Физико-химическое и кристаллографическое исследование пирофосфатазы и карбоксипептидазы из термофильных микроорганизмов тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

Обмолова, Галина Васильевна АВТОР
кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ
1990 ГОД ЗАЩИТЫ
   
01.04.18 КОД ВАК РФ
Автореферат по физике на тему «Физико-химическое и кристаллографическое исследование пирофосфатазы и карбоксипептидазы из термофильных микроорганизмов»
 
Автореферат диссертации на тему "Физико-химическое и кристаллографическое исследование пирофосфатазы и карбоксипептидазы из термофильных микроорганизмов"

1 и Ги

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ КРИСТАЛЛОГРАФИИ им. А.В.ШУБНИКОВА

На правах рукописи

ОБМОЛОВА ГАЛИНА ВАСИЛЬЕВНА

УДК 548.737

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЕ И КРИСТАЛЛОГРАФИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПИРОФОСФАТАЗЫ И КАРБОКСИПЕП-ТИДАЗЫ ИЗ ТЕРМОФИЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Специальность 01,04.18 - Кристаллография, физика

кристаллов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1990

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте кристаллографии им. А.В.Шубникова АН СССР

Научные руководители: доктор физико-математических

наук, академик Б.К.Вайнштейн

кандидат химических наук И.П.Куранова

Официальные оппоненты: доктор химических наук

A.A.. Байков

кандидат биологических наук М.Б.Гарбер

Ведущая организация: Институт молекулярной

биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР

Защита диссертации состоится 17 октября 1990 г. на заседании Специализированного совета Д 002.58.01 при Институте кристаллографии АН СССР по адресу: 117333 Москва, Ленинский проспект, 59.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института кристаллографии АН СССР

Автореферат, разослан 17 сентября 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат физ.-мат. наук В.М.Каневский

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Рентгеноструктурный анализ является самым мощным из физических методов, применяемых в настоящее время для изучения пространственных структур биологических макромолекул. Точное знание пространственной структуры необходимо для понимания механизма действия ферментов и направленного изменения их свойств методами генной инженерии. Несмотря на крупные достижения белковой кристаллографии в последние годы, получение совершенных и достаточно крупных монокристаллов белков по-прежнему остается лимитирующей стадией ренггеноструктурного анализа и во многом определяет его успех.

Карбоксипептидазы - это аминопептидазы, гидролизующие аминокислоты с С-концов полипептидных цепей. Вместе с другими пептидазами они играют исключительно важнуюроль в обмене веществ всех живых организмов - от бактерий и низших грибов до высших животных и человека. В настоящее время известны пространственные структуры карбоксипептидаз А и В, выделенных из млекопитающих. Однако, ряд важнейших вопросов, связанных с механизмом их действия, до сих пор остается нерешенным. Карбо-ксипептидаза ТЬегшоасг^потус&з обладает смешанной по сравнению с карбоксипептидаэами Д и В специфичностью. Детальное изучение строения активного центра этого фермента позволит выявить наиболее существенные особенности, ответственные за изменение специфичности,и понять механизм его действия.

Неорганические пирофосфатазы участвуют в процессах-, сопровождающих перенос энергии фосфатными группами. До сих пор неорганическая пирофосфатаза дрожжей остается единственным представителем этого класса, для которого установлена пространственная структура. Расширение спектра исследуемых пирофосфатаз, их всесторонняя характеристика, а также определение пространственной структуры позволит выяснить эволюционные отношения среди пирофосфатаз, выделить особенности строения, наиболее существенные для выполняемой функции.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ — физико-химическое и кристаллографическое исследование двух белков, выделенных из термофильных микроорганизмов - карбоксипептидазы ТЬегтоас-Ьхпотусез и пирофосфатазы ТЬегшиэ ЬЪегторЬгХиз.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Б результате проведенного исследования получены кристаллы карбоксипептидазы ТЬегтоас-Ь^пошусев , методами изоморфного и молекулярного замещения определена

