Рекомбинантная оксидаза D-аминокислот: получение и структурно-функциональные исследования тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ
|
Хороненкова, Светлана Владимировна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2008
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.15
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
0034545 г'И
На правах рукописи
ХОРОНЕНКОВА СВЕТЛАНА ВЛАДИМИРОВНА
РЕК01У1БИНАНТНАЯ ОКСИДАЗА й-АМИНОКИСЛОТ: ПОЛУЧЕНИЕ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
02.00.15-катализ 03.00.23 - биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва - 2008
003454578
Работа выполнена на кафедре химической энзимопогаи Химического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова
Научный руководитель:
профессор, доктор химических наук Тишков Владимир Иванович
Официальные оппоненты:
член-корреспондент РАН, профессор, доктор химических наук Габибов Александр Габибович
член-корреспондент РАН, профессор, доктор химических наук Кочетков Сергей Николаевич
Ведущая организация:
Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН
Защита диссертации состоится JL_ декабря 2008 года в 16 часов на заседании Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.11, МГУ, Химический факультет, кафедра химической знзимологии, аудитория 202.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.
Автореферат разослан ê октября 2008 г. Ученый секретарь
диссертационного совета Д 501.001.59,
кандидат химических наук
Сакодынская И.К.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Оксидаза D-аминокислот относится к классу FAD-содержащих оксидоредуктаз и катализирует окислительное дезаминирование D-аминокислот с образованием соответствующих а-кетокислот (КФ 1.4.3.3, DAAO*). Фермент играет исключительно важную роль в метаболизме микроорганизмов. В организме животных и человека DAAO отвечает за поддержание определенного уровня D-аминокислот в клетке. Например, в тканях мозга фермент контролирует содержание D-серина, который участвует в регуляции деятельности нервной системы. В настоящее время установлено, что повышенная активность DAAO в мозге служит одной из причин возникновения шизофрении. У страдающих болезнью Альцгеймера наблюдается снижение активности фермента, в результате чего в тканях мозга значительно возрастает содержание D-аланина. Пониженная активность DAAO характерна также для некоторых почечных заболеваний. Кроме того, оксидаза D-аминокислот принимает участие в регуляции процессов старения.
На практике этот фермент используется, главным образом, в биокаталитическом процессе окисления цефалоспорина С в 7-аминоцефалоспора-новую кислоту - исходное соединение для производства полусинтетических цефалоспоринов различных поколений (доля бета-лактамных антибиотиков составляет 10% от стоимости всех производимых в мире фармацевтических препаратов). Помимо этого, DAAO активно применяется в аналитичебкой биотехнологии, для хирального синтеза и имеет потенциальное значение для создания систем диагностики и мониторинга ряда психосоматических (шизофрении, болезни Альцгеймера и Паркинсона и др.) и онкологических заболеваний.
Среди всех известных оксидаз D-аминокислот наиболее широкое применение на практике находит фермент из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO). Это связано с его высокой температурной стабильностью и наиболее высокой активностью с цефалоспорином С среди DAAO из других источников. Однако, несмотря на более чем 30-летнюю историю исследования TvDAAO, количество экспериментальных данных о структуре и механизме действия этого фермента в настоящий момент невелико. Можно выделить несколько первоочередных задач и проблем, которые требуют решения для масштабного применения фермента на практике. Первой проблемой является отсутствие эффективной системы получения TvDAAO. В основном для биосинтеза фермента используют мутантные штаммы Т. variabilis и рекомбинантные штаммы бактерий Е. со//' и дрожжей Pichia pastoris,
' В настоящей работе приняты следующие сокращения: DAAO - оксидаза D-аминокислот, TvDAAO - оксидаза D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis, wt-TvDAAO -рекомбинантндЗ оксидаза D-аминокислот дикого типа, RgDAAO - оксидаза D-аминокислот из дрожжей Rhodotorula gracilis, FAD - фпавинадениндинуклеотид, ИПТГ -изопропил-р-О-тиогалактозид.
однако высокого содержания целевого продукта в клетке достичь не удается. Поэтому в настоящее время себестоимость получения TvDAAO достаточно высока. Во-вторых, несмотря на то, что TvDAAO является наиболее термостабильным ферментом среди известных оксидаз D-аминокислот, ее операционная и температурная стабильности недостаточно высоки для эффективного применения на практике. В-третьих, фермент проявляет высокую активность с ограниченным набором D-аминокислот. Поэтому для повышения его каталитической активности с остальными D-аминокислотами и другими перспективными субстратами (как природными, так и неприродными) стоит задача получения мутантных форм фермента с заданной субстратной специфичностью. Наконец, среди четырех наиболее активно исследуемых оксидаз D-аминокислот - из свиньи, человека, дрожжей Rhodotorula gracilis (RgDAAO) и Т. variabilis, данные о трехмерной структуре имеются только для трех первых ферментов. Для TvDAAO данные о структуре отсутствуют, что не позволяет проводить детальное исследование механизма действия фермента и направленное изменение его свойств методами белковой инженерии. Те немногочисленные эксперименты по направленному мутагенезу TvDAAO, которые описаны в литературе, не привели к улучшению каталитических или каких-либо иных свойств полученных мутантных форм по сравнению с ферментом дикого типа.
Цели исследования. Целью данной работы было решение следующих задач:
1. Разработка высокоэффективной системы экспрессии гена tvdaao в клетках Е. coli.
2. Изучение свойств рекомбинантного фермента дикого типа.
3. Получение мутантных форм TvDAAO с измененной субстратной специфичностью и повышенной температурной стабильностью.
4. Определение трехмерной структуры оксидазы D-аминокислот из дрожжей Т. variabilis.
5. Исследование каталитической эффективности фермента дикого типа и мутантных TvDAAO в реакции окисления цефалоспорина С.
Научная новизна. Впервые для TvDAAO детально изучен механизм температурной инактивации при различных температурах и концентрациях фермента. Показано, что в диапазоне температур 50-60 °С реализуется диссоциативный механизм термоинактивации, при более высоких и низких температурах инактивация протекает в соответствии с мономолекулярным механизмом.
В настоящей работе впервые были получены мутантные формы оксидазы D-аминокислот из дрожжей Т. variabilis с улучшенными свойствами. Введение точечных аминокислотных замен позволило увеличить каталитическую эффективность с рядом D-аминокислот в 2-8 раз. Температурная стабильность одного из мутеинов была увеличена в 2,2 раза по сравнению с ферментом дикого
типа (wt-TvDAAO). Было показано, что введение различных аминокислотных замен в одно и то же положение приводит к получению мутантных форм фермента с различным профилем субстратной специфичности.
Использование подхода по гидрофобизации белковой глобулы позволило получить кристаллы мутантного фермента. В результате впервые для оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis была определена трехмерная структура (разрешение 1,8 А).
Практическая значимость работы. Разработана высокоэффективная система экспрессии рекомбинантной TvDAAO в клетках Е.coli с выходом 35000 Ед с литра среды, что превышает известные мировые аналоги минимум в^-2 раза. Получены две мутантные формы фермента, каталитическая эффективность которых в реакции окисления цефалоспорина С в 3 и 4,4 раза выше по сравнению с ферментом дикого типа. Три мутантные TvDAAO не взаимодействуют с D-аланином, что делает их идеальными кандидатами для использования в электрохимических биосенсорах для селективного определения D-серина в нервных тканях. Разработана методика количественного определения DAAO как в биологических жидкостях, так и в колониях целых клеток, что было использовано для скрининга библиотек мутантных клонов. Определение трехмерной структуры фермента позволило создать основу для проведения экспериментов по его белковой инженерии.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях: International Symposium on Biocatalysis and Biotransformations "Biotrans" (Delft, The Netherlands, 2005, Oviedo, Spain, 2007), International Symposium on Environmental Biocatalysis: From Remediation With Enzymes to Novel Green Processes (Cordoba, Spain, 2006), the 4th Moscow International Congress "Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development" (Moscow, Russia, 2007), International Conference "Biocatalysis: Fundamentals & Applications" (Moscow-St.Petersburg, Russia, 2007), the 2nd International Conference "Biocatalysis in Non-Conventional Media" (Moscow, Russia, 2008), the 13,h International Biotechnology Symposium and Exhibition (Dalian, China, 2008) и на IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 статей и 8 тезисов докладов конференций, получено положительное решение на выдачу патента РФ.
Стуктура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и
н
их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 161 страниц печатного текста, 49 рисунков, 24 таблицы и 229 ссылок.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ
ОПТИМИЗАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА tvdaao В КЛЕТКАХ Е. со Ii
В настоящей работе для повышения выхода фермента при экспрессии гена tvdaao в клетках Е. coli была проведена оптимизация методики культивирования по следующим параметрам: система "штамм-хозяин - экспрессионный вектор", состав среды для культивирования, содержание добавок (рибофлавина, D-аминокислот), тип и концентрация индуктора, время индукции, температура процесса, условия аэрации, общая продолжительность культивирования.
