаметр - 10 мм, высота — 20 мм) для цементов и 1:1,5 (диаметр - 8 мм, высота - 12 мм) для реакционно-связанных материалов. Образцы подвергали сжатию вдоль оси цилиндра (в режиме постоянной скорости деформации, испытательная машина Р-05 с многоканальной измерительной системой Spider

1 ЯМР-исследавания проведены совместно с к.х.н. Ю.Г. Колягиным (Химический факультет МГУ)

(Германия); в режиме постоянного нагружения, испытательная машина Zwick-Roell (Германия) с электроприводом и следящей системой Z100). Определение прочности при трехточечном изгибе проводили на образцах в форме балочек с размерами 45x5*5 мм. Испытания на ползучесть проводили при фиксированной нагрузке 30-100 МПа в течение 15 мин. Испытания на малоцикловую усталость проводили при нагружении до 100-140 МПа и разгрузки до половины указанных значений. Количество циклов нагружения-разгрузки равнялось 15. Оценку трещиностойкости проводили методом микроиндентирования (пирамида Виккерса, прибор ПМТ-4). Статистический анализ разброса прочности был сделан на основе распределений Гаусса и Вейбулла.

Биологические испытания in vitro. Оценку резорбции проводили в соответствии с ГОСТ Р ИСО 10993-14-2001 с использованием цитратного буфера (рН=4). Исследование минерализации материалов проводили в растворе 5><SBF с РЭМ-регистрацией апатитного слоя. Для определения цитотоксичности материалов был применен МТТ-тест, основанный на восстановлении бесцветной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ) митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически активных клеток с образованием голубых кристаллов формазана, растворимого в диметилсульфоксиде (ДМСО).2

Биологические испытания in vivo. Биосовместимость, резорбируемость и остеоинтеграция полученных материалов исследовалась при ортотопической имплантации на экспериментальных моделях остеосинтеза "конец в конец". В экспериментах использовали половозрелых самцов крысы линии «Вистар» весом 150-200г. Томографическое исследование проводилось через 30 суток после имплантации на универсальном микротомографе Sky Scan 1178 с пространственным разрешением 80 мкм.3

Далее представлены полученные результаты и их обсуждение.

Реакционно-связанные материалы, как и КФЦ, удобно систематизировать по конечному продукту реакции, кристаллы которого, срастаясь, формируют монолит. В работе рассмотрены брушитные и апатнтные реакционно-связанные материалы.

Брушитные реакционно-связанные материалы

Было изучено влияние основных факторов получения образцов из брушитного цемента на их прочность: выбор исходных реагентов, температура, соотношение твердая фаза/жидкость (тв/ж), выбор модифицирующей добавки. В работе исследованы брушитные реакционно-твердеющие смеси, в которых протекают следующие реакции:

Са1()(Р04)б(0Н)2 + 4Н3Р04 + 18Н20 -> МСаНР04-2Н20, (1)

ß-Ca3(P04)2 + Н3РО4 + 6Н20 -> ЗСаНР04-2Н20. (2)

2 Испытания in vitro проведены совместно с к.ф.-м.н. И.И. Селезневой (ИТЭБ РАН, г.Пущино)

3 Испытания in vivo проведены к.м.н.В.В. Зайцевым (ЦИТО им. H.H. Приорова)

Изменение исходных реагентов для приготовления цементной пасты с ГАП(ТВ )/Н3Р04(р.р) на Р-ТКФ(тв/НзРО^р.р) приводит к уменьшению теплового эффекта основной реакции в пасте и, как следствие, к более медленной кинетике образования брушита, к увеличению пересыщения относительно брушита, к более мелкой и плотной микроструктуре с толщинами брушитных пластин порядка 5 мкм. Это ведет к увеличению прочности образцов (рис. 1 а, б).

р.-ТКФ

ГАП

■¡га

Д1К1

Рис. 1. Прочность брушитных цементов на основе ГАП и Р-ТКФ с использованием модификаторов цементной пасты а) 0,4М лимонной кислоты и б) 0,06М триметафосфата натрия (соотношение тв/ж = 0,8 г/мл)

Уменьшение Температуры приводит к увеличению времени схватывания пасты (ГАП/Н3Р04=0.5 г/мл) с I мин (23°С) до 6±1 мин (2°С). Увеличение отношения тв/ж ГАП/Н3Р04 с 0.5 до 0.8 г/мл приводит к уменьшению срока схватывания пасты на 15±2 сек, при этом, однако, возрастает плотность образца с 0.8 до 0.95 г/см3 и прочность с 1.0±0.25 МПа до 1.75 ±0.08 МПа.

Использование модификаторов цементной пасты ведет к увеличению срока схватывания пасты (рис.2), к изменениям микроструктуры и увеличению плотности образца брушитного цемента, что приводит к увеличению его прочности (рис.3).

Иа^О, (ЫаР03)3

Концентрация добавки (моль/л)

Концентрация добавки (моли/л)

а б

Рис.2. Зависимость сроков схватывания брушитного цемента от концентрации введенного модификатора при использовании а) ГАП и б) Р-ТКФ как исходной твердой фазы

Очевидно, что предложенные в работе модификаторы (три- и гексаметафосфаты натрия) эффективно замедляют схватывание КФЦ. Такое действие добавок можно объяснить, принимая во внимание два обстоятельства: 1) адсорбцию многозарядного аниона модификатора на

поверхности фосфата (определено на основании измерений ¡^-потенциала суспензии частиц), 2) образование прочных комплексов катионов кальция с ионизированной формой добавки, что препятствует реакции Са2+ + НР042" —>► СаНР04 и, следовательно, зародышеобразованию брушита. Сравнение констант реакции Са2+ + Ь <->■ (СаЬ) для непротонированых форм Ь аниона модификатора позволяет выстроить добавки по эффективности связывания кальция в следующий ряд: лимонная кислота < триметафосфат < пирофосфат < гексаметафосфат.

С6Н8°7

(NaPOj)j

Рис.3. Сравнение прочности цементов (исходная твердая фаза - ГАП), полученных с использованием различных модификаторов

Получение композитов брушит/ГАП и брушит/ТКФ мотивировано как увеличением сроков схватывания (с 7±1 мин для чистого брушитного цемента до 19±1 мин для композита брушит/ГАП=60/40), так и необходимостью понизить рН контактирующего с цементом раствора во избежание некроза окружающих тканей при использовании in vivo. Отмечено повышение уровня рН растворов, контактирующих с подобными материалами, с 4.8 (для чистого брушитного цемента) до 6.8 (для композитов ГАП/брушит).