„ о

структура этого фермента при разрешении 3 А, и получено прямое экспериментальное доказательство сходства пространственных структур карбоксипептвдаз бактерий и животных. Разработана методика выделения нового представителя семейства пирофос-фатаз - пирофосфатазы из экстремально'термофильной бактерии Т11егптз 1;Ьегтор11х1из, определены важнейшие физико-химические характеристики этого фермента. Установлено, что пирофосфагаза ТЬеттиэ -Ы1егпор111.1из является металлоактивируемым ферментом, проявляет максимальную активность в присутствии ионов магния и по гермостабильносги превосходит все известные пирофосфатаэы из других источников. Получены кристаллы пирофосфатазы, пригодные для рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Полученные в настоящей работе результаты являются основой для определения пространственной структуры карбоксипептидазы ТЬегтоасЫпотусез и пирофосфатазы ТйегтиБ 1ЬегторЬ11иБ с высоким разрешением. Знание пространственной структуры карбоксипептидазы позволит выработать рекомендации для создания фермента с измененными свойствами с целью дальнейшего его использования при получении инсулина . Изучение свойств пирофосфатазы, выделенной из экстремально термофильной бактерии, определение ее пространственной структуры позволит понять механизм каталитической активности и объяснить высокую термостабильность этого фермента.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты работы докладывались на 5-ом Всесоюзном симпозиуме "Структура биологических макромолекул" (Звенигород, 1987), на конкурсе научных работ в Икс-_ титуте кристаллографии АН СССР (1987).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 5 работ. Список публикаций приведен в конце автореферата.

ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы. Она изложена на страницах,

содержит рисунков и тг1блиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение включает в себя постановку задачи и краткое изложение диссертации.

ГЛАВА 1. КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ БЕЛКОВ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР).

Экспериментам по поиску условий кристаллизации белка предшествует получение его в виде активного и гомогенного препарата. Эффективность и быстрота очистки белка зависят главным образом от выбора методов разделения и их последовательности. Для определения гомогенности препарата как правило используют несколько аналитических методов: изоэлектрофокусирование, электрофорез, И-концевой анализ. Для белков, предназначенных для кристаллизации, важно не только отсутствие примесей каких-либо других белков, но и целостность полипептидной цепи и конформа-ционная гомогенность.

Кристаллизация белков происходит из пересыщенных растворов. Все используемые в настоящее время методы кристаллизации заключаются в медленном изменении параметров среды, приводящем к образованию такого раствора. Скорость роста кристаллов в значительной степени определяет их качество, в том числе дифракционные свойства. Чтобы уменьшить вредное влияние конвекционных по»

токов, кристаллизацию проводят с применением гелей или в невесомости.

Для того, чтобы вырос изометричный кристалл, скорости роста различных его граней должны быть близки. Степень пересыщения, а вместе с ней и концентрация белка, являются очень тонкими инструментами селективного влияния на скорость роста граней. Изменение рН раствора, кристаллизация в присутствии ионов металлов часто используются для получения кристаллов с другим габитусом или иной кристаллической модификации. Детергенты способствуют кристаллизации макромолекул, препятствуя их спонтанной агрегации за счет гидрофобных взаимодействий. Использование детергентов открыло возможность кристаллизации мембранных белков.

Процесс получения кристаллов - один из самых длительных и трудоемких этапов в определении структуры белка. Автоматизация приготовления растворов и распределения их по микропробам в начале исследования позволяет перебрать иолыиое количество вариантов и улучшает воспроизводимость результатов.

ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЕ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ ТЪеглоасМпотусев. Карбоксипептидаза ТЬегшоасЪ1пошусез (карбоксипептидаза Т), фермент с молекулярной массой 38000 дальтон, относится к классу металлокарбоксипептидаз и обладает смешанной, по сравнению с карбоксипептидазами А и В, специфичностью. Карбоксипептидаза Т была выделена и очищена из бактерий ТЬегтоас^потусеБ во ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов С13.

