Рентгеноструктурное исследование комплексов неорганической пирофосфатазы из E. coli с металлом-ингибитором и аналогом субстрата при атомном разрешении тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

Введение

Глава 1. Неорганические пирофосфатазы (обзор литературы)

1.1 Каталитические свойства неорганических пирофосфатаз E.coli и S.servesiae.

1.1.1 Кинетические схемы гидролиза пирофосфата РРазами

1.1.2 Эффективность различных металлов для катализа

1.1.3 Субстратная специфичность

1.1.4 Ингибирование пирофосфатаз

1.2 Первичная структура. Эволюционный аспект.

1.3 Рентгеноструктурный анализ пирофосфатаз

1.3.1 Пространственная структура пирофосфатазы E.coli

1.3.2 Рентгеноструктурные исследования каталитического механизма

1.4 Модели механизма гидролиза

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Получение кристаллов комплексов РРазе с Са и CaPPi

2.2 Подготовка кристаллов к сбору диффракционных данных

2.3 Сбор и обработка диффракционных данных

2.4 Решение и уточнение структур

Глава 3. Методика улучшения диффракционного качества кристаллов РРазы 41 Введение

3.1 Способы улучшения диффракцнонного качества белковых кристаллов (обзор литературы)

3.1.1 Перезамораживание макромолекулярных кристаллов

3.1.2 Настаивание в растворах, содержащих стабилизирующие агенты

3.1.3 Дегидратация 46 3.2 Методика улучшения диффракционного качества кристаллов

РРазы (результаты экспериментов)

3.2.1 Перезамораживание с постоянной концентрацией компонентов криораствора

3.2.2 Перезамораживание с постепенным изменением концентрации всех компонентов криораствора

3.2.3 Перезамораживание с повышением концентрации одного из компонентов криораствора

3.2.4 Улучшение разрешения настаиванием кристаллов в стабилизиркющем растворе с концентрацией NaCl, близкой к насыщенной с последующим быстрым замораживанием

3.2.5 Исследование влияния концентрации NaCl на диффракционное качество кристаллов при комнатной температуре

3.2.6 Обсуждение результатов

Глава 4. Результаты рентгеноструктурного анализа Са-РРазы и СаРР1-РРазы

4.1 Качество моделей

4.2 Структуры Са-РРазы и СаРР1-РРазы

4.3 Активный центр Са-РРазы

4.4 Активный центр CaPPi-PPa3bi

Глава 5. Обсуждение результатов рентгеноструктурного анализа

Са-РРазы и СаРРьРРазы 77 5.1 Сравнение положений связывания ионов Са2+ и Mg , молекул пирофосфата и фосфат-ионов в ктивном центре. 77 5. 2. Ингибирование пирофосфатазы ионами

5.3 Механиз гидролиза PPi РРазой Е.coli

Фермент, гидролизующий пирофосфат (PPi) до фосфата (Pi) был обнаружен в тканях млекопитающих в 1928 году [1], а позднее в других организмах и типах клеток [1]. Эти ферменты были названы «неорганическими пирофосфатазами» (РРазы). Широкая распространенность пирофосфатаз связана с их значительной ролью в метаболизме клетки. PPi является побочным продуктом многих равновесных реакций, таких как синтез нуклеиновых кислот, белков, липидов и полисахаридов. В организме взрослого человека в результате этих реакций образуется несколько килограммов PPi в день. Гидролиз PPi пирофосфатазами смещает равновесие реакций в сторону синтеза указанных биологически активных соединений.

Хотя ферменты фосфорного обмена образуют один из наиболее обширных классов в природе, механизм их действия недостаточно изучен. Центральная роль РРаз в метаболизме, сравнительная простота пирофосфата как субстрата, делают их привлекательными объектами для изучения. Информация, полученная при исследовании этих ферментов, может быть использована и для понимания механизма действия других ферментов, катализирующих похожие реакции гидролиза неорганических полифосфатов или органических полифосфатов, например АТФ. К настоящему времени пирофосфатазы являются наиболее хорошо изученными белками этой группы.

Для каталитической активности РРазе необходимо присутствие ионов двухвалентных металлов таких как Mg2+, Mn2+, Zn2+ и ли Со2+ [2,3] .

