Рентгеноструктурное исследование каталазы penicillium vitale тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ



АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ КРИСТАЛЛОГРАФИИ им. А.В.ШУБНИКОВА

На правах рукописи

д/ тоъ

jUo^cv YS.oe.iSr.

МЕЛИК - АДАМЯН ВИЛЬЯМ РАФАИЛОВИЧ

УДК 548.737

РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КАТАЛАЗЫ PENICILLIUM VITALE

Специальность 01,04.18 - Кристаллография и

физика кристаллов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Москва 1989

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте кристаллографии им. А.В.Шубникова АН СССР.

Официальные оппоненты:

Доктор физико-математических наук, профессор О.Б.Птицын Доктор биологических наук, чл.-кЬрр. АН СССР Н.А.Киселев Доктор химических наук, профессор М.Я.Карпейский

Ведущая организация:Институт молекулярной генетики АН СССР

Защита диссертации состоится "..." ........... 1989 г.

в ... часов ... минут на заседании Специализированного совета Д 002.58.01 при Институте кристаллографии АН СССР по адресу: 117333 Москва, Ленинский проспект, 59.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии АН СССР

Автореферат разослан "..." ...........■ 1989 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат физико-математических наук

В.И.Каневский.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы исследования.

Рентгеновская кристаллография белков в настоящее время :рактически единственный метод, позволяющий определять :ространственную структуру биологических макромолекул с атомным 1аэрешением. [1,2]. Давая точные сведения о том, как построены галекулы белков, рентгеновская кристаллография создает структурную iCHOBy для изучения стереохимических механизмов каталитического ;ействия ферментов, способствует пониманию общих принципов троения и самосборки белковых молекул и служит основой изучения :х физических свойств. Изучая пространственную структуру |ункционально родственных ферментов, выделенных из разных видов >рганизмов, рентгеновская кристаллография дает сведения об волюционных изменениях в структуре белковых молекул.

Являясь одним из разделов кристаллографии, рентгеновская ристаллография белков в то же время является важной частью юлекулярной биологии, и ее роль в этой науке возрастает по мере ого, как все более сложные биологические молекулы становятся 'бъектами изучения. Поэтому актуальность исследования

ространственной структуры сложных биологических макромолекул вязана, как с расширением знаний о строении конкретных белков, ак и с совершенствованием методов исследования их ространственной структуры.

Цель работы состояла в определении пространственной труктуры фермента каталазы методами рентгеновской

ристаллографии. Для достижения этой цели необходимо было решить ледующие задачи: найти условия получения кристаллов белка и его зоморфных производных с тяжелоатомными добавками, измерить нтенсивности рентгеновских дифракционных отражений от этих ристаллов, определить фазы структурных факторов белковых ристаллов, расчитать распределение электронной плотности в них и а основе интерпретации карт электронной плотности построить томную модель молекулы фермента.

Научная новизна работы. '4

Впервые определена с высоким разрешением пространственная труктура одного из представителей широко распространенного класса ерментов, каталазы микрогриба Pénicillium vitale, исследованы оменная организация и уникальная четвертичная «~трукту.?а этого

фермента.

Научно-практическая значимость работы.

Исследование пространственной структуры каталазы р vitale расширяет представления о строении сложных многосубъединичных белков. Построенная атомная модель молекулы может служить основой для стереохимического изучения механизмов ферментативного разложения перекиси водорода в живых клетках. Полученные сведения о структуре каталазы P.vitale вместе с данными о строении других каталаэ позволяют судить об изменениях этого фермента в процессе эволюции.

Структурные результаты и методические приемы, использованные в процессе исследования каталазы p.vita le, могут найти применение в исследованиях, проводимых в Институте молекулярной биологии АН СССР, Институте белка АН СССР, Институте молекулярной генетики АН СССР, Институте биоорганической химии АН СССР, Институте биохимии АН УССР и Институте молекулярной биологии АН УССР, а также могут быть использованы в курсах лекций о строении биологических макромолекул и методах их исследования в университетах и вузах.

Координаты атомов остова полипептидной цепи каталазы P.vitale помещены в Международный банк "белковых данных.

Апробация работы.

Результаты исследований, изложенные в диссертации, докладывались и обсуждались на следующих конференциях:

Пятая Европейская кристаллографическая конференция.

(Копенгаген, Дания, 1979 г.).

Шестая Европейская кристаллографическая конференция. (Барселона, Испания, 1980 г.).

Третий СССР-ФРГ симпозиум по химии пептидов и белков. (Махачкала, 1980 г.).

Пятый Всесоюзный симпозиум по химии и физике белков и пептидов. (Баку, 1980 г.).

12-ый Международный конгресс по кристаллографии. (Оттава, Канада, 1981 ,г. ) .

Третий Всесоюзный симпозиум "Структура биологических макромолекул". (Звенигород, 1981 г.).

Третье Всесоюзное совещание по органической кристаллохимии. (Горький, 1981 г.).

Первый Всесоюзный биофизический съезд. (Москва, 1982 г.).

Четвертый Всесоюзный симпозиум "Физико-химические основы ферментативного Катализа и его регуляция".(Москва, 1982 г.).

Четвертый Всесоюзный симпозиум "Структура биологических [акромолекул". (Звенигород, 1984 г.).

13-ый Международный конгресс по кристаллографии. (Гамбург, >РГ, 1984 г. ) .

Международный симпозиум "Перспективы биоорганйческой химии и юлекулярной биологии". (Алма-ата, 1984 г.).

16-я Конференция Федерации европейских биохимических обществ. Москва, 1984 г.).

Международный симпозиум по структуре и взаимодействию иомолекул. (Бангалор, Индия, 1984 г.).

Международная школа-симпозиум по структуре биологических [акромолекул. (Пущино, 1986 г.). .

626-ой Съезд Биохимичеркого общества Англии. (Шеффилд, нглия, 1988 г.).

Отдельные этапы исследования пространственной структуры аталазы Р.«1Ла1е дважды были отмечены медалями ВДНХ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения, сновных выводов, списка цитируемой литературы -и приложения, иссертация содержит 267 страниц, включающих 31 таблицу и 50 исунков. Список цитируемой литературы содержит 220 наименований.

Публикации.

По теме диссертации опубликованы 23 печатные работы, список оторых приведен в конце автореферата.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Во введении приводятся краткие сведения из истории ентгеновской кристаллографии белков, рассматриваются научные адачи, решение которых требует точных "структурных сведений о троении белков, и дается краткая аннотация результатов, олученных в работе.

Первые три главы диссертации носят обзорный характер.

В главе 1 рассматриваются факторы, определяющие прогресс в ентгеновской кристаллографии белков' за последние годця. Разделы той главы посвящены развитию'Методов выделения и очистки белков, овершенствованию методов кристаллизации белков, развитию техники эмерения интенсивностей рентгеновских диффракционных отважений от елковых кристаллов, использованию синхротронного ислучения, азвигию методики определения и уточнения пространственной

структуры белков, использовании ЭВМ и компьютерной графики.

В главе 2 приводятся сведения о пространственных структурах наиболее сложных белков, изученных в настоящее время, и методических приемах , использованных при их исследовании. Список этих белков с краткой характеристикой полученных результатов приведен в таблице 1. Там же для сравнения помещены сведения об .исследованной нами пространственной структуре каталазы P.vitale.

Таблица 1. Наиболее сложные белки, пространственная структура которых исследована методами рентгеновской кристаллографии.

Название белка МОЛ. Масса кДа Парам. ЭЛ.яч. А Мол. масса незав. части Разрешение Д число незав. отр. R-фактор Литература

Гликоген-фосфори-лаза Ь 180 (2x90) psv а = Ь=129 с= 11 Г 90 2,0 52000 0,21 [3]

Фотореакционный центр 125 (24+28+ +35+38) Р4 2 2 а=Ь=22Э с= 11 3 125 2,8 46000 0,36 [4]

Гемоциа-нин 450 (6x75) Р\ а = 120 Ь* 193 с=122 450 3,2 63000 [5]

Рубиско табака 550 8(53+15) 1422 а-119 Ь = 138 68 3,2 9700 0,33 [6]

Рубиско бактерий 110 (2x55) а*бЬ Ь = 71 с= 1 04 110 2.9 20500 0,38 [7]

Каталаза бычьей печени 240 (4x60) РЗ 21 а=Ь=142 с = 1 04 120 2,5 33250 0,19 С 81

Каталаза Р.vita le 300 (4x75) РЭ 21 a = 144 с = 1 34 150 2,0 68600 0,31

Глава 3 посвящена обзору биохимических и физико-химических аойств фермента каталазы.