Система "штамм-хозяин - экспрессионный вектор". Для биосинтеза TvDAAO использовали систему экспрессии, основанную на клетках Е. coli BL21(DE3)/pLysS Codon Plus и плазмиде pDAA02. Вышеуказанный штамм был выбран для обеспечения синтеза тРНК редких для клеток Е. coli кодонов, которые содержатся в гене tvdaao. Экспрессионный вектор pDAA02 был сконструирован на основе плазмиды серии рЕТ. Особенностью этого вектора является наличие в нем гена /acl - белка-репрессора промотора лактозного оперона, который обеспечивает строгий контроль как промотора /асUV5 на хромосоме штамма-хозяина (регуляция экспрессии гена РНК-полимеразы), так и промотора РНК-полимеразы фага Т7 на плазмиде (регуляция экспрессии гена tvdaao).
Состав среды для культивирования. Результаты экспериментов показали, что наиболее высокий выход TvDAAO наблюдается при использовании для культивирования богатой среды 2YT. В качестве дополнительного компонента среды для культивирования использовали глюкозу в конечной концентрации 0,1 мас%, которая является питательным компонентом и катабопическим репрессором /acUV5 промотора.
Влияние добавок. TvDAAO обладает высокой активностью с D-аланином, который является компонентом клеточной стенки Е. coli. Окисление D-Ala под действием TvDAAO в ходе культивирования может приводить к значительному замедлению скорости роста клеток. Снижение токсичности фермента для клеток штамма-хозяина обеспечивали добавлением в культуральную среду D-аминокислот. Было показано, что использование 1 мМ D-метионина, который является наилучшим субстратом рекомбинантной TvDAAO, позволяет значительно повысить выход активного фермента. Это связано с тем, что в клетке TvDAAO окисляет именно D-Met, а не D-Ala, который необходим для синтеза клеточной стенки.
Оптимизация индукции. Условия индукции (тип и концентрация индуктора, момент индукции) существенно влияют на биосинтез фермента. Использование ИПТГ (изопропил-р-О-тиогалактозида) в качестве индуктора позволяет получить выход активной TvDAAO в 2,5 раза больше, чем при индукции лактозой. Было также установлено, что общий выход фермента существенно зависит от концентрации
ИПТГ и его максимальное значение наблюдается при концентрации индуктора 0,1 мМ (рис. 1). Кроме того, оптимальный выход активного фермента достигается, когда индукцию проводят при поглощении клеток на 600 нм Аеоов 1,0.
* 8000£ <
и! 9000-
л
I-
о о
X а
10000-
7000-
■^¡360 х
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Концентрация ИПТГ, мМ
Рис. 1. Зависимости общей активности, (Ед на литр среды) (■) и удельной активности TvDAAO, (Ед на г сырой биомассы) (А) от концентрации индуктора (ИПТГ, индукция при величине поглощения клеток Аеоо *» 1,0). Штамм Е. coli BL21(DE3)/pLysS Codon Plus, плазмида pDAA02.
Температура культивирования. Первые эксперимент^ по экспрессии гена tvdaao в клетках Е. coli проводили при оптимальной с точки зрения скорости роста этих клеток температуре (37 °С). Было показано, что большая часть целевого фермента синтезируется в виде нерастворимых телец включения. Причиной низкого выхода активного фермента может быть слишком быстрый синтез полипептидной цепи и недостаток времени для правильного сворачивания белковой глобулы. Проведенные в данной работе эксперименты показали, что снижение температуры культивирования с 37 до 23 °С не приводит к уменьшению выхода биомассы или общего количества рекомбинантного белка, однако выход активного растворимого фермента увеличивается в 2,5 раза.
Условия аэрации. Концентрация кислорода в среде для культивирования является одним из важнейших параметров, которые существенно влияют на скорость роста клеток и выход целевого фермента. Для выбора оптимальных условий аэрации было изучено влияние объема и типа колб, используемых для культивирования, на выход биомассы и фермента. Было показано, что наилучшие результаты наблюдаются при использовании конических колб с отбойниками небольшого объема (объем колбы - 1 л, объем среды - 15%). Более детально влияние условий аэрации планируется изучить при культивировании в небольших ферментерах, которые позволяют строго контролировать концентрацию кислорода.
Общая продолжительность культивирования. Было показано, что зависимости выхода активного фермента и общего содержания целевого белка от времени проходят через максимум, который наблюдается через 24 часа после индукции.
В результате оптимизации экспрессии гена оксидазы D-аминокислот из дрожжей Т. variabilis в клетках £. coli выход активного фермента был увеличен с 1500 до 35000 Ед с литра среды. Полученные в настоящей работе данные в сравнении с лучшими результатами других авторов представлены в табл.1.
Таблица 1
Экспрессия нативных и рекомбинантных DAAO из различных источников.
Фермент, система экспрессии Активность, Ед/л Удельная активность, Ед/г биомассы Специфическая активность, Ед/мг белка Содержание DAAO, %
И} почки свиньи
Рекомбинантный, E.coli1 85 25,8 0,15 1,6
R. gracilis
Исходный штамм2 200 16 0,6 0,5
Рекомбинантный, E.coli3 2300 930 8,8 7,8
Т. variabilis
Исходный штамм* 4200 450 н.Д. 4,8
Рекомбинантный, Ulactis5 н.Д.* 150 н.Д. н.д.
Рекомбинантный, P.pastoris8 23000 473 1,46 н.Д.
Рекомбинантный, E.coli (рехультаты данной работы) 34600 1240 11,2 8,5
Arthrobacter protophormiae
Рекомбинантный, E.coli7 152660 1200 15 Н.Д.
1 Pollegioni L. et al, 1994; 2 Simonetta M.P. et al., 1989;3 Molla G. et al., 1998;" Hflrner R. ef a/., 1996, ^Gonzalez F.J. et al., 1997;6 Yu J. et al., 2002; 7Geueke B. et al., 2007.
Как видно из табл. 1, достигнутые в настоящей работе значения выхода активного фермента (35000 Ед с литра среды) в 1,5 раза выше лучших результатов, полученных при культивировании TvDAAO в дрожжах Pichia pastoris [Yu J. et al., 2002]. Кроме того, следует отметить, что в нашем случае такой выход достигается за 24 ч, тогда как в случае P. pastoris время культивирования составляет 43 ч.
Более высокий общий выход по активности по сравнению с результатами настоящей работы был получен дпя DAAO из A. protophormiae. Однако культивирование штамма-продуцента этого фермента проводилось в ферментере в режиме получения культуры клеток высокой плотности (high density culture). В этих условиях по сравнению с культивированием в колбах выход биомассы в 5-7 раз
выше. Поскольку величины активности фермента на г биомассы в обоих случаях одинаковы, очевидно, что при культивировании в режиме культуры клеток высокой плотности созданного штамма - продуцента TvDAAO (одна из главных целей будущей работы) выход по активности также составит не менее 150 000 Ед активности с литра среды. Отметим, что DAAO из A. protophormiae является достаточно нестабильным ферментом - его необходимо хранить в 20% глицерине при температуре -20 °С [Geueke В. е(а/., 2007], в то время как рекомбинантная TvDAAO не теряла активность в течение нескольких месяцев при хранении в фосфатном буфере при 4 °С.
ТЕРМОИНАКТИВАЦИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ TvDAAO
В литературе отсутствуют систематические данные о температурной инактивации TvDAAO, а имеющиеся чрезвычайно противоречивы и неполны. Одним из ключевых моментов разногласий является зависимость скорости инактивации от концентрации фермента. Кроме того, эксперименты, как правило, проводились при одной температуре, а зависимость остаточной активности от времени во всех случаях описывалась простой экспоненциальной функцией.
В настоящей работе было проведено детальное изучение механизма термоинактивации рекомбинантной TvDAAO при различных температурах и концентрациях фермента. Было показано, что при концентрациях 8-33 мкг/мл в интервале температур 50-60 °С зависимость остаточной активности от времени может быть описана только суммой двух экспонент (рис. 2А-Б). Правомерность описания экспериментальных данных биэкспоненциальной функцией была подтверждена расчетом значения критерия Фишера. В случае простой экспоненциальной модели величина расчетного коэффициента Фишера (F3Kcn=16,89) значительно превышает его теоретическое значение (FTeop=1,89). В случае аппроксимации биэкспоненциальной функцией расчетное значение критерия Фишера удовлетворяет требованию адекватности модели (F3KCn=0,90 < FTeop=1,91). Необходимость использования суммы двух экспоненциальных функций для корректной аппроксимации экспериментальных данных свидетельствует о том, что этот процесс протекает как минимум в две стадии.
В полулогарифмических координатах зависимости остаточной активности от времени представляют собой прямые с "изломом" (рис. 3). Подобные зависимости потери активности характерны для механизмов инактивации, в которых сначала происходит диссоциация олигомеров, а затем необратимая денатурация мономеров.
1,0
0,8
I 0,6
Ё я
5 ол
6W о
о,о
4
Equation: у ■ а*ехр(-к1*х) CN»2TOoF - 0.00382 RA2 - 0.9620]
a 0.91916 ,0.02152 И 0.03625 ±0.00224
30 45 60 Время, МИН
1,0
i
Jf
t
0
ш о,в т
1 "
аг
е
г о,*.!
