Функционально-важные остатки аминокислот неорганических пирофосфатаз S. Cereviciae и e. coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

введение

ГЛАВА I. ФШЩЮКАЛЬНО-ВАЖНЫЕ АМИНОКИСЛОТНЫЕ ОСТАТКИ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ПИРОФОСФАТАЗ (обзор литературы)

1 . РАСТВОРИМЫЕ ПИРОФОСФАТАЗЫ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ИСТОЧНИКОВ

A. Пирофосфатаза S.cerevisiae

1.А.1. Общие свойства фермента—

1 .А.2. Функционально-важные аминокислотные остатки

1.А.2.1. Химическая модификация

I.А. 2.2. Рентгено-структурный анализ

B. Пирофосфатаза е.coli

1.Б.1. Общие свойства фермента

1.Б.2. Функционально-важные, аминокислотные остатки

В. Пирофосфатаза термофильной бактерии PS-3

Г. Пирофосфатаза о?.thermophilic------------:

Д. Пирофосфатаза S. faecal is

Е. Пирофосфатаза Т. thiooxidans------■----------—■

Ж. Пирофосфатаза В.stearothermophilus

3. Пирофосфатаза s. commune

И. Пирофосфатаза U.urealiticum

2. ПРЕДПОЛАГАЕМЫМ ОБЩИМ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ПИРОФОСФАТАЗ. ОТЛИЧИЯ ФЕРМЕНТОВ ИЗ РАЗНЫХ ИСТОЧНИКОВ-------- '

ГЛАВА II. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Функционально-важный остаток тирозина в пирофосфатазе

S. cere vis iae

1.1. Химическая модификация и локализация в первичной структуре

1.1.1. Инактивация и модификация пирофосфатазы

1.1.2. Определение природы остатка, модификация которого приводит к инактивации фермента----------:

1.1.3. Локализация в первичной структуре функционально-важного остатка тирозина

1.2. Возможная роль Т;ут89 в механизме действия фермента—

1.2.1. Влияние лигандов активного центра на реакционное состояние Tyr89

1.2.2. Гшсохромный эффект в спектре поглощения пирофосфатазы, модифицированной NBD

1.2.3. Аномальная реакционная способность остатка Тугвэ—

1.2.4. Функциональная роль остатка Туг89

2. Функционально-важный остаток глутаминовой кислоты в пиро-фосфатазе Е.coli

2.1. Химическая модификация и локализация в первичной структуре

2.1.1. Инактивация и модификация фермента

2.1.2. Локализация функционально-важного остатка дикарбоновой аминокислоты в первичной структуре пирофосфатазы

2.2. Возможная роль остатка глутаминовой аминокислоты в механизме действия фермента

2.2.1. Аффинная элюция

2.2.2. Активность модифицированного фермента

2.2.3. Возможная функциональная роль остатка Е98

3. Селективная модификация пирофосфатазы E.coli реагентом Вудворда К вне активного центра

ГЛАВА III. ЭКСПЕРЗШЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Метода исследования

1.1. Определение концентрации бежа

1.2. Определение активности ферментов

1.3.Определение количества радиоактивных веществ

1.4. Протеолиз

1.4.1. Алкилирование SH-групп

1.4.2. Гидролиз трипсином

1.4.3. Гидролиз протеазой Staphilocooous aureus Y8

1.4.4. Гидролиз химотрипсином

1.5. Ступенчатая деградация по методу Эдмана

1.6. Масс-спектрометрический анализ пептидов

2. Исследование реакции РРазы S.oerevisiae с 4-хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом

2.1. Инактивация фермента

2.2. Получение модифицированного фермента

2.3. Спектры поглощения модифицированного фермента

2.4. Определение природы модифицированной аминокислоты

2.4.1. Реактивация модифицированной РРазы-------:——

2.4.2. Инактивация РРазы с модифицированными SH-группами

2.4.3. Модификация SH-rpyim РРазы, модифицированной ЖВБ—

2.5. Локализация в первичной структуре функционально-важного остатка тирозина

2.5.1. Разделение пептидов

2.5.2. Установление структуры пептидов

2.6. Выяснение возможной функциональной роли остатка тирозина

2.6.1. Влияние ионов металлов

2.6.2. Влияние фосфата

2.6.3. pH-зависимость скорости инактивации

3. Исследование реакции РРазы е.coli с реагентом Вудворда К. 83 3.1. Изучение устойчивости реагента Вудворда К при различных

3.2. Инактивация фермента

3.3. Получение модифицированного фермента—

3.4. Исследование устойчивости винилового эфира, образующегося при модификации РРазы реагентом Вудворда К

3.5. Локализация в первичной структуре функционально-важного остатка дикарбоновой аминокислоты