Была предпринята попытка получения брушитных реакционно-связанных материалов согласно реакции: Са3(Р04)2 + Са(Н2Р04)2Н20 + 7Н20—>4СаНР04-2Н20. Полученные материалы обладают невысокими механическими характеристиками (~5МПа на сжатие), вследствие чего не имеют практических преимуществ перед соответствующими цементами или композитами брушит/ГАП (|3-ТКФ).

В целом, следует отметить невысокие прочностные характеристики материалов на основе брушита. По-видимому, образование прочных межкристаллитных (фазовых) контактов в таких низкосимметричных структурах маловероятно вследствие малого числа благоприятных разориентаций кристаллических решеток контактирующих кристаллов.

и

Апатитные реакционно-связанные материалы

1. Выбор исходной твердой фазы (прекурсора) для формирования апатитных реакционно-связанных материалов. Результаты апробации различных исходных твердых фаз сведены в табл. 1.

Таблица 1. Сравнительные характеристики реакционно-твердеющих смесей на основе различных фосфатов кальция___

Прекурсор Реакция Объемный эффект реакции Прочность

Аморфный фосфат кальция (АФК) ЗСа3(РО„) хН20 + (1-Зх)Н20 — Са9(НР04)(Р04)50Н - 10% ~ 5 МПа

Аморфный пирофосфат кальция (АПФК) Са2Р207 хН20 + (2-х) Н20 — Са2Р20г2Н20 - 10% < 5 МПа

Брушит СаНР04'2Н,0 10СаНР04-2Н20 + 8ЫаОН — Са10(РО4)6(ОН)2 + 4Ыа2НРО„ + 26Н20 8СаНР04-2Н20 -»Са„(НР04)2(Р04)4'5Н20 + 2Н,Р04 + 11Н20 -58% -40% -5 МПа <5 МПа

Ренанит №СаР04 10№СаР04 + Н20 Саю(Р04)6(0Н)2 + 2№2НР04 + 2Ыа3Р04 -40% — 5 МПа

а-трикальциевый фосфат (а-ТКФ) ЗСа3(Р04)2+Н20 -» Са9(НР0,)(Р04)50Н -3% 40-140 МПа

'Оценки объемного эффекта реакций даны, исходя из мольных объемов прекурсоров и продуктов реакций (в случае АФК и АПФК даны экспериментальные значения)

Заметное влияние на прочностные характеристики реакционно-связанных материалов оказывает изменение объема в ходе протекания реакции химического связывания (значительные величины усадки приводят к образованию большого количества микротрещин). Наибольший успех в приготовлении реакционно-связанных материалов был достигнут при использовании ТКФ. Далее рассматриваются отдельные аспекты процесса изготовления реакционно-связанных композитов, исходя из ТКФ.

2. Исследование процесса гидратации ТКФ. Динамика изменения рСа и рН суспензии а-ТКФ в воде позволяет различить два основных явления, сопровождающих гидратацию этого фосфата: 1) Резкий рост [Са2+] и рН в начальный период, связанный с растворением ТКФ и гидролизом ортофосфатного аниона; 2) систематическое падение рН до величины 8-7 (или даже менее), обусловленное осаждением из пересыщенного над частицами ТКФ раствора нестехиометрического ГАП и накопления кислоты:

(10-х)Са3(Р04)2 + (6-Зх)Н20 — 3 Са1о-х(НР04)х(Р04)б-х(ОН)2.х +

+ 2(1-х)Н3Р04, (3)

где х=0... 1. Превращение ТКФ в ГАП протекает по схеме «растворение ТКФ—»пересыщенный раствор—»осаждение ГАП». Высокая вероятность гетерогенного образования ГАП на поверхности ТКФ обусловлена сходством расположения атомов в кристаллах ТКФ и ГАП. Энергетический барьер

нуклеации будет достаточно мал в случае следующего ориентационного соотношения фаз ТКФ и ГАП:

(001)тко (0001)гап [010]ткф [-12-10]гАа поскольку рассчитанное рассогласование решеток фаз в плоскости (0001)гап для различных направлений составляют Л-то] = +3.5% и /¡2-1-10] = -2.6%, то есть не превышают 5%. Анализ спектров 'Р и СРМАЭ ЯМР указывает на то, что при гидратации ТКФ протоны располагаются вблизи атомов фосфора, занимающих одну и ту же кристаллографическую позицию, по-видимому, в катион-катионных колонках глазеритной структуры. Это предполагает рост гексагональных призм кристаллов ГАП по нормали от грани (001) частицы ТКФ.

3. Превращение ТКФ—>ГАП в реакционно-связанных материалах. Результаты РФА показывают (рис.4), что, в зависимости от времени выдержки сформованного образца в растворе, реакционное связывание позволяет получать как однофазные ГАП-материалы, так и двухфазные композиты ГАП/ТКФ. Наиболее быстро превращение ТКФ протекает в воде: уже менее чем через сутки ТКФ полностью конвертируется в апатит при 80°С. В случае цитрата и гидрокарбоната натрия реакция идет со значительно меньшей скоростью, и за время 120 часов полностью не завершается. В растворах №НС03 образуется карбонатгидроксиапатит (КГАП) (моды С032" в ИК-спектрах) по схеме:

(10-х/2)Са3(Р04)2 + 3(2+х-у)ЫаНС03 - ЗСа<10.х/2,(РО4)(б-х)(СОз)хОН(2.2у)(СОз)у + + (4+х-Зу)Ыа2НР04 + (х+Зу-2)ЫаН2Р04 + 6С02|. (4) Кинетика превращения ТКФ—>ГАП была описана в рамках модели Колмогорова-Аврами для анализа процесса образования, роста и агрегации зародышей ГАП:

ос=1-ехр(-Л:Г), (5)

где а - степень превращения ТКФ в ГАП, К - константа скорости реакции, п - порядок реакции, I - время протекания реакции. Для диффузионно-контролируемого роста зародышей порядок реакции п = р+А/2; Р - параметр, характеризующий скорость образования зародышей: р=0 для мгновенного зародышеобразования, р=1 для зародышеобразования с постоянной скоростью, 0<Р<1 для замедляющегося зародышеобразования; ). -число преимущественных направлений роста зародышей (=1,2,3). В случае роста ГАП в условиях кинетического контроля (лимитирующая стадия — продвижение межфазной границы ТКФ/ГАП) п = Р+Х. [1]. Оценка порядка реакции п в совокупности с данными РЭМ позволяют проанализировать возможные наборы параметров X и Р; из температурной зависимости константы скорости реакции К по уравнению Аррениуса была проведена оценка кажущейся энергии активации превращения ТКФ—>ГАП (табл. 2).

