Изменения структуры неорганической пирофосфатазы Е. соli при точечных мутациях и связывании лигандов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕ!П¡ЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

гО—--

Химический факультет

На нравах рукописи

РОДИНА НлспаВалерьевна

УДК 577.153.35

ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ НЕОРГАНИЧЕСКОЙ

ПИРОФОСФЛТДЗЫ Е. coli ПРИ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЯХ И СВЯЗЫВАНИИ ЛИГАНДОВ

(Специальность 02 00.10 - биооргашпескзя химия, химня природных и физиологически активных веществ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА 1997

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Аваева С.М.

Научный консультант: кандидат химических наук, стлх. Назарова Т.И.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Кочетков С.Н.

(Институт молекулярной биологии РАН им. В А. Энгельгардога)

доктор химических наук Куранова И.П. (Институт кристаллографии РАН им. А.Н. Шубникова)

Ведущая организации: Государсгвсиный иаучно-иссяедовагельский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится 3 июня 1997 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова, Москва, 119899, Воробьевы горы, МГУ, лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 30 апреля 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

V

Смирнова И.Г.

Актуальность темы. Неорганические пирофосфатазы^ (КФ 3.6.1.1) катализируют гидролиз пирофосфата до фосфата. Эта реакция играет важную роль в метаболизме, смещая равновесие многих обратимых биосинтетических процессов, в которых гшрофосфат образуется в качестве (юбочного продукта, в направлении синтеза. Ферментативный гидролиз пирофосфата может также служить удобной моделью превращений фосфоангадридных связей под действием большого числа других ферментов фосфорного обмена.

К настоящему времени выделены пирофосфатазы бодее чем из 30 организмов; для 10 га них известна аминокислотная последовательность, а для трех - пространственная структура. Консервативность остатков активного центра и укладки полипептадной цепи позволяют предположить, что пирофосфатазы действуют по общему каталитическому механизму. Одной из важпых особенностей действия иирофосфатаз является участие в катализе четырех ионов двухвалентных металлов, из которых два связываются с ферментом (в разных по сродству центрах), а остальные привносятся с субстратом. Вероятна роль этих ионов металла практически на всех стадиях каталитической реакции: активация фермента и облегчение связывания субстрата, активация самого субстрата, участие в уходе продуктов и активация молекулы воды для нуклеофильной атаки на атом фосфора. Наибольшую активность пирофосфатазы проявляют в присутствии ионов Mg24. Ионы марганца связываются в активном центре прочнее, чем ионы магния, но эффективность Мп2+ в качестве активатора меньше.

Несмотря на интенсивные исследования пирофосфатаз различными кинетическими и равновесными методами, многие принципиальные черты их действия остаются пока не понятыми. Невыясненными также остаются также аспекты конформапионных изменений и возможных пугей рефляции активности этих конститутивных ферментов.

Для дальнейшего прогресса в понимании механизма функционирования иирофосфатаз представляется необходимым комплексный подход, включающий использование как биохимических, так и структурных методов исследования ферментов.

Цель работы заключалась н выявлении определенных корреляций между структурой и функцией пирофосфатазы E.coli. Для этого предстояло решить следующие задачи:

1) изучить свойства ряда мутаншых вариантов пирофосфатазы E.coli с заменами групп активного центра;

2) проанализировать структуры пирофосфатазы E.coli и охарактеризовать систему внутримолекулярных нековалентных взаимодействий;

3) сравнить структуры апофермента, комплексов пирофосфатазы со специфическими лигандами и структуры мутантных пирофосфатаз.

Научная новизна и практическая ценность работы. В первой части работы изучены мутантные варианты пирофосфатазы E.coli с заменами групп активного центра E20Q, E3!Q, D65N, D67N, D70N, D97N, D102N и K104Q. Показано, что эти мутации приводят к резкому снижению активности без существенного изменения сродства к ионам Mg"+ в активном центре и без значительных изменений в связывании субстрата. Показано также, что введение мутаций изменяет рКи каталитически важных групп фермента, причем их величины в одних случаях становятся меньше, а в других - больше.