3.5.1. Разделение пептидов

3.5.2. Установление структуры пептидов--------:---------—

3.6. Выяснение возможной функциональной роли остатка дикарбоновой аминокислоты

3.6.1. Аффинная элюция

3.6.3. pH-зависимость остаточной активности модифицированного фермента

4. Селективная модификация пирофосфатазы Е-coli реагентом Вудворда К вне активного центра

4.1. Модификация РРазы

4.2. Выделение модифицированного пептида

4.3. Установление структуры пептида

ВЫВОДЫ

Более полувека прошло с тех пор, как впервые была обнаружена пирофосфатазная активность (гидролиз неорганического пирофосфата) в клетках [1] и сорок лет назад удалось выделить из 3.сегеу1Б1ае чистый фермент [2]. С этого момента стало возможным изучение пи-рофосфатазы (РРазы) как индивидуального химического вещества.

По-видимому, растворимые неорганические пирофосфатазы существуют во всех клетках, в которых происходят биосинтетические реакции, на что обращал внимание Корнберг еще в 1962 году [31. Подтверждением подобного утверждения, вероятно, может служить выделение РРазы из клеток и.ш-еаШАсшп [43. Как известно, данный вид характеризуется крайне малым геномом и, соответственно, слабо развитым метаболизмом. Обнаружение в этом организме определенных ферментативных активностей позволяет сделать вывод об их абсолютной необходимости для существования и воспроизводства клеток. Таким образом, гидролиз РР± является одним из основных проявлений ферментативных активностей клетки.

Главная особенность фермента - его каталитическая активность. Следовательно, наибольший интерес представляет взаимосвязь структуры и функции, выяснение химического механизма действия -механизма ферментативного катализа на молекулярном уровне.

Адекватно описать механизм действия значит описать реакционное состояние субстрата, химические свойства и функциональную значимость отдельных аминокислотных остатков, принимающих участие в процессе его превращения.

Для решения этих задач исследования развивались параллельно в нескольких направлениях, важнейшими из которых являлись: - изучение кинетики ферментативного катализа

- определение первичной структуры

- рентгено-структурный анализ высокого разрешения

- выявление функционально-важных аминокислотных остатков

- сравнительный анализ свойств и структуры нативного и модифицированного фермента, полученного с помощью химической модификации и методов генетической инженерии.

Основные усилия исследователей были сконцентрированы на изучении РРазы 3.сегеу±в1ае. Позднее очищенные РРазы выделили из разнообразных организмов - от бактерий до млекопитающих. Расширение спектра источников выделения позволило обнаружить как общие закономерности ферментативного катализа, присущие именно реакции гидролиза-синтеза фосфоангидридной связи, так и некоторые особенности РРаз, связанные с видовыми различиями организмов.

Пирофосфатазы являются металлоактивируемыми ферментами. М.Хьюз подчеркивал, что "первый шаг на пути к пониманию функционирования металлопротеинов должен включать описание взаимодействия металл-белок, а именно определение природы связываемых групп и силы их-взаимодействия с металлом" [51.

В настоящее время известно, что в область активного центра РРазы обращены боковые группы более чем тридцати различных аминокислот, которые могут принимать участие в связывании ионов металла-активатора, субстрата, стабилизировать переходное состояние, быть "каталитическими" группами. Для некоторых остатков показана их важность в ферментативном катализе с помощью химической модификации или сайт-направленного мутагенеза. Несмотря на существенные достижения в этом направлении, лишь для ограниченного числа остатков аминокислот продемонстрирована функциональная значимость. Практически отсутствуют детальные исследования и выводы о роли этих остатков в процессе ферментативного катализа, поэтому предлагаемые в настоящее время механизмы действия РРазы являются либо гипотетичными, либо описывают только самые общие принципы.

Целью настоящей работы являлось продолжение изучения механизма действия РРазы по пути выявления и определения роли функционально-важных остатков аминокислот.

В первой главе представлены данные литературы, касающиеся изучения функционально-важных остатков аминокислот растворимых РРаз, выделенных из различных источников. Обзор построен следующим образом - первая часть содержит информацию о функционально-важных остатках, здесь же рассмотрены основные свойства наиболее изученных РРаз из S.cerevisiae и E.coli, вторая часть, обобщающая эту информацию, посвящена возможному механизму пирофосфатазной реакции.

Во второй главе обсуждаются результаты экспериментов по изучению функциональной рож остатков тирозина в РРазе S.cerevisiae и остатков дикарбоновых аминокислот в РРазе E.coli.

Третья глава посвящена описанию реагентов и экспериментальных методик, использованных в работе.

выводы

1. Установлено, что в пирофосфатазе S.cereviciae остаток тирози-на-89 подвергается селективной химической модифжации 7-хлор-4~ нитробензофуразаном. Процесс сопровождается потерей ферментативной активности, что свидетельствует о необходимости этого остатка для функционирования фермента.