Рис.4. Кинетические кривые превращения ТКФ—>ГАП (КГАП) в процессе консолидации реакционно-связанных материалов в дистиллированной воде (слева), в 0,5М растворе цитрата натрия (в центре) и 0,5М растворе гидрокарбоната натрия (справа) при различных температурах

Таблица 2. Кинетическое описание превращения ТКФ—>ГАП в различных средах в рамках модели Колмогорова-Аврами____

т, "с 20 40 60 80

Вода п, данные [21 1.5 - - 0.5

п, наст, работа 1,67±0,07 0,56±0,08 0,46±0,05 0,78±0,04

Габитус кристаллов ГАП (РЭМ) Пластины пластины (+иглы) пластины +ИГЛЫ Иглы

X 2 1 1 1

Р(=и-У2) 0 < 0.67 < 1 (замедляющаяся скорость зародышеобразования) 0.06 (-0) (мгновенное зародыше-образование) -0.04 (~0) (мгновенное зародыше-образование) 0.28 (-0?) (мгновенное зародыше-образование)

Еа 60±16 кДж/моль

Раствор цитрата и | 1,16±0,08 | 1,1±0,1 1 0,91±0,09

Еа 80±19 кДж/моль

Раствор гидрокарбоната п | - | 0,63±0,06 | 0,14±0,03

Еа 90±23 кДж/моль

Анализ табл.2 позволяет сделать следующие выводы:

1) модель Колмогорова-Аврами удовлетворительно описывает превращение ТКФ в воде, причем разумную интерпретацию порядка реакции п можно дать лишь в рамках диффузионно-контролируемого роста зародышей продукта;

2) понижение температуры замедляет скорость зародышеобразования, и способствует морфологическому отбору растущих зародышей и меняет их форму с игольчатой на пластинчатую;

3) введение в дисперсионную среду модификаторов и увеличение температуры ухудшает адекватность описания кинетики с помощью модели Колмогорова-Аврами, что связано, по-видимому, с быстрым образованием большого числа зародышей ГАП, покрывающих сплошным слоем частицы ТКФ;

4) значения кажущейся Еа практически неразличимы для различных сред и находятся на уровне -70 кДж/моль. Это заставляет предположить одинаковый во всех средах лимитирующий процесс с невысокой энергией активации; таким процессом может быть стадия растворения ТКФ.

4. Микроструктура и прочностные свойства реакционно-связанных материалов на основе ТКФ.

Микроструктура. Морфологический отбор зародышей ГАП в условиях постоянной или замедляющейся скорости нуклеации (вода, невысокие температуры) вызывает их срастание в плоские агрегаты. Развитие этой тенденции по мере протекания реакции приводит к пластинчатой морфологии кристаллов ГАП. Ускорение зародышеобразования приводит к игольчатой (призматической) морфологии ГАП (рис.5.). Морфологический переход пластины<->иглы имеет кинетический характер, и потому реализуется в температурном интервале (60-80 °С). Подобное явление - скорее общая черта кристаллизации ГАП из слабопересыщенных сред, нежели специфика превращения ТКФ—>ГАП.

Рис. 5. Микроструктура материалов, полученных при использовании воды в качестве дисперсионной среды

В случае раствора цитрата натрия степень пересыщения среды относительно ГАП возрастает; в сочетании с адсорбционным блокированием растущих граней это приводит к существенному уменьшению размеров кристаллов ГАП (50-200 нм). При использовании раствора гидрокарбоната натрия в качестве дисперсионной среды закономерное уменьшение размеров кристаллов КГАП с ростом содержания С032" приводит к тому, что в реакционно-связанном материале образуются первичные частицы с размерами порядка 100-300нм, которые по мере протекания реакции при невысоких температурах образуют упорядоченные агрегаты в виде мезокристаллов гексагональной формы (рис.6).

а

^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ Рис.б.Микроструктура^

"^¡^ '^т, " 'i """*"" I гидрокарбоната натрия

б

5. Прочностные свойства. Наиболее перспективными с практической точки зрения являются образцы, полученные с использованием раствора гидрокарбоната натрия при температурах 60 и 80 °С, которые имеют прочность при сжатии порядка 120 МПа, а также образцы, полученные в растворе цитрата натрия при 80°С, которые демонстрируют рекордную прочность при сжатии, рис.7 а (среди кальцийфосфатных материалов, полученных низкотемпературными методами) - порядка 180 МПа, что превышает прочность природной кости (100-150 МПа).

цитрат натрия гидрокарбрнат натрия

гндрокарбонат натрия пират натрия

а б

Рис.7. Прочность, полученных в различных растворах при 80 °С а) на сжатие , б) на изгиб 80 °С

Прочность при изгибе образцов, отвержденных в различных дисперсионных средах, неожиданно демонстрирует тенденцию противоположную прочности при сжатии (рис.7 б). Образцы, полученные в воде и растворе гидро карбоната натрия, обладают более высокой трещиностойкостью по сравнению с цитратными образцами (оценка методом микроиндентирования Л"1С=1.6±0.8 МПа м"2). Различия связаны как с меньшей жесткостью образцов, так и с различным характером их микроструктуры. Торможение трещин осуществляется за счет их переориентации и ветвления в

относительно пористом материале. Оценка модуля Юнга (жесткости), исходя из сопротивления нагрузке da/de. на упругом участке кривых нагружения, дает значения в диапазоне 4-20 ГПа. Таким образом, можно не опасаться проблемы экранирования нагрузки и последующей деградации костной ткани, находящейся в контакте с материалом, в случае его применения в качестве имплантата in vivo. В результате испытаний на кратковременную ползучесть, проводимых при фиксированных напряжениях в 30, 50, 70, 80, 100 МПа, не обнаружено этого явления в полученных материалах. В испытаниях на малоцикловую усталость получена оценка точки S-N кривой (при 0 = 30 МПа, lgjV > 3.2, т.е. iV>1760 циклов). Удовлетворительное сопротивление усталостному разрушению вызвано, по-видимому, особенностями микроструктуры исследованных материалов, включающей разнообразные по размеру и жесткости элементы - микро- и макропоры, крупные частицы непрореагировавшего ТКФ, пластины ГАП и т.д., что позволяет эффективно переориентировать трещину, замедляя скорость ее распространения.