В этой главе приводятся сведения об истории исследования 1талазы, локализации и физиологической роли этого фермента в петках, его физико-химических свойствах и ферментативной ктивности, рассматриваются результаты исследования структуры лталаэы методами электронной микроскопии и рентгеновского алоуглового рассеяния, приводятся результаты рентгеновских следований различных кристаллов каталазы. В последнем разделе павы приводятся сведения о каталазе p. vitale.

Каталаза ( н2 о2 : 02-оксидоредуктаза, К.Ф. 1.11.1.6) зрмент, осуществляющий разложение перекиси водорода на воду и элекулярный кислород в клетках почти всех живых организмов, лделены и более или менее изучены каталазы иэ клеток пекопитающих, растений, грибов и бактерий. Исследованию «иологических, биохимических, физико-химических и химических аойств каталазы посвящено большое количество работ t 9].

Согласно существующим представлениям, основная

«иологическая роль каталазы - защита живой клетки и ее змпонентов от повреждающего действия перекиси водорода, оделяющейся в процессе различных биохимических реакций.

Почти все изученные каталазы представляют собой тетрамерные глки с молекулярной массой 250-300 килодальтон, а субъединица грмента состоит из одной полипептидной цепи и содержит »могруппу.

Лучше других каталаз изучена каталаза бычьей печени, для нее одическими методами определена последовательность всех 506 «инокислотных остатков в полипептидной цепи.-

Каталаза относится к наиболее быстро действующим ферментам, 'акция, катализ которой осуществляет этот фермент, может быть тисана как разложение двух молекул перекиси водорода с фазованием двух молекул воды и молекулы кислорода:

к

гн2о2 —2Н2о ♦ 02-i (1)

константой скорости реакции kf ' = з к 107"м"'с"

Первые исследования пространственной структуры каталазы были сделаны в электронном микроскопе и позволили определить форму, размеры и симметрию молекулы [10,11]. На основании электронно-микроскопического исследования трубчатых и трехмерных кристаллов каталазы с использованием методов оптической дифракции и синтеза проектирующих функций была предложена модель молекулы каталазы млекопитающих, которая имела симметрию 222 и состояла из 4-х субъединиц, расположенных в вершинах тетраэдра, так что общие размеры молекулы были 70 х 95 х 90 Â. Аналогичные результаты были получены методом рентгеновского малоуглового рассеяния [12].

Объединив данные электронно-микроскопического и

рентгенографического исследования кристаллов каталазы, удалось построить модель молекулы фермента с разрешением 2 5 Д. [131.

Рентгеновские исследования кристаллов каталазы долго.е время не шли дальше определения параметров элементарных ячеек, симметрии и размеров молекулы фермента из-за трудностей, связанных с большими размерами элементарных ячеек этих кристаллов, содержащих в независимой части целую молекулу белка.

Более подходящие для . рентгеноструктурного исследования кристаллы хаталазы бычьей печени были получены Эвентофом, Тонакой и Россманом в 1976 году [14]. Кристаллы имели пространственную группу симметрии РЭ221, элементарную ячейку с параметрами а = 14 2,3 Â, с = 1 о4,о Â и содержали в независимой части элементарной ячейки 1/2 молекулы. Именно эти кристаллы дали возможность впоследствии провести детальное исследование пространственной структуры каталазы бычьей печени с разрешением 2,5 Д [15, 8].

Не менее . подходящими для рентгеноструктурных исследований, чем кристаллы каталазы бычьей печени, оказались полученные нами кристаллы каталазы микрогриба Pénicillium vitale.

Методика выделения и очистки каталазы p.vitale была разработана в Институте биохимии АН УССР [16]. Там же были проведены исследования физико-химических свойств этой каталазы и было показано, что она отличается от каталаз млекопитающих большим молекулярным * весом, ' устойчивостью и спектроскопическими характеристиками [17,18]. '

Последовательность аминокислотных остатков в каталазе p.vitale не известна и в настоящее время исследуется химическими методами [19].

Глава 4. "Рентгеноструктурное исследование каталазы Pénicillium vitale", содержит изложение всех этапов исследования пространственной структуры этого фермента и включает в себя следующие разделы: получение кристаллов, пригодных для исследований, получение кристаллов изоморфных тяжелоатомных производных, дифрактометрические измерения интенсивностей рентгеновских отражений, определение параметров тяжелых атомов в кристаллах изоморфных производных, построение модели молекулы с разрешением 6А и определение симметрии молекулы, использование некристаллографической симметрии для уточнения распределения электронной плотности в молекуле, определение пространственного расположения полипептидной цепи и . построение модели молекулы с разрешением 3 А, получение дифракционных данных с разрешением 2 А, расчет структурных факторов и распределения электронной плотности с разрешением 2 А, уточнение атомной модели молекулы и анализ возможных ошибок.

Кристаллы каталазы P.vitale размером О,3-0,5 мм, пригодные для рентгеноструктурного анализа, были получены в ультрацентрифуге из растворов, содержащих 15-184 2-метил-2,4-пентандиол и 0,1 M натрий ацетатный буфер Рн 5.5. Кристаллы имели пространственную группу симметрии рз.) 21 и элементарную ячейку с размерами а=ь=144,4 А. с=133,а А, содержащую в независимой части 1/2 молекулы.

Исследование пространственной структуры каталазы P.vitale вначале проводили методом полиизоморфных замещений. Кристаллы изоморфных производных получали выдерживанием кристаллов белка в растворах тяжелоатомных соединений с концентрациями ю"3-ю"4 м в течение 1-2 недель. Список этих соединений приведен в таблице 2.

Интенсивности рентгеновских дифракционных отражений от кристаллов белка и кристаллов изоморфных производных, соответствующие разрешению з А, измеряли в четырехкружном дифрактометре "Syntex Р2( . Измерения проводили на монохроматизированном медном излучении ш-методом. Средняя скорость измерения была около 45 отражений в час, при этом 704 отражений имели интенсивности, в 3 раза превышающие ошибку статистики. При ослаблении интенсивностей ■ контрольных отражений на 15-17 \ измерения прекращали и криеЧ-алл заменяли . новым. 0!г одного кристалла удавалось измерить около 2000 отражений за 80 часов. измерения проводили так, чтобы набор отражений от каждого

кристалла соответствовал узлам обратной решетки внутри независимой части сферического слоя в обратном пространстве.

Приведение к единой шкале наборов интенсивностей, измеренных от различных кристаллов, осуществляли по специальному набору интенсивностей, который содержал отражения типа hoi, Okl, hkl и имел общие отражения со всеми наборами.

Полученный после приведения к общей шкале полный набор структурных амплитуд нативного белка использовали для шкалирования интенсивностей дифракционных отражений от кристаллов производных.

Координаты мест присоединения тяжелых атомов в кристаллах производных каталазы p.vitale вначале определяли по разностным синтезам Паттерсона. По харкеровским сечениям этих синтезов были определены координаты единственного в независимой части ячейки места присоединения тяжелого иона в ММА-производной и координаты наиболее сильного места присоединения иона ptci^. Это дало возможность в первом приближении определить фазы структурных факторов белкового кристалла, рассчитать разностные синтезы Фурье электронной плотности для всех производных и по ним найти все места присоединения тяжелых атомов.

Координаты мест присоединения тяжелых атомов, относительные коэффициенты их заполнения и коэффициенты приведения структурных амплитуд белка и производных к общей шкале были уточнены с использованием алгоритма Диккерсона [20]. После объединения фазовой информации от разных производных был рассчитан наилучший синтез Фурье электронной плотности [21]. Показатели уточнения параметров тяжелых атомов и определения фаз структурных факторов белка приведены, в таблице 2.

