Характеристика эффекторного центра неорганической пирофосфатазы Escherichia Coli тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. Ломоносова

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

СИТНИК Татьяна Сергеевна

ХАРАКТЕРИСТИКА ЭФФЕКТОРНОГО ЦЕНТРА НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ПИРОФОСФАТАЗЫ ESCHERICHIA COLI

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2006

Работа выполнена в лаборатории химии белка кафедры химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор Аваева Светлана Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Румш Лев Давидович

кандидат химических наук, Сенин Иван Иванович

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

им. В .А. Энгельгардта РАН

Зашита состоится 28 марта 2006 года в 16.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, д.1, строение 40, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 28 февраля 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

2ööQ(\ 453 -f

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Растворимые пирофосфатазы являются важнейшими ферментами, катализирующими катион-зависимый гидролиз пирофосфата, тем самым обеспечивая эффективность многих биосинтетических реакций. Объектом исследования в настоящей работе является неорганическая пирофосфатаза из Escherichia coli (КФ З.6.1.1.; Е-РРаза). Пирофосфатаза является конститутивным ферментом, то есть ее регуляция происходит не на уровне экспрессии гена, а путем изменения активности уже синтезированного белка. В связи с этим одной из актуальных проблем является изучение возможных путей регуляции активности фермента. Недавно при изучении гидролиза MgPP, под действием тримерной формы пирофосфатазы E.coli были обнаружены особенности, которые удалось объяснить наличием эффекторного центра. В пользу существования эффекторного центра указывало также включение двух меченых молекул пирофосфата в каждую субъединицу фермента и активация гидролиза субстрата под действием метилендифосфоната.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению свойств эффекторного центра, выявлению его роли в функционировании неорганической пирофосфатазы Е. coli. Для выполнения работы были сформулированы следующие задачи:

1. поиск производных фермента, под действием которых гидролиз субстрата не подчиняется кинетике, описываемой уравнением Михаэлиса - Ментен.

2. изучение влияния на эффекторный центр замен остатков лизина и аргинина, которые образуют катионный кластер на поверхности пирофосфатазы, и остатка аспарагиновой кислоты, расположенного в области контакта тримеров;

3. изучение особенностей ферментативного гидролиза при заполнении эффекторного центра пирофосфатом, метилендифосфонатом и их магниевыми комплексами;

4. характеристика эффекторного центра при гидролизе LaPP,.

Научная новизна и практическая значимость работы Установлено, что РРаза Ecoli является субстрат-активируемым ферментом, то есть скорость гидролиза увеличивается при заполнении эффекториого центра еще одной молекулой MgPP,. Этот центр также связывает негидролизуемый аналог субстрата - магний метилендифосфонат (MgPCP), что обнаруживается при гидролизе как MgPP,, так и LaPP,. В последнем случае удается достичь активации в сотни раз.

Введение аминокислотных замен расширило круг мутантных вариантов Е-РРазы, для которых выявилось нарушение эффекториого центра, перестройка белковой структуры, а также изменение эффективных параметров химической и термической денатурации. Для Lysl 12Gln-PPa3bi и двух двойных мутантных вариантов, содержащих эту замену, обнаружено, что эффектор активирует гидролиз только LaPP,, но не MgPP,.

Использование в качестве альтернативного субстрата LaPP, выявило существование в гексамерной Е-РРазе положительной кооперативности активных центров. Показано, что кооперативность характерна также для димерной молекулы дрожжевого фермента (Y-РРаза) В обоих ферментах связывание LaPP, ухудшает заполнение ионами магния центра М2. Связывание в эффекторном центре MgPCP вызывает ускорение гидролиза LaPP, под действием не только Е-РРазы, ее мутантных вариантов и тримерной формы этого фермента, но и дрожжевой Разы; причем удается достичь скорости гидролиза LaPP,, близкой к той, с которой гидролизуется природный субстрат - MgPP,. В присутствии эффектора также происходит исчезновение асимметрии субъединиц и сильно возрастает сродство LaPP, к активному центру. К такому же результату приводит увеличение концентрации ионов магния и добавление в случае Е-РРазы фторид-иона.