6. Влияние условий получения на прочностные свойства, а) Оптимальное давление при одностороннем одноосном формовании образцов диаметром 8 мм и высотой 10-15 мм лежит в диапазоне 200-400 МПа, при этом относительная плотность составляет 59±2 % (-1.67 г/см3). При выпрессовке образца происходит трещинообразование, поскольку распределение прочности ст (в зависимости от объема V консолидированных образцов) следует закону Вейбулла Р = 1-ехр(-(К/Г0)(а/ (Jo)"') с модулем т~ 10, что связано с наличием в образцах «слабого звена» (магистральной трещины). При использовании разборной четырехсекционной пресс-формы нормальное распределение более адекватно описывает экспериментальные данные, чем функция Вейбулла.

б) Условия консолидации. Существенную роль играет температура, при которой сформованный образец выдерживается в воде. При 60-80 С происходит морфологический переход кристаллов продукта гидролитической реакции - ГАП. от пластинчатой к игольчатой форме, при этом прочность образца на сжатие проходит через пологий максимум (рис.8 а). Подобная зависимость свидетельствует о преимуществе пластинчатой микроструктуры по сравнению с игольчатой вследствие возможности образования более прочных контактов в массиве случайно расположенных пластин.

Элементом микроструктуры, обеспечивающим прочность реакционно-связанного образца, является фазовый контакт — сросток кристаллов, имеющий межкристаллитную границу с удельной энергией При

одноосном сжатии происходит полный сдвиг двух кристаллов в фазовом контакте друг относительно друга; при этом совершается работа против сил аутогезии А= Рфк-Г = (2у - Уфк)'5фк, где Рфк - силы аутогезии в фазовом контакте, Г - путь сдвига, уфк - (удельная) энергия межкристаллитной границы, у ~ поверхностная энергия грани, параллельной границе, 5фк -площадь контакта (т.е. его межкристаллитной границы). Простейшая модель фазового контакта — два пластинчатых или игольчатых кристалла ГАП, прижатые друг к другу, повернутые на угол 0 относительно оси, перпендикулярной или лежащей в плоскости границы. Тогда I - iftü), где /характерный размер кристалла ГАП, а _Д0) - некоторая функция угла

разориентации кристаллов в контакте; поверхностная энергия грани и энергия границы также являются функцией угла разориентации, так что и аутогезия зависит от угла />фк(9)=(2у(е) - уфк(9» ^«/(/-/9)).

а б

Рис.8. Зависимость прочности на сжатие образцов, консолидированных в воде а) от температуры консолидации, б) как функция степени превращения ТКФ—>ГАП

Макроскопическая прочность на сжатие ст0 = (.Рфк N)/S, где N - число контактов в поперечном сечении образца, S - площадь поперечного сечения. Плотность контактов в плоскости N/S пропорциональна числу кристаллов ГАП в единице объема, т.е. степени превращения а. Принимая, что 5фк ~ /, получим ас ~ Рфк(0) (///[0))' а. С этой точки зрения интересны зависимости сгс от а (рис.8 б). До величин а=20-30% прочность определяется плотностью фазовых контактов, дальнейший рост доли кристаллов ГАП, по-видимому, не приводит к увеличению числа контактов между ними. Однако, на начальных этапах консолидации прочность определяется свойствами фазового контакта: размером кристаллов I, который характеризует возможную площадь контакта (поэтому консолидация при повышенных температурах, дающая более крупные кристаллы ГАП, приводит и к большей прочности) и энергиями уфк(6)

нут-

Применение модификаторов снижает размер кристаллов ГАП до 50-200 нм и почти на порядок повышает плотность фазовых контактов. Однако, прочность возрастает лишь до 180 МПа (т.е. не более чем в 2 раза), что мы связываем с уменьшением аутогезионных сил />фК(9). Прочность контакта ■P$k(0)=(27(0)^k(0))^k/('^0))' определяющая макроскопические свойства консолидированного образца, при равных S^Jl тем больше, чем больше у(0) и меньше уфк(0).

7. Строение контактов между кристаллами продукта. Анализ углов разориентации 0 соседних пластинчатых кристаллов (на основе построения распределения сечений соответствующих двугранных углов плоскостью наблюдения образца) показал, что контактирующие частицы ориентированы друг относительно друга преимущественно под углом 60 градусов (рис. 9 а).

6, град

а б

Рис.9, а) Распределение сечений двугранных углов между кристаллами ГАП в фазовых контактах реакционно-связанных материалов, консолидированных в воде при различных температурах; б) Модели единичного контакта между пластинчатыми частицами гидроксиапатита

В работе рассмотрена возможность автоэпитаксии плотноупакованных плоскостей ГАП типа (41-50), (21-30), (02-21), (11-20), (10-10) (что эквивалентно наличию одномерной решетки совпадающих узлов - РСУ). С учетом строения единичной пластинки ГАП (представляющей собой сросшиеся гексагональные призмы апатита) срастание соседних пластин иллюстрируют модели «коробок карандашей». Три наиболее выгодных с точки зрения совпадения плоскостей с низкими индексами случая срастания соседних пластин показаны на рис. 9 б: прорастание одной пластины в другую с полным совпадением всех узлов соседних кристаллов (соответствует углу 60° между пластинами тривиальное описание трехмерной РСУ Ш, [0001]/ 60°); одна пластина ориентирована перпендикулярно другой, причем гидроксиапатитовые иголки, формирующие одну из пластин, срастаются только с одной иголкой, принадлежащей другой пластине (близкие варианты РСУ 25, [1 1 -2 0]/ 78.46° и 17, [1 1 -2 0]/ 81.79°); в третьем случае идет срастание не всей пластины с одной иголкой, а они группируются попарно, причем образуемый между пластинами угол составляет ~ 36° (низкоэнергетических аналогов РСУ нет).

Оценка удельной энергии фазового контакта в предположении равенства энергии образования новой поверхности раздела и упругой энергии, накопленной в материале, в момент, предшествующий разрушению, дает значение УфК ~ 100 мДж/м2. Полученное значение свидетельствует скорее об ионном характере связи между соседними частицами, чем Ван-дер-Ваальсовым с типичными энергиями порядка 1-10 мДж/м2. Таким образом, можно полагать, что именно срастание кристаллов продукта между собой, а не только механическое зацепление, обусловливает высокие прочностные свойства данного класса фосфатных материалов.

