Пространственная структура димарганцевой каталазы Thermus thermophilus с разрешением 1 A тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ
|
Антонюк, Светлана Владимировна
АВТОР
|
||||
|
кандидата физико-математических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2000
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
01.04.18
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
На правах рукописи
РГб од
АНТОНЮК СВЕТЛАНА ВЛАДИМИРОВНА г ,. . _ „„„„
~ 5 Гг!ДР 2С09
ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ДИМАРГАНЦЕВОЙ КАТАЛАЗЫ ГЯШЯ/5 ТНЕШОРНИив С РАЗРЕШЕНИЕМ 1 А.
Специальность 01.04.18 - Кристаллография, физика кристаллов
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Москва - 2000 г.
Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН
Научный руководитель:
доктор физико-математических наук В.Р. Мелик-Адамян
Официальные оппоненты:
Доктор физико-математических наук, профессор, Владимир Юрьевич Лунин, (Институт Математических Проблем Биологии РАН)
Кандидат физико-математических наук Малинина Людмила Викторовна, (Институт Молекулярной Биологии РАН)
Ведущая организация:
Институт Биоорганической Химии РАН.
-Г01-30.
Защита диссертации состоится « »L 9 » Диссертационного совета Д.002.58.01 при Институте кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН по адресу: 117333 Москва, Ленинский проспект, 59. (V /3 5
мо мл1-
марта 2000 г. в .>•£_» на заседании
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии РАН.
Автореферат разослан «/^9» февраля_2000 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета
кандидат физико-математических наук В.М. Каневский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Каталаза - фермент (ЕС1.11.1.6) присутствующий в клетках всех аэробных организмов и защищающий их от вредного действия перекиси водорода, которая образуется в реакциях обмена веществ. В настоящее время относительно хорошо изучены гемовые каталазы, для более чем 70 из них определены аминокислотные последовательности и для шести методами рентгеновской кристаллографии определены пространственные структуры [1,2].
Менее изучены димарганцевые каталазы, выделенные из бактерий Thermus thermophilic, Lactobacillusplantarum и Thermoleophilum album. Пространственная структура только одной из них, каталазы из Thermus thermophilus, была исследована с разрешением 3 А. Были показаны ход основной цепи и расположение двух ионов Мп в межспиральной области. Оказалось, что структура димарганцевой каталазы отличается от структур гемовых катализ как по укладке полипептидной цепи, так и по активному центру, содержащему вместо гемогруппы два расположенных рядом иона марганца. Однако разрешение ЗА не позволяло определить расположение аминокислотных остатков в активном центре и понять стереохимический механизм действия фермента. Поэтому актуальной задачей было определение, уточнение и описание структуры димаганцевой каталазы с атомным разрешением.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ заключалась в определении и уточнении пространственной структуры нативной и ингибированной ионами хлора димарганцевой каталазы из Thermus thermophilus с атомным разрешением, анализе пространственной структуры и определении механизма ферментативной активности димарганцевой каталазы на основе точных структурных данных высокого разрешения.
НАУЧНАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ
Впервые с атомным разрешением определена пространственная структура димарганцевой каталазы и ее активного центра. Точные структурные сведения о расположении аминокислотных остатков в активном центре, полученные в данной работе представляют надежную структурную базу для построения стереохимического механизма каталазной реакции. Полученные результаты существенно расширяют и уточняют существующие представления о механизме ферментативной активности фермента, основанные на исследованиях биохимическими методами и методами электронного парамагнитного резонанса.
В настоящее время известны более 3000 белковых структур и только 40 из них определены с атомным разрешением.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ
Полученные в данной работе результаты представляют собой детальную структурную информацию для понимания механизма активности фермента и проведения белково-инженерных работ с целью дальнейшего изучения этого фермента, обладающего уникальной термоустойчивостью и эффективностью при 95° С, Предложенная в работе методика многократного перемораживания белковых кристаллов позволяет получать дифракционные данные от белковых кристаллов с более высоким разрешением.
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 9 работ. Список работ приведен в конце автореферата.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Работа состоит из введения, пяти глав, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Она изложена на 122 страницах, содержит 53 рисунка и 14 таблиц.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы докладывались на Гордоновской конференции по биохимическим аспектам фотосинтеза (Нью Лондон, США, июль 1990); Европейском Кристаллографическом конгрессе (Прага, Чехия, август 1998); молодежном конкурсе научных работ в ИКР АН (декабрь 1998); Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучения, нейронов и электронов (Москва, май 1999); Всемирном Кристаллографическом Конгрессе ГОСгХУШ (Глазго, Великобритания, август 1999).
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение. Во введении обоснована актуальность темы, содержится постановка задачи, сформулирована цель работы и кратко описана структура диссертации. Глава 1. Марганцевые кластеры в белках (по литературным данным).
Глава посвящена обзору литературных данных о пространственной структуре и предполагаемым механизмам ферментативной реакции белков, имеющих в активном центре два иона марганца. Эти ферменты выполняют различные функции, имеют различные пространственные структуры. Механизмы реакций всех этих ферментов основаны на увеличении реакционной способности молекулы воды, связанной с обоими ионами марганца. Основное внимание в обзоре уделено пространственному окружению ионов марганца в белках.
Аргиназа из печени крысы [3]. Аргиназа катализирует реакцию гидролиза аргинина на последней стадии цикла мочевины и регулирует концентрацию аргинина и орнитина в клетке в биосинтетических реакциях и в том числе, при синтезе оксида азота.
Структура тримера аргиназы (319 аминокислотных остатков в мономере) была решена с разрешением 2.1 Â. Было показано, что аргиназа имеет глобулярную структуру с размерами 40x50x50 Â и относится к смешанному a/ß классу с центральным параллельным ß слоем, обрамленным по краям несколькими a спиралями. В активном центре, расположенном во впадине на глубине 15 Â, находится кластер из двух двухвалентных ионов Mn. Mnl координируется атомами NdHis 101, OdlAspl24, OdlAspl28, OdlAsp232 и молекулой растворителя, с квадратно пирамидальной геометрией связей. Молекула растворителя связана с обоими ионами металлов. Мп2 координируется атомами NdHis 126, Od2Aspl24, OdlAsp232, Odl, Od2Asp 234 (бидентатное связывание) и молекулой растворителя, образуя неправильную октаэдрическую геометрию связей. Расстояние между ионами марганца составляет 3.3 Â. Интересно, что при pH 9.5 у аргиназы обнаружена небольшая каталазная активность, фермент разлагает перекись водорода со скоростью 30 s (у димарганцевой каталазы из L. plcmtarum скорость разложения перекиси водорода 200 ООО s"1).
ГГролин специфическая аминопептидаза (AMPF) из Escherichia Coli [4]. Пролин специфические пептидазы расщепляют амидную связь, находящуюся до или после пролина. Структура нативной пролин специфической аминопептидазы из Escherichia Coli (440 аминокислотных остатков), была решена и уточнена до 2.0 Â. Белок кристаллизуется в виде тетрамера 125x100x80 А3. Мономер состоит из двух доменов. Активный центр расположен в большем С-концевом домене и содержит два иона Мп+2 на расстоянии 3.3 А, соединенных молекулой воды или гидроксилом в мостовом положении. Металлсвязывающие остатки находятся в одной субъединице. Каждый ион Мп+2 находится в октаэдрическом окружении. Mnl координируется атомами OdlAsp271, OdlGlu383, Ne2His354 и Oe2Glu406 и двумя молекулами воды. Мп2 координируется атомами Odl, Od2 Asp260 (бидентатное связывание), Od2Asp271, OelGlu406 и двумя молекулами воды. Аминокислотные остатки, взаимодействующие с металлами принадлежат трем субъединицам.
Протеиновая фосфатаза-1 (РР-1) [5]. Протеиновая фосфатаза (270 аминокислотных остатков) катализует гидролиз фосфосериновых, фосфотреониновых и фосфотирозиновых остатков в разнообразных сигнальных трансдукционных путях. В активном центре РР-1 находится кластер Мп2+, расстояние между ионами марганца 3.3 Â. Координационные связи лигандов иона Mnl образуют квадратную пирамиду (NeHisôô, OelAsp64, OelAsp92 и две молекулы растворителя, обозначенные W1 и W2). Координационные связи лигандов иона Мп2 образуют тригональную бипирамиду (Asp92, OdAsnl24, Ne Hisl73, Nd His 248 и
молекула растворителя W2). Одна молекула растворителя W2 и единственный карбоксилатный кислород связывают между собой два иона металла.