0,0
Equation: у*а'скр(-к1'х) + Ь'ехр(-к2"х} ChiA2/DoF -0.00022 R*2 - 0.99814
а 0.41518 ,0.02297
Ь 0.61672 ±0.02362
И 0.17912 ±0.01686
к2 0.0207 ±0.00097
30 45 I Время, мин
Рис. 2. Зависимость остаточной активности TvDAAO от времени при концентрации фермента 20 мкг/мл. 50 мМ КФБ, рН 8,0, 56 "С. Аппроксимация экспериментальных данных моноэкспоненциальной (А) и суммой двух экспоненциальных (Б) функций.
Ln А/Ад 0,0-
-0,5 -1,0 -1,5 -2,0 -2,5 -3,0
:
7f-ла
-А-
-А.
★
. 52 °С
* 60 °С
10 20 30 40 50 Время, мин
70
Рис. 3. Кинетика термоинактивации рекомбинантной TvDAAO при различных температурах.
50 мМ КФБ, рН 8,0, [En] - 20 мкг/мл, температура 50 °С (■), 52 "С (•), 54 "С (А), 56 °С
(♦), 58 °С(Т),60 °С(*)-
При более высоких концентрациях фермента (100 мкг/мл) в начальный момент времени наблюдается повышение его активности с последующей инактивацией в соответствии с двухэкспоненциальной зависимостью (рис. 4).
Для описания результатов по температурной инактивации TvDAAO была использована теория диссоциативной инактивации, предложенная О.М. Полтораком [Полторак О.М. и др., 1986]. Было показано, что полученные экспериментальные данные полностью удовлетворяют всем положениям теории (наличие излома на
кинетической кривой термоинактивации в полулогарифмических координатах, зависимость положения точки излома от температуры инактивации, зависимость вида кинетической кривой от начальной концентрации фермента).
ЫА/А,
----
-1,0
-1,5
-2,0-
-2,5
ч 4 4
ч*
■ 100 м кг/мл
• 33 мкг/мл ± 20 мкг/мл
• 14 мкг/мл
• 8 мкг/мл
15
30 45 60 Время, мин
75
90
Рис. 4. Кинетика термоинактивации рекомбинантной Т\ЮААО при различных начальных концентрациях белка. 50 мМ КФБ, рН 8,0, 56 "С, [Е0] - 8 мкг/мл (*), 14 мкг/мл (♦), 20 мкг/мл (А), 33 мкг/мл (•), 100 мкг/мл (■).
На основании полученных данных была предложена следующая общая схема температурной инактивации рекомбинантной ТуРААО (схема 1):
А_к О О г—К
оо
денатурированный фермент
Схема 1. Механизм температурной инактивации рекомбинантной "ПЮААО. Кс,5= к\1кл -константа равновесия процесса диссоциации фермента, к2 - константа скорости инактивации мономера.
При физиологической концентрации фермент существует в виде димера, инактивация которого протекает через стадию обратимой диссоциации на мономеры с их последующей необратимой инактивацией. При более высокой концентрации Т\ЮААО существует в виде олигомеров (например, тетрамеров), которые в пересчете на одну субъединицу обладают более низкой активностью, чем димер. Поэтому в начальный момент времени за счет диссоциации олигомеров на димеры наблюдается увеличение активности фермента, которая затем уменьшается при диссоциации димерных форм ТуОААО. Наличие форм фермента с более высокой степенью олигомеризации, чем димеры, было показано с помощью
седиментационного анализа. При концентрации ТуРААО 0,4 мг/мл фермент существует в виде частиц с молекулярной массой (196 ± 2) кДа (молекулярная масса субъединицы равна 40 кДа). Для более низких концентраций фермента (10-50 мкг/мл) методом гель-фильтрации было показано, что ТЛЮААО находится в виде димера.
В соответствии с математическим аппаратом, предложенным для описания механизма диссоциативной термоинактивации [РоКогак О.М. ef а/., 2000], был проведен расчет константы диссоциации димерных форм фермента на мономеры (Клб) и определены константы скорости диссоциации димеров (к-|) и необратимой инактивации мономеров (к2). Полученные результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2
Кинетические параметры диссоциативной термоинактивации рекомбинантной ТуОААО ([Ео] - 20 мкг/мл, 50 мМ КФБ, рН 8,0).
Т, "С Kdis-Ю7, м fri-104,c1 кг-104, С'1
50 0,19 2,86 2,28
52 1,27 3,67 3,13
54 1,34 9,20 5,56
56 6,00 11,57 7,07
58 9,27 21,51 10,84
° 60 14,56 40,54 19,42
Данные табл. 2 свидетельствуют о том, что при повышении температуры величина константы скорости диссоциации димера к-\ растет значительно быстрее константы скорости инактивации мономера кг. Это означает, что при температуре выше 60 °С стадия диссоциации димерной формы фермента на мономеры протекает так быстро, что скорость-лимитирующей оказывается стадия инактивации мономеров, описываемая кинетикой реакции первого порядка. При температурах ниже 50 °С ki < fe и скорость-лимитирующей стадией является диссоциация димерной формы TvDAAO. В диапазоне температур 50-60 °С константы скорости диссоциации димеров и инактивации мономеров сопоставимы, что и приводит к появлению двухэкспоненциальной зависимости остаточной активности от времени.
БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ TvDAAO
Нами были получены три мутантные формы TvDAAO с заменами Cys108Ala, Cys108Ser и Cys108Phe. Направленный мутагенез Cys108 был выполнен на основании литературных данных о том, что модификация или окисление этого остатка приводит к потере исходной активности TvDAAO на 75% [Slavica А. ef а/.,
2005]. Выбор типа аминокислотного остатка для замены был обусловлен следующими факторами:
1) остатки Ala и Ser являются наиболее близкими структурными аналогами остатка Cys. В природе именно на эти аминокислоты происходят замены Cys в однотипных ферментах;
2) выбор в пользу остатка Phe был сделан на основании сравнения аминокислотных последовательностей DAAO из различных источников. В последовательностях ферментов из N. crassa и F. solani, которые имеют наибольшую гомологию с TvDAAO, в положении, соответствующем положению остатка Cys108 в TvDAAO, находится остаток Phe.
Направленный мутагенез проводили с помощью полимеразной цепной реакции. Секвенирование полученных плазмид показало, что в гене tvdaao содержатся только те мутации, которые обеспечивают замены кодонов Cys108Ala, Cys108Ser и Cys108Phe. Методика культивирования клеток Е. coli - продуцентов мутантных ферментов и процедура их выделения и очистки были аналогичны таковым для wt-TvDAAO.
Температурная стабильность мутантных ферментов и wt-TvDAAO. Данные по температурной стабильности полученных мутантных TvDAAO при одинаковой температуре и равной концентрации ферментов представлены на рис. 5.
Время, мин
Рис. 5. Зависимость остаточной активности от времени для мутеинов и ТуОААО дикого типа при 54 °С. 50 мМ КФБ, рН 8,0, [Е0] -10 мкг/мл. М-ТуОААО (■), ТуОААО С108Р (•), ТУЭААО С108А (А), ТуОААО С1088 (★).
Из рис. 5 видно, что мутантные ТуОААОСЮ8А и ТуОААОСЮ83 менее стабильны, чем М-ТуОААО, тогда как введение замены Суэ108РЬе привело к увеличению периода полуинактивации фермента более чем в 2 раза. Кинетика
инактивации различных форм TvDAAO была изучена при различных температурах и концентрациях фермента. Оказалось, что диапазоны температур, в которых реализуется диссоциативная термоинактивация или необратимая инактивация в реакции первого порядка, различаются для всех мутантных форм и wt-TvDAAO (табл. 3).
Таблица 3
Температурные диапазоны различных механизмов термоинактивации TvDAAO.
Механизм потери активности TvDAAO С108А TvDAAO C108F TvDAAO C108S wt-TvDAAO
Термоинактивация по реакции первого порядка 54-56 °С 58-60 °С 50-60 °С <50 и >60 °С
Диссоциативная термоинактивация 48-52 °С 50-56 °С - 50-60 °С
В случае мутантных TvDAAO С108А и C108F произошло смещение верхней границы интервала температур, в котором реализуется механизм диссоциативной термоинактивации, в низкотемпературную область на 8 и 4 "С соответственно по сравнению с wt-TvDAAO. Для мутанта TvDAAO C108S во всем диапазоне температур 50-60 °С потеря активности фермента происходит в соответствии с мономолекулярным механизмом. Полученные результаты свидетельствуют,, что введение аминокислотных замен в положение 108 по-разному влияет на величины констант скорости диссоциации димеров к-, и необратимой инактивации мономеров кг (схема 1). Например, в случае TvDAAO C108F величина fa практически не изменяется, а константа к2 в зависимости от температуры уменьшается в 1,8-2,5 раз, т.е. повышение термостабильности связано со стабилизацией мономерной формы фермента. Полученные данные также свидетельствуют, что повышение стабильности сопровождается изменением размера белковой глобулы мутанта TvDAAO C108F по сравнению с wt-TvDAAO.
