Физико-химическое и кристаллографическое исследование пирофосфатазы и карбоксипептидазы из термофильных микроорганизмов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ
Обмолова, Галина Васильевна
АВТОР
|
||||
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
1990
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
01.04.18
КОД ВАК РФ
|
||
|
1 и Ги
АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ КРИСТАЛЛОГРАФИИ им. А.В.ШУБНИКОВА
На правах рукописи
ОБМОЛОВА ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА
УДК 548.737
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЕ И КРИСТАЛЛОГРАФИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПИРОФОСФАТАЗЫ И КАРБОКСИПЕП-ТИДАЗЫ ИЗ ТЕРМОФИЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Специальность 01,04.18 - Кристаллография, физика
кристаллов
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва 1990
Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте кристаллографии им. А.В.Шубникова АН СССР
Научные руководители: доктор физико-математических
наук, академик Б.К.Вайнштейн
кандидат химических наук И.П.Куранова
Официальные оппоненты: доктор химических наук
A.A.. Байков
кандидат биологических наук М.Б.Гарбер
Ведущая организация: Институт молекулярной
биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР
Защита диссертации состоится 17 октября 1990 г. на заседании Специализированного совета Д 002.58.01 при Институте кристаллографии АН СССР по адресу: 117333 Москва, Ленинский проспект, 59.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии АН СССР
Автореферат, разослан 17 сентября 1990 г.
Ученый секретарь Специализированного совета кандидат физ.-мат. наук В.М.Каневский
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Рентгеноструктурный анализ является самым мощным из физических методов, применяемых в настоящее время для изучения пространственных структур биологических макромолекул. Точное знание пространственной структуры необходимо для понимания механизма действия ферментов и направленного изменения их свойств методами генной инженерии. Несмотря на крупные достижения белковой кристаллографии в последние годы, получение совершенных и достаточно крупных монокристаллов белков по-прежнему остается лимитирующей стадией ренггеноструктурного анализа и во многом определяет его успех.
Карбоксипептидазы - это аминопептидазы, гидролизующие аминокислоты с С-концов полипептидных цепей. Вместе с другими пептидазами они играют исключительно важнуюроль в обмене веществ всех живых организмов - от бактерий и низших грибов до высших животных и человека. В настоящее время известны пространственные структуры карбоксипептидаз А и В, выделенных из млекопитающих. Однако, ряд важнейших вопросов, связанных с механизмом их действия, до сих пор остается нерешенным. Карбо-ксипептидаза ТЬегшоасг^потус&з обладает смешанной по сравнению с карбоксипептидаэами Д и В специфичностью. Детальное изучение строения активного центра этого фермента позволит выявить наиболее существенные особенности, ответственные за изменение специфичности,и понять механизм его действия.