Димарганцевые каталазы. Ыа-калалазы найдены в нескольких бактериях. Наиболее активно исследуются ферменты, ■ выделенные из экстремально термофильной бактерии Thermus thermophilics, Lactobacillusplantarum и Themoleophilium album.
Самые ранние рентгеноструктурные (с разрешением 3 А) [7] и ЭПР [8] исследования димарганцевой каталазы из Thermus themophilus показали, что фермент состоит из 6 идентичных субъединиц с молекулярной массой 33.3 кД. Исследование пространственной структуры димарганцевой каталазы было выполнено методом полиизоморфных замещений с использованием усреднения значения элекронной плотности в эквивалентных точках, связанных некристаллографической симметрией. Анализ разностных синтезов Паттерсона с помощью специальной процедуры автоматического поиска положения тяжелых атомов с перебором всех возможных межатомных векторов выявил расположение основных мест присоединения тяжелых атомов в кристаллах производных и позволил в первом приближении определить фазы структурных факторов белка. • Шесть субъединиц объединены в гексамер с симметрией 32, который может быть описан цилиндром с размерами 60А на 80А. Главной особенностью трехмерной структуры субъединицы является четыре большых почти параллельных плотно упакованных а-спирали, содержащих по 25-30 остатков. Меггаллсвязывающий центр лежит между этими спиралями. В каждой субъединице есть 2 иона Мп, расстояние между которыми 3.6 А [7].
Глава 2. Исследование окисления ионов марганца в активном центре димарганцевой каталазы из Thermus thermophilus методом электронного парамагнитного резонанса.
Исследования были проведены в Институте Химической физики РАН совместно с С.В. Хангуловым на установке спектрофотометре ЭЛР-В, снабженном низкотемпературной приставкой. Результаты исследования показали, что
а) в процессе хранения фермента происходит.. самопроизвольное окисление ионов марганца, входящих в состав активного центра. Этот процесс обусловлен автоокислением. Наиболее эффективно автоокисление происходит в щелочных условиях.
б) в результате длительного автоокисления практически все центры переходят в ЭПР не детектируемое состояние (Мп3+, Мп3+). Содержание центров в этом состоянии удается определить спектрофотометрически по поглощению при 480 нм. Часть центров в таких
препаратах находится в состоянии (Мп2+, Мп2+) и (Мп3+, Мп4+), но их общее содержание не превышает 5 %.
в) добавление небольших количеств перекиси к препаратам автоокисленной катал азы переводит ее в восстановленное состояние (Мп2+, Мп2+). В настоящей работе нам удалось прямо показать, что перекись водорода эффективно взаимодействует непосредственно с ионами марганца. Кроме того, этот экспериментальный факт устранил недоумение по поводу того, что препараты в состоянии (Мп2+, Мп2+) и в состоянии (Мп3+, Мп3') обладают одинаковой ферментативной активностью. Восстановление с помощью перекиси состояния (Мп3+,Мп3+) до состояния (Мп2+,Мп2+) является лишь одной из стадий каталитичекого цикла разложения перекиси водорода:
(Ш^ДЬ3*) + Н:А ------► (Мп=*,ыьг*) +0, +Н20
(ЫЬ^ЛйГ^+НА. -► (М^дйа3*) +ЕзО
ЙЧА.. -- О, + ДНаО
Глава 3. Рентгеноструктурные исследования димарганцевой каталазы из Ткеттиа 1кегторЫ1и$.
Кристаллизация. Использованные в работе препараты димарганцевой каталазы были выделены и очищены В.Барыниным по методике, описанной в работе [9]. Кристаллы димарганцевой каталазы были выращены методом висячей капли при температуре 37-46°С (рис.1). В качестве противораствора при росте кристаллов нативной каталазы использовали раствор 1.4 М сульфата аммония в буферном растворе 0.05 М AMP.SC) при рН 9.0. Состав капли: 4 белка с концентрацией 20-24 мг/мл + 4 р1 противораствора. Кристаллы, имеющие форму ромбододекаэдра, с размерами 1.0-1.5 мм, вырастали за неделю и имели пространственную группу симметрии Р2р с размерами элементарной ячейки а=Ь=с= 134.3 А. Изменение условий кристаллизации (повышение температуры кристаллизации на 15-26°С, изменение значения рН и увеличение концентрации осадителя) по сравнению с опубликованным в [9] позволило увеличить дифракционное поле кристаллов до 1.0 А и выше.
Кристаллы нативного фермента имели заметную буро-розовую окраску, что подтверждало ожидаемое состояние окисления (Мп3+,Мп3+) ионов Мп в кристаллах.
Рис.1. Кристалл димарганцевой каталазы.
Для получения кристаллов фермента, ингибированного ионами СГ, кристаллы 30 минут
Ш. выдерживали в растворе 3 мМ гидроксиламин-сульфата в 1.7М сульфате аммония и 0.1 М НЕРЕ5 буфере при рН 7.2,
что приводило к восстановлению состояния окисления ионов
„ ......................ш
Мп до (Мп 2,Мп ), после чего переносили в раствор, содержащий 100 мМ №С1 и 1.7М сульфата аммония в 0.1 М НЕРЕ8 буфере при рН 7.2, выдерживали 1 час и переносили в стабилизирующий раствор того же состава с рН 5.5.
Сбор и обработка экспериментальных данных.
Экспериментальные дифракционные данные от кристаллов нативного белка и комплекса с ингибитором хлорид-ионом (размер кристаллов 1.5x1.0x0.6 мм) были собраны на синхротронном излучении при температуре 100 К с использованием MAR Research Image Plate сканера на станциях XII, BW7 (длина волны 0.98 А, накопительное кольцо DORIS, 4.5 ГэВ , EMBL, Гамбург).
Данные обрабатывались по программам DENSO и SCALEPACK [10] (табл.2).
Таблица 2. Статистические характеристики экпериментальных данных, полученных от кристаллов димарганцевой каталазы.
Кристаллы Нативный Комплекс с СГ
Максимальное разрешение (А) 1.05 0.98
Параметры ячейки а=Ь=с (А) 132.31 132.07
Общее число проинтегрированных рефлексов 1043717 1315471
Общее число независимых рефлексов 354906 413309
Число рефлексов с 1> 2о 267199 353229
Полнота набора(%) 99.9 98.5
Полнота в последнем слое (%) 98.9 98.8
Я(1)тегЕе=1:|1-<1>|/11(%) 7.0 3.6
Уточнение пространственной структуры димарганцевой каталазы.
Позиции атомов нативной димарганцевой каталазы и их температурные факторы уточнялись в несколько этапов программами КЕБМАС [11] и 8НЕЬХ [12]. При этом на последнем этапе уточнения была использована последняя версия программы REFMAC, учитывающая анизотропию температурного фактора.
Уточнение проводилось по 98.5% данных. Оставшиеся 1,5% данных (примерно 1500 рефлексов выбранных случайным образом) использовались для расчета свободного R-free фактора в процессе уточнения. После каждого цикла уточнения для моделирования структуры растворителя применялась процедура автоматического встраивания растворителя (программа ARP [13]). Сумма заселенностей для остатков, находящихся в нескольких конформациях, принималась равной 1. Заселенности разных частей для различных конформаций при использовании программы REFMAC ставились вручную и уточнялись при использовании программы SHELX97. Позиции водородов рассчитывались по геометрическому критерию и не уточнялись. В ходе уточнения в обеих субъединицах, связаных некристаллографической симметрией 2 и обозначенных как К и L, коррекция модели проводилась независимо. На последнем этапе уточнения температурные факторы атомов уточнялись анизотропно.
Визуальная корректировка модели фермента основывалась на анализе карт разностных синтезов Фурье с коэффициентами (2F0-Fc,(?c) и (F0-F0, фс), где г0, Fe ~ экспериментальные и рассчитанные модули структурных факторов, <рс - фазы структурных факторов, рассчитанные по модели. Для построения и корректировки атомной модели молекулы фермента был использован комплекс графических программ О [14], установленный на интерактивной графической системе Silicon Grafics. Параметры и статистические характеристики двух уточненных моделей фермента и его комплекса с ингибитором приведены в табл. 3.
В качестве стартовой модели для получения структуры атомного разрешения нативной формы фермента были использованы координаты атомов белка структуры димарганцевой каталазы в состоянии (Мп2+,Мп2+), уточненной до R фактора 16% при разрешении 1.6 А (данные были собраны при комнатной температуре). Из модели был убран весь растворитель, двойных конформаций боковых цепей аминокислотных остатков в модели не было. Стартовый R-факгор был 47% для данных от 15 до 2.0 А.