Композиционные материалы

Армирование случайно ориентированными волокнами оказалось малоэффективным с точки зрения упрочнения материала при нагрузках на сжатие. Это вызвано тем, что волокна неэффективны при сжимающих напряжениях, а работают только на растяжение. Именно поэтому только в случае кольцевого армирования, когда на нитях возникают растягивающие напряжения в силу наличия ненулевого коэффициента Пуассона материала, удалось добиться положительных результатов (рис. 10).

вода

кеттутймм кевлар2мм ПВС

1мм полигликшщд2мм кевлар спираль

Рис. 10. Сравнение прочностных характеристик неармированного материала и различных типов композитов

Биологические испытания

1. Испытания in vitro. Оценка резорбции по динамике накопления Са2+ в растворе приведена на рисунке 11 а. Образцы, консолидированные в растворах гидрокарбоната натрия, содержащие КГАП обладают наилучшей растворимостью.

Вида (1)

Р-р цитрата патрпя (2)

Р-р гидроь-арбаната натрия (3)

Рис 11. а) Зависимость рСа от времени при растворении материалов в модельной среде (трис-буфер, рН=7,4); б) Жизнеспособность клеток ЫСТС Ь929 при инкубации с вытяжками из материалов (МТТ-тест): 1) - 2) материалы, полученные с использованием воды и пористостью 0 и 50 %, соответственно; 3) - 4) материалы, полученные с использованием раствора цитрата натрия и пористостью 0 и 50%, соответственно, 5) - 6) материалы, полученные с использованием раствора гидрокарбоната натрия в качестве дисперсионной среды и пористостью 0 и 50%, соответственно

■■н

Высокая выживаемость клеток относительно контроля свидетельствует об отсутствии цитотоксичности созданных материалов.

2. Испытания in vivo. При макроскопической визуальной оценке изменений в окружающих имплантат тканях нагноения и воспаления замечено не было. Томографическое исследование, проведенное через 30 суток после имплантации (рис.12), показало хорошую биосовместимость материала и остеоинтеграцию. Скорость биодеградации материала, по данным томографического исследования, можно связать с пористостью материала.

Рис.12 Томограммы

сплошных (слева) и пористых (справа)

апатитных реакционно-связанных материалов на основе ТКФ через месяц после имплантации

Список цитированной литературы

J. Браун М., Доллимор Д., Галвей А., Реакции твердых тел. И М.: «Мир», 1983. с. 54-84.

2. Синицына О.В, Вересов А.Г., Ковалева Е.С., Коленько Ю.В., Путляев В.И., Третьяков Ю.Д., Получение гидроксиапатита гидролизом а-Саз(Р0^2 II Известия Академии наук. Серия химическая, 2005. 1: с. 78-85.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Разработан низкотемпературный метод получения реакционно-связанных биоматериалов, состоящий в формовании высококонцентрированных кальцийфосфатных дисперсных систем и их последующей консолидации в водных средах. Кристаллы продукта гетерогенной реакции, протекающей на стадии консолидации, связывают частицы исходных фосфатов в прочный монолит.

2. Среди апробированных реакционно-связанных материалов на основе обширного ряда исходных фосфатов кальция наиболее перспективными являются материалы на основе грикальциевого фосфата (ТКФ), которые в зависимости от условий консолидации обладают прочностью в диапазоне 40180 МПа. Это предполагает возможность их применения в качестве нагружаемых имплантатов, а также получения на их основе макропористых матриксов для клеточных технологий.

3. Гидратация трикальциевого фосфата при формировании реакционно-связанного композита ТКФ/ГАП является диффузионно-контролируемой реакцией. Температура проведения реакции определяет не только скорость

гидратации, но и морфологию продукта реакции. Морфологический переход, выражающийся в смене габитуса кристаллов гидроксиапатита с пластинчатого на игольчатый, происходит при 60-80°С и связан с ускорением процессов образования и роста зародышей. В указанной области температур достигается максимум прочности на сжатие реакционно-связанного материала (до 90 МПа при консолидации в воде).

4. Предложены новые эффективные добавки-модификаторы водных дисперсий фосфатов кальция на основе полифосфатов (триметафосфат натрия и гексаметафосфат натрия), пригодных для модифицирования брушитных реакционно-твердеющих паст и позволяющих увеличить сроки их схватывания более 15 мин. Среди исследованных модифицирующих добавок наибольшее влияние на прочностные характеристики брушитных систем оказывает лимонная кислота (четырехкратное увеличение прочности на сжатие). Получены композиты ГАП/брушит, консолидированные брушитным цементом. Установлено увеличение сроков схватывания композитов и повышение уровня pH растворов, контактирующих с подобными материалами.

5. Для объяснения прочностных характеристик реакционно-связанных материалов привлечена модель фазового контакта в бикристаллле ГАП/ГАП с ионным типом химической связи. Показано, что строение фазового контакта можно описать на основе простых геометрических моделей соединения плотноупакованных плоскостей в структуре гидроксиапатита.

6. Получены компактные композиционные материалы ТКФ/ГАП с прочностью до 180 МПа и макроскопической пористостью до 70%. Показано, что армирование короткими отрезками полимерных волокон неэффективно с точки зрения улучшения прочности на сжатие. Оптимальной является схема армирования спиралевидно расположенными волокнами.

7. Полученные материалы демонстрируют способность к формированию на поверхности слоя апатита из растворной среды, близкой по составу к межтканевой жидкости, и являются биосовместимыми с культурой клеток фибробластов человека, не являются цитотоксичными и не содержат компонентов, негативно влияющих на адгезию, распластывание, пролиферативную активность и жизнеспособность фибробластов. Результаты испытаний in vivo подтверждают, что материалы являются биосовместимыми и могут применяться в работах по тканевой инженерии.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Плохих Н.В., Филиппов Я.Ю.. Путляев В.И., Сафронова Т.В., Иванов В.К., Модифицирование фосфатных цементов, содержащих брушит, с использованием комплексообразующих добавок // Журнал неорганической химии, 2013, Т. 58, № 10, с.1289-1297.

2. Филиппов Я.Ю., Ларионов Д.С., Путляев В.И., Соколов A.B., Ковальков В.К., Агахи К.А., Селезнева И.И., Никонова Ю.А., Реакционно-связанные резорбируемые фосфатные биоматериалы: получение и испытания in vitro. II Стекло и керамика. 2013. № 8, с. 35-40.