Все расчеты были сделаны с использованием программного комплекса "БЛАНК", созданного А.А.Вагиным [22].

Карты распределения электронной плотности, расчитанные с разрешением 6 А, позволили выделить в элементарной ячейке область, соответствующую одной молекуле. Анализ особенностей распределения электронной плотности в этой области и расположения мест присоединения тяжелых атомов выявил в молекуле каталазы, кроме оси симметрии второго порядка, совпадающей с кристаллографической, еще две некристаллографические оси симметрии второго порядка, с учетом которых из 39 мест присоединения тяжелых атомов в независимой части элементарной ячейки 28 мест образуют симметричные пары.

Таблица 2. Средние показатели уточнения параметров тяжелых атомов и определения фаз структурных факторов в кристаллах Каталазы P.vitale.

Соединения Разрешение Д Rc Rk Rs E/f ЧИСЛО тяжелых атомов число отражений

Нативные кристаллы 3,0 32392

сн ндососн Т ММА ) 6,0 0 ,13 0,09 0,77 0,95 1 4541

K2PtCl^ 6,0 0 ,12 0,11 0,63 0,63 7 4380

РЬ( СНЭ СОО )2 4,5 0 ,14 0, 11 '0,74 0, 99 8 9569

К PtCl„ 2 Б 4,5 0 11 0,07 0,64 0,70 8 9545

K2Pt(N02 3,5 0 ,12 0,08 0,63 0,68 8 20361

к2ио2 f5 3,0 0, 14 0,08 0,63 0,66 7 26703

В таблице использованы следующие обозначения:

Е||Fp|-|Fph|| Е||Fph|-|Dph|I Rc = - , Rk = -■-

E|Fp| E|Fph|

E||Fph|-|Dph|l

Rs

E||Fph|-|Fp||

где суммирование проводится по всем отражениям, |рр| и (Ррь | - экспериментально полученные структурные амплитуды кристаллов белка и тяжелоатомных производных, I ори! - теоретически рассчитанные структурные амплитуды кристаллов тяжелоатомных производных,

Е - среднеквадратичная ошибка незамкнутости векторного треугольника = ?р ♦ ?1п,

г - среднеквадратичный вклад в рассеяние тяжелых атомов.

После уточнения параметров тяжелых атомов и объединения фазовой информации-от всех тяжелоатомных производных среднее значение фактора достоверности определения фаз структурных факторов (н-лка т - 0,62.

По координатам симметрично расположенных мест присоединения тяжелых ионов методом наименьших квадратов были определены параметры некристаллографической симметрии, т.е. положение центра молекулы и направления осей симметрии молекулы, которые показаны на рис. 1.

Рис. 1. Расположение одной из молекул каталазы p.vitale в элементарной ячейке. р,q,г - молекулярные оси симметрии.

Таким образом было установлено, что в независимой части элементарной ячейки находятся 2 одинаковые части молекулы, а молекула каталазы P.vitale состоит из 4 одинаковых субъединиц и имеет симметрию 222. При этом координаты p,q,r в молекулярной системе координат, оси которой совпадают с осями симметрии молекулы, связаны с относительными координатами x.y.z в элементарной ячейке соотношением:

x □,0033 0,0069 -о. 0022 р 0 4 159

y -0,0033 0,0069 0 , 0022 q + 0 4 159

z « 0,0041 0 0 , 0 0 63 г 0

Существование некристаллографической оси симметрии в кристаллах каталазы p.vitale создало дополнительную возможность уточнения распределения электронной плотности, полученного методом полиизоморфных замещений.

Параметры некристаллографической симметрии и границы молекулы, уточненные по наилучшему совпадению значений электронной плотности в симметричных точках молекулы, были использованы в процедуре уточнения фаз структурных факторов белка.

Согласно этой процедуре, вначале рассчитывали распределение электронной плотности на основе фаз структурных факторов, определенных методом полиизоморфных замещений. Затем электронную плотность модифицировали так, что внутри молекулы значения плотности выбирали равными среднему из двух значений в точках, связанных некристаллографической симметрией, 1 причем вместо отрицательных значений брали значения, равные нулю, значения электронной плотности вне молекулы также приравнивали нулю. Из модифицированного распределения электронной плотности с помощью обратного преобразования Фурье рассчитывали модули й фазы структурных факторов белка. Рассчитанные модули структурных факторов приводили к шкале экспериментально измеренных структурных амплитуд, а рассчитанные фазы структурных факторов комбинировали с разами, подученными методом изоморфных замещений, с учетом расхождений рассчитанных и экспериментально измеренных амплитуд [23]. Новые значения фаз и весовых факторов, характеризующих достоверность фазового определения, использовали для расчета улучшенного распределения электронной плотности, после чего всю ■фоцедуру повторяли.

Было проведено 3 таких цикла уточнения фаз структурных факторов. Изменение средних значений фактора достоверности в 1роцессе уточнения фаз на основе некристаллографической симметрии гриведены на рис. 2.

m

10. ■

0,05

0/0

0,1 s

sine

Рис. 2. Зависимость среднего фактора достоверности определения фаз структурных факторов m от sinQ/л. Кривая т.

ISO

соответствует определению фаз методом полиизоморфных замещений, кривые ml и тэ соответствуют 1-му и 3-му циклу уточнения фаз на основе некристаллографической симметрии.

Уточнение фаз за счет некристаллографической симметрии значительно повысило информативность карт распределения электронной плотности и сделало возможным их интерпретацию. Карты распределения электронной плотности, рассчитанные с разрешением 3,0 А, дали возможность проследить остов полипептидной цепи и характерными изломами в местах расположения альфа-углеродных атомов и боковыми ответвлениями, соответствующими наиболее крупным аминокислотным остаткам, что позволило определить приблизительные координаты альфа-углеродных атомов в полипептидной цепи и оценить число аминокислотных остатков в субъединице.

Несколько сечений электронной плотности молекула, перпендикулярные оси г, приведены на рис. 3.

<3

Рис. 3. Сечения электронной плотности молекулы каталазы '.vitale, г=зо,э-зб,8 Д. ав - спиральный участок полипептидной ;епи.

Для однозначного определения мест расположения гемогрупп в юлекуле было предпринято исследование аномального рассеяния >ентгеновских лучей на кристаллах нативного белка, целью которого >ыло определение положения атомов железа. Разностный аномальный :интез Фурье с коэффициентами

( F { H ) - F ( H ) ) ,exp{i(ip-ir/2) }, (3)

:оторый был рассчитан с разрешением 8 А с учетом наиболее штенсивных отражений с индексами h.k.i и h", k", Т, показал, что в юлекуле каталазы p.vitale есть 4 места связывания гемогруппы, неположенные внутри субъединиц. Координаты атома железа в одной la субъединиц: р = -э.б A, q = 16,6 А. г = 15,3 А. Расстояние южду атомами железа в молекуле равны 31, 35. и 46 А.

Подтверждением правильности определения положения гемогрупп в молекуле и одновременно ответом на вопрос о том, с какой стороны от гема расположен активный центр молекулы фермента, стали результаты исследования кристаллов каталазы, ингибированной 3-амино-1,2,4-триазолом. Расчет разностного синтеза Фурье электронной плотности показал, что аминотриазол присоединяется к молекуле каталазы p.vitale на расстоянии 5 А от центра гемогруппы.

Координаты Са-атомов и некоторых ср-атомов объемных боковых цецей аминокислотных остатков, хорошо видимых на синтезе электронной плотности, послужили исходными данными для расчета первой полиаланиновой модели молекулы каталазы р.vitale, включавшей 653 аминокислотных остатка на субъединицу.

Более точная атомная модель молекулы, соответствующая разрешению з А, была получена с помощью графической компьютерной системы "Picture System 2" и комплекса программ froD'o [24] во время научной командировки автора в Биркбек колледж Лондонского университета.