Уточнение структуры фермента ингибированнопз ионами хлора велось без привлечения программы SHELX. В качестве стартовой модели использовали модель нативного фермента с разрешением 1.05 А и R-фактором 11.2% полученную после последнего цикла уточнения по программе SHELX. Стартовый R-фактор был 16.3% для данных от 15 до 2.0 А. Заселенности двойных положений ставились вручную в соответствии с объемом электронной плотности и значением температурных факторов атомов боковых цепей аминокислотных остатков.
Таблица 3. Статистические характеристики уточненных моделей нативнай каталазы и ei
комплекса с ионами СГ.
Модели Нативная Комплекс с СГ
R фактор (%) 9.8 10.0
R-free фактор (%) 11.0 i'1.2
DPI (А) [15] ^ 0.014 0.013
G-фактор (PROCHECK [16]). 0.04 0.04
Количество атомов (белковых) 5864(4954) 5871(4908)
Количество молекул воды 880 922
Двойные положения боковых цепей в К (L) субъединицах. 27(28) .32(33) .
Двойные положения молекул воды 37 54
Количество ионов сульфата 6 б
лития 3 2
йли отклонение параметров от идеальных значений длин связей 1-2 (А) 0.014 0.013
длин связей 1-3 (А) 0.027 0.027
длин связей 1-4 (А). - 0.036 0.037 ,, ,. ; ,
Хиралъного объема (А3) 0.127 0.127
планарности (А) 0.006 0.02
Средний В-фактор (А2) для основной цепи 9.7 9.8
для атомов боковой цепи 12.2 12.7
для молекул воды 26.5 26.7
Глава 4. Описание и анализ атомной модели.
Анализ качества модели.
Достоверность уточненных моделей фермента подтверждают статистические характеристики приведенные в табл. 3 и то обстоятельство, что на финальных картах распределения электронной плотности (2Ро-Бс) все аминокислотные остатки имеют хорошо определенную электронную плотность. Исключение в обоих субъединицах составляют аминокислотные остатки. А1аЗ01 и Ьуз302 и несколько последних атомов . длинных боковых цепей на поверхности молекулы (Ьув295 и 01и289, имеющих неполную заселенность). Эти остатки выходят в растворитель, их подвижность мешает полностью определить их. положение., В структуре нативного фермента в субъедшпще К(Ь) 28(29) боковых цепей аминокислотных остатков имеют двойную конформацию, в структуре ингибированного ионами хлора фермента двойную конформацию имеют 32(34) боковых цепи аминокислотных остатков. Боковые цепи аминокислотных остатков 01п18, А^ЗЗ, ОиЗб, \let41, ИебЗ, А5р134, ИиШ, Ьуз162, 01и197, 01и203, 1^206, 1^212, Ьуз222, Ьуз249, ТЬг267, 01и280, 01и293 имеют двойную конформацию в субъединицах К и Ь в нативном и ингибированном ионами хлора ферменте. Анализ распределения электронной плотности показал, что из 15 остатков пролина в субъединице, 3 остатка (Рго209, Рго211 и
Рго283) имеют цис конформацию. Все торсионные углы с? и при С-а атомах всех остатков находятся в разрешенных областях на карте Рамачандрана.
Рис.2. Схема пространственного расположения элементов вторичной структуры субъединицы димарганцевой каталазы.
Водородные связи внутри субъединицы.
Мономер димарганцевой каталазы содержит 302 аминокислотных остатка и состоит из 2 доменов. Первый домен, составляют аминокислотные остатки с 1 по 200. Эти аминокислотные остатки образуют четыре а спирали с линкером между первыми и вторыми парами спиралей и в середине межспиральной области формируют активный центр. Второй домен состоит из остатков 201-302 и образует канал к активному центру глубиной 18 Â.
Основными элементами вторичной структуры мономера являются две почти паралельно идущие пары из антипараллельных а спиралей A (Al(20-31)+A2(36-49)), В(57-85) и С(114-166), D( 172-200), три В структурированных участка, одна нить антипараллельного двухнитевого В-слоя S 1(1-5), антипараллельный В слой S2(7,8) S5(269,270), параллельный В слой S3(232-235) S4(260-263), две В-шпильки (151-153, 255-257). Вторичная структура одной субъединицы димарганцевой каталазы состоит на 42.7% из а спиралей, на 8.8% из спиралей типа 3/10 и на 4.3% из В слоев. Более детально вторичная структура приведена на рис.2,3.
В процессе уточнения несколько пиков на разностной карте электронной плотности, рассчитанной с коэфициентами (2Ро-Рс), были интерпретированы как шесть сульфат ионов и 2 иона лития. - '•;
Рнс.З.Схема водородных связей в субъединице молекулы, цифрами обозначены следующие элементы вторичной структуры: 1,2,4,5,7 и 8 - спирали типа 3/10, 3,6,9- а спирали.
Положения ионов сульфата в субъединицах К и Ь отличаются. Это связано с небольшими различиями в кристаллографическом окружении.
Различия в структуре субьедшшц, связанных некристаллографической симметрией.
.-■»"■■ Шесть субъединиц
молекулы димарганцевой каталазы образуют гексамер с симметрией ■.■■"•■. . ■■,-...■ ■ .-.-.-■ -. ;<:■■.... ■ 32, имеющий форму
' : ■■,:!>■: I, ■■ •" X' ■ ."• гексагональной призмы с
; л:- ' максимальными размерами 69А
вдоль оси 3-го порядка и 95А в ''й^'К^У^-'^'Т'1^ '¡I- перпендикулярном направлении
Рнс.4. Вид молекулы
димарганцевой каталазы вдоль оси
В независимой часи элементарной ячейки кристаллов каталазы находятся две субъединицы К и Ь, связанные некристаллографической осью симметрии 2.
Большинство аминокислотных остатков субъединицы К имеют Я.М.Б отклонения в положении С а атомов от остатков субъеднницы I, меньше 0.2 А (рис. 6).
< Д»? VI
' Л м
)Ш*А т»
^ ЛГ ^ А. ^ * ^
"»к-
« в»*'
I X, Г"*-
Рис.5. Вид молекулы димарганцевой каталазы вдоль оси 2.
' >■■", - _ !
^•-'.'ЭНаиболее заметные
отличия в положении
Со! атомов, 0.4 - 1.5 А наблюдаются в местах, связанных с небольшими отличиями в кристаллическом окружении субъединиц (остатки ¡4-17 расположенные перед спиралью А, остатки 169-172, составляющие И-поворот перед спиралью И, остатки 220-223, составляющие часть а-спирали 7, находящейся на петле и остатки 263, 268 находящиеся в неструктурированной области второго домена).
отклонения положения Са атомов субъединицы К от субъединицы С в нативной форме фермента.
(А)
1 4
1 2 1
С 8
а е
о А
о 2
Номер остатка
Рис.6. отклонения положения Са атомов субъеднницы К от субъединицы Ь
нативной форме фермента.
Температурные факторы у двух субъединиц сильно отличаются лишь в местах наибольших отличий между субъединицами. Наибольшие отклонения по температурным факторам между субъединицами наблюдаются для тех же остатков, для которых наблюдаются наибольшие отличия в положении Са атомов.
Значение среднего В-фактора для атомов основной цепи аминокислотных остатков
в нативной форме фермента.
Номер остатка
Рис.7. Зависимость средних на остаток температурных факторов от номера остатка субъединицы К(-) или Ц ).
В основном это области контактов А^7, 01и11 и Мег 14 с соседним гексамером, которые есть лишь в одной из субьедишщ и отсутствуют в другой (рис.7).
Наибольшие температурные факторы имеют аминокислотные остатки, расположенные на поверхности молекулы.
Каналы.
В структурах нативной и ингибированной каталазы имеются большой и малый каналы ведущие к активному центру с двумя атомами марганца (рис.8 ). Малый канал начинается в интерфейсе между субъединицами и заканчивается на 2-ом мостюсовом лиганде, '№2. Вход в большой канал расположен с внешней стороны гексамера и образован гидрофобными аминокислотными остатками Рго253, А1а189, А1а190, Ьеи182, Ьеи208. Следующий за ними участок поверхности канала в сторону активного центра включает заряженные боковые группы аминокислотных остатков А^159, боковая цепь которого расположена вдоль канала по направлению от активного центра, Айр215, 01и254, 01и155 и Азр214. Большой канал заканчивается на 1-ом мостиковом лиганде V»'!.
" ** , V V ^М! .
, Рис.8. Две субъединицы в
^ независимой части элементарной
' ячейки. Треугольником обозначена
I 1 ^ ось третьего порядка молекулы.
Стрелками указаны каналы к активному центру. 1- большой канал длиной 22 А и диаметром 8.5 А. 2 -малый канал длиной 16 А и диаметром 6.0 А.