Ионы Са являются сильным ингибитором гидролиза. Характер инактивирующего эффекта кальция является общим для всех известных пирофосфатаз. Ингибирование пирофосфатаз ионами кальция наступает при концентрации порядка

10'5 М, что соответствует пиковому уровню Са2+ в клетке [4]. Регуляция активности пирофосфатаз

-у, ионами Са служит средством контроля концентрации пирофосфата.

Данная работа посвящена рентгеноструктурному исследованию двух комплексов неорганической пирофосфатазы E.coli: с ионами Са2+ и, с ионами Са и кальции-пирофосфатом (CaPPi) при атомном разрешении. Анализ этих структур впервые позволил определить способ связывания пирофосфата и ингибирующих металлов.

В рамках этого исследования были решены следующие задачи: (1) получены кристаллы комплексов фермента; (2) разработана новая методика улучшения дифракционного качества кристаллов РРазы E.coli; (3) собраны наборы дифракционных данных для комплексов фермента с Са2+ и CaPPi до атомного разрешения; (4) проведено уточнение структур; (5) проведен анализ полученных структур и их сравнение со структурами других комплексов неорганических пирофосфатаз E.coli и S.cervesiae со специфическими лигандами (ионами металлов-активаторов и продуктами гидролиза), а также апофермента

9+

E.coli; (6) обсуждены причины ингибирующего эффекта ионов и механизм гидролиза субстрата на основе структурных данных.

Основные результаты и выводы

1. Найдены условия получения кристаллов комплексов неорганической пирофосфатазы E.coli с Са2+ и, с Са2+ и пирофосфатом.

2. Разработана методика улучшения дифракционного качества кристаллов пирофосфатазы, позволяющая увеличить максимальное разрешение до которого дифрагируют кристаллы с 1.8 до 1.2 - 1.1 А. Методика может быть использована для улучшения дифракционного качества других белковых кристаллов.

3. Собраны и обработаны наборы дифракционных данных для комплексов неорганической пирофосфатазы E.coli с Са2+ и, с и пирофосфатом кальция до 1.1 и 1.2 А соответственно.

4. Структуры полученных комплксов решены и уточнены до R-фактора 11.7 и 12.9%. Эти структуры являются первыми структурами ферментов семейства РРаз при атомном разрешении.

5. Детальный анализ активных центров комплексов фермента позволил выявить возможные причины ингибирующего эффекта Са . Присоединение ионов кальция искажает конформацию активного центра. Молекула пирофосфата в присутствие

Са2+ связывается в активном центре иначе чем в присутствие Mg , что препятствует достижению каталитически активной взаимной ориентации субстрата и атакующего нуклеофила в структуре CaPPi-PPa3bi.

6. На основе анализа активного центра CaPPi-PPa3bi, комплексов с продуктами реакции УРРазы и R78K-YPPa3bi смоделировано положение молекулы пирофосфата, которое вероятно реализуется при гидролизе. Это позволило подтвердить предположение о том что атакующим нуклеофилом является молекула воды между Ml и М2.

Благодарности

В заключении хочу выразить глубокую благодарность профессору Э.Г. Арутюняну, под чутким руководством которого был начата работа, за постановку задачи, неоценимую помощь, терпение и поддержку; а также сожаление о том, что основные результаты были достигнуты уже после его смерти.

Также хочется поблагодарить и выразить признательность:

К.М. Полякову, который взял на себя обязанности моего научного руководителя после Э.Г. Арутюняна, за помощь и советы в ходе работы.

A.Н. Попову - за помощь в проведении дифракционных экспериментов, плодотворное сотрудничество в ходе разработки методики улучшения дифракционного качества кристаллов пирофосфатазы, а также за помощь и советы в ходе уточнения структур и написания диссертации.

Профессору С.М. Аваевой - за полезные обсуждения результатов, замечательные идеи и проявленное терпение.

Н.Н. Воробьевой, Т.Н. Назаровой, Е.В. Родиной, С.А. Куриловой - за предоставление фермента, полезное обсуждение и доброе отношение.