Исходная модель молекулы каталазы была приведена к более удовлетворительному согласию с распределением электронной плотности, причем отклонение длин химических связей, валентных и торсионных углов от идеальных значений не превышало, соответственно, 0,1 А, 5° и 15°. Одновременно с построением модели по картам электронной плотности были идентифицированы и некоторые аминокислотные остатки с объемными боковыми цепями, так что атомная модель субъединицы была дополнена 218 боковыми группами аминокислотных остатков. На этом этапе в модель была также встроена' гемогруппа в виде протопорфирина-iх. Общее количество неводородных атомов в модели составило 4158 на одну субъединицу, т.е. 784 от общего числа неводородных атомов из расчета 8 атомов на остаток.

Построенная атомная модель молекулы довольно хорошо соответствовала распределению электронной плотности с разрешением з.о А и позволяла рассчитать теоретически фазы структурных факторов, соответствующих более высокому разрешению, которые вместе с экспериментально измеренными значениями структурных амплитуд дали возможность получить более детальные карты распределения электронной плотности.

Дифракционные данные от кристаллов каталазы Р.v:tale, :оответствующие более высокому разрешению, получали фотометодом в '.амере колебаний по методу Арндта-Вонакотта 125] .

Наиболее полный набор дифракционных данных, соответствующий >азрешению 2, о А, был получен от предоставленных нами кристаллов ia синхротроне в Гамбурге сотрудником Европейской юлекулярнобиологической лаборатории К.Бартелсом.

Рентгенограммы колебаний были получены при вращении ристалла вокруг оси "с" на 30° с интервалом колебаний 1°. Весь :абор содержал 62 рентгенограммы.

Статистические характеристики набора диффракционных данных риведены в таблице 3.

Таблица 3. Статистические характеристики экспериментальных

данных.

Параметры Кристалл 1 Кристалл 2

Число рентгенограмм 27 35

Тип отражений П П+Ч П П+Ч

Число измеренных отражений 61557 76699 69644 114062

Число независимых отражений Яз (%) 42746 8,7 51289 9,5 48238 6,6 67879 6,6

Число возможных независимых отражений 108779

!1исло отражений, измеренных а дифрактометре (ЗА) 32392

Rm (%) 6,8

¡исло независимых отражений з окончательном массиве (2А) 76729

таблице использованы следующие обозначения: П - полностью [регистрированные отражения, Ч - отражения, зарегистрированные по 1стям; R = 2 Г | I, - I / Г I I, 4 1г I : • f-4 - величина R для симметричных -ражений; Rm - величина R для отражений, измеренных в !фр«1КТОМС?Тре и фот'смотодом.

Теоретические значения структурных факторов, соответствующие разрешению 2 А, рассчитывали гю атомной модели каталазы P.vitale, построенной по картам электронной плотности с разрешением 3 Д. Расчеты были сделаны по программам А.Сильвы [ 8].

Кристаллографический R-фактор между экспериментально полученными и теоретически рассчитанными структурными амплитудами при разрешении 2 Д составил 50,14.

Дальнейшая корректировка и дополнение атомной модели основывались На анализе разностных синтезов Фурье, рассчитанных с коэффициентами

( 2 | f | - | f | ) . expl iip ) , И)

о с с

где |F^|ехр(1ФС) - теоретически рассчитанные структурные факторы, |f I - экспериментально измеренные амплитуды, соответствующие разрешению 2 Д.

Эта часть работы вместе с последующим уточнением атомной модели были выполнены в университете Пардью (Вест Лафайетт, США), с использованием вычислительных возможностей лаборатории профессора Россмана, любезно пригласившего автора для работы по сравнению пространственной структуры каталазы P.vitale с пространственной структурой каталазы бычьей печени.

Распределение разностной, электронной плотности, рассчитанное с разрешением г Д, было проанализировано на соответствие с атомной моделью с помощью компьютерной графической системы mmsx и комплекса программ frodo, что позволило более надежно определить конформацию полипептидной цепи и идентифицировать многие боковые •цепи аминокислотных остатков. Некоторую помощь при идентификации аминокислотных остатков в каталазе p.vitale оказало сопоставление с пространственной структурой каталазы бычьей печени, имеющей известную аминокислотную последовательность.

Атомная модель каталазы P.vitale; соответствующая распределению электронной плотности с разрешением 2 Д, была уточнена по программам Хендриксона и Концерта [26].

В процессе уточнения атомной модели каталазы было сделано 24 цикла с постепенным расширением поля дифракционных данных от 3,5 до 2,0 Д. После первых 11 циклов уточнения модель была подправлена на основе заново рассчитанного (2Fo-Fс)-синтеза. В ходе последних 3 циклов были уточнены индивидуальные температурные факторы, при

этом в уточнении участвовало 68000 структурных факторов и 20000 параметров атомной модели. Один цикл уточнения атомной модели каталазы на суперкомпьютере cyber-205 требовал около 1 часа процессорного времени.

Параметры уточнения, весовые множители и среднеквадратичные отклонения геометрических параметров модели от идеальных значений после последнего цикла уточнения приведены в таблице 4. Координаты атомов одной из субъединиц уточненной модели молекулы каталазы P.vitale помещены в приложении к диссертации.

Таблица 4. Параметры уточнения атомной модели каталазы Р.vitale.

Параметры

Число параметров

Среднее йг 68652

Расстояние между связанными атомами

1 - 2 5092

1 - 3 6931

1 - 4 1779

Плоскости 904

Хиральные объемы 793

Контакты между несвязанными атомами

1 - 4 1572

Другие контакты 1823

Углы и/ 709

Другие углы 779

17,28

0,03 0,04 0,05

0,02 0,15

0,5 0,5 5 15

41, 58

0,047 0,079 0,081

0,014 0,079

0,299 0,372 7,9 27, 5

Примечание ■.

о определяет вес параметра г, уточнении, равный 1 /а2. rms - среднеквадратичное отклонение от идеальных значений.

rms

а

Атомная модель молекулы каталазы, полученная после 24 циклов уточнения, содержала в одной субъединице 670 аминокислотных остатков и включала в себя 4999 атомов.

В диссертации приведена последовательность аминокислотных остатков в субъединице каталазы P.vitale, установленная по Картам распределения электронной плотности, которая с химической точки зрения не вполне однозначна, поскольку на картах электронной плотности с разрешением 2 Д нельзя отличить такие остатки как Asp и Asn, Glu и Gin, val и Thr. Довольно трудно также ОТЛИЧИТЬ Asp и Leu, Phe и His, Ala И Gly.

Сравнение аминокислотного состава каталазы p.vitale, найденного химическими методами [27], с аминокислотным составом, полученным из рентгеновских данных, показало, что количество аминокислотных остатков разного сорта, как правило, занижено на 10-154 за счет остатков аланина, и правильно идентифицированными можно считать около 504 боковых цепей аминокислотных остатков. В то же время, оценка неправильно расположенных атомов, добавленных или пропущенных, составляет около 124 от общего их числа, поэтому распределение электронной плотности, рассчитанное по этой модели, достаточно хорошо отражает пространственную структуру молекулы.

Глава 5 содержит описание пространственной структуры каталазы p.vitale. В этой главе обсуждаются вторичная, третичная и четвертичная структура фермента, доменное строение субъединицы, контакты между субъединицами, расположение гемогрупп и полостей в молекуле.

Молекула каталазы p.vitale состоит из 4-х идентичных субъединиц и имеет симметрию 222. Она представляет собой компактную глобулу с размерами 67 х 90 х 127 Ä (см.'рис. 4).

Пространственная структура одной субъединицы схематически изображена на рис. 5. Номера аминокислотных остатков и названия элементов вторичной структуры приведены в таблице 5.

Г

Рис. 4. Расположение полипептидных цепей в молекуле каталазы р.у^аХе. Пептидным группам соответствуют прямолинейные отрезки.

Г

Рис. 5. Схема пространственного расположения полипептидной цепи и элементов вторичной структуры в субъединице каталазы Р.и14а1е, цилиндрами обозначены а-спиральные участки, стрелками 0-участки.

Таблица 5. Домены и элементы вторичной структуры в субъединице каталазы р.изЛаге.