Пространственная структура активного центра димарганцевой катал азы. Сравнение активных центров нативного и ингибированиого фермента.
Димарганцевый кластер расположен в полости, богатой гидрофобными остатками в середине первого домена между сс-спиралями А, В, С, Б рядом с изломом спирали А и образован аминокислотными остатками всех четырех длинных спиралей (рис.2).
Расстояние между марганцами в нативной форме 3.12 А, а в ингибированной - 3.31 А.
¡Г ■> у
чш? йь»
О(о69
Рис.9. Распределение электронной плотности (2Ро-Рс) в активном центре а) нативного б) ингибированого фермента (показаны уровни 1 и 8 а, рисунки получены при помощи программы ВОВЗСКГРТ [18 ])
Координационные связи ионов марганца, которые, задаются атомами белковых остатков, могут заметно отличаться от идеальных, (табл. 5) Ионы мараганца Мп1 и Мп2, играющие наиболее важную роль в активном центре фермента, координационно связаны (рис.9,10) с атомами N01111573 и №1Н1з188 и атомами кислорода карбоксильных групп ОЕШ1и36, 0Е2 О1и36,ОЕЮ1и70, С)Е201и70, ОЕЮЫ55.
Некоторые длины связей приведены в табл. 5. Помимо белковых лигандов ионы марганца в нативном ферменте связаны между собой двумя молекулами «растворителя», атомы кислородов которых образуют два мостика между ионами Мп, Атомы мостиковых лигандов обозначены на рис.10 и в табл.5 как \У1 и '\¥2. Точная природа небелковых лигандов ионов Мп в димарганцевой каталазе в настоящее время не известна. Есть основание полагать, что в восстановленном состоянии мостиковыми лигандами между ионами Мп могут быть атомы кислорода молекул воды или гидроксила, а в нативном состоянии (Мп+3,Мп"гЭ) один из мостиков образован атомоми кислорода. В комплексе с хлоридом вблизи \У1 и \У2 расположены ионы СГ с коэффициентами заполнения равными 1.0 для позции \¥1 и 0.85 для позиции \У2 (рис.9б).
Анализ распределения электронной плотности в активном центре показал, что боковые цепи аминокислотных остатков 01и36 и Ьуз162, в нативном ферменте и в комплексе с хлором в обеих кристаллографически независимых субъединицах К и Ь имеют по два взаимозависимых и отличающихся положения изображенные на рис. 9а и 96. При этом при переходе из конформации 1 в конформацию II концевые атомы ОиЗб и Ьуз162 сдвигаются на 1.5-2.0 А и между 0Е201и36 и Мп1 становится молекула воды \УЗ, которая занимает шестое координационное положение у иона Мп1. Положению \УЗ соответствует двойной пик разностной (2Ро - Ис) электронной плотности, расположенный над плоскостью кольца Н1з73 в нативном ферменте. Заселенности положений А и В воды, \УЗ, коррелируют с заселенностями соответствующих двойных положений боковой цепи С1и36: если карбоксильная группа 01иЗб занимает первое положение, почти перпендикулярное плоскости кольца Н1$73, вода в позиции '\УЗВ (температурный фактор 18.6 А2) занимает дальнее от Мп1 положение на расстоянии 3.21 А, при этом она образует водородные связи с О Ьеи181, Ыг 1^162 и \У1. Если карбоксильная группа 01и36 занимает второе положение, то ШЗА (температурный фактор 11 А2) занимает положение на расстоянии 2.26 А н является координирующей для иона Мп1. При этом она образует водородные связи с ОЕ1и ОЕ2 аиЗб, V/! иШ2.
Таблица 5 Некоторые длины связей ионов марганца в нативной и ингибированной хлоридом димарганцевой каталазе в А.
Модели Натнвная Комплекс с СГ
Конформация I II I II
Коэффициенты заполнения 0.50(0.60) 0.50(0.40) 0.85 0.15
Мп1Мп2 3.13 3.30(3.32)
Координация Mnl 6(5) 1 6 6 6
MnIGlu36 ОЕ1 2.10(2.13) 2.05(2.03) 2.16(2.14) 2.16(2.16)
MnlGlu36 ОЕ2 2.35(2.59) 3.39(3.36) 2.28(2.26) 3.55
MnlGlu70 ОЕ2 2.12 2.12
MnlHis73 ND1 2.22(2.20) 2.21(2.22)
MnlWl 2.03(2.06) 2.50(2.51)
MnlW2 2.07(2.07) 2.6(2.59) 2.12(2.11)
MnlW3 | 2.27(2.29) 2.22(2.26)
Координация Mn2 5 5
Mn2Glu70 OE2 2.12(2.13) 2.12
Mn2Hisl88 ND1 2.26(2.25) 2.24(2.23)
Mn2Glul55 OE1 2.17(2.17) 2.20(2.22)
Mn2Glul55 OE2 2.64(2.63) 2.43(2.45)
Mn2Wl 2.12(2.13) 2.60(2.58)
Mn2W2 2.18(2.21) 2.50(2.52) I 2.14(2.15)
Примечание к табл. 5. Данные приведены для субъединицы К, в скобках указаны соответствующие данные для субъединицы Ь, если они отличающиеся. Жирным шрифтом выделены связи, не участвующие в координации. ■■,>
а Г б
Рис.10 Изображение активного центра фермента а -конформация I, б - конформация П.
С большой вероятностью можно предположить, что конформация I активного центра в комплексе с ионами хлора, при которой положения вЬЗб и ЬуБ162 имеют заполнение 0.85, соответствует восстановленному состоянию фермента с двумя ионами СГ в позициях \У1 и \У2. Конформация II соответствует состоянию фермента, в котором первый мостик образован ионом С1, а второй - атомом кислорода молекулы воды.
Глава 5. Обсуждение результатов.
Механизм действия димарганцевой каталазы с учетом пространственной структуры активного центра.
Ранее, во второй главе диссертации, было показано, что активными являются лишь два состояния окисления ионов Мп: (Мп+2, Мп+2) и (Мп+а, Мп+3). Анализ расположения ионов ингибитора в активном центре позволил предположить, что места мостиковых лигандов и \У2, куда садятся ионы СГ, в процессе ферментативной активности могут быть местами посадки кислородов молекул перекиси водорода, располагающихся почти перпендикулярно плоскости Мп1-\¥2-Мп2.
Следует заметить, что, в рамках сделанных предположений, атом кислорода молекулы
перекиси водорода при 1-ой конформации активного центра димарганцевой каталазы может замещать \У1 и а при конформации П только 39'- о)изе W2, из-за наличия молекулы воды в положении
\\'3, мешающей замещению лиганда Wl
ОЕщ. кислородом молекулы перекиси водорода.
.^зЬ'Щ {ф Рис.11. Активный центр фермента с двумя С1и1йб\УС
, молекулами перекиси водорода.
-ф ' ТЫ »
У«^'-^"' Расстояния между атомами гипотетически
расположенных молекул перекиси водорода и атомами активного центра фермента приведены на рис. 11,12.
Перенос протона между атомами 01 и 02 перекиси водорода в процессе ферментативной реакции может происходить с участием молекул воды, находящихся в положениях \У1, \У2 и и атома 0Е2 аминокислотного остатка 01и36. Электростатическое взаимодействие молекул перекиси водорода с Ьуз162 может быть существенным при разрыве связи 0-0
LySlM
первой молекулы перекиси водорода и облегчать депрогонирование второй молекулы перекиси водорода на втором этапе реакции. Присоединению перекиси водорода по второму мосту помогает взаимодействие с ТЬг39 (рис. 11)
На основании анализа пространственной структуры , активного центра нативного и ингибированного фермента можно предположить следующий стереохимический механизм разложения перекиси водорода димарганцевой каталазой.
Первая стадия, (рис.12.1) На первом этапе реакции активный центр находится в конформации I, ионы Мп находятся в состоянии окисления (Мпг+,Мл2+) и кислород ©из« 01 молекулы перекиси водорода (Perl) занимает позицию W1. Перенос протона происходит следующим образом: протон, принадлежащий кислороду 01 молекулы перекиси водорода, передается молекуле воды W2, а протон с молекулы воды W2 передается VC^rfs- второму кислороду перекиси водорода 02.
ХУХу-
His 18«
It
2—>
Рис.12. Возможный механизм разложения перекиси водорода димарганцевой каталазой. Стадии 1,2.