Неорганические пирофосфатазы участвуют в процессах-, сопровождающих перенос энергии фосфатными группами. До сих пор неорганическая пирофосфатаза дрожжей остается единственным представителем этого класса, для которого установлена пространственная структура. Расширение спектра исследуемых пирофосфатаз, их всесторонняя характеристика, а также определение пространственной структуры позволит выяснить эволюционные отношения среди пирофосфатаз, выделить особенности строения, наиболее существенные для выполняемой функции.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ — физико-химическое и кристаллографическое исследование двух белков, выделенных из термофильных микроорганизмов - карбоксипептидазы ТЬегтоас-Ьхпотусез и пирофосфатазы ТЬегшиэ ЬЪегторЬгХиз.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Б результате проведенного исследования получены кристаллы карбоксипептидазы ТЬегтоас-Ь^пошусев , методами изоморфного и молекулярного замещения определена
„ о
структура этого фермента при разрешении 3 А, и получено прямое экспериментальное доказательство сходства пространственных структур карбоксипептвдаз бактерий и животных. Разработана методика выделения нового представителя семейства пирофос-фатаз - пирофосфатазы из экстремально'термофильной бактерии Т11егптз 1;Ьегтор11х1из, определены важнейшие физико-химические характеристики этого фермента. Установлено, что пирофосфагаза ТЬеттиэ -Ы1егпор111.1из является металлоактивируемым ферментом, проявляет максимальную активность в присутствии ионов магния и по гермостабильносги превосходит все известные пирофосфатаэы из других источников. Получены кристаллы пирофосфатазы, пригодные для рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Полученные в настоящей работе результаты являются основой для определения пространственной структуры карбоксипептидазы ТЬегтоасЫпотусез и пирофосфатазы ТйегтиБ 1ЬегторЬ11иБ с высоким разрешением. Знание пространственной структуры карбоксипептидазы позволит выработать рекомендации для создания фермента с измененными свойствами с целью дальнейшего его использования при получении инсулина . Изучение свойств пирофосфатазы, выделенной из экстремально термофильной бактерии, определение ее пространственной структуры позволит понять механизм каталитической активности и объяснить высокую термостабильность этого фермента.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты работы докладывались на 5-ом Всесоюзном симпозиуме "Структура биологических макромолекул" (Звенигород, 1987), на конкурсе научных работ в Икс-_ титуте кристаллографии АН СССР (1987).
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 5 работ. Список публикаций приведен в конце автореферата.
ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы. Она изложена на страницах,
содержит рисунков и тг1блиц.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Введение включает в себя постановку задачи и краткое изложение диссертации.
ГЛАВА 1. КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ БЕЛКОВ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР).
Экспериментам по поиску условий кристаллизации белка предшествует получение его в виде активного и гомогенного препарата. Эффективность и быстрота очистки белка зависят главным образом от выбора методов разделения и их последовательности. Для определения гомогенности препарата как правило используют несколько аналитических методов: изоэлектрофокусирование, электрофорез, И-концевой анализ. Для белков, предназначенных для кристаллизации, важно не только отсутствие примесей каких-либо других белков, но и целостность полипептидной цепи и конформа-ционная гомогенность.
Кристаллизация белков происходит из пересыщенных растворов. Все используемые в настоящее время методы кристаллизации заключаются в медленном изменении параметров среды, приводящем к образованию такого раствора. Скорость роста кристаллов в значительной степени определяет их качество, в том числе дифракционные свойства. Чтобы уменьшить вредное влияние конвекционных по»
токов, кристаллизацию проводят с применением гелей или в невесомости.
Для того, чтобы вырос изометричный кристалл, скорости роста различных его граней должны быть близки. Степень пересыщения, а вместе с ней и концентрация белка, являются очень тонкими инструментами селективного влияния на скорость роста граней. Изменение рН раствора, кристаллизация в присутствии ионов металлов часто используются для получения кристаллов с другим габитусом или иной кристаллической модификации. Детергенты способствуют кристаллизации макромолекул, препятствуя их спонтанной агрегации за счет гидрофобных взаимодействий. Использование детергентов открыло возможность кристаллизации мембранных белков.
Процесс получения кристаллов - один из самых длительных и трудоемких этапов в определении структуры белка. Автоматизация приготовления растворов и распределения их по микропробам в начале исследования позволяет перебрать иолыиое количество вариантов и улучшает воспроизводимость результатов.
ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЕ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ ТЪеглоасМпотусев. Карбоксипептидаза ТЬегшоасЪ1пошусез (карбоксипептидаза Т), фермент с молекулярной массой 38000 дальтон, относится к классу металлокарбоксипептидаз и обладает смешанной, по сравнению с карбоксипептидазами А и В, специфичностью. Карбоксипептидаза Т была выделена и очищена из бактерий ТЬегтоас^потусеБ во ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов С13.