3. Филиппов Я.Ю.. Ларионов Д.С., Путляев В.И., Колягин Ю.Г., Георгиевский Д.В., Агахи К.А., Ковальков В.К., Соколов A.B., Кинетические особенности

формирования реакционно-связанных фосфатных биоматериалов // Наносистемы: физика, химия, математика. 2013. 4(1), с. 54-65.

4. Ларионов Д.С., Путляев В.И., Сафронова Т.В., Филиппов Я.Ю.. "Низкотемпературные" методы получения кальцийфосфатных биоматериалов: цементы и реакционно-связанные композиты II Вестник РФФИ. 2012. № 4(72), с. 97-105.

5. Filippov Ya.Yu.. Klimashina E.S., Ankudinov A.B., Putlayev V.T., Carbonate substituted hydroxyapatite (CHA) powder consolidated at 450°C // Journal of Physics: Conference Series. 2011. V. 291.

6. Я.Ю. Филиппов. E.C. Климашина, В.И. Путляев, А.Б. Анкудинов, М.И. Алымов, Получение композиционных материалов на основе карбонатзамещенного гидроксиапатита // Перспективные материалы. 2011. №12 спец. выпуск, с. 224-230.

7. Филиппов Я.Ю.. Ларионов Д.С., Путляев В.И., Агахи К.А., Ковальков В.К., Соколов A.B., Биорезорбируемые реакционно-связанные материалы для тканевой инженерии // V Всероссийская конференция по наноматериалам НАНО 2013. 23-27 сентября 2013г, Звенигород, с. 37.

8. Филиппов Я.Ю.. Ларионов Д.С., Путляев В.И., Агахи К.А., Ковальков В.К., Соколов A.B., Реакционно-связанные материалы для замещения костной ткани // Ломоносовские чтения, апрель 2013, с. 86.

9. Филиппов Я.Ю.. Ларионов Д.С., Путляев В.И., Соколов A.B., Ковальков В.К., Агахи К.А., Селезнева И.И., Никонова Ю.А., Реакционно-связанные резорбируемые фосфатные биоматериалы // XII конференция молодых ученых "Наноматериалы и материалы для энергетики", Россия, Звенигород, 9-11 ноября, 2012, с. 59.

10. Филиппов Я.Ю.. Ларионов Д.С., Путляев В.И., Реакционно-связанные материалы для замены костной ткани // Всероссийская молодежная научная школа "Химия и технология полимерных и композиционных материалов", Россия, Москва, 26-28 ноября, 2012, с. 302.

11. Ларионов Д.С., Лукина Ю.С., Сивков С.П., Филиппов Я.Ю.. Путляев В.И., Зайцев В.В., Сенин P.A., Получение апатитного цемента с заданным соотношением компонентов и изучение влияния грансостава на его свойства // XI конференция молодых ученых "Актуальные проблемы неорганической химии: наноматериалы, их исследование и модификация при помощи синхротронного излучения", Россия, Звенигород, 11-13 ноября, 2011, с. 33.

12. Климашина Е.С., Филиппов Я.Ю.. Путляев В.И., Третьяков Ю.Д. // Резорбируемые биоматериалы на основе карбонатзамещенных гидроксиапатитов // XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Т. 2, Россия, Волгоград, 25-30 сентября, 2011, с. 343.

13. Филиппов Я.Ю.. Ковалева Е.С., Путляев В.И., Получение компактных реакционно-связанных материалов на основе нестехиометричного годроксиапатита // XI конференция молодых ученых "Актуальные проблемы неорганической химии: наноматериалы, их исследование и модификация при помощи синхротронного излучения", Россия, Звенигород, 11-13 ноября, 2011, с. 53.

14. E.S. Klimashina. Ya.Yu. Filippov. V.l. Putlyaev, Synthesis and investigation

of nanosized carbonated hydroxyapatite for in vitro tests // III Nanotechnology International Forum «RUSNANOTECH-2010», Moscow, Expocentre, November 1-3, ISBN 978-5-9902492-1-9.

15. Филиппов Я.Ю.. Ковалева E.C., Путляев В.И., Композиционные биоматериалы на основе карбонатзамещенного гидроксиапатита // X конференция молодых ученых "Актуальные проблемы неорганической химии: наноматериалы и здоровье человека", Россия, Звенигород, 29-31 октября, 2010, с. 17.

Подписано в печать:

15.10.2013

Заказ № 8890 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ _М.В. ЛОМОНОСОВА_

ФАКУЛЬТЕТ НАУК О МАТЕРИАЛАХ КАФЕДРА НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ХИМИЧЕСКОГО ФАКУЛЬТЕТА

На правах рукописи

л ( Ч Л "Г / 1 / ¡п л

Ск£У I ОО'ЮОУ

ФИЛИППОВ ЯРОСЛАВ ЮРЬЕВИЧ

РЕАКЦИОННО-СВЯЗАННЫЕ КОМПОЗИТЫ НА ОСНОВЕ ФОСФАТОВ КАЛЬЦИЯ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНЫХ ТКАНЕЙ

Специальность 02.00.21 - химия твердого тела

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: доц., к.х.н. Путляев В.И.

Москва-2013

Оглавление

ОГЛАВЛЕНИЕ.....................................................................

1. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

2. ВВЕДЕНИЕ................................................................

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................................................12

3.1. Строение костной ткани..............................................................................................................12

3.2. Материалы биомедицинского назначения..............................................................................14

3.3. Фосфаты кальция..........................................................................................................................15

3.4 Кристаллохимия фосфатов кальция..........................................................................................18

3.4.1. Дикальциевый фосфат дигидрат..........................................................................................18

3.4.2. Кристаллохимия а-трехкалъциевого фосфата....................................................................19

3.4.3. Кристаллохимия апатитов....................................................................................................20

3.4.4. Методы синтеза гидроксиапатита......................................................................................23

3.4.5. Методы синтеза карбонатзамещенного гидроксиапатита..............................................24

3.5. Компактные биоматериалы на основе фосфатов кальция..................................................27

3.6. Кальцийфосфатная керамика....................................................................................................27

3.6.1. Гидроксиапатитовая керамика.............................................................................................28

3.6.2. Керамика на основе трикальциевого фосфата....................................................................29

3.6.3. Керамика на основе пирофосфата кальция..........................................................................30

3.6.4. Композиционная керамика.....................................................................................................30

3.6.5. Стеклокерамические материалы..........................................................................................31