Вторая стадия, (рис. 12.2) Молекула перекиси водорода с двумя протонами, принадлежащими кислороду 02, нестабильна и разлагается на атом кислорода, остающийся на месте \¥1 и молекулу воды, занимающую позицию Кислородный атом в положении
".............71
: / Ч)
"С»с£1 ;
Wl забирает два электрона, принадлежавших ионам марганца, ионы марганца переходят в состояние окисления а активный центр переходит в конформацшо II.
t
Третья стадия. (рис.12.3).Кислород 01 второй молекулы перекиси водорода (Рег2) вытесняет воду W2. Атом кислорода, занимающий место W1, забирает на себя протон, принадлежащий кислороду 01 Рег2. Для второго протона молекулы Рег2, принадлежащего кислороду 02, существуют два возможных пути. Скорее всего в случае с димарганцевой каталазой из Thermits themophilus он присоединяется к 0Е2 карбоксильной группы самого подвижного аминокислотного остатка Glu36, затем
карбоксильная группа Glu36 меняет свою конформацию и передает протон гидроксилу в положении W1.
lyjISJ
HIS73 х.
; His188
3t
Ряс.12. Возможный механизм разложения перекиси водорода димарганцевой каталазой. Стадии 3,4.
>4 LyslSJ ^
М
. t i.
О
HMS r^j^ T *
о
Mnjtf») "
ЫЭ-
ItisUB Л~и/ .........^
A GJUfSS
Четвертая стадия, (рис.12.4.) Депротонированная перекись водорода отдает два элекгорона ионам марганца, превращаясь в молекулярный кислород, состояние окисления активного центра становится (Мп2+, Мп2+). Молекулярный кислород вытесняется молекулой воды. В итоге мы получаем исходную конформацию I активного центра.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.
1. Методом ЭПР исследованы состояния ионов Мп в окисленной и восстановленной форме фермента. Показано, что активный центр каталазы в процессе разложения перекиси водорода переходит из состояния (Мп2+, Мп2+) в состояние (Мп3+, Мп3+).
2. . Найдены условия получения кристаллов димарганцевой каталазы из Thermus themophilus VK1, дифрагирующих до 1.0 A.
3. С использованием синхротронного излучения и низкотемпературной съемки собраны и обработаны дифракционные данные от нативных кристаллов димарганцевой каталазы из Thermus thermophilus и комплекса фермента с ингибитором, хлоридом натрия, с разрешением 1.05 и 0.98 А, соответственно.
4. Построены атомные модели нативной и ингибированной димарганцевой каталазы из Thermus thermophilus, которые уточнены до R-фактора 9.8 и 10.0%, соответственно.
5. Проведен анализ и сравнение пространственной структуры нативной и ингибированной хлоридом димарганцевой каталазы, включающий анализ водородных и ионных связей, контактов между субъединицами и контактов между молекулами.
6. На основании анализа пространственной структуры активного центра нативного и иншбированного фермента предложен механизм реакции разложения перекиси водорода димарганцевой каталазой из Thermus thermophilus с учетом пространственной структуры активного центра фермента.
МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ.
1. Khangulov S.V., Barynin V.V., Antonyuk S.V.(1990) «Manganese-containing catalase from Thermus thermophilus peroxide-induce redox transformation of manganese ions in presence of specific inhibitors of catalase activity.» Biochimica et Biophisica Acta, v. 1020, p.25-33.
2. Khangulov S.V., Barynin V.V., Antonyuk S.V. (1990) «Redox transformations of dimanganese active site of the catalase of Thermus thermophilus by hydrogen peroxide.» Gordon conference on Biochemical Aspects of Photosynthesis, Colby- Sawyer College, July 15-20, New London, New Hampshire.
3. Barynin V.V., Hepstread P.D., Vagin A.A., Antonyuk S.V., Melik-Adamyan W.R., Lamzin V.S., Harrison P.M., Artymiuk P.J. (1997) "Three-dimensional structure of di-Mn catalase from Thermus thermophilus at 1.6-1.4 A resolution". J. Inorganic Chemistry, v.67, n.1-4, p. 196.
4. Antonyuk S.V., Barynin V.V., Popov A.N., Lamzin V.S. (1998).«Cryogenic tempering for improvement of x-ray crystal diffraction.» ECM-18 posters abstracts. V. 5. special issue B. p. 493.
5. Barynin V.V., Hempstead P.D., Vagin A.A., Antonyuk S.V., Melik-Adamyan W.R., Lamzin V.S., Harrison P.M. & Artymiuk P.J. «High resolution structure of Thermus thermophilus Manganese catalase» EMBL Hamburg Outstation annual report (1999), p. 283-284
6. Antonyuk S.V., Barynin Y.V., Popov A.N., Lamzin V.S. (1999) «Cryogenic tempering for improvement of quality of x-ray crystal diffraction.» EMBL Hamburg Outstation annual report, p. 341-342.
7. Whittaker M M., Barynin V.V., Antonyuk S.V., Whittaker J.W. (1999) «The oxidized (3,3) state of Manganese catalase. Comparison of enzymes from Thermus thermophilus and Lactobacillusplantarum.» Biochemistry, v.38, n.28, p. 9126-9136.
8. Antonyuk S.V., Melik-Adamyan W.R., Popov A.N., Lamzin V.S., Hepstread P.D., Harrison P.M., Artymiuk P.J. and Barynin V.V. (1999) «The structure of di-manganese catalase from Thermus thermophilus at 1 A resolution» IUCrXVIII Collected abstracts, p.338.
9. Антонюк C.B., Мелик-Адамян B.P., Попов A.H., Ламзин B.C., Хемпстэд П.Д., Харрисон P.M., Артымюк П.Д. и Барынин В.В. «Структура фермента димарганцевая каталаза из Thermus thermophilus с разрешением 1 А » (2000) Кристаллография, 45(1), 111-122,
ЛИЧНЫЙ ВКЛАД СОИСКАТЕЛЯ.
Экспериментальная часть по ЭПР исследованиям проведена при личном участии автора. Экспериментальная часть по рентгеноструктурым исследованиям, уточнение и достраивание моделей фермента и их анализ проведены лично автором.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.
1. J.Bravo, I.Fita, P.Gonet, H.M.Jouve, W.Melik-Adamyan, G.N.Murshudov "Structure of catalases" (1997) in Oxidative stress and the solecular biology of the antioxidant defenses" Cold Spring Harbor Lab.Press.
2. M.Zamocky, F.Koleer "Understanding the structure and function of catalases:clues from molecular evolution and in vitro mutagenesis" (1999) Prog. Bioph. & Macr. Biology 72, p. 19-66.
3. Kanyo, Z.F., Scolnick, L.R., Ash, D.E., Christianson, D.W. (1996) «Structure of a unique binuclear manganese cluster in arginase. » Nature, 383: 554-557;
4. Wilce, M. C. J., C. S. Bond, N. E. Dixon, H. C. Freeman, J. M. Guss, P. E. Lilley and J. A. Wilce (1998) «Structure and mechanism of a proline-specific aminopeptidase from Escherichia coli.» Proceed, of the Nat. Acad, of Sciences of the United States of America 95(7). 3472-3477;
5. Goldberg, J., Huang, H.B., Kwon, Y.G., Greengard, P., Nairn, A C., Kuriyan, J. (1995) «3 dimensional structure of the catalytic subunit of protein serine/threonine phosphatase-1.» Nature, 316: 745-753;
6. Ludwig, M.L., Metzger, A.L., Pattridge, K.A., Stallings, W.C. (1991) «Manganese superoxide-dismutase from Thermus thermophilic - a structural model refined at 1.8A resolution. » Journal Of Molecular Biology, 219(2): 335-358;
7. Барынин, В В., Вагин A.A, Мелик-Адамян, В.Р., Гребенко А.И., Хангулов, С.В., Попов А.Н., Андрианова М.Е., Ваинштейн Б.К. (1986). Пространственная структура Т-каталазы с разрешением З.ОА. Докл. Акад.наук СССР 288(4): 877-880.
8. Хангулов, С.В., Барынин, В.В., Мелик-Адамян, В.Р., Воеводская, Н.В., Блюменфельд, Л.А., Добряков, С.Н., Ильясова, В.Н. «ЭПР исследования Т-каталазы из Thermus thermophilus» (1986) Биоорганическая химия 12, 741-748;
9. Барынин В.В., Гребенко А.И. (1986)Т-каталаза - негемовая каталаза экстремально-термофильной бактерии Thermus thermophilus НВ8. Докл. Акад.наук СССР 286(2) т.2, 461464.
10. Otwinowski, Z., Minor, V. (1993) «DENZO: an oscillation data processing program for macromolecular crystallography.» Yale University, New Haven, USA.
11. Murshudov, G. N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. (1997) «Refinement of macromolecular structures by the maximum- likelihood method. »Acta Crystallographica D 53(3): 240-255.