Изучение свойств мутантного варианта пирофосфатазы D42N, единственной известной мутантной пирофосфатазы, активность которой превосходит активность нативного фермента почти втрое, позволило высказать предположение, что остаток D42 расположен вблизи центра связывания ионов MgJ+ наименьшего сродства и важен для ориентации остатков, принимающих участие в связывании этого иона Mg2* и пирофосфата.

Разработан оригинальный спсктрофотометрический метод определения констант

диссоциации комплексов пирофосфатазы с М§2+ в центре низкого сродства. Показано, что причиной появления дифференциальных спектров поглощения является ионизация одного го остатков тирозина в составе пирофосфатазы при связывании иона в этом центре. На основании спектрофотометрнчсского титрования пирофосфатазы высказано предположение об участии остатка ШО в связывании иона М^2* в центре низкого сродства; это предположение нашло подтверждение в данных рентгеноструктурно го анализа. Предложенным методом были охарактеризованы центры связывания ионов магния пирофосфатазы Е.соИ и ее мутантных вариантов.

Впервые был проведен сравнительный анализ структур алофермента пирофосфатазы Е.соИ и ее комплексов с ионом Мп2+, с ионами М§2+ и с сульфат-ионом. Охарактеризована система нековалентных взаимодействий в молекуле алофермента, ее изменение и смещение участков полипептидной цепи при связывании специфических ллгандов, что в ряде случаев приводит к возникновению асимметрии субъединиц фермента. Выявлены существенные изменения структуры пирофосфатазы при введении мутаций Ш2Ы, Б65Ы, В70Ы и Ю7Ы в активный центр. Перестройки молекулы фермента и взаимное влияние субъединиц могут лежать в основе регуляции активности пирофосфатаз.

Апробация работы. По теме диссертации опубликованы 3 работы, 1 находится в печати, еще 2 в процессе подготовки.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав и выводов. Глава первая - обзор литературы, посвященный результатам исследования активного центра пирофосфатаз. Глава вторая - обсуждение результатов. Глава третья -экспериментальная часть.

Содержание работы.

1. Изучение функционирования мутантных вариантов пирофосфатазы Е.соИ.

Первой задачей настоящего исследования явилась всесторонняя характеристика мутантных пирофосфатаз с заменами групп активного центра: Е20<3, Е310, Ш2Ы, ЕК>5Ы, ШТО, 070Ы, [>97Ы, Ш02Ы и К104(3, полученных в лаборатории химии белка Института физико-химической биологии им. А Н. Белозерского. Изучены каталитические свойства мутантных пирофосфатаз в широком интервале рН, что дало возможность рассчитать рН-независимые каталитические константы и константы ионизации каталитически важных групп фермента и фермент-субстратного комплекса. Охарактеризовано также сродство мутантных вариантов к ионам металлов-активаторов, присоединяющихся в центрах связывания высокого и низкого сродства.

Основным итогом практически любой мутации является критическое падение активности фермента (табл.)). Максимальное значение рН-независимой каталитической константы мутантов не превышает трех процентов от ее значения для фермента дикого типа. Единственным исключением является вариант который отличается от

остальных мутантов и по другим параметрам и поэтому будет рассмотрен отдельно.

Величина константы Михаэлиса изменяется не столь значительно, как каталитическая константа, так что потеря активности не может быть связана только с ухудшением сродства пирофосфатазы к субстрату при мутации.

Изучение гидролиза пирофосфата в широком интервале рН показывает, что характер рН-зависимости кинетических параметров для большинства мутантов не изменяется (рис.1). При этом наблюдается изменение величин рКа каталитически важных групп, но объяснить падение активности мутантов только этой причиной также нельзя, т.к. константы ионизации изменяются для разных мутантов в разной степени и в одних

Рис.1. Зависимость кажущихся значений кса, и кса/Кт от рН для нагивной

пирофосфатазы К.соЬ (•) и мутантных вариантов (Д) и (■).

ТаблЛ.Кинетические параметры гидролиза РР* пирофосфатазой Е.соИ и ее мутантными формами.