Сегменты Спирали Номера Число р-цепи Номера Число Пово-

цепи остатков остатков роты

м-концевой А1 40г53 14 16-19

сегмент 31-34

(1-55)

Гем- А2 144-153 10 В1 63-74 12 58-61

содержа- АЗ 167-178 12 В2 90 101 12 84-87

щий А4 180-190 11 ВЗ 113-122 10 104-107

домен А5 234-245 12 В4 125-133 9 122-125

(56-366) А6 247-260 14 В5 202-212 11 156-159

А7 312-320 9 В6 215-227 13 212-215

А8 341-353 13 В7 263-272 10 292-295

В8 299-308 10 336-339

359-362

1-ый соединительный 391-394

сегмент (367-430) 400-403

Спираль- А9 431-441 11

ный А10 442-460 19

домен А11 462-476 15

(431-500) А12 477-489 13

2-ой соединительный

сегмент (501-517)

В9 518-526 9 528-531

С-концевой А13 531-545 15 В10 548-554 7 545-548

домен А14 604-616 13 В11 574-578 5 569-572

(518-670) А15 625-631 7 В12 618-623 6 593-596

А16 648-660 13 В13 639-643 5 622-625

637-640

В субъединице каталазы p.vitale можно выделить несколько относительно крупных и обособленных фрагментов пространственной структуры. Это N-концевой сегмент, три компактных домена и два соединительных сегмента между доменами.

Начальный N-концевой сегмент далеко выступает из основной части субъединицы, содержит один а-спиральный участок и образует многочисленные контакты с соседними субъединицами.

Следом за N-копцеаым сегментом расположен гем-содержащий домен, характерной особенностью которого является наличие 8 антипараллельных р--участкоь цепи, образующих р-баррел. Кроме того, в состав домена входят еще 7 а--спиральных участков. Согласно классификации белковых структур, пространственную структуру этого домена можно отнести к (а + (З)-типу.

Второй домен намного меньше первого, он состоит из 4-х а-спиралей, которые расположены рядом со спиралями первого домена.

Третий, С-концевой домен, содержит слой из 5 параллельных р-участков, которые чередуются с 4 спиралями. Пространственная структура этого домена относится к а/р-типу и топологически подобна пространственной структуре небольшого белка флаводоксина.

В состав трех доменов входит около 80°i аминокислотных остатков полипептидной цепи. Остальные образуют N-концевой сегмент и два нерегулярных участка цепи , соединяющие домены между собой.

Первый соединительный сегмент связывает гем-содержащий домен со спиральным доменом. В начальной части он образует несколько петель, а в конце имеет преимущественно вытянутую конформацию и опоясывает молекулу по дуге с общей длиной около 50 Д. Этот соединительный сегмент играет важную роль во взаимодействии с соседними субъединицами.

Второй соединительный сегмент связывает спиральный домен с С-концевым доменом. Он почти целиком расположен на поверхности молекулы и имеет протяженность около 60 Д.

В сииралях субъединицы содержится 210 аминокислотных остатков, что составляет 31% от общего количества. Все спирали близки к классической а-спирали. Исключение составляет спираль Л7, конформация которой ближе к и спиральной конформации.

Участки полипептидной цепи, образующие р-структуру, содержат 110 аминокислотных остатков, т.е. 18°. всех остатков субъединицы.

Наиболее многочисленны межсубъединнчные контакты в N >'!-.i!i;.'iiOM сегменте попииептидной цепи, который пронипыи.м>т мч.н; i-'У1':.

вдоль оси я и весь окружен остатками соседних субъединиц. Соединительный сегмент, связывающий гем-содержащий домен со спиральным доменом, в своей начальной части также контактирует с аминокислотными остатками двух соседних субъединиц. Особенно примечательно то, что сквозь петлю, образованную аминокислотными остатками 367-405 этого соединительного сегмента, проходят первые 13 остатков ы-концевого сегмента соседней субъединицы. Схема расположения и взаимного зацепления соседних субъединиц приведена на рис. б.

Рис. 6. Схема взаимного зацепления субъединиц в молекуле каталазы P. vitale.

Гемогруппы в каталазе р.vitale расположены глубоко внутри молекулы на расстоянии 17 А от ближайших участков поверхности и па расстоянии 23 А от центра молекулы.

В субъединице гем размещается в полости, которая находится вблизи внутреннего слоя [3-блррела ( р цепи В1 - в А) по соседству со спиралями А2 и А8. Вход в полость закрывают аминокислотные остатки спирали А1 соседней субъединици, связанной с первой молекулярной осью симметрии г.

Ближайшие к гему аминокислотные остатки, находящиеся в активном центре фермента, были идентифицированы по картам электронной плотности как остатки Val-БО, His-61- Asp-132, Phe-138, Phe-145. С другой стороны от гема, ближайшими к атому железа являются аминокислотные остатки Туг-Э45 и Arg-341.

Доступ к активному центру каталазы Р.vitale для молекул субстрата облегчается наличием в молекуле фермента полостей и каналов, которые были обнаружены специальными расчетами функции заполнения пространства внутри молекулы.

Глава 6 посвящена сравнению пространственной структуры каталазы P.vitale с пространственной структурой каталазы бычьей печени. Разделы этой главы содержат сравнение расположения молекул двух каталаз в кристаллах, анализ сходства и различия в структуре субъединиц, анализ расположения делеций и вставок в полипептидной цепи, сравнение межсубъединичных контактов в молекулах. В последнем разделе главы сравниваются пространственные структуры С-концевого домена каталазы p.vitale и флаводоксина.

Сравнение пространственной структуры каталазы P.vitale с пространственной структурой каталазы бычьей печени, которая была установлена в лаборатории профессора РоссмаНа в США [15, 8], показало, что на протяжении большей части полипептидной цепи субъединицы двух каталаз имеют очень похожую пространственную структуру.

Схематическое изображение пространственных структур субъединиц двух каталаз приведено на рис. 7.

Анализ пространственного сходства вначале был сделан по расположению элементов вторичной структуры, а затем с помощью автоматической процедуры совмещения гомологичных структур [28].

В результате в субъединицах двух каталаз было найдено 458 аминокислотных остатков, которые оказались пространственно эквивалентными, что составило . 914 всех аминокислотных остатков каталазы бычьей печени и 68S, остатков' каТалазы p. vitale. В таблице 6 приведены среднеквадратичные отклонения между парами эквивалентных атомов в различных участках молекулы.

[ti::. 7. Гхомотич<->с.то«-' í3¡,i)¡j,ur;i!i'. i:¡n, ■ rp.jiicTBHHHbix структур ДИНИЦ K.-lTcUI î.'bi Г. / i L.i It (.л Я Пычьой почони (б) .

Таблица 6. Сравнение положений эквивалентных атомов каталазы p.vitale и каталазы бычьей печени.

Части субъединицы Среднеквадратичные отклонения в А.

458 Са-атомов в субъединице 1 17

241 Са-атомов в гем-содержащем домене 1 12

87 Са-атомов в р-барреле 0 75

78 Са-атомов в спиралях А2-А8 0 80

. 54 Са-атомов в спиралях А9-А12 спирального домена 1 06

277 атомов остова цепи и стереохимически эквивалентных боковых цепей 29 остатков вблизи тема 1 14

Все атомы гемогруппы 0 66

Атомы гемогруппы без пиррольных заместителей 0 30

Наиболее значительным отличием двух структур является наличие в каталазе P.vitale на С-конце цепи 170 дополнительных аминокислотных остатков, которые образуют флаводоксиноподобный домен. Другое значительное отличие наблюдается на м-концевом участке полипептидной цепи. В каталазе бычьей печени этот участок длиннее на 12 остатков, расположен иначе, чем в каталазе P.vitale, и содержит дополнительную спираль.

Кроме этих отличий, в полипептидной цепи имеются вставки и делеции, большинство из которых находятся в участке, соединяющем первый и второй домены.

Сравнение определенной по рентгеновским данным

аминокислотной последовательности каталазы р.vi tal» с последовательностью аминокислотных остатков каталазы бычьей печени, определенной химическими методами, показало, что из 4r;f: эквивалентных пар аминокислотных остатков тождественными яиляы-п-я 178, т.е. 394

В обоих молекулах имеется необычное зацепление c:y(Vi "дикиц, 13 остатков катал.ты г. vital.» и 26 остатков каталазы бычьей ме'гепп г м конца одной суГп.единипы проходит 'i' pe:i петлю, образованную полипе.чтидной цепью другой СубГОДШПЩЫ . отличия I) МГ'ЖСуб'Ы'дипичных V чг.га:., i', двух к.пмя.г.шх vm:i.»ih.i «• различным |м<:иояиж«.'ИИ«>м м

сонцевых сегментов и наличием в каталазе p.vitale С-концевого цомена, который создает добавочные контакты между субъединицами, :вязанными осью г.