3.6.6. Покрытия из гидроксиапатита на металлах......................................................................31

3.7. Цементные материалы.................................................................................................................32

3.7.1. Коммерческие цементы..........................................................................................................32

3.7.2. Цементы на основе фосфатов кальция................................................................................36

3.7.3. Апатитовые цементы.......................................1......'...............................................................37

3.7.4. Брушитные цементы..............................................................................................................38

3.7.5. Механические свойства..........................................................................................................39

3.7.6. Преимущества и недостатки кальцийфосфатных цементов...........................................39

3.7.7. Влияние добавок на сроки схватывания................................................................................40

3.8. Химически (реакционно-) связанные материалы..................................................................42

3.8.1. Природа химического связывания..........................................................................................42

3.8.2. Методы упрочнения реакционно-связанных материалов....................................................43

3.8.3. Структурообразование в дисперсных системах.................................................................44

3.8.4. Типы контактов между частицами.....................................................................................45

3.9. Влияние микроструктуры на биологические характеристики............................................49

ЗЛО. Методы получения пористых материалов............................................................................52

3.10.1. Метод реплики.......................................................................................................................54

3.10.2. Метод удаляемой добавки....................................................................................................55

3.10.3. Метод вспенивания...............................................................................................................55

3.10.4. Метод механического задания пор......................................................................................56

3.11. Композиционные материалы...................................................................................................57

3.11.1. Композиты фосфат кальция/полимер................................................................................57

3.11.2. Композиты, армированные волокнами...............................................................................58

3.11.3. Биосовместимые волокна для армирования композитов..................................................59

3.12. Выводы из анализа литературы...............................................................................................61

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.......................................................................................................

4.1. Получение материалов................................................................................................................64

4.1.1. Синтез брушита.....................................................................................................................64

4.1.2. Получение пирофосфата кальция термическим разложением брушита.........................64

4.1.3. Синтез /?-трикальциевого фосфата.....................................................................................64

4.1.4. Синтез триметафосфата натрия.......................................................................................65

4.1.5. Синтез пирофосфата натрия...............................................................................................65

4.1.6. Получение брушитных цементов...........................................................................................65

4.1.7. Синтез аморфного фосфата кальция (АФК).......................................................................66

4.1.8. Синтез а-трикальциевого фосфата (а-ТКФ)......................................................................67

4.1.9. Получение реакционно-связанных материалов.....................................................................67

4.1.10. Получение макропористых материалов.............................................................................70

4.1.11. Получение композиционных материалов............................................................................71

4.2 методы исследования образцов.................................................................................................72

4.2.1 Рентгенографические исследования.......................................................................................72

4.2.2 Электронная микроскопия......................................................................................................74

4.2.3 Инфракрасная спектроскопия (ИК).......................................................................................75

4.2.4 Термогравиметрический (ТГ) и дифференциальный термический анализ (ДТА)..............75

4.2.5 Ионометрия растворов...........................................................................................................75

4.2.6 Исследование распределения частиц по размеру..................................................................76

4.2.7. Измерение потенциала........................................................................................................76

4.2.8. Определение времени схватывания цементной пасты.......................................................76

4.2.9. Расчёт геометрической плотности образцов.....................................................................77

4.2.10. ЯМР-спектроскопия..............................................................................................................78

4.2.11 Механические испытания......................................................................................................78

4.2.12. Биологические испытания....................................................................................................81

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.............................................................................................................85

5.1. Брушитные реакционно-связанные материалы.....................................................................85

5.1.1. Влияние основных факторов получения на прочностные характеристики брушитных реакционно-твердеющих систем...................................................................................................85

5.1.2. Влияние модификатора на сроки схватывания, микроструктуру и прочность брушитного цемента.............................................................................................................................................87

5.1.3. Композиты брушит/ГАП (брушит/fi-ТКФ).........................................................................92

5.1.4. Формирование брушитного реакционно-связанного материала........................................93

5.2. Апатитные реакционно-связанные материалы......................................................................95

5.2.1. Выбор исходной твердой фазы (прекурсора) для формирования апатитных реакционно-связанных материалов.....................................................................................................................95

5.2.2. Исследование процесса гидратации ТКФ...........................................................................102

5.2.3. Превращение ТКФ—>ГАП в реакционно-связанных материалах......................................106

5.2.4. Микроструктура и прочностные свойства реакционно-связанных материалов на основе ТКФ.................................................................................................................................................115

5.2.5 Строение контактов между кристаллами продукта.......................................................129

5.3. Пористые материалы.............................................................................................................134

5.4. Композиционные материалы...............................................................................................139

5.5. Биологические испытания реакционно-связанных материалов................................143

5.5.1. Испытания in vitro................................................................................................................143

5.5.2. Испытания in vivo.................................................................................................................149

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................................................................152

7. ВЫВОДЫ..............................................................................................................................................153

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................................155

9. ПРИЛОЖЕНИЯ..................................................................................................................................168

1. Список используемых сокращений

ГАП - гидроксиапатит Саю(РС>4)б(ОН)2

ТКФ - трикальцийфосфат Саз(РС>4)2

ПФК - пирофосфат кальция СагРгСЬ

АФК - аморфный (орто)фосфат кальция Саз(Р04)2-хН20

АПФК - аморфный пирофосфат кальция СагРгОухНгО

ДКФД - дикальциевый фосфат дигидрат (брушит) СаНРО^ЬЬО

МКФМ - монокальциевый фосфат моногидрат Са^гРС^-НгО

нГАП - нестехиометрический гидроксиапатит Ca<i0-x)(HPC)4)x(PO4)(6-x)(OH)(2-x)

КГАП - карбонатгидроксиапатит Са(ю-х/2)(Р04)(б-х)(СОз)хОН(2-2у)(СОз)у

КФЦ - кальцийфосфатные цементы

РФА - рентгенофазовый анализ

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

ИК-спектроскопия - инфракрасная спектроскопия

РЭМ - растровая электронная микроскопия

ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия

РСУ - решетка совпадающих узлов

SBF - искусственная межтканевая жидкость (от англ. Simulated Body Fluid) MDF - материалы, не содержащие макродефектов (от англ. Macro-Defect Free) МТТ - тест на цитотоксичность материала

2. Введение

Разработка материалов для замены повреждённой костной ткани - одно из наиболее перспективных направлений в области медицинского материаловедения. Быстрое и своевременное восстановление целостности кости после переломов и прочих повреждений позволит человеку в короткие сроки вернуться к нормальной жизни. Разработка и производство подобных биоматериалов чрезвычайно важны в плане оказания высокотехнологичной медицинской помощи. Соответствующий рынок остеозамещающих материалов можно охарактеризовать как динамичный, растущий, устойчивый. В 2011 году объем рынка таких материалов, вместе с биогенными имплантатами (деминерализованный костный матрикс) и остеоиндуцирующими веществами (морфогенетические костные белки типа BMP) превысил отметку в 2 млрд $. К 2017 году ожидается его увеличение до 3,33 млрд $ со средним ежегодным приростом 8,3%, при этом наибольший рост наблюдается в сегменте собственно материалов медицинского назначения (до 10%) (рис.2.1.1.).