2. Изучено влияние лигандов активного центра пирофоефатазы - фосфата, ионов металлов-активаторов, -ингибиторов и значения pH среды на химические свойства тирозина-89. Показано, что ион кальция, ингибитор фермента, снижает значение рК функциональной группы тирозина-89, фосфат оказывает защитный эффект, а металлы-активаторы не влияют на инактивацию.

3. Предположено, что тирозин-89 образует водородную связь с субстратом и является донором протона для продукта ферментативной реакций. Мнгибирование активности пирофоефатазы ионами кальция, по-видимому является результатом взаимодействия с остатком тиро-зина-89.

4. .Установлено, что реакция пирофоефатазы е. coli с N-этилфенил-изоксазолий-3-сульфокислотой приводит к инактивации фермента, обусловленной модификацией остатка глутамшовой аминокислоты-98 (Е98), что указывает на функциональную значимость этого остатка.

5. Изучено связывание модифицированным ферментом ионов металла-активатора. Показано, что модификация Е98 приводит к значительному снижению сродства фермента к ионам магния. Обнаружено существенное возрастание активности модифицированной пирофоефатазы при увеличении значения pH среды, что, по-видимому, отражает изменение природы или состояния лигандов в координационной сфере иона металла-активатора.

S. Обнаружено взаимодействие N-этилфенилизоксазолйй-З-сульфокис-лоты с N-концевым участком пирофосфатазы е.соИ, нфо держащим остатков дикарбоновых аминокислот и цистеина, сделано гфедположение о наличии на N-конце молекулы фермента остатка фосфосерина,

1. Baner Е. - Hoppe-Sayler's Ztschr.physiol.chem.» 1935', v.239, p.195-206.

2. Kuriltz M. Crystalline inorganic pyrophosphatase isolated from baker's yeast J.Gen.Phsiol.,1952,v.35,p.423-449.

3. Romberg A. On the metabolic significance of phosphorolytic and pyroph.osph.orolytic reactions, in Horizons in biochemistry (H.Kos-ha, B.Pullman, eds.) Academic Press, New York, 1962, p.251

4. Davis J.W., Moses I.S. ,Ndubuka Oh., Ortis R. Inorganic pyrophosphatase activity in cell free extracts from Ureaplasma urealy-ticum J. of General Microbiol., 1987, v.133, p.1453-1459.

5. Хьюз M. Неорганическая химия биологических процессов, М., "Мир", 1983, с.73.

6. Heinrikson R.L., Sterner R., Noyes 0., Oooperman B.S., Brukmann R.H. On the subunit structure of yeast inorganic pyrophosphatase. J. Biol. Chem. 1973, v.248, p.2521-2528.

7. Аваева C.M., Назарова Т.И. Структура и особенности функционирования неорганической пирофосфатазы из пекарских дрожжей. Усп. биол. химии, 1985, т.26, с.42-63.

8. Cohen S.A., Sterner R., Keim P.S., Heinrikson R.L. Covalent structural analysis of yeast inorganic pyrophosphatase J. Biol. Chem., 1978, v.253, Ю, p.889-897.

9. Balmleva N.P., Baykov А.А., Kasho Y.N., Nasarova I.I., Avaeva S.M. The flip-flop mechanism of the phosphorylation of yeast inorganic pyrophosphatase. Int. J. Biochem., v.15»N6, p.849-854.

10. Аваева С.M.,Диков М.М., Кузнецов А.В., Склянкина В.А. Специфическая модификация активного центра неорганической пирофосфатазы из дрожжей N-хлорацетилфосфоэтаноламином. Биоорган, химия, 1977, т.З, т, с.943-949.

11. Кузнецов А.В., Склянкина В.А., Аваева С.М. Неодинаковое функционирование химически идентичных субъединиц неорганической пирофосфатазы из дрожжей. Биоорган, химия, 1978, т.4, N7, с.984-986.

12. Кузнецов А.В., Склянкина В.А., Аваева С.М. Особенности ингиби-рования неорганической пирофосфатазы О-фоефоэтаноламином. Биоорган. химия, 1979, т.5, N9, с.1396-1403.

13. Свято И.Е., Склянкина В.А., Аваева С.М. Инактивация неорганической пирофосфатазы из дрожжей 0-фосфосерином и его метиловым эфиром. Вестн. МГУ, сер. Химия, т.20, N5, с.479-484.

14. Svyato I.E., Nazarova T.I., Sklyankina V.A., Avaeva S.M. Half-of-the-sites reactivity of inorganic pyrophosphatase from yeast is the result of induced asymmetry. FEBS Lett., 1984, v. 16?, N2, p.269-272.

15. Лагутина И.О., Склянкина В.А., Аваева С.М. Аффинная модификация неорганической пирофосфатазы из дрожжей метилфосфатом. Биохимия, 1980, т.45, N9, с.1568-1575.