Кристаллы фермента, пригодные для рентгеноструктурного анализа, получены методом диффузии в парах при комнатной температуре из раствора, содержащего 14-17 мг/мл белка, 1 мМ сульфата цинка и 3 % 2-метил-2,4-пентандиола в 0,05 М МЕЗ-НаОН буфере, рН 6,0. Концентрация сульфата аммония в противорастворе составляла 32-35%. Через 5-6 недель кристаллы в виде гексагональных бипирамид достигали максимальных размеров 0,8x0,8x0,7 мм. Кристаллы принадлежат к гексагональной пространственной

о

группе Р6^22 с параметрами ячейки: а= Ь= 159,5, с -106,9 А» Как показал дальнейший рентгеноструктурный анализ, содержание

растворителя в кристаллах составляет около 80%. Кристаллы дают

©

дифракционную картину при разрешении 2,0 А.

Кристаллы комплекса карбоксипептидазы Тс ВЬ -бензилянтар-

ной кислотой получали настаиванием нативных кристаллов в кон-

-5 -3

сервирующем растворе, содержащем от 10 до 10 М ингибитора. CвязывaниJ бензилянтарной кислоты контролировали по прецессионным рентгенограммам. Изменения дифракционной картины были такие же, как для кристаллов комплекса, полученных сокристал-лизацией, хотя в последнем случае качество кристаллов было хуже.

Изоморфные тяжелоатомные производные карбоксипептидазы Т получены путем настаивания кристаллов нагивного белка в 3 мМ растворах НбВг2 и КгР-Ь(БСН)ц. Вхождение тяжелых атомов контролировали по прецессионным рентгенограммам.

Наборы ингенсивностей дифракционных отражений для кристал-

о

лов нативного белка при разрешении 3 А и для кристаллов тяжело-

о

атомных.производных при разрешении 4 А получены на дифрактомет-ре "З^г^ех Р 2 ^ " . Каждый набор получен с одного кристалла. Параметры наборов приведены в табл.1.

Кристаллическая структура карбоксипептидазы Т была определена методом молекулярного замещения, а правильность решения подтверждена с помощью метода изоморфных замещений. Функция

Таблица 1. Характеристики наборов экспериментальных данных карбоксипептидазы Т.

Набор Нативный невг2 к^-ьСзсл)^

0 разрешение, А 3,0 4,0 4,0

Число' отражений 36000 7500 • 10000

й1/1,'% 10 15 15

В , % вут сгуэ-Ь* 3,8 15,2 5,2 17 ,0

максимальное уменьшение интенсивности контрольных отражений,

/Цг1+Р2|., где 1'1 и ?г - структурные амплитуды эквивалентных отражений, 71ррн-рр1 /I Гр> где Гр и Грц - структурные амплитуды нативного белка и производного.

Л1/1 -й

Бут

Н

СГуБХ

вращения-Кроутера [23 с использованием модели карбоксипептидазы А СЗЗ, дифракционных данных в зоне разрешения 10-3 А и рао

диуса интегрирования 15 А содержала три пика, один из которых соответствовал правильному решению. С помоиью функции трансляции [43 молекулу карбоксипептидазы удалось разместить в кристаллической ячейке так, чтобы не возникало недопустимо близких контактов, и в то же время обеспечивалась стабильность всей структуры. Упаковка молекул карбоксипептидазы Т в кристалле показана на рис. 1.

Места присоединения тяжелых атомов в производных карбоксипептидазы Г определены по разностным синтезам Паттерсона. Карта электронной плотности, рассчитанная с "изоморфными" фазами

о

в зоне разрешения 20-4 А ( и= 0,48) , позволила выделить область, занятую молекулами белка (рис. 2). Результат совпал с данными молекулярного замещения.