12. Sheldrick, G. M. and T. R Schneider (1997) «SHELX: High-resolution refinement.» Methods In Enzymology 111'. 319-343.
13. Lamzin, V. S. and K. S. Wilson (1993) «Automated refinement of protein models.» Acta Crystallographica D 49(1): 129-147.
14. Jones, T. A., Zou, J.Y., Cowan, S.W., Kjeldgaard, M. (1991) «Improved methods for building protein models in electron- density maps and the location of errors in these models.» Acta Crystallographica Section A 47(2): 110-119.
15. Bailey, S. (1994). «The CCP4 suite - programs for protein crystallography.» Acta Crystallographica D 50(5): 760-763.
16. Cruickshank, D.W.J. (1996) «Protein precision re-examined: Luzzati plots do not estimate final errors.» in Proceedings of the CCP4 Study Weekend: Macromolecular Refinement 11-22; Dodson, E., Moore, M., Ralph, A. & Bailey, S. (Eds).
17. Hutchinson, E. G. and J. M. Thornton (1996) «PROMOTIF - A program to identify and analyse structural motifs in proteins.» Protein Science 5(2): 212-220.
18. Esnouf, R. M. (1997) An extensively modified version of MolScript that includes greatly enhanced colouring capabilities. Journal Of Molecular Graphics & Modelling 15(2): 133-138.
Подписано в печать 16.02.2000. Формат 30x42/8. Гарнитура «Times». Ризография. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 471.
Л ИЗДАТЕЛЬСТВО ^^МОСКОВСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ГОРНОГО УНИВЕРСИТЕТА
Лицензия на издательскую деятельность ЛР № 062809 от 30.06.98 г. Код издательства 5X7 (03)
Отпечатано в типографии Издательства Московского государственного горного университета
Лицензия на полиграфическую деятельность ПЛД № 53-305 от 05.12.91 г.
117935, Москва, ГСП-1, Ленинский проспект, 6; Издательство МГГУ; тел. (095) 236-97-80; факс (095) 956-90-40
Введение.
Глава 1. Марганцевые кластеры в белках (по литературным данным).
1. Введение. Роль марганца в живой природе.
2. Химическая природа геометрическая координация ионов Мп в марганецсодержащих белках.
2.1. Координационные связи иона Мп с азотами имидазола гистидина.
2.2. Координационные связи иона Мп с кислородами карбоксильных групп.
2.3. Экзогенные лиганды.
3. Природные белки, содержащие ионы марганца в активном центре.
3.1.Аргиназа из печени крысы.
3.2. Пролин специфическая аминопептидаза (АМРР) из Escherichia Coli.
3.3. Протеиновая фосфатаза-1.
3.4. Супероксиддисмутаза (СОД).
4. Димарганцевые каталазы.
4.1. Первичная структура димарганцевой каталазы из Thermits thermophilus.
4.2. Магнитные свойства Мп кластеров в марганцевых каталазах.
4.3. Влияние анионов на окислительное состояние и активность димарганцевой каталазы.
4.4. О механизме действия димарганцевой каталазы.
Глава 2. Исследования каталазы с использованием метода Электронного Парамагнитного Резонанса.
1. Введение.
2. Материалы и методы. 42 2.1. Э1 IP - измерения.
2.2. Ферментативная активность.
2.3. Оценка относительного содержания активных центров в различных состояниях окисления.
2.4. Влияние перекиси водорода на различные окислительных состояния биядерного кластера.
2.5. Обсуждение.
Глава 3. Рентгеноструктурные исследования димарганцевой каталазы из Ткегтиз ОгегторкИт.
1. Пространственная структура димарганцевой каталазы при разрешении 1.4 А.
2. Определение структуры нативного фермента и ингибированного ионами хлора с атомным разрешением 1.05-0.98 А.
2.1. Материалы и методы
2.1.1. Кристаллизация.
2.1.2. Применение метода многократного перемораживания к кристаллам димарганцевой каталазы и его усовершенствование.
2.1.3. Сбор и обработка экспериментальных данных.
2.2. Уточнение пространственной структуры димарганцевой каталазы
2.2.1. Уточнение и достраивание атомной модели фермента. Общая стратегия.
2.2.2. Уточнение структуры нативного фермента.
2.2.3. Уточнение структуры ингибированного фермента.
Глава 4. Описание и анализ атомной модели димарганцевой каталазы.
1. Анализ качества модели.
2. Водородные связи внутри субъединицы.
3. Сульфат ионы и ионы и их окружение.
4. Различия в структуре субъединиц, связанных некристаллографической симметрией.
5. Сравнение структур димараганцевой каталазы в кислых и щелочных условиях.
6. Пространственная структура активного центра димарганцевой каталазы. Сравнение активных центров нативного и ингибированного фермента
7. Каналы.
8. Сравнение структуры и строения активного центра суперокисленной димарганцевой каталазы (Мп3+, Мп4+) со структурой нативной димарганцевой каталазы (Мп3+, Мп3+).
Глава 5. Обсуждение результатов.
1. Отличия активного центра димарганцевой каталазы от активных центров других ди-марганцевых ферментов.
2. Несоответствия предложенного ранее механизма ферментативной реакции пространственной структуре активного центра димарганцевой каталазы.
3. Механизм действия димарганцевой каталазы с учетом пространственной структуры активного центра. 99 Основные результаты и выводы.
Благодарности
Изучение пространственной структуры биологи чеких макромолекул является важным направлением современной науки, так как позволяет связать накопленные различными методами наблюдения над функционированием биологических систем с пространственным описанием на молекулярном уровне. Атомное разрешение (выше 1.2 А) позволяет получить самую полную информацию о структуре фермента, расположении водородных атомов и подвижности боковых цепей аминокислотных остатков белка, анизотропии неводородных атомов, включении в модель белковой молекулы молекул растворителя с частичной заселенностью. Получение рентгеновских дифракционных данных атомного разрешения стало возможно только благодаря применению синхротронного излучения, двумерным детекторам и методике низкотемпературной съемки. В настоящее время в PDB (Банк Белковых Данных) имеется только 40 структур с атомным разрешением из более чем 3000 белковых структур.
Данная работа посвящена ренгеноструктурным исследованиям димарганцевой каталазы из Thermus thermophilics с разрешением 1 А.
Актуальность этой работы связана с тем, что в настоящее время известны и изучены шесть гемовых каталаз. выделенных из различных источников, и значительно менее изученными являются димарганцевые каталазы, живущие в термофильных условиях при 90аС, при которых гемовые каталазы денатурируют. Известны димарганцевые каталазы. выделенные из бактерий Thermus thermophilus, Lactobacillus plantarum и Thermoleophilum album. Пространственная структура только одной из них, каталазы из Thermus thermophilus, была исследована с разрешением 3 А [1]. Были показаны ход основной цепи и расположение двух ионов Мп в межспиральной области. Оказалось, что структура димарганцевой каталазы отличается от структур гемовых каталаз, как по укладке полипептидной цепи, так и по активному центру, содержащему вместо гемогруппы два расположенных рядом иона марганца. Однако разрешение ЗА не позволяло определить расположение аминокислотных остатков в активном центре и понять стереохимический механизм действия фермента. Поэтому актуальной задачей было определение, уточнение и описание структуры димаганцевой каталазы с атомным разрешением.
В задачу диссертации входило определение и уточнение пространственной структуры нативной и ингибированной ионами хлора димарганцевой каталазы из Thermus thermophilus с атомным разрешением, анализ пространственной структуры и определение механизма ферментативной активности димарганцевой каталазы на основе точных структурных данных высокого разрешения.
Диссертация состоит из пяти глав. Первая глава представляет собой обзор литературы по свойствам ионов марганца и известным природным белкам, содержащим либо два иона марганца в активном центре, либо один ион марганца, способный менять состояние окисления в процессе ферментативной реакции. В главе также затрагиваются данные о гемовых каталазах и димарганцевой каталазе из Thermus thermophilus, рассматривается предложенный ранее механизм ферментативной реакции димарганцевой каталазы.
Во второй главе диссертации представлена экспериментальная часть работы по исследованиям активных состояний димарганцевой каталазы методами ЭПР и фотометрическим методом.
В третьей главе представлена экспериментальная часть работы по структурным исследованиям димарганцевой каталазы, состоящая из материалов и методов определения структуры нативной каталазы и ее комплекса с хлоридом с разрешением 1.05 и 0.98 А, соответственно, и их уточнению.
Четвертая глава посвящена анализу качества построенной модели, детальному описанию пространственной структуры молекулы основанном на анализе водородных связей и описанию строения активного центра.