Сравнение пространственной структуры С-концевого домена саталазы P.vitale с пространственной структурой флаводоксина юказало, что из 153 аминокислотных остатков С-концевого домена и 138 остатков флаводоксина 99 пар остатков пространственно эквивалентны со среднеквадратичным расстоянием между Са-атомами равным 3,0 А. Структурная гомология в этом случае оказалась не такой близкой, как между гомологичными участками двух каталаз, но зполне сравнимой со структурной гомологией между нуклеотид-:вязывающими доменами дегидрогеназ.

Глава 7 содержит описание пространственной структуры иктивного центра каталазы P.vitale и обсуждение механизма ферментативного разложения перекиси водорода.

Активный центр каталазы P.vitale формируется остатками His-61, Ser-99, Asn-132, Phe-138, Phe-145, находящимися рядом с гемом. С противоположной стороны от гемогруппы лигандом гемового келеза является атом кислорода аминокислотного остатка Туг-345 (см. рис. 8).

his 6/

SER 99

1'ис. 0. Расположение аминокислотных остатков в актиьном центре каталазы p.vitale.

Такие же аминокислотные остатки находятся и в активном центре каталазы бычьей печени, но в каталазе p.vitale гемогруппа имеет более плоскую конфигурацию, и на картах электронной плотности видна молекула воды, находящаяся в 6-ом координационном положении по отношению к атому железа.

Координаты некоторых наиболее существенных атомов в активном центре каталазы P.vitale приведены в таблице 7. Там же приведены координаты двух молекул воды (wt, W2), найденные из распределения электронной плотности с разрешением 2,0 Л, и координаты центра присоединения ингибитора каталазы, аминотриазола (ат), определенные из анализа разностных синтезов электронной плотности с разрешением 6 А.

Таблица 7. Координаты атомов в активном центре одной из субъединиц каталазы P.vitale.

Группа Атом Координаты атомов в молекулярной системе координат (А) Р q г

Гем F Е - 3 ,44 1 Б .07 1 5 1 2

N А -3 . 00 1 5 , 4 5 13,01

NB -1 .05 1 7 . 35 1 4 , 39

NC 3 , К 7 18 .39 1 6 56

N0 - 4 , 92 1 5 . 9 1 1 5 . 94

HlS-61 CD -3 . 53 1 3 . 26 1 8 , 35

ME - 3 . 55 1 4 ,50 18,93

CE -4 . 36 1 4 .52 1 9 . 99

ND - 4 . 88 13 , 3 4 20 , 1 4

S f г - 9 9 OG - 7 . 2 8 1 1 .59 20 . 7 6

CB - 7 . 22 1 0 . 4 0 21 , 44

A s il - 1 3 2 ND - 4 . 7? 19 . 33 21 . 44

OD - 5 . 85 1 7 . 4 2 2 1 . 1 1

Т i Т 4 5 OH - 4 . Г. 7 1 7 . 70 1 3 . 76

CZ - 4 . 95 1 7 . 4 7 1 2 , 48

M 1 - 2 . 5 1 7 . 0 1 9 . 3

W? - 1 , 7 1 5 . В 1 6 . 9

AT -2 , 9 1 6 , G 20 . 2

D диссертации рассматривается гипотетический механизм ¡•••pMi-ит■ iTKim'iro л<"йс"1 ги>! ката лапы, предложенный И.Фитой и

М.Россманом на основе пространственной структуры каталазы бычьей печени с291. Показано, что он вполне применим и к каталазе p.vitale. Согласно этому механизму, первая молекула перекиси водорода окисляет фермент, отдавая атом кислорода железу тема и образуя молекулу воды, а вторая - восстанавливает фермент, отдавая протоны связанному с железом атому кислорода с образованием молекулы воды и молекулы кислорода. В обеих реакциях перенос протона осуществляется через гистидин, который взаимодействует с гемом.

Заключение диссертации посвящено обсуждению эволюционных изменений в пространственной структуре каталаз.

Известно, что пространственная структура белков более консервативна, чем их аминокислотная последовательность, поэтому сравнение пространственных структур функционально родственных белков из разных видов организмов позволяет более надежно, чем при сравнении их аминокислотных последовательностей, судить о наиболее важных компонентах структуры, сохраняющихся в процессе эволюции.

Каталаза микрогриба P.vitale и каталаза бычьей печени

з

выделены из организмов, разошедшихся в процессе эволюции около 10, лет назад. На основании сравнения их пространственных структур можно сделать вывод о том, что эволюционные изменения в структуре молекул каталаз происходили, в основном, на концах полипептидной цепи, а высокая степень подобия и большая протяженность пространственно гомологичных участков в центральных частях цепи делает очень вероятным предположение о том, что в двух каталазах сохранились наиболее существенные структурные черты белка-предшественника, существовавшего миллиард лет назад.

Более детальному изучению этих существенных структурных особенностей, которые, по-видимому, необходимы для формирования и функционирования фермента, могут способствовать исследования пространственной структуры каталаз, выделенных из других далеко отстоящих видов организмов. Особенно перспективными нам кажутся исследования пространственной структуры каталаз дрожжей и бактерий в сочетании с модификацией фермента методами генной инженерии.

Приложение к диссертации содержит список координат атомов п одной из субъединиц модели молекулы каталазы р.vítalo.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.

1. Найдены условия получения крупных кристаллов фермента каталазы P.vitale в двух кристаллических. формах. Для рентгеноструктурных исследований выбраны кристаллы, имеющие пространственную группу симметрии рз 2 1 и элементарную ячейку с размерами а = b = tu,4 Î, с = 133,8 А.

Получены 6 изоморфных тяжелоатомных' производных кристаллов каталазы P.vitale, содержащих ионы сн^ ндОСОСнз , рь(снзсоо)2,

Рt ( n0 J . PtCl . PtCl, . UO F .

2 ♦ 6 4 2 5

2. Дифрактометрически измерены интенсивности рентгеновских отражений от кристаллов белка и тяжелоатомных производных в области углов дифракции, соответствующих разрешению 3 А. Дифракционные данные от кристаллов нативного белка, соответствующие разрешению 2,0 Д, получены фотометодом в камере колебаний с использованием синхротронного излучения.

3. Рассчитано распределение электронной плотности в кристаллах каталазы P.vitale с разрешением 2,0 А. фазы структурных факторов кристаллов белка до разрешения 3 Д определены методом полиизоморфных замещений и уточнены на основе имеющейся в кристаллах некристаллографической симметрии. По картам распределения электронной плотности, рассчитанным с разрешением 3 А, прослежен пространственный ход полипептидной цепи и построена атомная модель молекулы, позволившая в первом приближении рассчитать фазы структурных факторов до разрешения 2 А. Окончательные значения фаз структурных факторов были рассчитаны после дополнения и уточнения атомной модели молекулы.

4. На основе анализа распределения электронной плотности с разрешением 2 Д построена атомная модель молекулы каталазы p.vitale, состоящая из 4-х идентичных субъединиц, в каждой из которых 5000 неводородных атомов. В модель включены 3350 атомов остова полипептидной цепи вместе с ср-атомами и 1650 атомов боковых ценой аминокислотных остатков, идентифицированных но картам распределения электронной плотности. Атомная модель уточнена методом наименьших квадратов с наложенными геометрическими ограничениями, окончательное зкачение кристаллографического R-фактора после 24 циклов уточнения равно 0,31.