Исходная модель карбоксипептидазы уточнялась по программе СОКЕЬБ [51, в результате чего кристаллографический Е-фактор (£1 г'о-Гс I , где Ро и Р^ - экспериментальные и расчетные

Рис.2. Карта электронной плотности карбоксипептидазы Т при

о

разрешении 4 А по данным изоморфного замещения. Разбиение ячейки: 120x120x72. Приведено наложение первых 12 сечений.

структурные амплитуды) снизился с 0,50 до 0,34 в зоне раэреше-ния 10-3,5 А. Далее аминокислотные остатки в модели были заменены в соответствии с последовательностью карбоксипептидаэы Т, и уточнение продолжено по программе PR0LSQ [63 до R = 0,30 при

о

разрешении 3 А.

Укладка полипептидной цепи в карбоксипептидззе Т в целом соответствует структуре карбоксипептидаэы А. Структура относится к oL/jl -типу. Ядро молекулы образует 8-цепочечный скрученный р>-слой и 6 Ы.-спиралей, расположенных по одну сторону от него. Полипептидная цепь с другой стороны jS-слоя почти не содержит элементов вторичной структуры.

В результате проведенного исследования получено прямое экспериментальное доказательство того, что карбоксипептидаэы прокариотов и панкреатические карбоксипептидаэы животных принадлежат к одному семейству. Сходство пространственных структур карбоксипептидаз Т и А и смешанный тип субстратной специфичности, наблюдающийся у карбоксипептидаэы Т, подтверждает предположение о существовании общего предшественника и дивергентной эволюции ферментов с образованием двух подсемейств с различной субстратной специфичностью.

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ПИРОФОСФАТАЗЫ Thermus thermophilus.

Неорганические пирофосфатазы катализируют гидролиз фосфо-ангидркдной связи неорганического пирофосфата. Освобождающаяся nprf этом энергия способствует завершению биосинтетических реакций. Наиболее полно охарактеризованы неорганические пиро-фосфатазы, выделенные из дрожжей и Е. coli. Методом ренггено-структурного анализа установлена пространственная структура пирофосфатазы дрожжей при разрешении 2,35 А С71. Работа по определению пространственной структуры пирофосфатазы Е. coli проводится в Институте кристаллографии ЛН СССР.

В настоящей работе была разработана методика выделения пирофосфатазы из экстремально термофильных бактерий Thermus thermophilus НВ8 (пирофосфатаза Т). Бактериальную массу выращивали в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов ДН СССР. Клеточные стенки разрушали с помощью лизоцима [8]. Активность пирофосфатазы определяли по скорости образования фосфата из пирофосфата магния при 37°С [9}. .Рв.чтвор для определения активности содержал 0,2 мМ пирофосфата магния, 2 мМ сульфата

Таблица 2. Схема очистки пирофосфатазы Т.

Удельная Выход,

Стадия выделения активность, %

ед./мг

I . Первичный экстракт 2,7 . 100

II .Фракционирование

сульфатом аммония 8 90

III.Хроматография на ВЕАЕ-

сефарозе в 20 мМ Тг1з-

НС1, рН 8,5, 5 мМ

МвБО^, 10 мМ меркапто-

этанола 26 76

IV .Хроматография на ОЕАЕ-

сефарозе в 50 мм ими-

дазол-НС1, рН 6,6 210 60

Уа .Гель-фильтрация на

ультрагеле аСа-34 в

" 20 мМ ТГ1Б-НС1, рН 8,5 500 36

УЪ .Гидрофобная хроматогра-

фия на В\гЬу1-Тоуореаг1

650 в 20 мМ Тг1в-НС1,

рН 7,5 500 48

VI .Рехроматография на

РЕАЕ-сефарозе в 20 мМ

ТГ18-НС1, рН 8,5 600 20-30

магния в 0,1 M Tris-HCl буфере, рН 8,5. Схема очистки пирофосфатазы Т представлена в табл. 2.