Епгуше рКЕН2 РКЕН ^са/К-т* ю'м-'в1 рКгяп рКван £ Л«аЛ 5-' Кт IV* м

ЛУГ 7.76+0.88 8.67+0.56 3038+800 7.56+0.25 8.96+0.21 389178 0.13+0.06

Ш* 6.8410.16 8.91+0.16 481+59 6.60+0.16 9 69+0.16 209119 1.44+0.09

Е20С? 6.42+0.41 8.3710.32 5.63+1.64 6.46+0.14 10.09+0.16 3.7610.21 0.6710.23

М5К 7.6610.23 9.8310.21 6.9310.97 6.33±0.91 8.2110.19 5.4410.15 0.78+0.13

065К" 7.1810.32 9.1510.28 19.114.0 6.90+0.18 — 4.3910.22 0.2310.06

Г>67К 8.24+0.41 8.2910.38 80150 6.93+0.16 8.62+0 12 15.2+1.9 0.19+0.13

В70К 7.38+0.13 9.33+0.13 2.6710.27 7.1310.08 9.3510.07 2.6710.14 1.0010.14

Ш7К 6.40+0.18 9.27+0.13 1.54+0.13 7.12±0.15 9.58+0.13 1.7410.13 1.13+0.18

Ш02Ы 6.52+0.13 9.25+0.09 4.1510.27 7.3010 10 8.93+0.21 4.29+0.27 1.0310.13

К 104(} 6.79+0.29 8.5310.28 1.3010.32 6.6410.08 10.6110.15 1.0310.03 0.7910.22

В42К 7.73Ю.18 8.3610.18 5761144 8.1110 21 8.9310.21 11501312 2.0011.04

а20тММ£2+

случаях становятся больше (рКвт, Е20(3, К1040), а в других - меньше (например, рК^ц, ЕЩ см. табл.1).

Проведение реакции гидролиза при различных концентрациях магния показывает (рис.2), что характер зависимости кинетических параметров для большинства мутантов изменяется незначительно. Следовательно, мутангные пирофосфатазы сохраняют способность связывания ионов магния в центре высокого сродства.

10 9 8 7 6

и 5

у я

X 4

3 2 1

О

О

о

о

о

о о

8

о

д

# О-*

д д

¡а

д

V

V

V V V,

бv

_1_

0.001 0.01 0.1

10

250

200

150

100

50

2+,

100 1000 [¡^ ], тМ

Рис.2. Зависимость каталитической константы гидролиза PPi нативной пирофосфатазой (О) и мутантными вариантами Е20<3 (а), Ш2И (•) и К1040 (V) от концентрации

Э о

5

о К

0.03

0.06 -

1 Для характеристики связывания иона мапшя в центре ¡такого сродства быя разработан удобный метод, основанный на появлении дифференциального шекгра ПОГЛОИС7ТИЯ при связывании ионов металлов (рис.3). Как показываег спектрофотометрическое титрование гшрофосфатазы и ее комплекса с магнием ]гри разных рН, в ее составе имеете» остаток тирозина, снижающий величину своего рКи при связывании ионов магния в центре низкого сродства. Ионизация этого остатка приводит к появлению характерных дифференциальных спектров. Высокое поглощение в пике при длине волны 243 нм позволяет титровать пирофосфатазу ионами мапшя с высокой чувствительностью.

Этим методом был охарактеризован центр связывания низкого сродства фермента дикого типа. Исходя из строения активного центра апофермента, высказано предположение, что лигандом иона магния в этом центре является остаток аснарагиновой кислоты 70. С| ¡ектрофотометрическое титрование при разных рН мутантных вариантов (пирофосфатазы по трем остаткам тирозина активного центра с заменами их на фенидалаиин (У51Р, У55Р и У141Р) показывает, что появление дифференциальных спектров нри добавлении ионов М£2+ связано с ионизапией остатка Туг55.

О.ОА -

0.02 -

0.00 -

340

Длина волны, нм

Рие.З. Типичный дифференциальный спектр поглощения пирофосфатазы Е.соЬ, возникающий при связывании М£"' в центре низкого сродства Цифрами показаны кривые, снятые при 3 тМ (1), 5 тМ (2). 7.5 тМ (3), 15 тМ (4), 25 тМ (5) ми 50 тМ (б)

Предложенным методом были охарактеризованы центры такого сродства

Табл.2.Константы диссоциации комплекса с М§2+ в центре низкого сродства для пирофосфатазы К.соН и ее мутантных форм.