Изменение размера белковой глобулы. Методом гель-фильтрации было показано, что времена удерживания wt-TvDAAO и мутантной TvDAAO C108F различаются. Величины молекулярной массы для wt-TvDAAO и мутантной TvDAAO C108F, получаемые из калибровочной кривой, составляют 68,9 и 63,6 кДа соответственно. Заниженные значения молекулярной массы, определяемой методом гель-фильтрации, можно объяснить тем, что молекула фермента в обоих случаях не является идеальным шаром, а представляет собой эллипсоид. Более низкая величина молекулярной массы мутанта TvDAAO C108F, полученная с помощью гель-фильтрации, по сравнению с таковой для wt-TvDAAO
свидетельствует о том, что в случае мутанта белковая глобула является более компактной, чем в случае wt-TvDAAO.
Методом динамического светорассеяния был определен эффективный радиус молекулы wt-TvDAAO и мутантной TvDAAO C108F, который составил 12,4 и 9,4 нм соответственно. Таким образом, двумя независимыми методами показано, что введение аминокислотной замены Cys108Phe приводит к компактизации белковой глобулы TvDAAO.
Субстратная специфичность мутантных TvDAAO. Результаты исследования кинетических параметров полученных мутантов представлены в табл. 4. Кроме того, для наглядности на рис. 6 показано относительное изменение каталитической эффективности мутатных форм по сравнению с wt-TvDAAO (величина /Ccai/Км для фермента дикого типа принята за 100%).
Из полученных данных следует, что введение различных аминокислотных замен в одно и то же положение приводит к получению мутантных форм фермента с различным профилем субстратной специфичности. Все три мутанта перестали катализировать окисление D-Ala, который является "хорошим субстратом" wt-TvDAAO (высокое значение /fcat/Км). Мутантная TvDAAO C108F не реагирует с D-Lys и D-Pro. Наиболее значительное изменение кинетических свойств наблюдается в случае D-Leu, по которому величина /fcat/Км для мутантных ферментов в 2,2-7,5 раза выше таковой для TvDAAO дикого типа.
Получение мутантных оксидаз D-аминокислот с различным спектром субстратной специфичности позволяет создавать биосенсоры как для селективной детекции, так и для определения общего содержания D-аминокислот в биологических образцах. Например, для диагностики шизофрении необходимо количественно определять содержание D-серина в спинномозговой жидкости. В работе [Pernot Р. ei al., 2008] для такого анализа был предложен биосенсор на основе RgDAAO. Однако селективная детекция D-Ser с помощью такого биосенсора в присутствии сравнимых количеств D-Ala невозможна из-за практически одинаковой каталитической эффективности RgDAAO с этими двумя D-аминокислотами. Полученная в работе мутантная TvDAAO С108А является идеальным кандидатом для такого анализа, поскольку кроме отсутствия активности с D-Ala, ее каталитическая эффективность с D-Ser выше, чем с ферментом дикого типа (рис. 6).
Таблица 4
Кинетические параметры взаимодействия мутантных ТуОААО и фермента дикого типа с различными О-аминокислотами
Форма фермента ТУОААО С108Р ТУОААО С108А ТУЭААО сювэ \vt-TvDAAO
О-аминокислота Км, мМ ^саЪ С-1 Км, с-1-мМ-1 Км, мМ КсаЬ С-1 кси! Км, С"1-мМ"1 Км, мМ ^саЬ С"1 кса*1 Км, с"1-мМ"1 Км, мМ ^са!» С"1 Км, с-1-мМ"1
0-метионин 2,54 40,06* 15,77 0,66 56,96 86,30 0,83 25,20 30,36 0,24 26,57 110,70
О-валин 36,70 13,64 0,37 3,78 2,14 „ °.57 7,72 20,81 2,70 17,73 23,63 1,33
й-лейцин 0,84 26,27 31,28 0,19 16,22 85,31 0,23 5,90 25,64 0,78 8,91 11,42
Э-пролин НЕТ РЕАКЦИИ 35,42 3,61 0,10 Н.Д.** 26,28 1,40 0,05
0-треонин 6,38 2,09 0,33 6,55 2,34 0,36 Н.Д. 10,02 1,31 0,13
Р-фенилаланин 0,54 32,66 60,47 0,56 30,75 54,90 0,32 6,22 19,42 0,40 10,48 26,20
й-триптофан 0,19 4,57 24,04 0,19 7,48 39,39 0,27 3,53 13,07 0,32 5,66 17,68
0-лизин НЕТ РЕАКЦИИ 17,52 4,02 0,23 73,15 2,67 0,04 49,38 10,38 0,21
0-тирозин 0,20 5,91 29,54 0,43 9,51 22,11 0,55 4,68 8,51 0,73 10,10 13,83
О-серин 42,80 1,44 0,03 18,98 3,25 0,17 32,82 4,23 0,13 28,71 4,04 0,14
Б-аспарагин 17,94 39,13 2,18 18,20 16,57 0,91 36,38 20,96 0,58 15,78 15,74 1,00
Р-аланин НЕТ РЕАКЦИИ НЕТ РЕАКЦИИ НЕТ РЕАКЦИИ 9,72 13,28 1,37
* - Полужирным шрифтом на сером фоне выделены кинетические параметры мутантных ТуЭААО, лучшие по сравнению с таковыми для^-ТУЬаАО. Погрешности измерения констант не превышают 10%. ** н.д. - нет данных.
800 r-
600-1
£
Jt
э
S
400
~ TvDAAO C108S 5 TvDAAO C108A ■ TvDAAO C108F _ wt-TvOAAO
wt-TvDAAO ■» TvDAAO C108F a TvDAAO C108A ® TvDAAO C10BS
Рис. 6. Относительные значения параметра каталитической эффективности к^/Км для мутантных ТуРААО и фермента дикого типа. Величины отношения к^/Км для уЛ-ТуОААО по каждому из субстратов приняты за 100%.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРЕХМЕРНОЙ СТРУКТУРЫ TvDAAO
Оксидаза D-аминокислот из дрожжей Т. variabilis впервые была получена в высокоочищенном состоянии более тридцати лет назад [Berg С.P. et а!., 1976]. Поскольку с этим ферментом активно работали во многих лабораториях мира, можно предположить, что в течение этого периода времени предпринимались попытки кристаллизации TvDAAO. Однако отсутствие структуры фермента в банке
Рис. 7. Структура субъединицы (А) и димера (В) мутантной TvDAAO C108F. Наложение aC-атомов структур (Б) субъединиц TvDAAO C108F (черный) и RgDAAO (голубой).
данных PDB и статей на эту тему свидетельствует о том, что все эти попытки не увенчались успехом. Нами также был проведен масштабный скрининг условий кристаллизации фермента дикого типа, но получить кристаллы wt-TvDAAO также не удалось. Неудача экспериментов по кристаллизации, по-видимому, связана с тем, что фермент способен образовывать различные олигомерные структуры, которые не кристаллизуются. Одним из подходов для получения кристаллов белков является гидрофобизация белковой глобулы [Derewenda Z.S. etal., 2006]. В настоящей работе введение гидрофобной замены Cys108Phe позволило получить кристаллы фермента и определить его структуру с разрешением 1,8 А.
Схематическая структура субъединицы мутантной TvDAAO представлена на рис. 7 А. Анализ полученной структуры позволяет четко выделить два домена: каталитический и FAD-связывающий. Каталитический домен фермента находится в верхней части субъединицы и представляет собой объемную полость, образованную р-тяжами. Нижняя половина субъединицы представляет собой FAD-связывающий домен. Из рис. 7 Б видно, что общая конформация полипептидной цепи в субъединице TvDAAO C108F близка к таковой для субъединицы DAAO из дрожжей R. gracilis. Наиболее существенными отличиями структуры субъединицы TvDAAO C108F от RgDAAO является ббльший объем полости активного центра и отсутствие петель, отвечающих в структуре RgDAAO за образование димера. Конформация FAD в обоих случаях практически одинакова. Димер TvDAAO C108F (рис. 7 В), как и димер RgDAAO организован по принципу "голова-хвост". Однако, в отличие от последнего, субъединицы в молекуле TvDAAO C108F не лежат в одной плоскости, а смещены друг относительно друга. Площадь межсубъединичного контакта для мутантной TvDAAO C108F и RgDAAO составляет 1225 и 1485 А2 соответственно.
Следует также отметить, что остаток Phe108 ориентирован внутрь активного центра (рис. 7 А, отмечен сиреневым цветом). Этот факт объясняет значительное изменение субстратной специфичности фермента при введении аминокислотной замены в это положение.
ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ TvDAAO
Окисление цефалоспорина С. Нами была изучена каталитическая активность мутантных TvDAAO и рекомбинантного фермента дикого типа в реакции окисления цефалоспорина С. Результаты экспериментов представлены на рис. 8. Из рисунка видно, что две из трех мутантных форм фермента обладают более высокой каталитической активностью в реакции окисления цефалоспорина С, чем wt-TvDAAO.