Экстракт водорастворимых белков фракционировали сульфатом аммония. Фракцию, выпадавшую при концентрации соли от 40 до 80% обессоливали на сефадексе, диализовали и разделяли на колонке (3,5 х 35 см) с DEAE-сефарозой CL-6B при рН 8,5 (стадия III) и рН 6,6 (стадия IV). Дальнейшую очистку проводили двумя

способами.Растворы, содержащие пирофосфатазную активность, разделяли либо на колонке (2,6 х 90 см) с ультрагелем АсА-34, либо на колонке.(2,6 х 30 см) с Butyl-Toyopearl 650 - ионооб-меннике со слабо выраженными гидрофобными свойствами. Замена стадии гель-фильтрации на гидрофобную хроматографию.улучшала выход пирофосфатазы. Фермент, гомогенный по данным диск-электрофореза Сю], был получен после дополнительной стадии хроматографии на DEAE- сефарозе при рН 8,5.

Молекулярная масса пирофосфатазы Т, определенная методом гель-фильтрации СИ] на колонке (1,6 х 100 см) с ультрагелем АсА-34, уравновешенной 20 мМ Tris-HCL буфером рН 7,5, составила 115 кДа.

Молекулярная масса субьединицы, определенная методом электрофореза в полиакриламидном геле С додецилсульфатом натрия [12], составила 20 кДа. То, что при этом проявляется только одна полоса, означает, что молекула нативного фермента состоит из шеста субьединиц, одинаковых по массе.

Максимальную активность в присутствии ионов магния пиро-фосфатаза Т проявляет при рН 8,3-9,5. Рёзультаты измерения активности пирофосфатазы Т в присутствии различных двухвалентных металлов представлены в табл. 3. Активность определяли при 37° С в 0,1 Tris-HCl буфере рН 7,9, в растворе, содержащем 0,2 мМ пирофосфата натрия, ионы металла[9].

Таблица 3. Влияние ионов металлов на активность пирофосфатазы Т.

Ионы Концентрация Активность

металлов ионов металла, мМ %

Mg2 + 1,0 100

Мп2 + 0,25 68

Zn2 + 0,25 58

Со2 + 0,25 19

Са2 + 0 ,6 0

Таблица 4. Бремя полуинактивации пирофосфатазы Т при нагревании.

Температура, Время полуинактивации, мин

2 + EDTA+Ca EDTA+Mg2+

°С Без добавок EDTA

75 00 22 со 00

90 72 <1 63 72

Зависимость активности от температуры определяли в интервале от 25 до 96°С. Максимальная активность наблюдалась при 90°С. Исследовалось также влияние ионов металлов на время полуинактивации пирофосфатазы Т' (табл. 4) . Удаление ионов металлов из раствора с помощью EDTA резко снижает устойчивость фермента к тепловой денатурации. Добавление Mg2 + или Са2+ оказывает стабилизирующее действие.

Определен аминокислотный состав пирофосфатазы Т. Как видно из табл. 5, обнаруживается большое сходство с пирофосфата-зой Е. coli [13j.

Кристаллы пирофосфатазы Т, пригодные для рентгеноструктур-ыого анализа, получали методом диффузии в парах. К раствору бэлка с концентрацией 15 мг/мл в 20 Ttis-HSl буфере, pH .7,5, содержащему 2 мМ сульфата магния, добавляли 2-метил-2,4-пентандиол до концентрации 3% (об.) и 4 М водный раствор сульфата аммония без шдедаавительного подщелачивания до концентрации 28 % (об.). Насыщающий раствор содержал только сульфат аммония в концентрации 46-50 i (об.). Через 3 дня появлялись зародыши кристаллов. Повышение концентрации на 2-3 % приводило к дальнейшему росту кристаллов. Через 2 недели кристаллы достигали максимальных размеров 0,6 х 0,6 х 0,5 мм.