*». Уотаичиленк, что молекула каталазы P. vitale имеет размори :■: г>0 х 1?7 А, '>.!|ал-с'Т симметрией 22? и состоит ип Л х

одинаковых субъединиц. Каждая субъединица представляет собой полипептидную цепь из 670 аминокислотных остатков и содержит гемогруппу. В состав полипептидной цепи входят 16 а-спиралей и 13 р-цепей, которые образуют три домена с характерной третичной структурой. Первый домен, включающий в себя гем, имеет структуру типа (а + 0), содержит 7 спиралей и р-баррел из 8 антипараллельных р-цепей. Второй домен состоит из 4-х спиралей. Третий домен имеет структуру типа а/р, содержит 4 спирали и р-слой из 5 параллельных р-цепей. Субъединицы каталазы сложным образом переплетены между собой, образуя уникальную четвертичную структуру молекулы, в которой 13 аминокислотных остатков с N-конца полипептидной цепи одной субъединицы проходят через петлю в средней части цепи соседней субъединицы.

6. Показано, что гемогруппы и расположенные рядом с ними активные центры каталазы P.vit a le находятся глубоко внутри молекулы, на расстоянии 17 Д от поверхности и 23 Д от центра молекулы. Расстояния между атомами железа гемогрупп соседних субъединиц равны 31, 34 и 45 Д.

7. Внутри молекулы каталазы p.vitale выявлены полости и каналы объемом от 60 до 300 А3 Один из каналов подходит близко к тему и соединяет полость активного центра с окружающим молекулу раствором, тем самым обеспечивая доступ молекул перекиси водорода и других субстратов к активному центру фермента.

8. Сделано сравнение пространственных структур каталазы p.vitale и каталазы бычьей печени, исследованной позднее в лаборатории профессора М.Россмана (США). Выявлено большое структурное сходство молекул этих ферментов, 68* аминокислотных остатков в полипептидной цепи каталазы p. vitale и 91'. остатков каталазы бычьей печени занимают пространственно эквивалентные положения. При оптимальном пространственном совмещении атомных моделей среднеквадратичное расстояние между 458 эквивалентными са-атомами равно 1,17 Д. Наибольшие различия в пространственных структурах двух каталаз связаны с наличием в молекуле каталазы p.vitale дополнительного С-концевого домена, состоящего иэ 153 аминокислотных остатков, и с различным расположением м-концевого фрагмента цепи, который в каталазе бычьей печени на 12 аминокислотных остатков длиннее и содержит дополнительную а-спираль.

9. Анализ распределения электронной плотноети в области активного центра каталазы P.vitale показал, что ближайшими к атому

железа гемогруппы с проксимальной стороны являются аминокислотные остатки аргинина и тирозина, кислород фенольной группы которого занимает 5-ое координационное положение атома железа, а с дистальной стороны - остаток гистидина, модификация которого аминотриазолом приводит к потере активности фермента. Те же аминокислотные остатки находятся и в активном центре каталазы бычьей печени, но в .кАталазе p.vitale гемогруппа имеет более плоскую конфигурацию, и на картах электронной плотности видна молекула воды,' находящаяся в 6-ом координационном положении по отношению к атому железа.

10. Показано, что гипотетический стереохимический механизм ферментативного действия, предложенный для каталазы бычьей печени, хорошо согласуется с полученной структурой активного центра каталазы P.vita le.

11. Большая протяженность и высокая степень пространственной гомологии в расположении полипептидной цепи в молекулах каталазы P.vitale и каталазы бычьей печени свидетельствуют о консерватизме большей части структуры этого фермента в процессе эволюции и делают очень вероятным предположение о том, что в каТалаза^ этих двух видов организмов, давно разошедшихся в процессе эволюции, сохранились структурные черты белка-предшественника, необходимые для образования и функционирования молекулы этого фермента.

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Мелик-Адамян В.Р., Барынин В.В., Гудкова Л.В., Мироненко Н.И., Дегтярь Р.Г. Предварительное кристаллографическое исследование и некоторые свойства каталазы гркба Pénicillium vitale // Кристаллография. 1978. T. 23. Вып. 5. С. 1052-1054.

2. Вайнвтейн Б.К., Ислик-Адамян В.Р., Барынин В.В., Вагин А.А., Некрасов Ю.В., Калинина Л.В., Гулый М.Ф., Гудкова Л.В., Дегтярь Р.Г. Рентгенографическое исследование структуры каталазы гриба Pénicillium vitale // Доклады АН СССР. 1979. Т. 246. С. 220 223.

3. Vainshtein В.К.. Melik Aclamyan W.R., Barynin V.V., Vagin A.A. Structure of catalase from Pénicillium vitale at 4.5 A résolution // Fifth Européen Crysta 1 lograph 1»: Meeting.- Copenhagen, DtMitmtrk, Î979. P. te*.

4. Вайнштейн Б.К., Мрлик Адамям В.Р., Барынин В.П., Вагин АЛ Реитгоноструктурноо иггл^дов.шне каталазы Pénicillium vit.dlf с разрешенном 3,Г- А // Л'-гл.,ди AU cm'. V)flO. T. 250. С. 24? 246.

5. Vainshtein В.К., Melik-Adamyan W.R.. Barynin V.V., Vagin A.A-., Grebenko A.I. Structure of catalase from PeniciJ-lium vitale at 3.5 A resolution // Sixth European Cry stallographic Meeting.-Barselona, Spain. 1980. P. 306.

6. Мелик-Адамян В.P., Барынин В.В., Вагин А.А., Гребенко А.И., Вайнштейн Б.К. Структура каталаэы Pénicillium vitale ПО данным С разрешением 3,5 А // Третий СССР-ФРГ симпозиум по химии пептидов и белков,- Махачкала, 1980. С. 30-31.

7. Мелик-Адамян В.Р., Барынин В.В., Вагин А.А., Гребенко А.И., Вайнштейн Б.К. Исследование пространственной структуры каталазы Pénicillium vitale с разрешением 3,0 А // Пятый Всесоюзный симпозиум по химии и физике белков и пептидов,- Баку, 1980. С. 98.

8. Vainshtein В.К., Melik-Adamyan W.R.. Barynin V.V., Vagin A.A., Grebenko A.I. Structure of catalase from Pénicillium' vitale at 3.5 A resolution // Acta crystallogr. 1981. V. A37. P. C-29.

9. Вайнштейн Б.К., Мелик-Адамян В.Р., Барынин В.В., Вагин А.А., Гребенко А.И. Структура каталазы Pénicillium vitale // Кристаллография. 1981. Т. 26. Вып. 5. С. 1003-1016.

10. Vainshtein В.К., Melik-Adamyan W.R., Barynin V.V., Vagin A.A., Grebenko A.I. Three-dimensional structure of the enzyme catalase // Nature." 1981. V. 293. No.5831. P. 411-412.

11. Вайнштейн Б.К., Мелик-Адамян В.Р. Структура каталазы // Третье Всесоюзное совещание по органической кристаллохимии.-Черноголовка, 1981. С. 101.

12. Барынин В.В., Мелик-Адамян В.Р. 0 механизме кристаллизации белков в ультрацентрифуге // Кристаллография. 1982. Т. 27. Вып. 5. С. 981-987.

13. Мелик-Адамян В.Р. Пространственная структура каталаэы Pénicillium vitale // Первый Всесоюзный биофизический съезд. Тезисы докладов пленарных лекций и симпозиальных заседаний.-Москва, 1982. С. 14-15.

14. Vainshtein В.К.. Melik-Adamyan W.R., Barynin V.V.. Vagin A.A., Grebenko A.I., Borisov V.V., Bartels К.S., Rossmann M.G.. Fita I. The structure of fungal catalase at 2 A resolution // Act.! crystallogr. 1984. V. A-40. P. C-42.

15. Вайнштейн Б.К., Мелик-Адамян ВЛ>. Пространственная структура каталазы Pénicillium vitale // 16 я конференция федерации европейских биохимических общестг.. д<»1?л.*я<-л: Kc>«-xim, 1984. С. 332.

16. Vainshtein В.К., Melik-Adamyan W.R., Barynin V.V., Vagin A.A. Spatial organization of catalase proteins // Progress in bioorganic chemistry and molecular biology - Amsterdam : Elsevier, 1984. P. 117-126. • "

17» Vainshtein B.K., Melik-Adamyan W.R., Barynin V.V., Vagin A.A., Grebenko A.I.Spatial organization of catalase proteins // Proceedings of the . International Symposium on Biomolecular Structure and Interactions.- Bangalore, India, 198«. P. 471-479.