Кристаллы фермента, пригодные для рентгеноструктурного анализа, получены методом диффузии в парах при комнатной температуре из раствора, содержащего 14-17 мг/мл белка, 1 мМ сульфата цинка и 3 % 2-метил-2,4-пентандиола в 0,05 М МЕЗ-НаОН буфере, рН 6,0. Концентрация сульфата аммония в противорастворе составляла 32-35%. Через 5-6 недель кристаллы в виде гексагональных бипирамид достигали максимальных размеров 0,8x0,8x0,7 мм. Кристаллы принадлежат к гексагональной пространственной
о
группе Р6^22 с параметрами ячейки: а= Ь= 159,5, с -106,9 А» Как показал дальнейший рентгеноструктурный анализ, содержание
растворителя в кристаллах составляет около 80%. Кристаллы дают
©
дифракционную картину при разрешении 2,0 А.
Кристаллы комплекса карбоксипептидазы Тс ВЬ -бензилянтар-
ной кислотой получали настаиванием нативных кристаллов в кон-
-5 -3
сервирующем растворе, содержащем от 10 до 10 М ингибитора. CвязывaниJ бензилянтарной кислоты контролировали по прецессионным рентгенограммам. Изменения дифракционной картины были такие же, как для кристаллов комплекса, полученных сокристал-лизацией, хотя в последнем случае качество кристаллов было хуже.
Изоморфные тяжелоатомные производные карбоксипептидазы Т получены путем настаивания кристаллов нагивного белка в 3 мМ растворах НбВг2 и КгР-Ь(БСН)ц. Вхождение тяжелых атомов контролировали по прецессионным рентгенограммам.
Наборы ингенсивностей дифракционных отражений для кристал-
о
лов нативного белка при разрешении 3 А и для кристаллов тяжело-
о
атомных.производных при разрешении 4 А получены на дифрактомет-ре "З^г^ех Р 2 ^ " . Каждый набор получен с одного кристалла. Параметры наборов приведены в табл.1.
Кристаллическая структура карбоксипептидазы Т была определена методом молекулярного замещения, а правильность решения подтверждена с помощью метода изоморфных замещений. Функция
Таблица 1. Характеристики наборов экспериментальных данных карбоксипептидазы Т.
Набор Нативный невг2 к^-ьСзсл)^
0 разрешение, А 3,0 4,0 4,0
Число' отражений 36000 7500 • 10000
й1/1,'% 10 15 15
В , % вут сгуэ-Ь* 3,8 15,2 5,2 17 ,0
максимальное уменьшение интенсивности контрольных отражений,
/Цг1+Р2|., где 1'1 и ?г - структурные амплитуды эквивалентных отражений, 71ррн-рр1 /I Гр> где Гр и Грц - структурные амплитуды нативного белка и производного.
Л1/1 -й
Бут
Н
СГуБХ
вращения-Кроутера [23 с использованием модели карбоксипептидазы А СЗЗ, дифракционных данных в зоне разрешения 10-3 А и рао
диуса интегрирования 15 А содержала три пика, один из которых соответствовал правильному решению. С помоиью функции трансляции [43 молекулу карбоксипептидазы удалось разместить в кристаллической ячейке так, чтобы не возникало недопустимо близких контактов, и в то же время обеспечивалась стабильность всей структуры. Упаковка молекул карбоксипептидазы Т в кристалле показана на рис. 1.
Места присоединения тяжелых атомов в производных карбоксипептидазы Г определены по разностным синтезам Паттерсона. Карта электронной плотности, рассчитанная с "изоморфными" фазами
о
в зоне разрешения 20-4 А ( и= 0,48) , позволила выделить область, занятую молекулами белка (рис. 2). Результат совпал с данными молекулярного замещения.
Исходная модель карбоксипептидазы уточнялась по программе СОКЕЬБ [51, в результате чего кристаллографический Е-фактор (£1 г'о-Гс I , где Ро и Р^ - экспериментальные и расчетные
Рис.2. Карта электронной плотности карбоксипептидазы Т при
о
разрешении 4 А по данным изоморфного замещения. Разбиение ячейки: 120x120x72. Приведено наложение первых 12 сечений.