Кристаллы пирофосфатазы Г принадлежат к ромбоэдрической пространственной группе R32 с параметрами ячейки: а=Ъ =110,3, с - 82,0 А. Исходя из молекулярной массы пирофосфатазы Т 115 кДа, можно заключить, что в кристаллической ячейке содержится 3 гексамера белка - по одной субъединице в асимметричной части ячейки. При этом удельный объем, приходящийся на единицу

о з

массы, (vn> составляет 2,5 А /Да, что соответствует среднему значению для кристаллов белков. Таким образом установлено, что гокелмер пирофосфатазы Т состоит из одинаковых мономеров, свя-тлкних кристаллографическими осями симметрии 3-го и 2-го по-

Таблица 5. Аминокислотный состав и вычисленный молекулярный вес пирофосфатаз из ГпЛпеги и .¡е.Со11

Источник Thermus Escherichia

tbermophilus coli [83

Asx 18 21

Ihr 5 4

Ser 5 8

Glx 20 17

Pro 11 13

Gly 20 9

Ala 15 16

Су s 1 2

Val 14 16

Met 2 3

Ile 7 10

Leu 19 15

Туг 7 '8

Fhe 4 б

His 3 5

Lys 13 16

Arg 9 4

Trp 0 2

Число остатков 173 175

Масса мономера 21872 22682

Масса гексамера 131232 136092

рядка. Центры гексамеров лежат на пересечении этих осей. Полученный результат хорошо согласуется с данными рентгеноструктур-ного анализа пирофосфатазы Е. coli при разрешении 5 А C14J Это свидетельствует о возможном сходстве их пространственных структур.

- И -

Полный набор дифракционных отражений при разрешении 2,0 А

собран с одного кристалла пирофосфатазы Т в течение 3 сут.

Набор, включающий 13387 отражений, является основой для определения пространственной структуры пирофосфатазы Т.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Разработана методика выращивания кристаллов карбоксипепти-. дазы Т, пригодных для рентгеноструктурного анализа. Получены кристаллы кативного белка, двух.тяжелоатомных производных и комплекса с бензилянтарной кислотой. Определена их пространственная группа и параметры элементарной ячейки.

2. Получены наборы дифракционных отражений для кристаллов на-

о

тивной карбоксипептидазы при разрешении 3 А и двух тяжелоатомных производных при разрешении 4 А.

3. Определена кристаллическая структура карбоксипептидазы Т методами молекулярного и изоморфного замещения. Получено прямое экспериментальное доказательство сходства пространственных структур карбоксипептидаз бактерий и животных.

4. Разработана методика выделения новой неорганической пирофосфатазы из 'бактерий ТЬегтиэ ЪЬегтор11а1из .

5. Определены молекулярная масса, число субъединиц, аминокислотный состав пирофосфатазы Т. Показано, что она является металлоактивируемым ферментом и проявляет максимальную активность в присутствии ионов магния.

6. Установлено, что пирофосфатаза Т по термостабильности превосходит все известные пирофосфатазы из других источников.

7. Получены кристаллы нативной пирофосфатазы Т, пригодные для рентгеноструктурного анализа. Определена их пространственная группа и параметры элементарной ячейки.

8. Получен набор дифракционных отражений для кристаллов нативной пирофосфатазы Т при разрешении 2 А.

МАТЕРИАЛЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ: 1. Обмолова Г.В., Куранова И.П., Поляков K.M., Мосолова О.В., Руденская Г.Н., Степанов В.М. Карбоксипептидаза Т - кристаллизация и предварительное рентгеноструктурное исследование. - Кристаллография, 1988, том 33, вып.2, с.517.

2. Куранова И.П., Обмолова Г.В. Способ получения кристаллов карбоксипептидазы Г.- Авторское свидетельство № 1442547, 1937.

3. Поляков К.М., Обмолова Г.В., Куранова И.П., Строкопытов

Б.В., Вайнштейн Б.К., Мосолова О.В., Степанов В.М., Руден-ская Г.Н. Рентгеноструктурное исследование карбоксипепти-

е

дазы Г термоактиномицетов с разрешением 3 А. - Молекулярная биология, 1989, том 23, »1, с.266-272.