18. Вайнштейн Б.К., Мелик-Адамян В.Р., Барынин В.В., Вагин А.А. Пространственная организация каталазных белков // Перспективы бчоорганической химии и молекулярной биологии. - Москва, 1986. С. 91-96.

19. Вайнштейн Б.К., Мелик-Адамян В.Р. Определение сложных белковых структур // Применение рентгеновских лучей к исследованию материалов - Кишенев : Штиинца, 1986. С. 8-15.

20., Vainshtein В.К., Melik-Adamyan -W. R. , Barynin V.V., Vagin A.A., Grebenko A.I., Borisov V.V., Bartels К.S., Fita I., Rossmann M.G. Threë-dimensional structure of catalase from Pénicillium vitale at 2 A resolution // J. Molec. Biol. 1986. V. 188. P. 4961.

21. Melik-Adamyan W.R., Barynin V.V., Vagin A.A., Borisov V.V., Vainshtein В.К., Fita I., Hurthy M.R.N., Rossmann M.G. Comparison of beef liver and Pénicillium vitale catalases // J. Molec. Biol. 1986. V. 188. P. 63-72.

22. Мелих-Адамян В.P., Барынин В.В., Вагин А.А.* ВайнштейнК., Гребенко А.И., Борисов В.В., Бартелс К., Фита И., Россман М.Г. Определение и уточнение пространственной структуры каталаэы Pénicillium vitale с разрешением 2,0 А // Кристаллография. 1987. Т. 32. Вып. 3. С. '638-652. - ,

23. Мелик-Адамян В.Р.^ Барынин В.В., Вагин А.А., Вайнштейн Б.К., Гребенко А.И., Борисов В.В., Мурти М., Фита И., Россман М.Г. Сравнение пространственных»структур каталазы Pénicillium vitale и каталазы бычьей печени // Кристаллография. 1987. Т. 32. Вып. 3. С. 653-660.

Цитируемая литература

1. Вайнштейн Б.К. Современная кристаллография.- М.: Наука, 1979. Т. 2. С. 193-245.

2. Бландел Т., Джонсон JI. Кристаллография белка.- М. : Мир, 1979. 620 с.

3. Мс Laughlin P.J., Stuart D.I., Klein H.W., Oikonomakos N.G., Johnson L.N. Substrate-cofactor interaction for glycogen Phosphorylase b /./ Biochemistry. 1984. V. 23. P. 5862-587 2.

4. Deisenhofer J., Epp 0.. Miki K., Huber R., Michel H. Structure of the protein subunits in the photosynthetic reaction centre of Rhodopseudomonas viridis at 3 A resolution // Nature. 1985. V. 318, P. 618-G24.

5. Gaykema W.P.J., Volbeda A., Hol W.G.J. Structure determination of Panulirus interr.uptus haemocyanin at 3.2 A resolution // J.Molec.Biol. 1985. V. 187. P. 255-275.

6. Chapman M.S., Suh S.W., Cscio D., Smith W.W., Eisenberg D. Sliding-layer conformational change limited by the quaternary structure of plant Rubisco // Nature. 1987. V. 329. P. 3 54 -356 .

7. Schneider G., Lindqvist Y., Branden С.-I., Lorimer G. Three-dimensional structure of ribulose-1.5-bisphosphate carboxylase/oxygenase from Rhodospirillum rubrum at 2.9 A resolution // EMBO J. 1986. V. 5. P. 3405-3415.

3. Fita I., Silva A.M., Murthy M.R.N., Rossmann M.G. The refined structure of beef liver catalase at 2.5 A resolution // Acta Cry stallоqr. 1906. V. B42. P. 497-51 5 .

9. Schounbaum G.R., Chance 0. Catalase // The Enzymes / Ed. Boyer P.D.- New York.: Academic Press. 1976. V. 13. P. 363408 .

10. Kiselev N.A., De Rosier D.J., Klug A. Structure of the tubes of catalase: Analysis of electron mi сrophоtographs by optical filtering // J.Molec.Biol. 19S8. V.15. P. 551-566.

11. Пармнин В.Г.. Электронно-микроскопическое и рентгенографическое исследование каталаэы: Лис. ... канд. физ.-мат. наук,- Москва, 1982.

12. Вайнштейн Б.К., Карпухина С.Я., Сосфенов Н.И., Фейгин JI.A. Построение модели каталазы по данным рентгеновского малоуглового рассеяния // Докл. АН СССР. 1972. Т. 207. С. 1336-1339. . -

13. Гурская Г.В. Повышение разрешения при изучении структуры белковых молекул с помощью рентгенографии и электронной микроскопии. Структура каталазы с разрешением 25 А // Кристаллография. 1975. Т. 20. С. 516-523.

14. Eventoff W . , Tanaka N.. Rossmann H.G. Crystalline bovine liver catalase // J.Molec.Biol. 1976. V. 1D3. P. 799-801.

15. Murthy M.R.N., Reid T.J., Sicignano A. Tonaka N., Rossmann M.G. Structure of beef liver catalase // J.Molec,Biol. 1981 V. 152. P. 465-4 99.

16. Гулый М.Ф. , Гудкова JI.B., Дегтярь Р. Г., Мироненко Н.И., Латышко H.В. Получение в кристаллическом виде каталазы гриба Pénicillium vitale Pidopl. et Bilai // ДОКЛ. АН СССР. 1975. T. 225. С. 211-213.

17. Протвин Д.Д., Гудкова Л.В., Дегтярь Р.Г. Гидродинамические свойства и молекулярный вес каталазы из Pénicillium vitale. -Украинский биохимический журнал, 1974, т.46, с. 10-12.

18. Мироненко Н.И., Демченко А.П., Дегтярь Р.Г., Гулый М.Ф. Исследование спектральных свойств простетической группы каталазы Pénicillium vitale // Украинский биохимический журнал. 1978. Т. 50. С. 234-239.

19. Козлов Э.Ф., Левитина Т. Л., Гусак II. М. , Годиин II.В., Гудкова Л.В., Кириленко М.Т., Дегтярь Р.Г. Фрагменты нолипептидной цепи каталазы гриба Pénicillium vitale // Биополимеры и клетка. 1987. Т. 3. С. 318-320.

20. Oickerson R.E., Weinzierl I.E., Palmer R.A. A least squares refinement method for .i:;omorphous replacement // Acta Crystallogr . 1П6В. V. 824. p. 0 9 7 - 1 Г) 0 3 .

21. Blow D.M., Crick Г.Н.С. The treatment of errors in the isomorphous replacement mothod // Acta Crystallogr. 1959. V. 12. P. 794 ППг.

22. Вагин А.Л. Йспомьгюп.тне пекристаллографической симметрии в структурной К1>ист.1ллмпмф1ш белков: Дис. ... канд. фиэ. -мат. наук. Мостил, vvï

Bricogne G. Methods and programs for exploitation of geometric redundancies // Acta Crystallogr. 1976. V. A32. P. 8 3 2-847.

I. Jones T. A. A graphics model building and refinement syste'm for macromolecules // J.Appl.Crystallogr. 1978. V. 11. P. 288-272.

i. Arndt U.M., Wonacott A.J. The rotation method in

crystallography.- Amsterdam : North Holland, 1978. >. Hendrickson Ы.А., Konnert J.H. // Biomolecular structure, function, conformation and evolution / Ed. by Srinivasan R.Oxford : Pergamon Press, 1980. P. 43-47. '. Гудкова JI.В., Кириленко M.Т., Левитина T.Л., Козлов Э.А. Исследование субъединичной структуры каталаэы Pénicillium vitale // Украинский биохимический журнал. 1985. Т.57. С. 2933.

Rossmann M.G., Argos P. Exploring structural homology of proteins // J.Molec.Biol. 1976. V. 105. P. 7S-95. . Fita I., Rossmann M.G. The active center of catalase // J.Molec.Biol. 1985. V. 185. P. 21-37.

Отпечатано в ИКАНе Подписано в печать 07.04.89. Т-02 116 Формат 60 х 90 1/16. Печ. л. 1,5 Заказ 435. Тираж 100