структурные амплитуды) снизился с 0,50 до 0,34 в зоне раэреше-ния 10-3,5 А. Далее аминокислотные остатки в модели были заменены в соответствии с последовательностью карбоксипептидаэы Т, и уточнение продолжено по программе PR0LSQ [63 до R = 0,30 при
о
разрешении 3 А.
Укладка полипептидной цепи в карбоксипептидззе Т в целом соответствует структуре карбоксипептидаэы А. Структура относится к oL/jl -типу. Ядро молекулы образует 8-цепочечный скрученный р>-слой и 6 Ы.-спиралей, расположенных по одну сторону от него. Полипептидная цепь с другой стороны jS-слоя почти не содержит элементов вторичной структуры.
В результате проведенного исследования получено прямое экспериментальное доказательство того, что карбоксипептидаэы прокариотов и панкреатические карбоксипептидаэы животных принадлежат к одному семейству. Сходство пространственных структур карбоксипептидаз Т и А и смешанный тип субстратной специфичности, наблюдающийся у карбоксипептидаэы Т, подтверждает предположение о существовании общего предшественника и дивергентной эволюции ферментов с образованием двух подсемейств с различной субстратной специфичностью.
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ПИРОФОСФАТАЗЫ Thermus thermophilus.
Неорганические пирофосфатазы катализируют гидролиз фосфо-ангидркдной связи неорганического пирофосфата. Освобождающаяся nprf этом энергия способствует завершению биосинтетических реакций. Наиболее полно охарактеризованы неорганические пиро-фосфатазы, выделенные из дрожжей и Е. coli. Методом ренггено-структурного анализа установлена пространственная структура пирофосфатазы дрожжей при разрешении 2,35 А С71. Работа по определению пространственной структуры пирофосфатазы Е. coli проводится в Институте кристаллографии ЛН СССР.
В настоящей работе была разработана методика выделения пирофосфатазы из экстремально термофильных бактерий Thermus thermophilus НВ8 (пирофосфатаза Т). Бактериальную массу выращивали в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов ДН СССР. Клеточные стенки разрушали с помощью лизоцима [8]. Активность пирофосфатазы определяли по скорости образования фосфата из пирофосфата магния при 37°С [9}. .Рв.чтвор для определения активности содержал 0,2 мМ пирофосфата магния, 2 мМ сульфата
Таблица 2. Схема очистки пирофосфатазы Т.
Удельная Выход,
Стадия выделения активность, %
ед./мг
I . Первичный экстракт 2,7 . 100
II .Фракционирование
сульфатом аммония 8 90
III.Хроматография на ВЕАЕ-
сефарозе в 20 мМ Тг1з-
НС1, рН 8,5, 5 мМ
МвБО^, 10 мМ меркапто-
этанола 26 76
IV .Хроматография на ОЕАЕ-
сефарозе в 50 мм ими-
дазол-НС1, рН 6,6 210 60
Уа .Гель-фильтрация на
ультрагеле аСа-34 в
" 20 мМ ТГ1Б-НС1, рН 8,5 500 36
УЪ .Гидрофобная хроматогра-
фия на В\гЬу1-Тоуореаг1
650 в 20 мМ Тг1в-НС1,
рН 7,5 500 48
VI .Рехроматография на
РЕАЕ-сефарозе в 20 мМ
ТГ18-НС1, рН 8,5 600 20-30
магния в 0,1 M Tris-HCl буфере, рН 8,5. Схема очистки пирофосфатазы Т представлена в табл. 2.