4. Куранова И.П., Обмолова Г.В., Конарева Н.В. Неорганическая пирофосфатаза из экстремально термофильной бактерии Thermus thermophilus НВ8. - Доклады АН СССР, 1987 , том 295, »4, с.1013-1016.

5. Hohne W.E., Wessner Н. , Kuranova I.P., Obnolova G.V. Kinetic characterization of a thermostable inorganic pyrophosphatase from Thermus thermophilus. - Biomed. Biochim. Acta, 1988, v.UT, N12, р.9И-9^7.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Остерман А.Л., Степанов В.М., Руденская Г.Н., Ходова О.М., Цаплина И.А., Яковлева М.Е., Логинова Л.Г. Карбоксипепти-даза Т - внеклеточная карбоксипептидаза термоактиномицетов - отдаленный аналог карбоксипептидаз животных. - Биохимия, 1984, том 49, №2, 292-301.

2. Crovther R.A. In: The Molecular Replacement Method, ed. Rossmann M.G. Int. Sci. Rev., r.13, Hew York: Gordon and Breach, 1972, p.173-178.

3. Rees D.C., Lewis M., Lipscomh W.H. Refined crystal struc-

, о

ture of carhoxypeptidase A at 1.54 A resolution. - J. Mol.

Biol., 1983, v.168, p.367-387.

4. Вагин А.А. Использование некристаллографической симметрии

в структурной кристаллографии Белков. - Дисс. на соиск. уч. степ. канд. физ.-мат. наук, Москва, 1983.

5. Sussman J.L., Holbrook S.E., Church G.M., Kim S.H. A structure-factor least-squares refinement procedure for шасгоио-lecaiar structures using constrained and restrained рагагги:--ters. - Acta Crystallogr., 1977, V.A33, p.800-8cU.

6. Hendrickson W.a., Konnert J.H. In: Biomolecular Structure Conformation, Function and Evolution, ed. Srinivasan R., Oxford: Pergamon Press. 1981, v.1, p.1*3-57.

7. Чиргадзе Н.Ю'Г, Куранова И.П., Невская H.A., Тепляков A.B., Вильсон К., Строкопытов Б.в., Арутюнян Э. Г., Хене В. Кристаллическая структура МпР комплекса неорганической

I>

пирофосфатазы дрожжей при разрешении 2,35 А. - кристаллография, 1990, в печати.

8. Морозов И.А., Гамбарян A.C., Венкстерн Т.В. тРНК(аденин-1-) метилтрансфераза из thermus thermophilus НВ8.- Молекулярная биология, .1984, т.18, №5, с.1363-1368.

9. Taussky H.H., Schorr Е. A microcolorimetric method for the determination of inorganic phosphorus. - J. Biol. Chem., 1953, v.203, Ho.2, p.675-685.

10. Davis B.J. Disc electrophoresis. 2. Method and application to human serum proteins. - Ann. Hev York Acad. Sei., 1961t, v.121, Но.2, p Д 0lt-U27 •

11. Methods of biochemical analysis / ed. D. Click, N.Y.; L.: Intersci. Puhl., 1970, v.18, p.1-53.

12. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T.U. - Mature, 1970, v.227, Ho.5259, p.680-685.

13. Lahti R., Pitkaranta Т., Valve E., Uta I., Kukko-Kalske E., Heinonen J. Cloning and characterization of the gene encoding inorganic pyrophosphatase of Esheri'chia coli K-12. - J. Bacteriology, 1988, v.170, Ho.12, p.5901-5907.

14. Мороз O.B.,Строкопытов Б.В.,Оганесян В.Ю.,Айрумян Л.Г., Некрасов КЗ.В. .Назарова Т .И. ,Курилова С. А. , Воробьева H.H., Терзян С.С.,Аваева С.Ч.,Арутюнян Э.Г. Исследование неорганической пирофосфатазы из E.Coli с разрешением 5 8.-Кристаллсграфия, 1990, в печати.