Публикация и апробация работы По теме диссертации опубликованы 2 статьи Результаты диссертации были представлены на 29 Конгрессе Европейского Биохимического сообщества FEBS-2004 (Варшава, 2004), 3 международном конгрессе по пирофосфатазам (Бирмингем, 2004), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов - 2004" (Москва, 2004), Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущине, 2004),

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы Диссертация изложена на joK страницах и содержит рисунков и таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Пирофосфатазы относятся к конститутивным ферментам, то есть регуляция их активности осуществляется не на уровне экспрессии генов, а на уровне уже синтезированного белка. Регуляция активности таких ферментов может происходить в результате конформационных перестроек высокоинтегрироваяной структуры белков.

Одним из способов регуляции активности неорганической пирофосфатазы из E.coli является заполнение эффекторного центра, который впервые проявился при изучении тримерной формы фермента. Оказалось, что для достижения максимальной активности гримерной форме Е-РРазы требуется увеличение концентрации субстрата, чтобы свободный пирофосфат (РР,) заполнил эффекторный центр.

Важно, что пирофосфатазы являются металл-зависимыми ферментами. Известно, что физиологический диапазон концентраций Mg^B клетке составляет 1-1,5 мМ, а для насыщения активного центра Е-РРазы необходимо 5-6 мМ Mg2*. Поэтому in vivo этот фермент может быть и не насыщен ионами магния, однако, его высокая активность дает основание предполагать существование некоего компенсаторного механизма.

В настоящей работе получен ряд доказательств того, что при гидролизе MgPP, в эффекторном центре Е-РРазы связывается еще одна молекула субстрата (MgPP,), что приводит к активации фермента. В эффекторном центре могут также связываться другие активаторы гидролиза: РСР и его магниевая соль. Использование в качестве субстрата LaPP, подтвердило наличие эффекторного центра в Е-РРазе и выявило его существование в дрожжевом ферменте Положительная кооперативность субъединиц, обнаруженная при связывании LaPP,, исчезала при добавление либо MgPCP, либо фторид-иона, либо высоких концентраций Mg2* Изучение гидролиза MgPP, мутантными вариантами показало, что для части ферментов происходит ухудшение связывания эффектора. Исключение составляют белки, содержащие замену Lysl 12, для них действие эффектора проявляется при гидролизе LaPP,, но не MgPP,.

Свойства мутантных вариантов неорганической пирофосфатазы Escherichia coli, содержащих замены на поверхности белковой глобулы и в межтримерной области

контактов.

На поверхности белковой глобулы существует область, образованная положительно заряженными аминокислотами: Lysl 15, Lysl 12, Lysl48, Lysl46, Arg43, в которой потенциально могла связываться отрицательно заряженная молекула РР, (рис.1).

Остатки Lys 148 и Lys 146 принадлежат наиболее неупорядоченному участку полипептидной цепи - петле 144-149. Эта петля

непосредственно

примыкает к а -спирали 127-143 -остатки которой,

с одной стороны, образуют межтримерную область, а с другой входят в состав активного центра. Arg43 обращен в полость активного центра, когда связан субстрат, и поворачивается наружу в его отсутствие. Остатки Lysl 12 и LysllS попадают в эту область из другой субъединицы. Для введения сайт-направленных мутаций в ген Е-РРазы использовали двухстадийную полнмеразную цепную реакцию с применением трех праймеров. Синтезированные и очищенные гены мутаятных белков лигировали с плазмидой pUC19 и проводили отбор рекомбинантных. Секвенирование модифицированных генов показало, что все они несут только нужные мутация. Соответствующие белки были выделены в гомогенном состоянии. Для получения двойных мутантных вариантов в качестве матрицы использовали ген пирофосфатазы с единичной заменой. Таким образом, были получены следующие мутантные варианты РРазы: Arg43Gln, Lysll5Ala, Lysl48Gln, Lysll2Gln, Lysl 12/148Gln и Lysl 12G!n/Lysl 15Ala.