Экстракт водорастворимых белков фракционировали сульфатом аммония. Фракцию, выпадавшую при концентрации соли от 40 до 80% обессоливали на сефадексе, диализовали и разделяли на колонке (3,5 х 35 см) с DEAE-сефарозой CL-6B при рН 8,5 (стадия III) и рН 6,6 (стадия IV). Дальнейшую очистку проводили двумя
способами.Растворы, содержащие пирофосфатазную активность, разделяли либо на колонке (2,6 х 90 см) с ультрагелем АсА-34, либо на колонке.(2,6 х 30 см) с Butyl-Toyopearl 650 - ионооб-меннике со слабо выраженными гидрофобными свойствами. Замена стадии гель-фильтрации на гидрофобную хроматографию.улучшала выход пирофосфатазы. Фермент, гомогенный по данным диск-электрофореза Сю], был получен после дополнительной стадии хроматографии на DEAE- сефарозе при рН 8,5.
Молекулярная масса пирофосфатазы Т, определенная методом гель-фильтрации СИ] на колонке (1,6 х 100 см) с ультрагелем АсА-34, уравновешенной 20 мМ Tris-HCL буфером рН 7,5, составила 115 кДа.
Молекулярная масса субьединицы, определенная методом электрофореза в полиакриламидном геле С додецилсульфатом натрия [12], составила 20 кДа. То, что при этом проявляется только одна полоса, означает, что молекула нативного фермента состоит из шеста субьединиц, одинаковых по массе.
Максимальную активность в присутствии ионов магния пиро-фосфатаза Т проявляет при рН 8,3-9,5. Рёзультаты измерения активности пирофосфатазы Т в присутствии различных двухвалентных металлов представлены в табл. 3. Активность определяли при 37° С в 0,1 Tris-HCl буфере рН 7,9, в растворе, содержащем 0,2 мМ пирофосфата натрия, ионы металла[9].
Таблица 3. Влияние ионов металлов на активность пирофосфатазы Т.
Ионы Концентрация Активность
металлов ионов металла, мМ %
Mg2 + 1,0 100
Мп2 + 0,25 68
Zn2 + 0,25 58
Со2 + 0,25 19
Са2 + 0 ,6 0
Таблица 4. Бремя полуинактивации пирофосфатазы Т при нагревании.
Температура, Время полуинактивации, мин
2 + EDTA+Ca EDTA+Mg2+
°С Без добавок EDTA
75 00 22 со 00
90 72 <1 63 72
Зависимость активности от температуры определяли в интервале от 25 до 96°С. Максимальная активность наблюдалась при 90°С. Исследовалось также влияние ионов металлов на время полуинактивации пирофосфатазы Т' (табл. 4) . Удаление ионов металлов из раствора с помощью EDTA резко снижает устойчивость фермента к тепловой денатурации. Добавление Mg2 + или Са2+ оказывает стабилизирующее действие.
Определен аминокислотный состав пирофосфатазы Т. Как видно из табл. 5, обнаруживается большое сходство с пирофосфата-зой Е. coli [13j.
Кристаллы пирофосфатазы Т, пригодные для рентгеноструктур-ыого анализа, получали методом диффузии в парах. К раствору бэлка с концентрацией 15 мг/мл в 20 Ttis-HSl буфере, pH .7,5, содержащему 2 мМ сульфата магния, добавляли 2-метил-2,4-пентандиол до концентрации 3% (об.) и 4 М водный раствор сульфата аммония без шдедаавительного подщелачивания до концентрации 28 % (об.). Насыщающий раствор содержал только сульфат аммония в концентрации 46-50 i (об.). Через 3 дня появлялись зародыши кристаллов. Повышение концентрации на 2-3 % приводило к дальнейшему росту кристаллов. Через 2 недели кристаллы достигали максимальных размеров 0,6 х 0,6 х 0,5 мм.