Кп/утпе К.,!, тМ

У/Т РРаяе 1.4610.10

Е20О —

кз 10 1.72 .Ю.03

1>65Ы 2.1 ±0.2

ЕК>7М 4.49Ю.88

070Ы 3.13±0.37

П97Ы 5.56±0.02

ОЮ2Ы 1.03 ±0.13

К1040 —

042Ы 3.1810.98

остальных мутантных вариантов (табл.2). Сравнение констант диссоциации их комплексов с магнием в этом центре показывает, что доя большинства мутантов сродство ко второму иону магния изменяется незначительно. Исключение составляет вариант Е20(2, для которого или константа диссоциации в этом центре ухудшается более чем на порядок, или его заполнение не вызывает изменения спектра поглощения пирофосфатазы.

Таким образом, изменения центров связывания ионов магния в активном центре также не может бьпъ общей причиной столь значительного падения активности большинства мутантов.

1542К вариант отличается от остальных изученных тем, что его каталитическая константа в 2.5 раза превышает константу нативного фермента, в то время как Кш ухудшается в 15 раз. Наблюдается и совершенно иной характер зависимости кинетических параметров гидролиза от концентрации магния. Еще на ранних этапах изучения пирофосфатазы Е.соН было обнаружено, что она ингибируется в присутствии больших концентраций магния. Было высказано предположение, что это падение активности связано с заполнением центра связывания ионов металла наименьшего сродства, который поэтому был назван ингибирукмцим. Как видно, большинство ( Ра с. 2 ) изученных мутантов сохраняют способность ингибироваться большими концентрациями магния, в то время как 042Ы теряет это свойство. Совокупность необычных свойств этого мутанта позволила нам высказать предположение, что ингибирующий центр связывания ионов магния расположен вблизи остатка 1342, и его мутация резко ухудшает сродство магния к этому центру. Следствием этого может быть уменьшение сродства фермента к субстрату, что и проявляется в увеличении Кт и к фосфату, что облегчает его уход из активного центра. Т.к. этот процесс является одной из скорость лимитирующих стадий гидролиза пирофосфата, то это предположение позволяет объяснить увеличение каталитической константы Ш2И.

Для объяснения полученных результатов было сделано предположение о существовании распространенной сети нековалентных взаимодействий, связывающих все функциональные группы активного центра. Эта система должна быть столь важна для каталитической активности пирофосфатазы, что замена любого ее участника приводит практически к одинаковому результату - падению активности.

2. Анализ структуры пирофосфатазы КсоИ и характеристика системы внутримолекулярных взаимодействий.

Высказанное выше предположение о существовании системы взаимодействий в активном центре пирофосфатазы нашло свое подтверждение при анализе пространственных структур. В 1994 г. совместными усилиями Института А.Н. Белозерского и группы Института кристаллографии была решена пространственная структура фермента с разрешением 2.5 А. К 1996 г. структура апофермента была уточнена до 2.2 А, а также были получены структуры комплексов пирофосфатазы со специфическими лигандами. Один из них включал ион МпГ связанный в центре высокого сродства каждой субъединицы; второй - сульфат-ион, связанный в активном центре подобно одному из фосфатов. В третьем комплексе каждая субъединица содержала ионы

в центре высокого сродства, а 4 субъединицы из 6 - также и в центре низкого сродства.

Для анализа структур использовали компьютерную обработку координат атомов. Был применен комплекс прикладных программ для расчета внутри- и межмолекулярных межатомных расстояний, расчета температурных факторов, наложения сравниваемых структур с минимизацией среднеквадратичного отклонения по Са-атомам.

Полученные результаты характеризуют систему нековалентных взаимодействий в пирофосфатазе Е.соН и ее изменение при связывании специфических лигандов.