16. Butler L.G, Yeast and other inorganic pyrophosphatases. The Enzymes/ ed. Boyer P.В., N.Y., Acad. Press, 1971, 3d ed., v.4,p.529-541

17. Волк С.E., Вайков А.А., Аваева С.М. Сравнение эффективностиметаллов-активаторов неорганической пирофосфатазы. Биохимия, 1981, т.46, N1, с.33-39.

18. Ichiba T., Shibasaki Т., Jizuka Е., Hachimori A., Samejima Т, Cation-induced thermostability of yeast and E.coli pyrophosphatase. Bioohem. Cell. Biol., v.66, N7, p.25-31.

19. Prommel 0., Hohne W.E. Einfluss von magnesiumionen auf die hit-zestabilitat der anorganischen pyrophosphatase aus backerhefe. -Acta biol. med. Germ. 1979, v.38 N10, p. 1399-1412.

20. Ridlington J.W., Butler L.G. Yeast inorganic pyrophosphatase. I.Binding of pyrophosphate, metal ion and metal ion-pyrophosphate complexes. J. Biol. Chem. 1972, v.247, n22, p.7303-7307.

21. Braga E.A., Avaeva S.M. The interaction of yeast inorganic pyrophosphatase with bivalent cations and pyrophosphate. PEBS Lett., 1972, v.27, H2, p.251-255.

22. Rapoport T.A., Hohne W.E.,Reich I.I., Heitmann P., Rapoport S.M. A kinetic model for the action of the inorganic pyrophosphatase from baker's yeast.

23. Воробьева H.H., Назарова T.M., Бакулева H.П., Аваева С.M., Протасевич И.M., Платонов А.Л. Калориметрическое изучение взаимодействия пирофосфатазы дрожжей с ионами магния и фосфатом. Биохимия, 1982, т.47, N5, с.740-745.

24. Bakuleva N.P., Nazarova T.I., Baykov A.A., Avaeva S.M. Thephosphorilation of yeast inorganic pyrophosphatase and formation of stoichiometric amounts of enzyme-bound pyrophosphate. PEBS Lett., v.124, N2, p.245-247.

25. Holme W.E., Heitmann P. Trip о lypho spha t e as a substrat of the inorganic pyrophosphatase from baker's yeast; the role of divalent metal ions. Acta biol. med. Germ. 1974, v.33 N1, p. 1-14.

26. Кузнецов А.В., Аваева C.M., Банков A.A.*, Склянкина В.A. 0-пирофосфоэтаноламин новый субстрат неорганической пирофосфатазы дрожжей. Синтез и субстратные свойства. - Биоорган, химия, 1977, Т.З, N7, с.950-957.

27. Мельник М.С.,Назарова Т.И., Аваева С.М. Метилфосфат простейший органический субстрат неорганической пирофосфатазы дрожжей. -Биохимия, 1982, т.47, N2, с.323-328.

28. Мое 0.A., Butler L.G. Yeast inorganic pyrophosphatase. II. Kinetics of Mg2+ activation. J. Biol. Chem., 1972, v.247, p.7308-7314.

29. Шафранский Ю.А., Байков А.А., Андрукович П.Ф., Аваева С.М. Сравнительное изучение кинетики Mg2+-активируемого гидролиза пиро-фосфата и триполифосфата неорганической пирофосфатазой. Биохимия, 1977 т.7, с.1244-1251.

30. Baity лева Н.П., Костенко Е.В., Банков А. А., Аваева С.М. Обнаружение и характеристика дополнительного центра присоединения субстрата и его аналогов у неорганической пирофосфатазы. Биохимия, 1981, т.46, с.832-840.

31. Smimova 1.1., Baylrov А.А., Avaeva S.M. Studies on inorganic pyrophosphatase using imiclocliphosphate as a substrate. PEBS Lett., 1986, v. 205, N2, p.121-124.

32. Cooper-roan B.S., Parackal A., Springs В., Hamm D.J. Divalent metal ion, inorganic phosphate and inorganic phosphate analoguebinding to j^east inorganic pyrophosphatase. Biochemistry, 1981, v. 20, N21, p.6051-6060.

33. Springs В., Welsh K.M., Cooperman B.S. Thermodynamic, kinetics and mechanism in yeast inorganic pyrophosphatase catalysis of inorganic pyrophosphate:inorganic phosphate equilibration. Biochemistry, 1981, v.20, p.6384-6391.

34. Шестаков i.e. Роль ионов металлов в проявлении гидролазной и синтетазной активности неорганической пирофосфатазы. Дисс. канд. хим. наук, М., 1991.

35. Kolakowski P.L., Schlosser М., Cooperman B.S. Cloning, molecular characterization and chromosome localization of the inorganic pyrophosphatase (PPA) gene from S.cerevisiae. Nucleic Acids. Res., 1988, v.16, N22, p. 10441-10452.