Время, мин
Рис. 8. Кинетика окисления цефапоспорина С, катализируемого мутантными ЪЮААО и ферментом дикого типа. 5 мМ цефалослорин С. 10 мкг фермента, 50 мМ КФБ, рН 8,0, 25 °С. Ы-ТмОААО (■), С108Р (.), С108А (А), С1085 (*).
Были рассчитаны значения кинетических параметров реакции окисления цефалоспорина С, результаты представлены в табл. 5.
Таблица 5
Кинетические параметры окисления цефалоспорина С.
Форма фермента Км, мМ ^саЬ С 1 Кс/Кн, мМ-'-с1
М-ТУОААО 2,6 ±0,1 19 ± 1 7,2
Т\ЮААО С108Р 0,99 ± 0,13* 21 ±2 21,3
™ЭААОСЮ8А 0,71 ± 0,09 23 ±2 31,8
Т\ЮААО СЮвЭ 5,6 ± 0,6 10,8 ±0,9 1,9
* Полужирным шрифтом на сером фоне отмечены кинетические параметры реакции, катализируемой мутантными ТуОААО, лучшие по сравнению с таковыми для иЛ-ТуОААО.
Из полученных данных следует, что в случае двух мутантных Ту РАДО наблюдается значительное уменьшение величины Км по сравнению с ферментом дикого типа, тогда как значение /си| в обоих случаях изменилось незначительно. Каталитическая эффективность мутеинов ТуОААО С108Р и С108А в реакции окисления цефалоспорина С в 3 и 4,4 раза выше, чем в случае \лгКП/ОААО.
Детекция йААО на мембранах. В случае ряда заболеваний наблюдаются значительные изменения не только концентрации О-аминокислот в различных тканях организма, но и активности самой ОААО. Поэтому высокочувствительные методы детекции фермента в биологических образцах могут быть использованы для целей медицинской диагностики.
2670 296 33 3,6 0,4 контроль
фффОО 1
890 99 11 1,2 0,13 А
Б
Рис. Детекция ОААО (в нг) на мембране (А). Зависимость интенсивности сигнала от количества ОААО в диапазоне 0,13-296 нг (Б). Вставка - зависимость интенсивности сигнала от количества ОААО в диапазоне 0,13-3,60 нг. Нитроцеллюлозная мембрана, количество ПХ в пробе 0,61 нг.
В
Рис.й Скрининг мутантных клонов DAAO, полученных методом неупорядоченного мутагенеза, с использованием D-метионина (А), D-триптофана (Б) или D-аспарагиновой кислоты (В) в качестве субстрата. (Г) Контрольная чашка с колониями клеток Е. coli, не содержащих плазмиды с геном tvdaao.
Нами была разработана методика определения микроколичеств фермента в различных образцах на мембранах. Детекция основана на сопряженной реакции определения Н2Ог с участием пероксидазы хрена и 3,3'-диаминобензидина, образующего черно-коричневый нерастворимый продукт. Методика определения фермента была оптимизирована по ряду параметров (тип мембраны, фоновое окрашивание мембраны, способ введения пероксидазы для детекции DAAO). В результате чувствительность анализа составила менее 1 нг фермента в пробе (рис. 9 А). Калибровочная кривая для количественного определения оксидазы D-аминокислот приведена на рис. 9 Б. Из этого рисунка видно, что при низком содержании фермента в анализируемой пробе наблюдается линейная зависимость интенсивности сигнала от количества DAAO.
Было показано, что данная методика может быть использована для де гекции активности фермента не только в растворе, но и в колониях целых клеток. На рис.10 представлены результаты применения предложенной методики с использованием различных D-аминокислот для скрининга библиотеки мутантных клонов TvDAAO, полученной методом неупорядоченного мутагенеза. Результаты этих экспериментов хорошо согласуются с данными по субстратной специфичности фермента дикого типа. Наилучшим субстратом wt-TvDAAO является D-метионин, для которого наблюдается максимальное количество и интенсивность окрашивания клонов по сравнению с D-триптофаном. Кроме того, в результате скрининга удалось получить мутантные формы TvDAAO, активные с D-аспарагиновой кислотой, с которой фермент дикого типа не взаимодействует. Таким образом, применение разработанного метода анализа для скрининга библиотек мутантных клонов позволяет отбирать колонии, содержащие фермент с наиболее высокой активностью с требуемыми D-аминокислотами.
ВЫВОДЫ
1. Проведена оптимизация экспрессии гена оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis в клетках Е. coli. Изучено влияние различных параметров (штамм-хозяин, состав среды для культивирования, тип и концентрация индуктора, время индукции, температура культивирования, условия аэрации, общая продолжительность культивирования) на выход фермента. В результате оптимизации условий процесса выход активного фермента был повышен с 1500 до 35000 единиц с литра среды, что превышает известные мировые результаты в 1,5 раза.
2. Получены три мутантные формы фермента TvDAAO C108F, С108А, C108S. Исследование кинетических свойств показало, что введение замены в положение 108 приводит к значительному изменению профиля субстратной специфичности TvDAAO. Замены Cys108Phe и Cys108Ala обеспечивают значительное
увеличение каталитической эффективности фермента по отношению к D-аминокислотам с большим гидрофобным радикалом в боковой цепи. Все три мутантные формы не реагируют с D-аланином. Кроме того, мутанты TvDAAO C108F, С108А обладают в 3 и 4,4 раза более высокой каталитической эффективностью в реакции окисления цефалоспорина С, чем фермент дикого типа. Получение мутантных форм фермента с различными спектрами субстратной специфичности позволяет осуществить индивидуальный подбор биокатализаторов в зависимости от поставленной задачи.
3. Изучен механизм термоинактивации рекомбинантной TvDAAO. Для фермента дикого типа показано, что в диапазоне концентраций 8-33 мкг/мл и температур 50-60 °С реализуется диссоциативный механизм термоинактивации, а при более высоких и низких температурах инактивация протекает в соответствии с мономолекулярным механизмом. При концентрации фермента выше 33 мкг/мл диссоциативной термоинактивации предшествует стадия обратимой диссоциации тетрамерных форм TvDAAO на димерные. В случае мутантных ферментов наблюдается сдвиг температурного диапазона, в котором реализуется механизм диссоциативной термоинактивации. Введение мутации Cys108Phe приводит к повышению температурной стабильности фермента в 2,2 раза и компактизации белковой глобулы.
4. Получены кристаллы мутантной TvDAAO C108F и определена ее трехмерная структура методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 1,8 А. Данная структура является первой для оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis. Показано, что общая конформация полипептидной цепи в субъединице TvDAAO C108F близка к таковой в субъединице оксидазы D-аминокислот из дрожжей Rhodotorula gracilis, однако в димерах наблюдается различная взаимная ориентация субъединиц. Наиболее существенными отличиями структуры субъединицы TvDAAO C108F от таковой для RgDAAO является бблыиий объем полости активного центра и отсутствие петель, отвечающих в структуре RgDAAO за образование димера.
5. Разработана методика высокочувствительного определения DAAO в различных типах образцов, в том числе в сложных биологических жидкостях. Чувствительность детекции составляет 0,13 нг фермента в пробе. Методика также применима для определения оксидазы D-аминокиспот в колониях целых клеток, что позволяет проводить простой и эффективный скрининг библиотек мутантных клонов по активности с нужным субстратом.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Тишков В.И., Хороненкова С.В. Оксидаза D-аминокислот: структура, механизм действия и практическое применение. // Биохимия. 2005. Т. 70. №1. С. 51-67.
2. Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis: expression in E. coli cells, purification and characterisation of recombinant enzyme. II Abstracts of The 7th International Symposium on Biocatalysis and Biotransformations. Delft, The Netherlands, 2005. P182.
3. Савин C.C., Чернышев И.В., Тишков В.И., Хороненкова С.В. Субстратная специфичность оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis, экспрессированной в клетках Е. coll. II Вестник Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2006. Т. 47. №1. С. 25-30.
4. Khoronenkova S.V., Savin S.S., Tishkov V.I. Physlcochemical properties of recombinant D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. II Abstracts of International Symposium on Environmental Biocatalysis: From Remediation With Enzymes to Novel Green Processes. Cordoba, Spain, 2006. P52.
5. Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. Production of recombinant D-amino acid oxidase and its immobilization. II Abstracts of The 4th Moscow International Congress "Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development". M., 2007. V. 2, P.187.
6. Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. Site-directed mutagenesis of D-amino acid oxidase: from Trigonopsis variabilis. II Abstracts of The 8th International Symposium on Biocatalysis and Biotransformations. Oviedo, Spain, 2007. P164.
7. Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. D-amino acid oxidase: from gene cloning to protein engineering. // Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2007: Fundamentals & Applications". M., 2007. P.40.
8. Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. High throughput screening assay for D-amino acid oxidase. II Analytical Biochemistry. 2008. V. 374. № 2. P. 405-410.
9. Хороненкова C.B., Тишков В.И. Рекомбинантная оксидаза D-аминокислот для биотехнологии и медицинской диагностики. // Сборник трудов IV Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 2008. С. 383.