Связывание ионов магния. Для характеристики состояния активного центра важно было проверить, повлияли ли введенные мутации на сродство Mg2+ к центрам М2 и М4. Центр М1 характеризуется высоким сродством к ионам Mg2* я оказывается заполненным при очень низких концентрациях ионов металла. Спектрофотометрическое титрование нативной Е-РРазы и ее мутантных вариантов ионамя магния было использовано для определения константы диссоциации в центре М2 в отсутствие субстрата. Сродство ионов магния в центре М2 в присутствия субстрата вычисляли из зависимости скорости гидролиза субстрата от концентрации Mg2+. Оказалось (табл. 1), что для мутантных вариантов РРазы Asp26Ala, Lysl 12Gln, Lysl 12Gln/Lysl 15Ala и Lysl 15А1а константа диссоциации иона металла в

Рис. 1. Субъединица Е-РРазы. В активном центре показаны ионы металла и молекула пирофосфата. Отмечены аминокислотные остатки, которые были заменены. При создания рисунка использована структура комплекса Е-Са2.СаРР„ Н40.р<1Ь.

Таблица 1 Константы диссоциации (мМ) комплексов -фермент и -фермент-субстрат для нативной и мутантных РРаз.

присутствии субстрата сопоставима с

величиной, характерной для фермента дикого типа В случае же мутантных вариантов ЬувШап- и

1^148/1 ШЬ-РРщ сродство к ухудшается. Данные СФ титрования показывают, что небольшое ухудшение связывания иона металла с апо-формой фермента происходит только у Ьув115А1а-РРазы.

Известно, что при высоких концентрациях ионов магния и рН 9,0 может наблюдаться падение активности, причиной которого является заполнение ионом магния центра М4. В отличие от других мутантных вариантов фермента, такое поведение не наблюдалось для Ьуз14801п-РРазы, что свидетельствовало об ухудшении связывания в центре М4 для этого фермента Четвертый металл слабее также связывался и с А^4301п-РРазой, поэтому ингибирование гидролиза начинало проявляться при более высоких концентрациях

Однако такие свойства Ьу$141Ю1п- и А^4301п-РРазы нельзя расценивать как результат замены данных конкретных остатков, так как известно, что многие другие единичные мутации Е-РРазы приводят к аналогичному результату. По-видимому, при введении мутаций нарушается тонкая структура сети нековалентных контактов в области центра М4, что может отражать влияние мутаций на интегрированную структуру фермента.

Кинетика гидролиза субстрата мутантными формами Е-РРазы. Как уже отмечалось, наличие эффекторного центра в неорганической пирофосфатазе Е соИ вытекает из различных видов экспериментов: кинетика гидролиза субстрата не подчиняется уравнению Михаэлиса - Ментен; из данных равновесной гель-фильтрации, и из активации гидролиза М§РР, в присутствии негидролизуемого аналога - метилендифосфоната. Причем отклонение от кинетики, подчиняющейся уравнению Михаэлиса - Ментен, удается обнаружить в тех случаях, когда сродство к эффекторному центру каким-то образом нарушено Впервые эффекторный центр был обнаружен для тримерной формы Е-РРазы В этом случае результаты хорошо описывались следующей схемой.

РРаза комплекс

М^-фермент М£"-фермент-субстрат

рН 9,0 рН 7,5

\УТ 1,4±0,4 О,3±0,04

ЬувШап 1,08±О,О8 0,23±о,оз

Ьуз115А1а З,7±0,3 0,3±0,04

Ьуз112С1п/Ьу5115А1а 0,26±0,04

Аг§43ап 1,8±0,4 0,5±0,04

1лч148СИп 1,2±0,1 0,9±0,08

1д*112/14801п М±0,2

АБр26А1а 1,0±о,1 0,27±0,02

ЕМгз*-

4

к*

*Шг1(МгРР1)-

ЕЩ? (ЛР,) < & > 24^, ЯР,) $кса1

Скорость гидролиза MgPP, - V, при данной концентрации (1) описывается уравнением (1) (при допущении, что константы диссоциации комплексов с эффектором (РРО и с субстратом (\lgPPi) не зависят от их порядка присоединения к ферменту):

V=-——'-"то—^- (1) где ут _ максимальная скорость

/КеШ^ЛЗ+К^2/Ке[М^+]

гидролиза в данных условиях, р - коэффициент увеличения скорости гидролиза, и Ке -константы диссоциации субстрата и эффектора, соответственно, Кл - константа диссоциации комплекса \lgPP, при фиксированном значении рН.

Изучение кинетики гидролиза субстрата мутантными ферментами показало, что в отличие от нативного фермента, дня вариантов с заменой Азр26А1а, А^4301п, Ьу$115А1а, и Ьу$148С1п характерно ярко выраженное отклонение от кинетики, подчиняющейся уравнению Михаэлиса - Мешен (рис.2).