Г.Д. Бартунику - за предоставление возможности работать в институте Макс-Планка и использовать часть рабочего времени на выполнение диссертационной работы.

B.C. Ламзину - за предоставление времени на станциях синхротронного излучения EMBL, г.Гамбург, а также возможности использования компьютерных мощностей и компьютерного времени EMBL.

Г.С. Качаловой - за интерес к работе, полезные практические советы и доброе отношение.

Всем сотрудникам лаборатории структуры биокристаллов - за советы, практическую помощь и благожелательное отношение.

1. А.А. Baykov, B.S. Cooperman, A. Goldman, and R. Lahti. Cytoplasmic Inorganic Pyrophosphatase (1999) Prog. Mol. SubcellBiol., v23, pl27-150

2. Kunitz M.J. (1952) J. Gen. Physiol., v.35, p423

3. Schlesinger M.J., Coon M.J. (1960) Biochim. Biophys. Acta, v.41(l), p30-36

4. Williams, RJ.P (1998) Calcium: outside/inside homeostasis and signalling. Biochim. Biophys. Acta, v. 1448, pl53-165

5. Kapylyla J., Hyytia Т., Lahti R., Goldman A., Baykov A.A., Cooperman B.S.(1995) Effect of D97E substitution on the kinetic and thermodynamic properties of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. Biochemistry, v34, p 792-800

6. Baykov A.A., Shestakov A.S., Kasho V.N., Yener A.V., Ivanov A.H. (1990) Kinetic and thermodynamics of catalysis by the inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli in both directions. Eur. J. Biochem., v 194, p 879-887

7. Baykov A.A., Shestakov. (1992) Two pathways of pyrophosphate hydrolysis and synthesis by yeast inorganic pyrophosphatase. Eur.J.Biochem., v 206, p 463-470

8. Cooperman B.S., Panackal A., Springs В., Hamm D. (1981) Divalent metal ion, inorganic phosphate analogue binding to yeast inorganic pyrophosphatase. Biochemistry, v 20, p 6051 -6060

9. Knight W.B., Dunaway-Mariano D., Ransom S.C., Villafranca JJ. (1984) Investigations of the metal ion-binding sites of yeast inorganic pyrophosphatase. J.Biol. Chem., v259, p 28862895

10. Cooperman B.S (1982) The mechanism of action of yeast inorganic pyrophosphatase. Methods Enzymol., v 87, p 526-548

11. Butler L.G., Sperow J.W. (1977) Multiply roles of metal ions in the reaction catalyzed by yeast inorganic pyrophosphatase. Bioinorg. Chem., v 7, p 141 150

12. Cooperman B.S., Baykov A.A., Lahti R. (1992) Evolutionary conservation of the active site of soluble inorganic pyrophosphatase. Trends Biol. Sci., v 17, p 262 266

13. Вайнонен Ю.П. Роль Zn2+ и Mn2+ в гидролизе субстратов неорганической пирофосфатазой Е. coli (1999) Дипломная работа, Москва, МГУ

14. Ting S.J., Dunaway-Mariano D. (1984) Investigation of the role of the substrate metal ion in the yeast inorganic pyrophosphatase. FEBS Lett., v 165(2), p251-253

15. Кузнецов A.B., Аваева C.M., Байков A.A., Склянкина В.А. (1977) Сравнительные кинетические исследования Mg2+ активируемого гидролиза триполифосфата и пирофосфата неорганической пирофосфатазой. Биохимия, т 42(7), 950-957

16. Мельник М.С., Назарова Т.И., Аваева С.М. (1982) Некоторые особенности гидролиза метилпирофосфата неорганической пирофосфатазой дрожжей. Биохимия, т 47(2) ,с 323 -328

17. Knight W.B., Fitts S.W.,Dunaway-Mariano D. (1981) Investigation of the catalytic mechanism of yeast inorganic pyrophosphatase. Biochemistry, v 20, p 4079 4086

18. Курилова С.А., Богданова A.B., Назарова Т.И., Аваева С.М. (1984) Субстраты неорганической пирофосфатазы из E.coli. Биоорганическая химия, т 10(9), с 1147 1152