Система нековалентных взаимодействий играет основную роль в стабилизации нативной конформации полипептидной цепи пирофосфатазы. Участки цени как внугри отдельных элементов вторичной структуры, так и между ними связаны множеством прочных водородных связей Отдельные области фермента имеют различную свободу теплового движения, что видно при анализе профиля В-факторов (количественно характеризующих свободу теплового движения, см. рис.6). К участкам, обладающим повышенной подвижностью, относятся три иетли, формирующие вход в активный центр (62-70, 96-102 и 142-151), а также С-коиец цепи. Эти участки гораздо менее структурированы, чем остальная молекула, и слабо привязаны к стабильному кору. Боковые группы обладают большей свободой теплового движения, чем пептидная цепь; несмотря па это, они также входят в систему пековалешиьтх взаимодействий и формируют важную ее часть. Как правило, взаимодействия с участпсм функциональных групп имеют более дальний порядок, чем связи между участками цепи, так что эта составляющая сети взаимодействий более лабильна. Группы активного центра также участвуют во взаимодействиях, что подтверждает роль этой сети в катализе. В систему взаимодействий входят также многочисленные молекулы растворителя.

Интереснейшая особенность пирофосфатазы заключается в том, что многие каталитически важные остатки активпого центра принадлежат участкам подвижных петель. Подвижность этих петель облегчается наличием в них остатков глицина 66, 100 и 147. При этом группы активного центра находятся в контакте с остатками (3-барреля, так что конформационная стабильность его п целом не страдает. Консервативность такой организации активного центра среди известных пирофосфатаз говорит о ее функциональной значимости.

Центры связывания лигандов расположены как раз между этими подвижными участками, так что их заполнение может привести к движению нетель и к его дальнейшей передаче по сети взаимодействий на остальные участки молекулы.

Система нековалентных взаимодействий объединяет остатки всего гексамера, а в кристалле распространяется и на соседние молекулы. Шестъ субъединиц пирофосфатазы в апоферменте идентичны. Они образуют два тримера, которые связаны осью второго порядка. Вход в активный центр каждой субъединицы и центр связывания субстрата непосредственно граничат с зонами контакта субьединиц. Контакт тримеров также осуществляется за счет множества нековалентных взаимодействий, причем зона контакта также граничит с активным центром. Такая организация молекулы является структурной основой передачи взаимодействия между субъедтшцами как внутри тримеров, так и между ними.

Функциональные группы, обращенные в раствор, также могут отвечать на связывание лигандов в активном центре. При этом изменяются кластеры боковых групп, являющиеся потенциальными областями межбелкового взаимодействия, например, гидрофобный гаж вдоль С-концевой спирали.

Таким образом, структура апофермента очень лабильна и способна к разнообразному о тклику на связывание лигандов в активном центре.

X Анализ изменений структуры пирофосфатазы при связывании специфических лигандов.

3.1. Комплекс пирофосфатазы с ионом Мп2*.

Анализ структуры комплекса пирофосфатазы с ионом марганца показывает, что структура фермента действительно отзывается па присоединение Мп~ в активном центре изменением положения множества функциональных групп. Ион марганца связывается в центре высокого сродства каждой субъединицы гексамера. Его лигандами являются карбоксильные группы остатков 1)65, 070 и 0102 (рис.4).

Рис.4. Положение иона Мп2+в активном центре. Ион hin2* показан большим кружком, молекулы растворителя - маленькими кружками. Пунктиром показаны возможные партнеры по водородныгиичи ионным взаимодействиям, расстояние между которыми не превышает 3.3 А.

Рис.5. Наложение структур апофермента и комплекса пирофосфатазы с ионом Мп (фрагмент). Апофермент показан серым цветам, комплекс - черным; ион Мп обозначен большим кружком, молекулы воды - маленькими.

Связывание иона металла между подвижными петлями приводит к их смещению и развороту цепей благодаря наличию остатков глицина (рис.5). Это движение передается через сеть взаимодействий ца остальные участки молекулы, в том числе и не связанные непосредственно с ионом Мп:". В результате изменяются взаимодействия между ними. Одним из итогов связывания иона марганца является появление большого числа новых

residue number

Рис.6. Изменение В-факгоров по ходу полипептидной цени фермента. А - апофермент; В -комплекс с Мпг+. Показаны Са-атомы (сплошной линией) ши боковые группы (пунктиром).

3.2. Комплекс пирофосфатазы с сульфат-ионом.

Кристаллизация пирофосфатазы в присутствии (NH-shSO-i приводит к его включению в активный центр фермента. Лигандами сульфат-иона являются те же остатки, которые принимают участие в связывании одного из фосфатов (рис.7). Таким образом, комплекс пирофосфатазы с сульфатом можно рассматривать как комплекс с аналогом продукта каталитической реакции, так что интерес к изучению этой структуры вполне закономерен.