Объём рынка

3500 -

3000

w

1 2500

&

о.

о to о

)S

о

со

о

5

2000 -

1500

1000

500 -

I Деминарлизованный матрикс (DBM)

I Имплзнтэты искусственного происхождения**

I Костно морфогенетические белки (BMP)

2004

2008

2012

2016*

Рис.2.1.1. Рынок биоматериалов (* - прогнозируемые значения согласно "Bone Graft Substitutes -Global Pipeline Analysis, Competitive Landscape and Market Forecast to 2017";

** - согласно "Bone Graft Substitutes - Global Pipeline Analysis, Competitive Landscape and Market Forecast to 2017" в группу имплантатов искусственного происхождения включают помимо синтезированных кальцийфосфатных и прочих биоактивных материалов ауто-, алло- и ксенотрансплантаты).

Такие темпы роста связаны с остающейся актуальной проблемой имплантатов, способных нести механические нагрузки и, в то же время, обеспечивать биологическую интеграцию с костной тканью. В 2020 г. не менее 70 млн. человек будут нуждаться в оперативном вмешательстве для имплантирования подобных материалов. Потребность отечественного здравоохранения в остеопластических материалах составляет 160-220 тыс. единиц в год, а всего в Российской Федерации ежегодно фиксируют более 20 миллионов костных травм. При этом, помимо необходимости импортозамещения, остро стоит проблема качества существующих материалов имплантатов: 18 % от всех случаев оперативного вмешательства связаны с повторными операциями по замене некачественного имплантата, что, конечно - дополнительный риск для здоровья пациента [1].

Биосовместимые имплантаты на основе фосфатов кальция занимают особое место среди имплантатов искусственного происхождения. Наиболее широкое применение в настоящее время находят керамика на основе гидроксиапатита (ГАП) и/или трикальциевого фосфата (ТКФ), металлические материалы с ГАП покрытием. Все эти и аналогичные им имплантаты выполняют в значительной степени опорную функцию, но не позволяют кости прорастать внутрь материала. Это связано с низкой растворимостью этих фосфатов в среде

I ! I

организма и отсутствием связанной системы макропор. В то же время всё большее внимание уделяют т.н. регенеративному подходу, в рамках которого имплантату отводят роль не только материала с определенными механическими характеристиками, но и источника веществ, необходимых для роста костной ткани. Данный подход также предполагает, что со временем имплантат должен быть полностью заменён нативной костной тканью. Таким образом, заметным трендом в области остеопластики является получение материалов с высоким уровнем биорезорбции - биорезорбируемых материалов. Улучшения резорбируемости (и растворимости) можно добиться или за счет химической модификации, или за счет варьирования морфологии кристаллов ГАП (например, уменьшения размера зерна компактного материала). Последнее может быть достигнуто, прежде всего, за счёт получения фосфатных имплантатов при комнатных или близких к ним температурам в водных средах. Именно поэтому всё большое внимание исследователи уделяют цементным материалам.

Кальцийфосфатные цементы (КФЦ), рассматриваемые в последнее время в качестве основной альтернативы биокерамике, обладают большей растворимостью (а, следовательно,

и биорезорбцией); технология их применения может быть совмещена с различными вариантами создания макроскопических пор в материале. Кроме того, относительно низкие температуры консолидации цементов позволяют сочетать их как с физиологически активными веществами (например, белками, инициирующими остеосинтез), так и с пролиферирующими клеточными культурами (например, стволовыми клетками). Подобные свойства раскрывают потенциал кальцийфосфатных цементов как основы для создания тканеинженерных конструкций в целях остеопластики. Простота процедуры получения позволяет медицинским работникам самостоятельно готовить и применять материал непосредственно во время операции (in situ), что значительно расширяет возможности применения данного класса имплантатов. Образование цементного камня связано с образованием и ростом кристаллов фосфатов кальция и их взаимным перекрыванием. Кальцийфосфатный цемент обычно состоит из плохо закристаллизованного ГАП или брушита (СаНР04-2Н20); также в цементном камне можно обнаружить исходные вещества, не вступившие в реакцию. Уникальной особенностью цемента является то, что силы, связывающие вновь образованные кристаллы фосфатов, весьма слабы, поэтому отдельные кристаллы могут быть легко отделены от основной массы цементного камня, особенно после

I

частичной, деградации материала в организме. «Слабые прочностные характеристики ограничивают область применения КФЦ заполнением тех дефектов, где кости не несут существенной нагрузки. Низкая прочность КФЦ цементов вызвана также и значительной остаточной микропористостью - фактором не первостепенной значимости в формировании их биологических свойств. Стратегия удаления избыточной пористости активно разрабатывается для классических силикатных цементов. К сожалению, предложенные решения нельзя напрямую перенести на системы типа КФЦ. Тем не менее, сравнение силикатных и фосфатных материалов различного типа указывает на возможные резервы прочностных характеристик КФЦ.

Целью данной работы является разработка низкотемпературного метода получения компактных биоматериалов, сочетающих достоинства фосфатных цементов и высокую прочность керамики. Требование к низким температурам получения (не выше 100°С) связано с тем, что будущее применение подобных материалов допускает возможность их предварительного наполнения биологически активными веществами и/или соответствующими клеточными культурами. В основе низкотемпературных методов

получения лежат химические реакции между фосфатами кальция и раствором. Продукты этих реакций связывают частицы исходного порошка в прочный монолит. Подобные материалы называют реакционно-связанными (или «химически связанными»), чтобы подчеркнуть особенности метода их получения. В процессе интеграции в костную ткань такой материал выполняет первоначальную опорную функцию, а по мере прорастания кости имплантат постепенно растворяется (резорбируется) и способствует росту нативной кости. Таким обра