19. Шестаков А.С. (1991) Дис. канд. хим.наук, Москва, МГУ

20. Мельник М.С., Назарова Т.Н., Аваева С.М (1984) Взаимосвязь субстратной специфичности неорганической пирофосфатазы из дрожжей и природы иона металла-активатора. Биоорганическая химия, т 10(11), с 1483 1489

21. Knight W.B., Ting S.J., Shaung S., Dunaway-Mariano D., Наготу Т., Sundaralingam M. (1983) Yeast inorganic pyrophosphatase substrate recognition. Arch. Biochem. Biophys., v 227(1), p 302-309

22. Курилова С.А., Назарова Т.Н., Аваева С.М. (1983) Гидролиз субстрата неорганической пирофосфатазы из E.coli. Биоорган, химия, т 9, 1032-1039.

23. С.М. Аваева, Н.Н. Воробьева, С.А. Курилова, Т.И. Назарова, К.М. Поляков, Е.В. Родина, В.Р. Самыгина (2000) Механизм ингибирования неорганической пирофосфатазы Esherichia coli ионами кальция. Биохимия, т 65(3) с 442-458

24. Унгурите А.П., Смирнова И.Н., Кашо В.Н., Байков А.А. (1989) Сравнение каталитичеческих свойств неорганических пирофосфатаз митохондрий и цитозоля печени крыс. Биол. мембр., т.6, N4, с 356 361

25. Sklyankina V.A., Avaeva S.M. (1990) The quaternary structure of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase as essential for phosphorylation Eur. J. Biochem., vl91,p 195-201

26. Волк C.E., Павлов A.P., Байков A.A. (1984) Мембранная неорганическая пирофосфатаза. Роль SH-групп в проявлении гидролитической активности. Биоорг. химия, т 10 (2), с 204 212

27. Кашо В.Н., Байков А.А., Аваева С.М. (1982) Сравнение эффекта фторида на три фермента, гидролизующие пирофосфат кислые и щелочные фосфатазы и неорганическую пирофосфатазу. Биохимия, т 47(8), с 1289-1292

28. Shestakov А.А., Baykov А.А., Avaeva S.M. Tightly bound pyrophosphate in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase (1990) FEBS Lett., v 262, N 2, 194-196

29. T. Sivula, A. Salminen, A.N. Parfenev, P. Pohjanjoki, A. Goldman, Cooperman B.S., Baykov A.A, Lahti R.(1999) Evolutionary aspects of inorganic pyrophosphatase. FEBS Lett., v454(l), p 75-80.

30. Махалдиани B.B., Смирнова E.A., Воронова A.A., КурановаИ.П., Арутюнян Э.Г., Ванштейн Б.К., Хене В., Бинвальд Б., Хансен Г. (1978) Докл. Акад. Наук СССР, т 240, с 1478- 1481

31. Kankare J., Neal G, Salaminen Т., Glummoff Т., Cooperman B.S., Lahti R., Goldman A. (1994) The structure of E. coli soluble inorganic pyrophosphatase at 2.7 A resolution. Protein Eng., v 7, p 823 830

32. Oganessyan V.Y., Kurilova S.A., VorobyevaN.N., Nazarova T.I., Popov A.N., Lebedev A.A., Avaeva S.M., Harutyunyan E.H. (1994) X-ray crystallographic studies of recombinant inorganic pyrophosphatase from Escherichia coli. FEBS Lett v348, p 301-304

33. Teplyakov A., Obmolova G., Wilson K.S., Ishii K., Kaji H., Samejima Т., Kuranova I. (1994) Crystal structure of inorganic pyrophosphatase from Thermus thermophilus. Protein Sci., v3, p 1098-1107

34. Kankare J., Neal G, Salaminen Т., Lahti R, Cooperman B.S., Baykov A.A, Goldman A. (1996) Inorganic Pyrophosphatase at 2.2 A resolution. Acta Crystal., D52, p 551-563

35. Heikenheimo P., Tuominen V., Lahti R., Cooperman В.S.,Goldman A. (1996) The structural basis for pyrophosphatase catalysis. Structure, v4, p 1491 1508