Рис.7. Положение сульфат-иона в активном центре одной из субъединиц комплекса пирофосфатазы с сульфатом. Сульфат-ион показан как тетраэдр, изображенный сплошной черной линией; маленькими кружками показаны молекулы растворителя. Пунктиром соединены атомы, расстояния между которыми не превышают 3.31

Анализ структуры полученного комплекса показывает, что сульфат-ион присутствует во всех 6 субъединицах фермента, но в результате его связывания возникает неидентичность субъединиц, что приводит к потере оси симметрии второго порядка. Структура фермента из нативной а« становится А3В3. Различие двух типов субъедшшц видно при наложении их структур; оно проявляется в ориентации сульфат-иона и некоторых функциональных групп (рис.8; табл.3), а также в разных взаимодействиях, в том числе в активном центре.

Возникновение асимметрии связано с тем, что присоединение сульфат-иона в активном центре пирофосфатазы приводит к изменению положения множества функциональных групп и связей между ними (рис.9). Неидентичность тримеров является одним из проявлений взаимосвязанности субъединиц пирофосфатазы, о котором уже упоминалось.

Ранее в лаборатории химии белка были выявлены многие примеры появления у пирофосфатазы неидентичности тримеров в результате реакций с рядом ингибиторов, например, с моноэфирами фосфорной кислоты или гидроксиламином. Фермент проявляет в этих случаях половинную реакционную способность, что предполагает изменение конформации одного тримера при связывании ингибитора в другом. Данные по возникновению структурной асимметрии тримеров при связывании сульфата - аналога фосфата могут служить основой для объяснения таких свойств пирофосфатазы.

Возникновение неидентичности субъединиц пирофосфатазы при связывании лигандов в активном центре обнаружено впервые. Такая индуцированная асимметрия, возможно, отражает один из способов регуляции активности пирофосфатазы КсоИ в клетке.

субъединицы В показана черным цветам. А - серым цветом; сульфат ионы обозначены тетраэдрами соответствующего 11вета. Маленькими кружками соответствующего цвета показаны молекулы растворителя. Табл.3.Расстояния от атомов кислорода сульфат-иона до лигандов в двух субъединицах

сульфатного комплекса пирофосфатазм.

субъедигоща А субъединица В

Атом кислорода .чиганд расстояние (А) Атом кислорода лиганд расстояние (А)

01 Агй43 N111 3.58 02 Агу43 ЫН2 3.21

Туг! 41 ОН 2.66 Туг141 ОН 3.00

н2о (35) 3.42 Н20 (197)3.31

02 Ьуя142 ЫН2 3.39 04 Туг141 ОН 3.58

03 А^43 N111 3.23 01 Ьув29 ЫН2 3.56

А^43 N112 2.61 Н20 (197)3.34

н2о (216)3.20 ОЗ Ьуэ29 ЫН2 3.12

04 Ьуь29 N112 3.13 Аг^'43 N111 3.25

н2о (35)3.18

Передача изменений по сети взаимодействий на поверхность молекулы приводит к изменению контакта гексамеров и, как следствие, к разной упаковке их в кристалле, и отражается на параметрах кристаллической решетки пирофосфатазы.

Рис.9. Фрагмент наложения структуры одной из субъединиц сульфатного комплекса на апофер-менг. Апофермент показан серым цветом, сульфатный комплекс - черным. Сульфат-ион обозначен тетраэдром. Пунктиром соединены атомы, расстояние между которыми не превышает 3.3 А.

3.3 Комплекс пирофосфатазы с ионами Ме2*.

Проанализирована также структура комплекса фермента с ионами магния. В этом комплексе присутствуют субъединицы трех видов, которые далее обозначены как А, В и С. Все три субъединицы внутри одного тримера различны. Две из них (А и В) содержат по 2 иона М^+в активном центре, связанных в центрах высокого и низкого сродства. Третья субъединица каждого тримера (С) содержит только одип ион магния в активном центре; он связан в центре высокого сродства.