Кристаллы пирофосфатазы Г принадлежат к ромбоэдрической пространственной группе R32 с параметрами ячейки: а=Ъ =110,3, с - 82,0 А. Исходя из молекулярной массы пирофосфатазы Т 115 кДа, можно заключить, что в кристаллической ячейке содержится 3 гексамера белка - по одной субъединице в асимметричной части ячейки. При этом удельный объем, приходящийся на единицу
о з
массы, (vn> составляет 2,5 А /Да, что соответствует среднему значению для кристаллов белков. Таким образом установлено, что гокелмер пирофосфатазы Т состоит из одинаковых мономеров, свя-тлкних кристаллографическими осями симметрии 3-го и 2-го по-
Таблица 5. Аминокислотный состав и вычисленный молекулярный вес пирофосфатаз из ГпЛпеги и .¡е.Со11
Источник Thermus Escherichia
tbermophilus coli [83
Asx 18 21
Ihr 5 4
Ser 5 8
Glx 20 17
Pro 11 13
Gly 20 9
Ala 15 16
Су s 1 2
Val 14 16
Met 2 3
Ile 7 10
Leu 19 15
Туг 7 '8
Fhe 4 б
His 3 5
Lys 13 16
Arg 9 4
Trp 0 2
Число остатков 173 175
Масса мономера 21872 22682
Масса гексамера 131232 136092
рядка. Центры гексамеров лежат на пересечении этих осей. Полученный результат хорошо согласуется с данными рентгеноструктур-ного анализа пирофосфатазы Е. coli при разрешении 5 А C14J Это свидетельствует о возможном сходстве их пространственных структур.
- И -
Полный набор дифракционных отражений при разрешении 2,0 А
собран с одного кристалла пирофосфатазы Т в течение 3 сут.
Набор, включающий 13387 отражений, является основой для определения пространственной структуры пирофосфатазы Т.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
1. Разработана методика выращивания кристаллов карбоксипепти-. дазы Т, пригодных для рентгеноструктурного анализа. Получены кристаллы кативного белка, двух.тяжелоатомных производных и комплекса с бензилянтарной кислотой. Определена их пространственная группа и параметры элементарной ячейки.
2. Получены наборы дифракционных отражений для кристаллов на-
о
тивной карбоксипептидазы при разрешении 3 А и двух тяжелоатомных производных при разрешении 4 А.
3. Определена кристаллическая структура карбоксипептидазы Т методами молекулярного и изоморфного замещения. Получено прямое экспериментальное доказательство сходства пространственных структур карбоксипептидаз бактерий и животных.
4. Разработана методика выделения новой неорганической пирофосфатазы из 'бактерий ТЬегтиэ ЪЬегтор11а1из .
5. Определены молекулярная масса, число субъединиц, аминокислотный состав пирофосфатазы Т. Показано, что она является металлоактивируемым ферментом и проявляет максимальную активность в присутствии ионов магния.
6. Установлено, что пирофосфатаза Т по термостабильности превосходит все известные пирофосфатазы из других источников.
7. Получены кристаллы нативной пирофосфатазы Т, пригодные для рентгеноструктурного анализа. Определена их пространственная группа и параметры элементарной ячейки.
8. Получен набор дифракционных отражений для кристаллов нативной пирофосфатазы Т при разрешении 2 А.
МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ: 1. Обмолова Г.В., Куранова И.П., Поляков K.M., Мосолова О.В., Руденская Г.Н., Степанов В.М. Карбоксипептидаза Т - кристаллизация и предварительное рентгеноструктурное исследование. - Кристаллография, 1988, том 33, вып.2, с.517.
2. Куранова И.П., Обмолова Г.В. Способ получения кристаллов карбоксипептидазы Г.- Авторское свидетельство № 1442547, 1937.
3. Поляков К.М., Обмолова Г.В., Куранова И.П., Строкопытов
Б.В., Вайнштейн Б.К., Мосолова О.В., Степанов В.М., Руден-ская Г.Н. Рентгеноструктурное исследование карбоксипепти-
е
дазы Г термоактиномицетов с разрешением 3 А. - Молекулярная биология, 1989, том 23, »1, с.266-272.