36. Leppanen V-M., Nummelin H., Hansen Т., Lahti R., Schafer G., Goldman A. (1999) Sulfolobus acidocaldaris inorganic pyrophosphatase: structure, thermostability, and effect of metal in the archael pyrophosphatase. Protein Sci., v 8, p 1218 1231

37. Kankare J., Neal G, Salaminen Т., Lahti R, Cooperman B.S., Baykov A.A, Goldman A. (1996) Crystallographic identification of metal-binding sites in E.coli inorganic pyrophosphatase. Biochemistry, v 35, p 4670 4677

38. Родина E.B.(1998) Дис. канд. хим. наук, Москва, МГУ

39. Е.Н. Harutyunyan, Kuranova I.P.,Vanshtein В.К., Hohne W.E., Lamzin Y.S., Dauter Z, Teplyakov A.Y., Wilson K.S. (1996) X-ray structure of yeast inorganic pyrophosphatase complexed with manganese and phosphate. Eur. J. Biochem., v 239, p 220 228

40. Avaeva S.M., RodinaE.V., Kurilova S.A., Vorobyeva N.N., Harutyunyan E.H., Oganessyan V.Y (1995) Mg2+ activation of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. FEBS Lett v377, p 44-46

41. J. M. Harp, D.E.Timm and J.Bunick (1998) Macromolecular Crystal Annealing: Overcoming Increased Mosaicity Associated with Cryocrystallography. Acta Cryst D54,622-628

42. Otwinowski Z., Minor W. (1997) Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol., v 276, p 307 326

43. French S. & Wilson A.J.C. (1978) On the treatment of negative intensity observation. Acta Crystal. A34, p 517 525

44. Navaza J. (1994) AMoRe: an Automated Package for Molecular Replacement. Acta Crystal, A50, pl57 -163

45. Colobarative Computational Project, Number 4 .The CCCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography (1994) Acta Crystal D52, p 760 763

46. Murshudov G., Vagin A., Dodson G (1996) in The Refinement of Protein Structures, Proceedings of Daresbury Study Weekend.

47. Jones A.T, Zou J.Y., Cowan S.W., Kjeldgaard M. (1991) Improved methods for building protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Crystal A47, p 110— 119

48. G.W. Sheldrick and T. R. Schneider (1997) SHELX: High-resolution refinement. Methods In Enzymology 227, 319-343

49. E.F. Garman and T. Schneider (1997) Macromolecular Cryocrystallography. J. Appl. Cryst., 30,211-237

50. Hope H., Frolow F., von Bohlen K., Makowski L., Katky C., Halfon Y., Danz H., Webster P., Bartels K.S., Wittmann H.G. & Yonath A.(1989) Cryocrystallography of ribosomal particles. Acta Cryst B45, 190-199

51. Gonzales A & Nave С (1994) Radiation damage in protein crystals at low temperature. Acta Cryst D50, 874-877

52. Kurinov I.V. & Harrison (1995) The influence of temperature on lysozyme crystals. Structure and dinamics of protein and water. Acta Cryst D51, 98-109

53. V.S. Kumaraswamy, P.F. Lindley, C. Slingsby and D. Glover (1996) An eye lens protein-water structure: 1.2 A resolution structure of yB-crystallin at 150 K. Acta Cryst. D52, 611-622

54. G.A. Petsko (1975) Protein Crystallography at Sub-zero Temperatures: Cryo-protective Mother Liquors for Protein Crystals. J. Mol. Biology, v 96, 381-392

55. D.W. Rodgers. Practical Cryocrystallography (1997) Methods in Enzymology, V.276,183-203

56. Антонюк C.B. Прострпнственная структура димарганцевой каталазы thermus thermophilus с разрешением 1А .- Диссертационная работа канд. Физ-мат. наук, М., 2000

57. С.С.Н. Chen and О. Herzberg (1992) Inhibition of (3-Lactamase by clavulante trapped intermediates in cryocrystallographic studies. J.Mol.BioL, v 224, 1103-1113

58. T. Schneider (1995) Crystallography at EMBL- Hamburg.Practical Guide.

59. J.I.Yeh, W.GJ. Hoi (1998) A flesh-annealing technique to improve diffraction limits and lower mosaicity in crystals of glycerol kinase. Acta Cryst D54,479-480