Лигандами ионов магния в центрах высокого сродства каждой субъединицы являются те же остатки, которые участвуют в связывании иона Мп1+ в описанном выше комплексе. Лигандами иона магния в центре низкого сродства (в субъединицах А и В) является остаток 070, который, таким образом, служит мостиком между двумя центрами, и пять молекул воды (рис. 10).

Субъединицы А и В с одинаковым заполнением центров связывания магния высокого и низкого сродства тем не менее различаются по структуре. Это следует из наложения их структур и сравнительного анализа системы внутримолекулярных взаимодействий. Различие их проявляется в разной ориентации множества функциональных групп, что особенно заметно в областях межсубъединичных контактов внутри тримера.

Кроме этих ионов магния, вне активного центра, между тримерами, связаны еще три иона Мё'"+ на гексамер. Существование такого межтримерного иона магния уже описано в литературе, но роль его в функционировании пирофосфатазы остается пока не выясненной. Лигандами каждого такого иона магния являются шесть молекул воды, три из которых связаны с субъединицей одного тримера, а три другие - с субъсдиницсй

Рис.10. Активный центр одной из субъсдиниц комплекса пирофосфатазы с ионами с заполнегг-

ными центрами связывания высокого и низкого сродства. Ионы обозначены

большими кружками, молекулы растворителя - маленькими. Пунктирной линией соединены возможные партнеры по водородной (или ионной) связи, расстояние между которыми не превышает 3.3 А.

Рис.11. Положение меж-тримерного иона магния. Обозначения как на предыдущем рисунке.

другого тримера (рис. 11).

В комплексе пирофосфатазы теряется и ось симметрии между тримерами, так что межтримерный ион магния связывает или С-С пару, или две А-В пары.

Связывание ионов магния, как и других лигандов, приводит к смещению подвижных участков цепи и большого количества функциональных групп. Смещения эти не очень велики по амплитуде, но могут приводить к важным функциональным последствиям, облегчая дальнейшее связывание как пирофосфата, так и еще двух ионов магния.

Возникновение асимметрии в комплексе пирофосфатазы с ионами магния, как и в случае сульфат-иона, является проявлением свойства фермента, о котором говорилось выше: функциональные группы всего гексамера связаны в единую сеть нековалентпых взаимодействий, и состояние активного центра любой из субъединиц чувствуется во всех остальных субьединицах (как внутри тримера, так и между ними).

3.4. Анализ структур мутантньп вариантов пирофосфатазы Ксо1и

В прошлом году, кроме описанных выше комплексов, впервые был сделан рентгепоструктурный анализ некоторых мугантных вариантов пирофосфатазы (с разрешением 2.2 А). В рамках настоящего исследования был проведен предварительный анализ структур П42Ы, П65Ы, В7(Ж и Е>97К вариантов. Основным результатом этого исследования является важнейший вывод, что единичная мутация группы активного центра не приводит к изменению положения только этой группы. Напротив, все изученные варианты показали множественные изменения положения групп как в активном центре, так и по всей молекуле. Это приводит к перестройке системы взаимодействий. Такая перестройка, затрагивающая практически все группы активного центра, делает понятными описанные выше свойства мутантов.

Влияние мутации в активном центре на структуру пирофосфатазы можно проиллюстрировать двумя примерами. На рис. 12 представлено наложение структуры Ш7Ы варианта на апофермент; для этого мутанта характерны минимальные, среди всех изученных, изменения положения полипегоидной цепи. Несмотря на это, мутация все же вызывает существенное смещение большого количества функциональных групп и перестройку системы взаимодействий между ними. Такая закономерность характерна и для вариантов 042.Ы и 065Н В отличие от других мутантов, 070Ы вариант является примером гораздо более сильного влияния мутации на структуру фермента (рис.13). В этом случае замена одного остатка приводит не только к смещению подавляющего большинства групп фермента, но и к значительному движению полипептидной цепи, и к перестройке всей системы контактов между субъединицами.

Итак, предположение о том, что причиной потери активности подавляющего большинства мутантов является нарушение каталитически важной системы взаимодействий активного центра, получает структурное обоснование. Вероятно, это же верно и для известного из литературы падения активности при заменах дикарбоновых аминокислот на гомологичные, т.к. сеть взаимодействий должна быть чувствительна не только к заряду функциональных групп, но и к их ориентации.