4. Куранова И.П., Обмолова Г.В., Конарева Н.В. Неорганическая пирофосфатаза из экстремально термофильной бактерии Thermus thermophilus НВ8. - Доклады АН СССР, 1987 , том 295, »4, с.1013-1016.
5. Hohne W.E., Wessner Н. , Kuranova I.P., Obnolova G.V. Kinetic characterization of a thermostable inorganic pyrophosphatase from Thermus thermophilus. - Biomed. Biochim. Acta, 1988, v.UT, N12, р.9И-9^7.
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Остерман А.Л., Степанов В.М., Руденская Г.Н., Ходова О.М., Цаплина И.А., Яковлева М.Е., Логинова Л.Г. Карбоксипепти-даза Т - внеклеточная карбоксипептидаза термоактиномицетов - отдаленный аналог карбоксипептидаз животных. - Биохимия, 1984, том 49, №2, 292-301.
2. Crovther R.A. In: The Molecular Replacement Method, ed. Rossmann M.G. Int. Sci. Rev., r.13, Hew York: Gordon and Breach, 1972, p.173-178.
3. Rees D.C., Lewis M., Lipscomh W.H. Refined crystal struc-
, о
ture of carhoxypeptidase A at 1.54 A resolution. - J. Mol.
Biol., 1983, v.168, p.367-387.
4. Вагин А.А. Использование некристаллографической симметрии
в структурной кристаллографии Белков. - Дисс. на соиск. уч. степ. канд. физ.-мат. наук, Москва, 1983.
5. Sussman J.L., Holbrook S.E., Church G.M., Kim S.H. A structure-factor least-squares refinement procedure for шасгоио-lecaiar structures using constrained and restrained рагагги:--ters. - Acta Crystallogr., 1977, V.A33, p.800-8cU.
6. Hendrickson W.a., Konnert J.H. In: Biomolecular Structure Conformation, Function and Evolution, ed. Srinivasan R., Oxford: Pergamon Press. 1981, v.1, p.1*3-57.
7. Чиргадзе Н.Ю'Г, Куранова И.П., Невская H.A., Тепляков A.B., Вильсон К., Строкопытов Б.в., Арутюнян Э. Г., Хене В. Кристаллическая структура МпР комплекса неорганической
I>
пирофосфатазы дрожжей при разрешении 2,35 А. - кристаллография, 1990, в печати.
8. Морозов И.А., Гамбарян A.C., Венкстерн Т.В. тРНК(аденин-1-) метилтрансфераза из thermus thermophilus НВ8.- Молекулярная биология, .1984, т.18, №5, с.1363-1368.
9. Taussky H.H., Schorr Е. A microcolorimetric method for the determination of inorganic phosphorus. - J. Biol. Chem., 1953, v.203, Ho.2, p.675-685.
10. Davis B.J. Disc electrophoresis. 2. Method and application to human serum proteins. - Ann. Hev York Acad. Sei., 1961t, v.121, Но.2, p Д 0lt-U27 •
11. Methods of biochemical analysis / ed. D. Click, N.Y.; L.: Intersci. Puhl., 1970, v.18, p.1-53.
12. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T.U. - Mature, 1970, v.227, Ho.5259, p.680-685.
13. Lahti R., Pitkaranta Т., Valve E., Uta I., Kukko-Kalske E., Heinonen J. Cloning and characterization of the gene encoding inorganic pyrophosphatase of Esheri'chia coli K-12. - J. Bacteriology, 1988, v.170, Ho.12, p.5901-5907.
14. Мороз O.B.,Строкопытов Б.В.,Оганесян В.Ю.,Айрумян Л.Г., Некрасов КЗ.В. .Назарова Т .И. ,Курилова С. А. , Воробьева H.H., Терзян С.С.,Аваева С.Ч.,Арутюнян Э.Г. Исследование неорганической пирофосфатазы из E.Coli с разрешением 5 8.-Кристаллсграфия, 1990, в печати.