36. Соорегтаап B.S., Chiu N.Y. Inorganic pyrophosphatase. III. Active-site mapping by electrophilic reagents and binding measurements. Biochemistry, 1973, v.12, p.1676-1682.

37. Heitmarm P., Uhlig H.J. Role of carboxyl, imidazole and amino groups in inorganic pyrophosphatase from baker's yeast. Acta bi-ol. med. Germ. 1974, v.32, p.565-573.

38. Аваева C.M. Пирофосфатаза. Новое в регуляции активности. -Биохимия, 1989, т.54, N5, с.751-756.

39. Венер А.В., Назарова Т.И., Аваева О.М. Фоефорилирование какспособ регуляции активности неорганической пирофосфатазы дрожжей.

40. Активация неорганической пирофосфатазы под действием ATP. -Биоорган, химия, 1985, т.11, N6, с.784-790.

41. Венер А.В., Назарова I.M., Аваева С.М. Фосфорилирование как способ регуляции активности неорганической пирофосфатазы дрожжей.1.. Характеристика регуляторного центра. Биоорган, химия, 1985, т.11, N6, с.791-796.

42. Riordan J.?., McElvang K.D., Borders O.L. Structure and function of zinc metalloenzymes.- Science, 1977, v.195, p.884

43. Bond МЛ?,, Ohiu N.Y., Gooperman B.S. Identification of an ar-ginine important for enzymatic activity within the covalent structure of yeast inorganic pyrophosphatase. Biochemistry, 1980, v.19, p.94-102.

44. Комиссаров А.А., Макарова И.А., Склянкжна В.А., Аваева С.М. Функционально важный остаток лизина неорганической пирофосфатазы из дрожжей. Биоорган химия, 1985, т.11, N11, с. 1504-1509.

45. Аваева С.М., Воробьева Н.Н., Мельник М.С., Назарова Т.И. Реакция аспарагиновой кислоты активного центра неорганической пирофосфатазы дрожжей с гидроксиламином и боргидридом натрия. Биоорган, химия, 1979, т.10,N5, с.1570-1578.

46. Avaeva S.M., Bakuleva U.P., Baratova L.A., Nazarova T.I., Pink N.Yu. The essential activated carboxyl group of inorganic pyrophosphatase. Biochem. Biophys. Acta, v.482, p.173-184.

47. Бакулева Н.П., Комиссаров А.А., Кузнецов А.В., Назарова Т.И., Склянкжна В.А., Аваева С.М. Триптический гидролиз неорганической пирофосфатазы, модифицированной фосфатом и 0-фосфоэтаноламином. -Химия прир. соед., 1982, N3, с.379-384.

48. Gooperman B.S., Ohiu N.Y., Bruckmann R.H., Bunick G.J., Mcken-na G.P. Yeast inorganic pyrophosphatase. I. New methods of purification, assay, .and crystallization. Biochemistry, 1973, v. 12, p.1665-1669.

49. Heitmann P., Mollerke Gh., Uhlig H.J. The state of tyrosine in pyrophosphatase from baker's yeast. Acta biol. med. Germ. 1972, v. 29, p-551-560.

50. Negi Т., Samejima Т., Irie M. Studies on the tryptophan residues of yeast inorganic pyrophosphatase in relation on the enzymatic activity. J.Biochem, 1972, v.71, p.26-37.

51. Куранова М.П. Пространственная структура неорганической пирофосфатазы дрожжей и ее активного центра. Биохимия, 1988, т.53, N11, с.1821-182.7.

52. Hansen Ст., Hohne W.E., Kuranova I.P. Wechselwirkung von Tbmit anorganisher pyrophosphatase aus backerhefe: charakterisierurig der binding sorte.- Acta biol. med. Germ. 1982, v.41, N1, p.23-30.

53. Bienwald В., Heitmann P. The interaction with иг any 1 ions inorganic pyrophosphatase from baker's yeast. Acta biol. med. Germ. 1978, v.37, N1, p.13-18.

54. Свято И., Склянкина В.А., Аваева С.М. Модификация активного центра неорганической пирофосфатазы дрожжей моноэфирами фосфорной кислоты. Тезисы 6-го Всесоюзн. симп. по химии белков и пептидов. Рига, 1983, с.167-168.

55. Wong S.O.K., Hall D.G., Josse J. Constitutive inorganic pyrophosphatase of E.coli. III. Molecular weight and physical properties of the enzyme and its subunits. J.Biol.Ohem., 1970, v.245, N17, p.4335-4345.

56. Lachti R., Pitkaranta Т., Valve Е., Ilta I., Kukko-Kalske E., Heinonen J. Cloning and characterization of the gene encoding inorganic pyrophosphatase of E.coli K-12. J. Bacterid., 1988, v. 170, N12, p.5901-5907.