Таким образом, уникальное сочетание системы нековалентных взаимодействий, выполняющей структурную, каталитическую и информационную роль, и расположения центров связывания лигандов в подвижных участках цепи делает структуру РРазы очень лабильной. Это позволяет ей отвечать на связывание лигандов и точечные мутации в активном центре небольшими по амплитуде, но множественными изменениями положения функциональных групп и связей между ними.

Рис. 12. Наложение структуры мутантной гтирофосфатазы П)97Ы на апофериент: А -боковые труппы остатков активного центра, В - полипептидная цепь. Структура мутанта гмкатапа черным цветом, апоферменти - серым.

Рис-13. Наложение структуры мутантной пирофосфатазы 070Ы на нативный фермент (одна из субъединиц). Обозначения те лге, что и па предыдущем рисунке.

\

Выводы

1. Изучены pH-зависимости скорости ферментативной реакции для пативной

неорганической пирофосфатазы E.coh и ее мутантных форм, содержащих замены в активном центре: E20Q, E31Q, D65N, D67N, D70N, 1>97N, D102N и K104Q. Рассчитаны pH-независимые кинетические константы, а гакже кажущиеся значения констант ионизации для свободного фермента и фермент-су бстра гною комплекса. Установлено, что все изученные мутанты характеризуются резким снижением и несущественным увеличением К„, при этом величины рКи для одних мугантов уменьшаются, а для других -увеличиваются.

2. Изучена pH-зависимость скорости ферментативной реакции для D42N пирофосфатазы. Установлено, что kca, возрастает 2.5 раза, а Кт увеличивается в 15 раз; величины рКа изменяю!ся незначительно по сравнению с нативным ферментом. В то же время характер зависимости активности от концентрации Mg2 изменяется принципиально. Высказано предположетше, что увеличение активности и уменьшение сродства к субстрату являются результатом изменений связывания Mg2+ с центром наименьшего сродства.

3. Для характеристики взаимодействия пирофосфатазы E.coli с ионами магния разработан чувствительный спектрофотометрический метод, основанный на изменении рК, остатка тирозина при связывании Mg2+. Определены константы диссоциации комплексов с Mg2+ в центре низкою сродства для нативного и мутантных ферментов.

4. I {роведсп анализ структур апофермента и комплексов пирофосфатазы с сульфатом - аналогом фосфата, с ионом марганца, с ионами магния, а также струкгур мугантных форм пирофосфатазы R42N, D65N, D70N и D97N Установлено, что связывание специфических лигандов и единичные замены функциональных групп в активном центре выбывают смещение некоторых участков полипептидной цепи и большого количества боковых групп, а также перестройки системы водородных связей молекулы, приводящие и

ряде случаев к появлению асимметрии субъединиц и составе гекеамера. Высказано предположение, что взаимодействие субъединиц может являться основой для регуляции фермента и vivo.

Список литературы, опубликованной по теме работы.

1. Avaeva S.M., Rodina E.V., Kurilova S.A., Nazarova T.I., Vorobjova N.N., Harutyunyan E.H., Oganessyan V.Yu. Mg2+activation of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase (1995) FEBSUtt., v. 377, pp 44-46.

2. Avaeva S.M., Rodina E.V., Kurilova S.A., Nazarova T.I., Vorobyeva N.N. Effect of D42N substitution in Escherichia call inorganic pyrophosphatase on catalytic activity and Mg2+ binding (1996) FEBS Letters, v. 392, p. 91-94.

3. Avaeva S., Ignatov P., Kurilova S., Nazarova Т., Rodina E., Vorobyeva N., Oganessyan V., Harutyunyan E. Escherichia coli inorganic pyrophoshatase: site-directed mutagenesis of the metal binding sites (1996) FEBS Letters, v.399, p.99-102.

4. Avaeva, S., Kurilova, S., Nazarova, Т., Rodina, E., Vorobyeva, N., Sklyankina, V., Grigorjeva, O., Harutyunyan, E., Oganessyan, V., Wilson, K., Dauter, Z. & Huber, R. (1997) Crystal structure of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase complexed with S042". Ligand-induced conformational changes. FEBS Lett., в печати.