10 Тишков В.И., Савин С.С., Хороненкова С.В. Получение биокатализаторов с заданными свойствами. // Известия Академии наук. Серия химическая. 2008. Т. 57. №5. С. 1014-1022.
11. Хороненкова С.В., Тишков В.И. Оксидаза D-аминокислот: физиологическая роль и применение. II Успехи биологической химии. 2008. Т.48. С. 359-376.
12.Хороненкова С.В., Савина Л.И., Тишков В.И. Мугантные оксидазы D-аминокислот. Заявка на патент РФ № 2007127822/13, положительное решение от iM.10.2008.
13. Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. Recombinant D-amino acid oxidase for biotransformation and medicine diagnostics. II Abstracts of The 2nd International Conference "Biocatalysis in Non-Conventional Media". M., 2008. P. 15.
14.Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. Recombinant D-amino acid oxidase with improved properties. //Abstracts of The 13th International Biotechnology Symposium. Dalian, China, 2008. PV3-Y-010.
Подписано в печать 02.10.2008 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 п.л. Тираж 150 экз. Заказ № 743 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
I. ВВЕДЕНИЕ.б
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Общие сведения об оксидазе D-аминокислот.
2.2. Локализация и физиологическая роль DA АО.
2.2.1. Регуляция уровня D-серина.
2.2.2. Регуляция секреции гормонов.
2.2.3. Регуляция кровяного давления.
2.2.4. Регуляция уровня D-аланина.
2.2.5. Регуляция уровня D-пролина.
2.3. Первичная структура DAAO.
2.4. Пространственная структура.
2.5. Клонирование генов и экспрессия рекомбинантных DААО.
2.6. ochobi1ые свойства DAAO.
2.6.1. Субстратная специфичность.
2.6.2. Температурная стабильность.
2.6.3. pH-Стабильность.
2.7. Кинетическая схема катализируемой DAAO реакции.
2.8. Белковая инженерия DAAO.
2.9. Практическое применение фермента.
2.9.1. Определение D-аминокислот и активности DAAO.
2.9.2. Профилактика психосоматических и онкологических заболеваний.
2.9.3. Получение физиологически активных соединений.
2.9.4. Конверсия цефалоспорина С.
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Материалы.
3.2. Методы исследования.
3.2.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле.
3.2.2. Рестрикция ДНК.
3.2.3. Выделение ДНК-фрагментов из агарозного геля.
3.2.4. Лигирование фрагментов ДНК.
3.2.5. Трансформация клеток Е. coli.
3.2.6. Выделение плазмидной ДНК.
3.2.7. Направленный мутагенез гена оксидазы D-аминокислот.
3.2.8. Секвенирование ДНК.
3.2.9. Экспрессия TvDAAO и ее мутантов в клетках Е. coli.
3.2.10. Очистка DAAO.
3.2.11. Белковый электрофорез в денатурирующих условиях.
3.2.12. Изоэлектрофокусирование.
3.2.13. Светорассеяние.
3.2.14. Определение молекулярной массы методом гель-фильтрации.
3.2.15. Определение концентрации белков.
3.2.16. Определение активности DAAO.
3.2.17. Определение кинетических параметров.
3.2.18. Изучение стабильности при различных температурах.
3.2.19. Стабильность в буферах с различной ионной силой.
3.2.20. pH-стабильность.
3.2.21. Определение кинетических параметров реакции с цефалоспорином С.
3.2.22. Детекция микроколичеств DAAO на мембранах.
3.2.23. Детекция активности DAAO в колониях целых клеток Е. coli.
3.2.24. Рентгеноструктурный анализ.
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. Оптимизация экспрессии гена оксидазы D-аминокислот из дрожжей т. variabilis в клетках е. coli.
4.1.1. Общие положения оптимизации условий культивирования.
4.1.2. Выбор среды для культивирования и температуры процесса.
4.1.3. Влияние количества рибофлавина.
4.1.4. Тип и концентрация индуктора, время индукции.
4.1.5. Влияние условий аэрации на экспрессию гена tvdaao.
4.1.6. Влияние добавок на биосинтез целевого фермента.
4.1.7. Продолжительность культивирования.
4.2. Выделение рекомбинантного фермента.
4.2.1. Термообработка бесклеточного экстракта.
4.2.2. Ион-обменная хроматография.
4.2.3. Гель-проникающая хроматография.
4.3. Стабильность рекомбинантной Т vD ААО.
4.3.1. Концентрационная и температурная зависимости активности.
4.3.2. Стабильность рекомбинантной TvDAAO.
4.3.3. рН-Стабильность рекомбинантного фермента.
4.4. Субстратная специфичность рекомбинантного фермента.
4.5. Механизм температурной инактивации рекомбинантной TvDAAO.
4.6. Белковая инженерия DAAO из дрожжей т. variabilis.
4.6.1. Получение и выделение мутантных TvDAAO.
4.6.2. Субстратная специфичность мутантных TvDAAO.
4.6.3. Температурная стабильность мутантных ферментов.
4.6.4. Изменение размера белковой глобулы.
4.7. Определение трехмерной структуры TvDAAO.
4.8. Практические аспекты применения полученных TvDAAO.
4.8.1. Детекция фермента на мембранах.
4.8.1.1. Оптимизация условий детекции DAAO на мембранах.
4.8.1.2. Применимость метода.
4.8.1.3. Скрининг библиотек мутантных клонов.
4.8.2. Окисление цефалоспорина С.
V. ВЫВОДЫ.
Оксндаза D-аминокислот относится к классу FAD-содержащих оксидоредуктаз и катализирует окислительное дезаминирование D-аминокислот в соответствующие а-кетокислоты (КФ 1.4.3.3, DAAO). Фермент играет исключительно важную роль в метаболизме микроорганизмов. В организме животных и человека DAAO отвечает за поддержание определенного уровня D-аминокислот в клетке. Например, в тканях мозга фермент контролирует содержание D-серина, который участвует в регуляции деятельности нервной системы. В настоящее время установлено, что повышенная активность DAAO в мозге служит одной из причин возникновения шизофрении. У пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, наблюдается снижение активности фермента, в результате чего в тканях мозга значительно возрастает содержание D-аланипа. Пониженная активность DAAO характерна также для некоторых почечных заболеваний. Кроме того, оксидаза D-аминокислот принимает участие в регуляции процессов старения.
На практике этот фермент используется главным образом в биокаталитическом процессе окисления цефалоспорина С в 7-аминоцефалоспорановую кислоту - исходное соединение для производства полусинтетических цефалоспоринов различных поколений (доля бета-лактамных антибиотиков составляет 10% от стоимости всех производимых в мире фармацевтических препаратов). Помимо этого, DAAO активно применяется в аналитической биотехнологии, хиральном синтезе, получении а-кетокислот и имеет большое потенциальное значение для создания систем диагностики и мониторинга ряда психосоматических (шизофрении, болезни Альцгеймера и Паркинсона и др.) и онкологических заболеваний.
Несмотря на высокую теоретическую и практическую значимость, оксидаза D-аминокислот до недавнего времени была малоизученным ферментом. Фактически в настоящее время накоплен достаточно большой объем экспериментальных данных для DAAO из почки свиньи (pkDAAO) и из дрожжей Rhodotorula gracilis (RgDAAO). Трехмерные структуры этих ферментов были определены в 1996 и 2000 годах соответственно. Для pkDAAO и RgDAAO в литературе имеются данные по детальному изучению механизма действия этих ферментов методом направленного мутагенеза. В 2006 году была опубликована структура еще одной DAAO - фермента из человека (hDAAO). Интерес ученых к этому ферменту активно растет в последние годы в связи с открытием новых аспектов, связанных с физиологической ролью hDAAO в организме человека.
Результаты по изучению механизма действия совместно с данными о структуре позволяют создать основу для направленного изменения свойств фермента с целью получения биокатализаторов с заданными свойствами. В настоящий момент такая работа начата для DAAO из R. gracilis, однако для ферментов из других источников подобных данных в литературе не представлено.