57. Арутюнян Э.Г., Назарова Т.И., Курилова С.А., Аваева С.М. Рент-геноструктурное исследование неорганической пирофосфатазы из е.coll. I. Выращивание кристаллов и получение тяжелоатомных производных. Вестник МГУ, сер.2, Химия, т.31, N1,с.98-100.

58. Борщик И.Б., Магретова Н.Н., Черняк В.Я., Склянкина В.А., Аваева С.М. Структурная организация неорганической пирофосфатазы E.coli. -Биохимия, 1986, т.51, N9, с.1484-1486.

59. Борщик М.Б., Склянкина В.А., Аваева С.М. Молекулярные формы неорганической пирофосфатазы E.coli. Вестник МГУ, сер.2, Химия, т.27, N1, с. 102-103.

60. Joese J. Constitutive inorganic pyrophosphatase of E.coli. I. Purification and catalytic properties. J.Biol.Chem., 1966, v.241, N9, p.1938-1947.

61. Josse J., Wong S.C.K. Inorganic pyrophosphatase of Escherichia coll. In: The Enzymes / Ed.Boyer P.D. N.Y.: Acad.Press, 1971, 3d ed., v.4, p.499-527.

62. Josse J. Constitutive inorganic pyrophosphatase of E.coli. II. Nature and binding of active substrate and the role of magnesium. J.Biol.Chem., 1966, v.241, N9, p.1948-1957.

63. Курилова С.А., Назарова T.M., Аваева С.М. Регуляторный центр в неорганической пирофосфатазе E.coli. Биоорган, химия 1984, т.10, N10, с.1336-1341.

64. Курилова С.А., Богданова А.Б., Назарова Т.И., Аваева С.М. Изменение активности неорганической пирофосфатазы E.coli при взаимодействии с ионами магния, цинка, кальция и фтора. Биоорган, химия, 1984, т.10, N9, с.1153-1160.

65. Курилова С.А., Назарова Т.И., Аваева С.М. Гидролиз субстрата неорганической пирофосфатазой E.coli. Биоорган, химия, 1983, Т.9, N8, с.1032-1039.

66. Курилова С.А.,, Богданова А.Б., Назарова Т.И., Аваева С.М. Субстраты неорганической шрофосфатазы E.coii. Биоорган, химия, 1984, т.10, N9, с.1147-1152.

67. Shestakov A.A., Baykov A.A., Avaeva S.M. Tightly bound pyrophosphate in E.coii inorganic pyrophosphatase. EEBS Lett., 1990, v.262, n2, p.194-196.74.

68. Baykov A.A., Shestakov a.s., Kasho v.n., Yener A.V., Ivanov A.H. Kinetics and thermodynamics of catalysis by the inorganic pyrophosphatase of E.coii in both directions. Eur. J. Biochem., 1990, v.194, N12, p.879-887.

69. Burton D.M., Josse J. Constitutive inorganic pyrophosphatase of E.coii. VI. Inactivation by chimical modification of lysine residues.- J.Biol.Ohem., 1970, v.245, N17, p.4358-4364.

70. Комиссаров А.А. Функционально важные остатки лизина и аргинина в неорганических пирофосфатазех из дрожжей и E.coii. Дисс. канд. хим. наук, М., 1988, МГУ.

71. Samejima T., Tamagawa Y., Kondo Y., Hachimori A., Kaji H., Take da A., Shiroga Y. Chemical modification of histidyl and tyrosyl residues of inorganic pyrophosphatase from E.coii. J. Biochem.,1988,v.103,N5, p.766-772.

72. Lachti R., Salminen Т., Latonen S., Heikinheimo P., Pohjanoksa K., Heinonen J. Genetic engineering of E.coli inorganic pyrophosphatase. Tyr55 and Tyr141 are important for the structural integrity. Eur. J. Biochem., 1991, v. 198, N2, p.293-297.

73. Борщик И.Б., Склянкина В.А., Аваева С.М. Моноэфиры фосфорной кислоты аффинные ингибиторы неорганической пирофосфатазы E.coli. - Биоорган. химия, 1985, т.11, N6, с.778-783.

74. Sklyankina V.A., Avaeva S.M. The quaternary structure of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase is essential for phosphorylation. Eur.J.Biochem, 1990, v.191, p.195-201.

75. Ichiba Т., Takenaka 0., Samejima Т., Hachimori A. Primary structure of the inorganlo pyrophosphatase from thermophilic bacterium PS-3- J. Biochem., 1990, v.108, p.572-578.

76. Hachimori A., Shiroga Y., Hirato A., Miyahara Т., Same j ima T. Effects of divalent catoins on thermophilic inorganic pyrophosphatase J. Biochem., 1979, v.86, p.121-130.

77. Hirano N., Iciiiba Т., Hachimori A. The role of histidine-118 of inorganic pyrophosphatase from thermophilic bacterium PS-3. -Biochem. J., 1991, v.278, p.595-599

78. Куранова И. П., Обмолова Г.В., Конарева H.B. Неорганическая пирофосфатаза из экстремально термофильной бактерии' Thermus ther-mophilus. Докл. АН СССР, т.295, N4, с.1013-1016.