60. J. M. Harp, B.L. Hanson, D.E. Timm J.Bunick (1999) Macromolecular Crystal Annealing: evalution of techniques and variabales. Acta Cryst D55, 1329-1334

61. R.Sousa (1995) Use of Glycerol, Polyols and Other Protein Structure Sabilizing Agents in Protein Crystallization. Acta Cryst D51, 271-277

62. Z.Q. Fu, G.C. DuBois, Sh. P. Song, R.W. Harrison and I.T. Weber (1999) Improving the diffraction quality of MTCP-1 crystals by post-crystallization soaking. Acta Cryst D55, 5-7

63. M.A. Rould, J.T. Perona & T.A. Steitz (1991) Structural basis of anticodon loop recognition by glutaminyl-tRNA synhetase. Nature, 352, 213-218

64. E.P.Mithchell and E.F. Garman (1994) Flash freezing of protein crystals: investigation of mosaic spread and diffraction limit with variation of cryoprotectant concentration.

65. H.Pelletier and J. Kraut (1992) Crystal structure of a complex between electron transfere partners, cytochrom с peroxidase and citochrome c. Science, v.258, 1748-1755

66. Ren J, Esnouf, R., Garman, E., Somers, D., Ross, C., Kirby, I., Keeling, J., Darby, G., Jones Y., Stuart, D. & Stammers. D. (1995) High resolution structure of HIV-1 RT from four RT-inhibitor complexes. Nature Struct. Biol., 2, 293-302

67. Esnouf, R. M., Ren J., Garman, E.F., Somers, D.O., Ross, C.K., Jones Y.E., Stammers. D.K. and Stuart D.I. (1998) Continuous and discontinuous changes in the unit cell of HIV-1 revers.transcriptase crystals on dehydration. Acta Cryst D54, 938-953

68. Izard Т., Sarfaty S., Westphal A. Kok A and W.G.J. Hoi (1997) Improvment of diffraction quality upon rehydration of dehydrated icosahedral Enterococcus faecalis pyruvate dehydrogenase core crystals. Protein Science , 6,913-915

69. Lazovski R. A., MacArthur M.V., Moss D.S. & Thornton J.M (1993) PROCHECK: a programm to check the stereochemical quality of protein structures. J.Appl. Cryst. 26,283-291

70. Cruickshank D.W.J. (1999) Remarks about structure precision. Acta Crystal. D55, 583-601

71. Samygina Y.R., Antonuk S.V., Lamzin V.S., Popov A.N. (2000) Improving the X-ray resolution by reversible flash-cooling combined with concentration screening, as exemplified with PPase. Acta Crystal. D56, 595-603

72. Harding M. (1999) The geometry of metal-ligand interactions relevant to proteins. Acta Crystal D55, p 1432 1443

73. McCarthy W.J., Smith D.M., Adamowicz, Ortega-Blake I. (1998) An ab initio study of the isomerization of Mg- and Ca-pyrophosphates. J. Am. Chem. Soc., 120,6113-6120.

74. Romero I., Celis H. (1995) Comparison of the hydrolysis of Zn-PPi2- and the MgPPi2- as substrates and the effect of free cations upon membrane-bound pyrophosphatase of Rhodospirillum rubrum. Biochimie, 77, 949 952

75. Knight W.B., Fitts S.W. & Dunway-Mariano D. (1981) Investigation of the catalytic mechanism of yeast inorganic pyrophosphatase. Biochemistry 20, 4079-4086

76. Konsowitz L. & Cooperman B.S. (1976) Solvent isotope effect in inorganic pyrophosphatase catalyzed hydrolysis of inorganic pyrophosphate. J. Am. Chem. Soc. 98, 1993-1995

77. Baykov, A.A., Hyytia, Т., Volk, S.E., Kasho, V.N., Vener, A.Y., Goldman, A., Lahti, R. & Cooperman, B.S. (1996). Catalysis by Escherichia coli inorganic pyrophosphatase: pH and Mg^ dependence. Biochemistry, 35, 4655-4661.