В пятой главе обсуждается возможный стереохимический механизм ферментативной активности димарганцевой каталазы.
Научная новизна работы состоит в том, что впервые с атомным разрешением определена пространственная структура димарганцевой каталазы и ее активного центра. Точные структурные сведения о расположении аминокислотных остатков в активном центре, полученные в данной работе представляют надежную структурную базу для построения стереохимического механизма каталазной реакции. Полученные результаты существенно расширяют и уточняют существующие представления о механизме ферментативной активности фермента, основанные на исследованиях биохимическими методами и методами электронного парамагнитного резонанса.
Основные результаты и выводы.
1. Методом ЭПР исследованы состояния ионов Мп в окисленной и восстановленной форме фермента. Показано, что активный центр каталазы в процессе разложения перекиси водорода переходит из состояния (Мп2+, Мп2+) в состояние (Мп3+, Мп3+).
2. Найдены условия получения кристаллов димарганцевой каталазы из Thermus thermophilus VK1, дифрагирующих до 1.0 А.
3. С использованием синхротронного излучения и низкотемпературной съемки собраны и обработаны дифракционные данные от нативных кристаллов димарганцевой каталазы из Thermus thermophilus и комплекса с ингибитором хлоридом натрия с разрешением 1.05 и 0.98 Ä соответственно.
4. Построены атомные модели нативной и ингибированной димарганцевой каталазы из Thermus thermophilus, которые уточнены до R-фактора 9.8 и 10.0% соответственно.
5. Проведен анализ и сравнение пространственной структуры нативной и ингибированной хлоридом димарганцевой каталазы, включающий анализ водородных и ионных связей, контактов между субъединицами и контактов между молекулами.
6. На основании анализа пространственной структуры активного центра нативного и ингибированного фермента предложен механизм реакции разложения перекиси водорода димарганцевой каталазой из Thermus thermophilus с учетом пространственной структуры активного центра фермента.
Автор выражает глубокую благодарность В.Р.Мелик-Адамяну за руководство диссертационной работой;
В.В.Барынину и С.В.Хангулову за обсуждение результатов и поддержку;
A.И.Гребенко за ценные советы по кристаллизации фермента;
B.C. Ламзину за предоставленную возможность использовать оборудование и компьютеры EMBL в ходе выполнения работы;
А.Н.Попову за помощь в получении и обработке данных и плодотворную дискуссию в ходе выполнения работы;
Всем сотрудникам Лаборатории структуры биокристаллов за моральную поддержку и интерес, проявленный к работе.
1. Барынин, В.В., Вагин А.А, Мелик-Адамян, В.Р., Гребенко А.И., Хангулов, С.В., Попов А.Н.; Андрианова М.Е., Ваинштейн Б.К. (1986). Пространственная структура Т-каталазы с разрешением 3.OA. Докл. Акад.наук СССР 288(4), 877-880;
2. Cotton, F.A. & Wilkinson, G. (1980) Advanced Inorganic Chemistry, 4th Edn. Wiley, New York; 3.2. Bemshtein, F.C., Koetzle, T.F., Williams, G.J.B., Meyer, E.F., Brice, M.D., Rodgers, J.R., et al (1977) Journal of Molecular Biology 112, 535-542;
3. Christianson, D.W. Anfinsen, C.B., Edsall, J.T., Richards, F.M. & Eisenberg, D.S. (1991) Structural biology of zinc. Advances in Protein Chemistry: Metalloproteins Structural Aspects 42, 281-355;
4. Weighardt K. (1989) Angew. Chem. Int. Ed.Engl. 28, 1153-1172;
5. Glusker, G.P., Anfinsen, C.B., Edsall, J.T., Richards, F.M. & Eisenberg, D.S. (1991) Structural aspects of metal-liganding to functional groups in proteins. Advances in Protein Chemistry: Metalloproteins Structural Aspects 42, 1-76;
6. Chakrabarty, P. (1990) Geometry of interaction of metal-ions with histidine-residues in proteinstructures. Protein Engineering 4(1), 57-63;
7. Carrell, C.J., Carrell, H.L., Erlebacher, J., Glusker, J.P. (1988). Structural aspects of metal-ioncarboxylate interactions. Journal Of The American Chemical Society 110(26), 8651-8656;
8. Vedani A., Huhta D.V. (1990) A new force-field for modeling metalloproteins. Journal Of The
9. American Chemical Society 112(12), 4759-4767;
10. Christianson, D.W. (1997) Structural chemistry and biology of manganese metalloenzymes.
11. Progress In Biophysics & Molecular Biology 67(2-3), 217-252.
12. Bradbury, J.H. and Carver, J.A. (1984) Conformational differences between various myoglobin ligated states as monitored by H-l-NMR spectroscopy. Biochemistry 23(21), 4905-4913;
13. Carver, J.A. and Bradbury, J.H.(1984) Assignment of H-l-NMR resonances of histidine and other aromatic residues in met-myoglobin, cyano-myoglobin, oxy-myoglobin, and (carbon monoxy)myoglobin. Biochemistry 23(21), 4890-4905;
14. Rardin R.L., Tolman W.B. and Lippard S.J. (1991) Monodentate carboxylate complexes and the carboxylate shift implications for polymetalloprotein structure and function. New Journal Of Chemistry 15(6), 417-430:
15. Carrell, C.J., Carrell, H.L., Erlebacher, J., Glusker, J.P. (1988). Structural aspects of metal-ion carboxylate interactions. Journal Of The American Chemical Society, 110(26), 8651-8656;
16. Lippard, S.J. and Berg, J.M. (1994) Principles of Bioinorganic Chemistry. University Science Books, Mill Valley, CA;
17. Dismukes, G.C. (1996) Manganese enzymes with binuclear active sites. Chemical Reviews, 96(7), 2909-2926;
18. Kanyo, Z.F., Scolnick, L.R., Ash, D.E., Christianson, D.W. (1996) Structure of a unique binuclear manganese cluster in arginase. Nature 383, 554-557;
19. Krebs, H.A., Henseleit, K. & Hoppe-Seyles, Z. (1931) Physiol.Chem.210, 33-66.
20. Reckowski R.S., Ash D.E. (1989; Journal Of The American Chemical Society 111, 6412-6419.
21. Scolnick, L.R., Kanyo, Z.F., Cavalli, R.C., Ash, D.E., Christianson, D.W. (1997) Altering the binuclear manganese cluster of arginase diminishes thermostability and catalytic function. Biochemistry 36(34), 10558-10565;
22. Wilce, M. C. J. C. S. Bond, N. E. Dixon, H. C. Freeman, J. M. Guss, P. E. Lilley and J. A. Wilce (1998) Structure and mechanism of a proline-specific aminopeptidase from Escherichia coli.
23. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95(7), 34723477;
24. Roderick, S.L. and Matthews, B.W. (1993) Structure of the cobalt-dependent methionine aminopeptidase from escherichia-coli a new type of proteolytic-enzyme. Biochemistry 32(15), 3907-3912;
25. Cohen, P. (1989) The structure and regulation of protein phosphatases. Annual Review Of Biochemistry 58. 435-508;
26. Shenolikar, S. (1994) Protein serine/threonine phosphatases new avenues for cell regulation. Annual Review Of Cell Biology 10, 55-86;
27. Johnson, L.N., Barford, D. (1993) The effects of phosphorylation on the structure and function of proteins. Annual Review Of Biophysics And Biomolecular Structure 1(22), 199-232;
28. Stone, R.L., Dixon, J.E. (1994) Protein-tyrosine phosphatases. Journal Of Biological Chemistry, 269(50): 31323-31326;
29. Goldberg, J., Huang, H.B., Kwon, Y.G., Greengard, P., Nairn, A.C., Kuriyan, J. (1995) 3-dimensional structure of the catalytic subunit of protein serine/threonine phosphatase-1. Nature 376, 745-753;
30. Egloff, M.P., Cohen, P.T.W., Reinemer, P., Barford, D. (1995) Crystal-structure of the catalytic subunit of human protein phosphatase-1 and its complex with tungstate. Journal of Molecular Biology, 254(5), 942-959;
31. Vincent, J.B., Averill, B.A. (1990) Sequence homology between purple acid-phosphatases and phosphoprotein phosphatases are phosphoprotein phosphatases metalloproteins containing oxide-bridged dinuclear metal centers? FEBS Letters, 263(2), 265-268;
32. Berndt, N. and Cohen, P.T.W. (1990) Renaturation of protein phosphatase-1 expressed at high-levels in insect cells using a baculovirus vector. European Journal Of Biochemistry, 190(2), 291297;
33. Koonin, E.V. (1994) Conserved sequence pattern in a wide variety of phosphoesterases. Protein Science, 3(2), 356-358;
34. Zhuo, S.Q., Clemens, J.C., Stone, R.L., Dixon, J.E. (1994). Mutational analysis of a ser/thr phosphatase identification of residues important in phosphoesterase substrate-binding and catalysis. Journal Of Biological Chemistry, 269(42), 26234-26238;
35. Beese, L.S., Stietz, T.A. (1991) Structural basis for the 3-5'exonuclease activity of Escherichia-coli DNA-polymerase-i a 2 metal-ion mechanism. Embo Journal, 10(1), 25-33;