79. Hoehne W.S., Wessner Н., Kuranova I.P., Obmolova G.Y. Kinetic characterization of a thermostable inorganic pyrophosphatase from Thermus thermophilus. Biomed. Biophem. Acta, 1988, v.47, N12, p. 941 -947.

80. Петевка H.B. Химическая модификация функциональных групп неорганической пирофосфатазы Thermus thermophilus. Дипломная работа, М., 1988, с.27-53.

81. Lallti R., Niemi Z. Purification and properties of inorganic pyrophosphatase from Streptococcus faecalis. J. Biochem., 1981, v. 90, p.79-84.

82. Lahti R., Heinonen J. Reversible changes in the activity of inorganic pyrophosphatase of Streptococcus faecalis. The effect of compounds, containing SH-groups. Acta Ghem Scand., 1981, v.356, p.33-37.

83. Lahti R., Hannukainen R., Lounberg H. Effect of spermine and spermidine on the inorganic pyrophosphatase of Streptococcus faecalis. Interactions between poliamines and inorganic pyrophosphate. -Biochem. J., 1989, v.259, N1, p.55~59.

84. Tominaga N., Mori T. Purification and characterization of inorganic pyrophosphatase from Thiobacillus thiooxidans. J. Biochem ., 1977, v.81, p.477-483.

85. Howard A., Lungren D.G. Inorganic pyrophosphatase from Ferro-bacillus Perrooxidans (Thiobacillus ferrooxidans). Can. J. Biochem., 1970, v.48, p.1302-1307.

86. Scheier E., Hohne W.E. Kinetic characterization of inorganic pyrophosphatase from Bacillus stearothermophilus PEBS Lett., 1978, v.90, N1, p.93-96.

87. Shiroga Y., Samejima T. The specific modification of histidil residues of inorganic pyrophosphatase from Bacillus stearotermo-philus by photooxidation. J. Biochem. 1985, v.98, p.333-339

88. Lahti R., Randaskoski M. Soluble inorganic pyrophosphatase from Schizoph.il lum commune. Polia Microbiol., 1983, v.28, p.371-378.

89. Osterheld R.K. Kinetics of the aqueous Reversion of pyrophosphate. J.Phys.Chem., 1958, v.62, p.1133-1142.

90. Lundin M., Baltscheffsky H., Ronne H. Yeast PPA2 gene encodes a mitochondrial inorganic pyrophosphatase that is essential for mitochondrial, function. J. Biol. Chem., 1991, v.266, N19, p.12168-12172.106.

91. Kang C.B.H., Ho K.K. Characterization of a soluble inorganic pyrophosphatase from Microcystis aeruginosa and preparation of its antibody. Arch. Biochem. Biophys., 1991, v.289, N2, p.281-288.

92. Личко Л.П., Окороков Л.А. Мембранная и растворимая пирофосфа-тазы из вакуолей Saccharomyces carlsbergensis. Виол, мембраны, 1989, т.6, N7, с.683-688.

93. Hachimori A., Takeda A., Kaibuchi М., Ohkawara N., Samejima Т. Purification and characterization of inorganic pyrophosphatase from Bacillus stearothermophilus. J. Biochem., 1975, v.77, p.1177-1182.

94. Смирнова М.Н., Байков А.А. Неорганическая пирофосфатаза цито-золя печени крысы: выделение и свойства. Биохимия, 1989, т.54, N2, с.228-234.

95. Morita J., Yasui 'Т. Purification and some properties of a neutral muscle pyrophosphatase. J. Biochem.,1978, v.83, p.718-722.

96. Krishnan Y.A., Gnanam A. Properties and regulation of magnesium-dependent chloroplast inorganic pyrophosphatase from Sorghum vu,jgare leaves. Arch. Biochem. Biophys., 1988. v.260, N1, p.277-284.

97. Bermet Y.L., Ristrophe D.L., Hamming J.J., Butler L.G. Maize leaf inorganic pyrophosphatase: izosymes, specifityfor substrates, inhibitors, and divalent metal ions, and pH optima. - Bio-ehiffi. Biophys. Acta, 1973, v.293, p.232-241.

98. Mukherjee J.J., Pal P.R. Distribution of alkaline inorganic pyrophosphatase in leaves of different families of plants and partial characterization of the enzyme from Amarantus blitum L. Acta Biol. Chem., 1982, v.46, p.2735-2740.

99. Kawasaki I., Adachi N., Ikeda H. Nucleotide^sequence of Schi-zosaccharomyces pombe inorganic pyrophosphatase. Nucleic. Acids Res., 1990, v.18, N19, p.5888

100. Но K.K., Khoo K.L. Alkaline inorganic pyrophosphatase from orchid leaves. Phytochemistry, 1985, v.24, p.2529-2532.