Среди всех известных оксидаз D-аминокислот наиболее широкое применение на практике находит фермент из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO). Это связано с его высокой температурной стабильностью и наиболее высокой активностью с цсфалоспорином С среди DAAO из других источников. Однако, несмотря на более чем 30-летнюю историю исследования TvDAAO, количество экспериментальных данных о структуре и механизме действия этого фермента в настоящий момент невелико. Это приводит к тому, что для практических целей используется только фермент дикого типа, который не является оптимальным даже для уже разработанных процессов с его участием. Можно выделить несколько первоочередных задач и проблем, которые требуют решения для масштабного применения фермента на практике. Первой проблемой является отсутствие эффективной и дешевой системы получения TvDAAO. В основном для биосинтеза фермента используют мутантные штаммы Т. variabilis и рекомбипантные штаммы бактерий Е. coli и дрожжей Pichia pastoris, однако высокого выхода фермента по активности с литра среды на единицу времени (Ед активности/объем/время, space/time yield), равно как и содержания целевого продукта в клетке, достичь не удается. Поэтому в настоящее время себестоимость получения TvDAAO достаточно высока. Во-вторых, несмотря на то. что TvDAAO является наиболее термостабильным ферментом среди известных оксидаз D-аминокислот, ее операционная и температурная стабильности недостаточно высоки для эффективного применения на практике. В-третьих, фермент проявляет высокую активность с ограниченным набором D-аминокислот, в то время как спектр соединений, интересующих биотехнологов, значительно шире. Кроме того, для целей медицинской диагностики необходимы ферменты, высокоспецифичные к определенной D-аминокислоте и не активные с другими соединениями, содержащимися в определенных тканях организма. Поэтому для повышения его каталитической активности с целевыми D-аминокислотами и другими перспективными субстратами (как природными, так и неприродными) стоит задача получения мутантных форм фермента с заданной субстратной специфичностью. Наконец, среди четырех наиболее активно исследуемых оксидаз D-аминокислот - pkDAAO, RgDAAO, hDAAO и TvDAAO, данные о трехмерной структуре имеются только для первых трех ферментов. Для DAAO из Т. variabilis данные о структуре отсутствуют, что не позволяет проводить детальное исследование механизма действия фермента и направленное изменение его свойств методами белковой инженерии (rational design approach).
Целью настоящей работы было проведение систематических исследований по разработке высокоэффективной системы экспрессии оксидазы D-аминокислот из дрожжей Т. variabilis в клетках Е. coli, изучение свойств рекомбинантного фермента дикого типа, получение новых мутантных форм фермента с заданными свойствами и определение трехмерной структуры TvDAAO.
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
У. выводы
1. Проведена оптимизация экспрессии гена оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis в клетках Е. coli. Изучено влияние различных параметров (штамм-хозяин, среда для культивирования, температура культивирования, содержание добавок, тип и концентрация индуктора, время индукции, условия
1 аэрации, общая продолжительность культивирования) на выход фермента. В i результате оптимизации условий процесса выход активного фермента был повышен с 1500 до 35000 единиц с литра среды, что превышает известные мировые аналоги в 1,5 раза.
2. Получены три мутантные формы фермента TvDAAO C108F, С108А, C108S. Исследование кинетических свойств показало, что введение замены в положение 108 приводит к значительному изменению профиля субстратной специфичности TvDAAO. Замены Cysl08Phe и Cysl08Ala обеспечивают значительное увеличение каталитической эффективности фермента по отношению к D-аминокислотам с
I большим гидрофобным радикалом в боковой цепи. Все три мутантные формы не реагируют с D-Ala. Кроме того, мутанты TvDAAO C108F и С108А обладают в 3 и 4,4 раза более высокой каталитической эффективностью в реакции окисления цефалоспорина С, чем фермент дикого типа. Получение мутантных форм фермента с различными спектрами субстратной специфичности позволяет осуществить индивидуальный подбор биокатализаторов в зависимости от поставленной задачи.
3. Изучен механизм термоинактивации рекомбинантной оксидазы D-аминокислот. Для фермента дикого типа показано, что в диапазоне концентраций 8-33 мкг/мл и температур 50-60 °С реализуется диссоциативный механизм термоинактивации, при
I более высоких и низких температурах инактивация протекает в соответствии с мономолекулярным механизмом. При концентрации фермента выше 33 мкг/мл диссоциативной термопнактивации предшествует стадия обратимой диссоциации тетрамерных форм TvDAAO на димерные. В случае мутантных ферментов наблюдается сдвиг температурного диапазона, в котором реализуется механизм диссоциативной термоинактивации. Введение аминокислотной замены Cysl08Phe приводит к повышению температурной стабильности фермента в 2,2 раза и компактизации белковой глобулы.
4. Получены кристаллы мутантной TvDAAO C108F и определена ее трехмерная структура методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 1,8 А. Данная структура является первой для оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis. Анализ полученной структуры свидетельствует, что общая конформация полипептидной цепи в субъединице TvDAAO C108F близка к таковой в субъединице оксидазы D-аминокислот из дрожжей Rhodotomla gracilis, однако в димерах наблюдается различная взаимная ориентация субъединиц. Наиболее существенными отличиями в структурах субъеднниц TvDAAO C108F и RgDAAO является больший объем полости активного центра и отсутствие петель, отвечающих в структуре фермента из R. gracilis за образование димера.
5. Разработана методика высокочувствительного определения DAAO в различных типах образцов, в том числе в сложных биологических жидкостях. Чувствительность детекции составляет 0,13 нг фермента в пробе. Методика также применима для определения оксидазы D-аминокислот в колониях целых клеток, что позволяет проводить простой и эффективный скрининг библиотек мутантпьтх клонов по активности с требуемым субстратом.
1. Ghisla, S., Massey, V. (1989) Mechanisms of flavoprotein-catalyzed reactions. Eur. J. Biochem., v.181, p. 1-17.
2. Pilone, M.S. (2000) D-Amino acid oxidase: new findings. Cell Mol. Life Sci., v.51, p.1732-1747.
3. Krebs, H.A. (1935) Metabolism of amino acids: Deamination of amino acids. Biochem. J., v.29, p.l620-1644.
4. Conlon, H.D., Baqai, J., Baker, K., Shen, Y.Q., Wong, B.L., Noiles, R., Rausch, C.W. (1995) Two-step immobilized enzyme conversion of cephalosporin С to 7-aminocephalosporanic acid. Biotechnol. Bioeng., v.46, p.510-513.
5. Курочкина В.Б., Ныс П.С. (2002) Новые беталактамные структуры. Проблемы конструирования. Антибиотики и химиотерапия, т.47, с.29-37.
6. Brodelius, P., Nilsson, К., Mosbach, К. (1981) Production of a-keto acids. Part I. Immobilized cells of Trigonopsis variabilis containing D-amino acid oxidase. Appl. Biochem. Biotechnol., v.6, p.293-308.
7. Beard, T.M., Turner, N.J. (2002) Deracemisation and stereoinversion of alpha-amino acids using D-amino acid oxidase and hydride reducing agents. Chem. Commun.•Camb.), v.2, p.246-247.
8. Dominguez, R., Serra, В., Reviejo, A J., Pingarron, J.M. (2001) Chiral analysis of amino acids using electrochemical composite bienzyme biosensors. Anal. Biochem., v.298, p.275-282.
9. Тишков В.И., Савин С.С., Хороненкова С.В. (2008) Получение биокатализаторов с заданными свойствами. Изв. Акад. Наук. Сер. Химическая, т.57, с.1014-1022.
10. Meister, A. in Biochemisry of the aminoacids (2nd edn.). N. Y.: Academic Press, 1965, v.l, p. 297-304.
11. Pistorius, E.K., Voss, H. (1977) A D-amino acid oxidase from Chlorella vulgaris. Biochim. Biophys. Acta, v.481, p.395-406.
12. Sikora, L., Marzluf, G.A. (1982) Regulation of L-amino acid oxidase and of D-amino acid oxidase in Neurospora crassa. Mol. Gen. Genet., v.186, p.33-39.
13. Benz, F., Liersch, M., Nuesch, J., Treichler, H.J. (1971) Methionine metabolism and cephalosporin C synthesis in Cephalosporium acremonium. D-amino acid oxidase. Eur. J. Biochem., v.20, p.81-88.
14. Isogai, T., Ono, H., Ishitani, Y., Kojo, H., Ueda, Y., Kohsaka, M. (1990) Structure and expression of cDNA for D-amino acid oxidase active against cephalosporin C from Fusarium solani. J. Biochem. (Tokyo), v. 108, p. 1063-1069.
15. Kubicek-Pranz, E.M., Rohr, M. (1985) D-amino acid oxidase from the yeast Trigonopsis variabilis. J. Appl. Biochem., v.7, p.104-113.
16. Yoshizawa, M., Ueda, M., Mozaffar, S., Tanaka, A. (1986) Some properties of peroxisome-associated D-amino acid oxidase from Candida tropicalis. Agric. Biol. Chem., v.50, p.2637-2638.
17. Simonetta, M.P., Vanoni, M.A., Curti, B. (1982) D-Amino acid oxidase activity in the yeast Rhodotorula gracilis. FEMSMicrobiol. Lett., v. 15, p.27-31.
18. Yurimoto, H., Hasegawa, T., Sakai, Y., Kato, N. (2001) Characterization and high-level production of D-amino acid oxidase in Candida boidinii. Biosci. Biotechnol. Biochem., v.65, p.627-633.
19. Hils, M., Munch, P., Altenbuchner, J., Syldatk, C., Mattes, R. (2001) Cloning and characterization of genes from Agrobacteriinn sp. IP 1-671 involved in hydantoin degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol., v.51, p.680-688.
20. LaRue, T.A., Spencer, J.F. (1967) The utilization of D-amino acids by yeasts. Can. J. Microbiol., v.13, p.777-788.
21. Pollegioni, L., Piubelli, L., Sacchi, S., Pilone, M.S., Molla, G. (2007) Physiological functions of D-amino acid oxidases: from yeast to humans. Cell Mol. Life Scl, v.64, p.1373-1394.