36. Lavelle,F., McAdam, M.E., Fielden, E.M.(1977) Biochemical Journal 161,3-11.
37. Ludwig, M.L., Metzger, A.L., Pattridge, K.A., Stallings, W.C. (1991) Manganese superoxide-dismutase from thermus-thermophilus a structural model refined at 1.8A resolution. Journal Of Molecular Biology, 219(2), 335-358
38. Parker, M.W. and Blake, C.C.F. (1988). Crystal-structure of manganese superoxide-dismutase from bacillus-stearothermophilus at 2.4A resolution. Journal Of Molecular Biology, 199(4), 649661;
39. Sines, J., Allison, S., Wierzbicki, A., McCammon, J.A. (1990). Brownian dynamics simulation of the superoxide superoxide-dismutase reaction iron and manganese enzymes. Journal Of
40. Physical Chemistry 94(2), 959-961.
41. Vincent, J.B. and Christou, G. (1989) Advances in Inorganic Chemistry 33, 197-257.
42. Lah, M. S., Dixon, M.M., Pattridge, K.A, Stallings, W.C, Fee, J.A, Ludwig, M.L. (1995) Structure-function in escherichia-coli iron superoxide dismutase comparisons with the manganese enzyme from thermus- thermophilus. Biochemistry 34(5), 1646-1660.
43. Halliwell, B. and J. M. C. Gutteridge (1990) Role of free-radicals and catalytic metal-ions inhuman-disease an overview. Methods In Enzymology 186, 1-85.
44. Stadtman, E. R., Berlett, B.S., Chock, P.B. (1990) Manganese-dependent disproportionation ofhydrogen-peroxide in bicarbonate buffer. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America 87(1), 384-388.
45. Неорганическая химия под ред. Эйхорн Г.М. (1978) Издательство «Мир» т.2,с.316.
46. Kono, Y. and I. Fridovich (1983) Isolation and characterisation of the pseudocatalase of lactobacillus-plantarum a new manganese-containing enzyme. Journal Of Biological Chemistry 258(10), 6015-6019.
47. J.Bravo, I.Fita, P.Gonet, H.M.Jouve, W.Melik-Adamyan, G.N.Murshudov Structure of catalases (1997) in "Oxidative stress and the solecular biology of the antioxidant defenses" Cold Spring Harbor Lab.Press.
48. M.Zamocky, F.Koleer Understanding the structure and function of catalases:clues from molecular evolution and in vitro mutagenesis (1999) Prog. Bioph. & Macr. Biology 72, 19-66.
49. Schonbaum G.R., Chance B. (1976) The Enzymes, ed Boyer P.D. 3rd ed. V.13 New York. Acad Press, 363.
50. Fita, I. and M. G. Rossmann (1985) The active-centre of catalase. Journal Of Molecular Biology 185(1), 21-37.
51. Барынин В.В., Гребенко А.И. (1986) Т-каталаза негемовая каталаза экстремально-термофильной бактерии Thermus thermophilus НВ8. Докл. Акад.паук СССР 286(2), 461-464.
52. Kono, Y. and I. Fridovich (1983) Journal Of Biological Chemistry 258(10), 13646-13648.
53. Хангулов, С.В. Барынин, В.В., Мелик-Адамян, В.Р., Воеводская, Н.В., Блюменфельд, J1.A., Добряков, С.Н., Ильясова, В.Н. (1986) ЭПР исследования Т-каталазы из Thermus thermophilus. Биоорганическая химия 12, 741-748
54. Shlyapnikov S.V., Dementev A.A., Moir A.J.G., Keen J.N., Barynin V.V. (частное сообщение).
55. Barynin V.V., Hempstead P.D., Vagin A.A., Antonyuk S.V., Melik-Adamyan W.R., Lamzin V.S., Harrison P.M. & Artymiuk P.J. (1999) High resolution structure of Thermus thermophilus Manganese catalase. EMBL Hamburg Outstation annual report. 283.
56. Meier, A., Whittaker, M.M. & Whittaker, J.W. (1996) EPR polarisation studies on Mn catalase from Labobacillus plantarum Biochemistry, 35, 348-360.
57. Waldo, G. S., Yu, S.Y., Penner-Hahn, J.E. (1992) Structural characterisation of the binuclear Mn site in lactobacillus-plantarum manganese catalase. Journal Of The American Chemical Society 114(14), 5869-5870.
58. Dismukes, G.C. (1992) in Bioorganic cataliysis, Reedijk,J., Ed. Marcel-Dekker, Amsterdam.
59. Gamelin, D. R„ Kirk, M.L., Stemmler, T.L., Pal, S., Armstrong, W.H., Penner-Hahn, J.E., Solomon, E.I. (1994) Electronic-structure and spectroscopy of manganese catalase and di-mu-oxo
60. Mn(III)-Mn(IV). model complexes. Journal Of The American Chemical Society 116 (6), 23922399.
61. Ivancich, A., Barynin, V.V., Zimmermann, J.I. (1995) Pulsed EPR studies of the binuclear Mn(III)-Mn(IV) centre in catalase from thermus-thermophilus. Biochemistry 34(20), 6628-6639.
62. Dismukes, G.S. (1996) Manganese enzymes with binuclear active sites. Chem.Rev. 96, 2909-2926.
63. Sheats, J. E., Czernuszewicz, R.S., Dismukes, G.C., Rheingold, A.L. (1987) Binuclear manganese(III) complexes of potential biological significance. Journal Of The American Chemical Society 109(5), 1435-1444.
64. Czernuszewicz, R.S., (1991) Special Publish R.Soc.Chem. 94.
65. Carroll, J. and J. R. Norton (1992) Protonation of a bridging oxo ligand is slow. Journal Of The American Chemical Society 114(22), 8744-8745.
66. Асатурян. К.А., Черняк, И.В., Нехорошее, H.C., Муромцев. В.И. (1986) Приборы и техника эксперимента 6, 203-207.
67. Goldshtein, D.B. (1968) Analit.Biochem. 24,431-437.
68. Deisseroth, A., Dounce, A.L. (1970) Physiol.Rev. 50, 319-375.
69. Yeh, J.I. & Hoi, W.G.J. (1998) A flash annealing technique to improve diffraction limits andlower mosaicity in crystals of glycerol kinase Acta. Cryst. D54, 479-480.
70. Otwinowski, Z., Minor, V. (1993) DENZO: an oscillation data processing program for macromolecular crystallography. Yale University, New Haven, USA.
71. Murshudov, G. N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. (1997) Refinement of macromolecular structures by the maximum- likelihood method. Acta Crystallographica Section D-BiologicalCrystallography 53(3), 240-255.
72. Sheldrick, G. M. and T. R. Schneider (1997) SHELX: High-resolution refinement. Methods In Enzymology 227, 319-343.
73. Lamzin, V. S. and K. S. Wilson (1993) Automated refinement of protein models. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography 49(1), 129-147.
74. Jones, T. A., Zou, J.Y., Cowan, S.W., Kjeldgaard, M. (1991) Improved methods for building protein models in electron- density maps and the location of errors in these models. Acta Crystallographica Section A 47(2), 110-119.
75. Bailey, S. (1994). The CCP4 suite programs for protein crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography 50(5), 760-763.
76. Cruickshank, D.W.J. (1996) Protein precision re-examined: Luzzati plots do not estimate final errors, in Proceedings of the CCP4 Study Weekend: Macromolecular Refinement 11-22; Dodson, E„ Moore, M„ Ralph, A. & Bailey, S. (Eds)
77. Laskowski, R. A., Macarthur, M.W., Moss, D.S., Thornton, J.M. (1993) Procheck a program to check the stereochemical quality of protein structures. Journal Of Applied Crystallography 26(2) 283.
78. Hutchinson, E. G. and J. M. Thornton (1996) PROMOTIF A program to identify and analyse structural motifs in proteins. Protein Science 5(2), 212-220.
79. Esnouf, R. M. (1997) An extensively modified version of MolScript that includes greatly enhanced colouring capabilities. Journal Of Molecular Graphics & Modelling 15(2), 133-138.