101. Koskowska-Dziadowicz M., Malgovzata 0., Szymczyk T. Purification and of inorganic pyrophosphatase from rat salivary glands. -Acta Biochim. Pol., 1990, v.37, N3, p.345-358.

102. Stark M.J.R., Mulner J.S. Cloning and analysis of the Kluyve-romyces laotis TRP1 gene: a chromosomal locus flanked by genes encoding inorganic pyrophosphatase and histone H3

103. Liu Mei Sliion, Kao Ching Huei, Senesence of rice leaves.1. Ojl

104. XXIII. Changes of Zn -dependent acid inorganic pyrophosphatase. -J. Plant Physiol.,1990, v.137, N1, p.41-45.

105. Jacob J.L., Prevot J.C., Clement-Vidal A., D'Anzae J. Inorganic pyrophosphatase metabolism in Hevea brasiliensis latex. Characteristics of cytosolic alkaline inorganic pyrophosphatase. -Plant Physiol. Biochem. (Paris), 1989, v.27, N3, p.355-364.

106. Border M. Inorganic pyrophosphate-phosphohydrolytic activity in human serum. Catalytic properties of the ionic species of PP and MgPP± complexes. Biochim. Biophys. Acta, 1973, v.312, p.329-335.

107. Morita J., Yasui T. Subcellular localization of inorganic pyrophosphatase in rabbit skeletal muscle and some properties of a micrisomal acid pyrophosphatase. Agric. Biol. Chem., 1985, v.49, N5, p.1397-1 403.

108. Брага Э.А., Байков А.А., Аваева C.M. Роль ионов магния в гидролизе пирофосфата неорганической шрофосфатазой из дрожжей. -Биохимия, 1973, N2, с.344-350.

109. Ferguson S.J., Lloyd W.J., Lyons М.Н., Radda G.K. Selective and reversible inhibition of the ATPase of Micrococcus denitrifi-cans by 7-chloro-4-nitro-2,1,3,-bensooicad.iaxole. Eur. J.Biochem., 1975, v.54, p.117-126.

110. Sutton K., Ferguson S.S. Tyrosine311 of a (3-chain is the essential residue specifically modified by 4-Ghloro~7~nitrobenzofu~ razan in bovine heart mitochondrial ATPase. Eur. J. Biochem., 1985, v.148, N3, p.551-554.

111. Andrews W.W., Hill P.O., Allison W.S. Identification of theessential tyrosine residue in the (3-subunit of bovine heart mito1 4ehondrial P^-ATPase that is modified by 7-chloro-4nitro 43.benso~ furazan. J. Biol. Chem., 1984, v.259, N13, p.8219-8225.

112. Банков А.А., Краснова B.M., Аваева C.M. Изменение функциональных свойств неорганической пирофосфатазы дрожжей при модификации SB-грузш.- Биоорган, химия, т.8, N2, с.195-199.

113. Yano Y., Irie М. Renaturation of yeast inorganic pyrophosphatase denaturated in urea and guanidine hydrochloride. -J.Biochem., 1975, v.78, p.1001-1006.

114. Хьюз M. Неорганическая химия биологических процессов, М., "Мир", 1983, с.325.

115. Mattews B.W., Weaver L.H., Binding of lantanide ions to ther-molysin.- Biochemistry, 1974, v.13, p.1719

116. Glockshuber R., Stadlmuller J., Pluckthurn A. Mapping and modification of an antibody hapten binding site: a site-directed mutagenesis study of МсРСбОЗ. Biochemistry, 1991, v.30, N12, p.3049-3054

117. Woodward R.B., Olofson R.A., Mayer M.Y. J. Amer. Chem. Soo., 1961, v.83, p. 1010-1012.

118. Petra P.H. Characterization of bovine carboxypeptidase A. -Biochemistry, 1971, v.10, N7, p.3163-3170.

119. Sinha U., Brewer J.M. Yeast enolase carboxyl modification using ?foodward's reagent K. Bio chem. cell biol., 1986, v.64,1. N10, p.970-975.

120. Sinha U., Brewer J.M. A spectrophotometry method for quantitation of carboxyl group modification of proteins using Woodward's reagent K. Anal. Biochem., 1985, v.151, p.327-333.

121. Baykov A.A-, Avaeva S.M. Asimpie and sensitive apparatus of continios monitoring of orthophosphate in the presence of acide-labile compounds. Anal. Biochem., 1981, v.116, N1, p1~4.

122. Hudson E.N., Weber G. Biochemistry, 1973, v.12, N21, p. 4154- 4161.

123. Дарбре А. Практическая химия бежа, M., "Мир", 1989, с. 147.

124. Ellman G.L. (Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem. Bio-phys., 1959, v.82, p.70-77.