22. Momoi, K., Fukui, K., Watanabe, F., Miyake, Y. (1988) Molecular cloning and sequence analysis of cDNA encoding human kidney D- amino acid oxidase. FEES Lett., v.238, p.180-184.
23. D'Aniello, A., D'Onofrio, G., Pischetola, M., D'Aniello, G., Vetcre, A., Petrucelli, L., Fisher, G.H. (1993) Biological role of D-amino acid oxidase and D-aspartate oxidase.
24. Effects of D-amino acids. J. Biol. Chem., v.268, p.26941-26949.
25. Maekawa, M., Watanabe, M., Yamaguchi, S., Konno, R., Hon, Y. (2005) Spatial learning and long-term potentiation of mutant mice lacking D-amino-acid oxidase. Neurosci. Res., v.53, p.34-38.
26. Hasegawa, H., Matsukawa, T., Shinohara, Y., Konno, R., Hashimoto, T. (2004) Role of renal D-amino-acid oxidase in pharmacokinetics of D-leucine. Am. J. Physiol Endocrinol. Metab, v.287, p. 160-165.
27. Owen, M.J., Craddock, N., O'Donovan, M.C. (2005) Schizophrenia: genes at last? Trends Genet., v.21, p.518-525.i1 37. Korostishevsky, M., Kaganovich, M., Cholostoy, A., Ashkenazi, M., Ratner, Y.,
28. Dahary, D., Bernstein, J., Bening-Abu-Shach, U., Ben-Asher, E., Lancet, D., Ritsner,
29. M., Navon, R. (2004) Is the G72/G30 locus associated with schizophrenia? Single nucleotide polymorphisms, haplotypes, and gene expression analysis. Biol. Psychiatry, v.56, p.169-176.
30. Schell, M.J., Molliver, M.E., Snyder, S.H. (1995) D-serine, an endogenous synaptic modulator: localization to astrocytes and glutamate-stimulated release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, v.92, p.3948-3952.
31. Nishikawa, T. (2005) Metabolism and functional roles of endogenous D-serine in mammalian brains. Biol. Pharm. Bull., v.28, p.1561-1565.
32. Harrison, P.J., Owen, M.J. (2003) Genes for schizophrenia? Recent findings and their pathophysiological implications. Lancet, v.361, p.417-419.
33. Corvin, A., Donohoe, G., McGhee, K., Murphy, K., Kenny, N., Schwaiger, S., Nangle,
34. J J.M., Morris, D., Gill, M. (2007) D-amino acid oxidase (DAO) genotype and moodsymptomatology in schizophrenia. Neurosci. Lett., v.426, p.97-100.
35. MacDonald, A.W., Chafee, M.V. (2006) Translational and developmental perspective on N-methyl-D-aspartate synaptic deficits in schizophrenia. Dev. PsychopathoL, v.l 8, p.853-876.
36. Collingridge, G. (1987) Synaptic plasticity. The role of NMDA receptors in learning and memory. Nature, v.330, p.604-605.
37. Meldrum, B.S., Akbar, M.T., Chapman, A.G. (1999) Glutamate receptors andtransporters in genetic and acquired models of epilepsy. Epilepsy Res., v.36, p.189-204.
38. Chung, S., Jung, J., Chung, H.Y., Yoo, H.K., Kim, C.Y., Joo, Y.H., Choi, S.E., Hong, J.P. (2007) No association between polymorphisms of DAO and DAOA genes and homicidal behaviors in Korean schizophrenia. Psychiatr. Genet., v.17, p.313.
39. Furuchi, T. Homma, H. (2005) Free D-aspartate in mammals. Biol. Pharm. Bull., v.28,1.p.1566-1570.
40. D'Aniello, G., Tolino, A., D'Aniello, A., Errico, F., Fisher, G.H., Di Fiore, M.M. (2000) The role of D-aspartic acid and N-methyl-D-aspartic acid in the regulation of prolactin release. Endocrinology, v.141, p.3862-3870.
41. D'Aniello, A., Di, C.A., Di, C.C., Annunziato, L., Petrucelli, L., Fisher, G. (1996) Involvement of D-aspartic acid in the synthesis of testosterone in rat testes. Life Sci., v.59, p.97-104.
42. Helfrnan, P.M. Bada, J.L. (1975) Aspartic acid racemization in tooth enamel from living humans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, v.12, p.2891-2894.
43. Man, E.H., Sandhouse, M.E., Burg, J., Fisher, G.H. (1983) Accumulation of D-aspartic acid with age in the human brain. Science, v.220, p.1407-1408.
44. Fisher, G., Lopez, S., Peterson, K., Goff, T., Philip, I., Gaviria, R., Lorenzo, N., Tsesarskaia, M. (2007) Is there a correlation between age and D-aspartic acid in human knee cartilage? Amino. Acids, v.32, p.27-30.
45. Man, E.H., Fisher, G.H., Payan, I.L., Cadilla-Perezrios, R., Garcia, N.M., Chemburkar, R., Arends, G., Frey, W.H. (1987) D-Aspartate in human brain. J. Neurochem., v.48, p.510-515.
46. Wang, Y.X., Zhou, Т., Pang, C.C. (1991) Pressor effects of L- and D-enantiomers of № -nitro-arginine in conscious rats are antagonized by L- but not D-arginine. Eur. J. Pharmacol., v.200, p.77-81.
47. Wang, Y.X., Poon, C.I., Pang, C.C. (1993) In vitro and ex vivo inhibitory effects of Land D-enantiomers of NG-nitro-arginine on endothelium-dependent relaxation of rat aorta. J. Pharmacol. Exp. Ther., v.265, p.112-119.
48. Xin, Y.F., Zhou, X.J., Cheng, X., Wang, Y.X. (2005) Renal D-amino acid oxidase mediates chiral inversion ofN(G)-nitro-D-arginine. J. Pharmacol. Exp. Ther., v.312, p.1090-1096.
49. Abe, H., Yoshikawa, N., Sarower, M.G., Okada, S. (2005) Physiological function and metabolism of free D-alanine in aquatic animals. Biol. Pharm. Bull., v.28, p.1571-1577.
50. Fisher, G.H., D'Aniello, A., Vetere, A., Padula, L., Cusano, G.P., Man, E.H. (1991) Free D-aspartate and D-alanine in normal and Alzheimer brain. Brain Res. Bull., v.26, p.983-985.
51. Fisher, G., Lorenzo, N., Abe, H., Fujita, E., Frey, W.H., Emory, C., Di Fiore, M.M., D'Aniello, A. (1998) Free D- and L-amino acids in ventricular cerebrospinal fluid from Alzheimer and normal subjects. Amino. Acids, v. 15, p.263-269.
52. Hamase, K., Konno, R., Morikawa, A., Zaitsu, K. (2005) Sensitive determination of D-amino acids in mammals and the effect of D-amino-acid oxidase activity on their amounts. Biol. Pharm. Bull., v.28, p.1578-1584.
53. Hamase, K., Takagi, S., Morikawa, A., Konno, R., Niwa, A., Zaitsu, K. (2006) Presence and origin of large amounts of D-proline in the urine of mutant mice lacking D-amino acid oxidase activity. Anal. Bioanal. Chem., v.386, p.705-711.
54. Rossman, M.G., Liljas, A., Branden, C.-I., Banaszak, L.J. in The Enzymes (Boyer, P.D., edr., 3rd edn.), N. Y.: Academic Press, 1975, v.l 1, p.61-102.
55. Subramani, S. (1993) Protein import into peroxisomes and biogenesis of the organelle. Annual Rev. Cell Biol, v.9, p.445-478.
56. Mizutani, H., Miyahara, I., Hirotsu, K., Nishina, Y., Shiga, K., Setoyama, C., Miura, R.1996) Three-dimensional structure of porcine kidney D-amino acid oxidase at 3.0 A resolution. J. Biochem. (Tokyo), v. 120, p. 14-17.
57. Miura, R., Setoyama, C., Nishina, Y., Shiga, K., Mizutani, H., Miyahara, I., Hirotsu, K.1997) Structural and mechanistic studies on D-amino acid oxidase x substratecomplex: implications of the crystal structure of enzyme x substrate analog complex. J.
58. Biochem. (Ток)ю), v.122, p.825-833.i 77. Todone, F., Vanoni, M.A., Mozzarelli, A., Bolognesi, M., Coda, A., Curti, В., Mattevi, A. (1997) Active site plasticity in D-amino acid oxidase: a crystallographic analysis. Biochemistry, v.36, p.5853-5860.
59. Pollegioni, L., Diederichs, 1С., Molla, G., Umhau, S., Welte, W., Ghisla, S., Pilone, M.S. (2002) Yeast D-amino acid oxidase: structural basis of its catalytic properties. J. Mol. Biol., v.324, p.535-546.
60. Kawazoe, Т., Tsuge, H., Imagawa, Т., Aki, K., Kuramitsu, S., Fukui, K. (2007) Structural basis of D-DOPA oxidation by D-amino acid oxidase: alternative pathway for dopamine biosynthesis. Biochem. Biophys. Res. Cornmun., v.355, p.385-391.