тИОМ

о/в 0,06 аов о,12

403 ДО аов 0,12

0,15

Рис.2. Гидролиз MgPP, А5р26А1а-(1), Ьуз148С1п-(2), ЬуБ115А1а-(3) и А1£4301п-(4) - Разами; 2мМ Мд2*, рН 7,5; данные представлены в двойных обратных координатах.

Для этих белков согласно приведенной схеме и уравнению определены кинетические параметры гидролиза субстрата (табл. 2).

Из таблицы видно, что данные мутации мало отразились на связывании субстрата (К$) в активном центре и немного хуже эта величина стала для А^43С1п-РРазы. Для этого мутантного варианта также характерно снижение каталитической активности на два порядка по сравнению с нативным ферментом (для Е-РРазы Ут,, = 680 МЕ). Поскольку остаток А^43 является прямым лигандом субстрата в активном центре и координирует уходящий

Таблица 2 Кинетические параметры гидролиза MgPP, гексамерами мутантных Е-РРаз и тримерной формой нативной Е-РРазы при рН 7,5 и 2 мМ Mg2*, рассчитанные по уравнению (1).

фосфат после его гидролиза, такой результат неудивителен. Введение мутационных замен остатков Lysl48 и Asp26 также отразилось на скорости гидролиза, которая снизилась приблизительно в два раза по сравнению с нативным ферментом. Сродство к эффекторному центру мало отличается от сродства субстрата к активному и величина КЕ лежит в микромолярной области.

Принципиально по-иному ведут себя Lysll2Gln-PPa3a и двойные мутантные варианты, содержащие также замену Lysl 12' Lysll2Gln/Lysll5Ala- и Lysl 12/148Gln-PPa3bi При низких концентрациях субстрата скорости гидролиза MgPP, под действием этих мутантных вариантов и под действием тримерной формы нативного фермента очень похожи (рис. 3). Однако при дальнейшем увеличении концентрации субстрата активность тримерной

РРаза Уши,ME b Кs, мкМ Kc, мкМ

Lysll5Ala 329±16 1,8±0,1 1,0±0,2 3,7±1,6

Lysl48Gln 132±5 1,5±0,1 3,5±0,6 3,2±1,2

Arg43Gln 7,2±0,5 2,5±0Д 6,2±0,7 3,5±0,7

Asp26Ala 164±52 1,7±0,5 3,1±1,6 0,7±0,4

WTtphm 288±11 2,0±0,1 2,6±0,5 6±1

[MgPPJ, мкМ

Рис. 3. Гидролиз MgPP, WT-(l), WT^ 42), и Lysl 12Gln-(3) РРазами при 5 мМ Mg2+, рН 7,5.

5.0x1 (Г" 4,5x10^ 4.0x1ff"

2

<

S 3,5x10 3,0x1e4-

0,07

o,oe

0,05 Ш 2

003 0,02

1/[МдРР^ ним1

Рис. 4. Гидролиз MgPP1 Ьу8112Ч1), Ьув 11201п/Ьу5115А1аЧ2) и Ьу5112/148С1п-(3), РРазами данные представлены в двойных обратных координатах.

формы растет, а в случае этих мутантных вариантов остается постоянной Зависимость скорости гидролиза от концентрации субстрата в двойных обратных координатах имеет линейный вид (рис. 4), что позволяет рассчитать кинетические параметры гидролиза в соответствии с уравнением Михаэлиса-Ментен, которые приведены в таблице 3 Удивительно, что одновременная замена двух остатков не отражается на общем ходе

Таблица 3. Кинетические параметры гидролиза М(»РР, гексамерными формами нагивной и мутаятных РРаз.

зависимости скорости от концентрации субстрата, но столь по-разному сказывается на их активности, которая увеличивается при введении второй мутации по 15 и резко уменьшается при введении замены ЬувМв. Такие особенности гидролиза можно объяснить двумя способами. Возможно, что в этих мутантных вариантах значительно улучшилось связывание эффектора и стало таким, как у нативиого фермента. В этом случае при низких концентрация субстрата поведение Ьу$112С1п-РРазы было бы аналогичным \УТ-РРазе (рис. 3), оказалось, что это не так. Активность нативного гексамера при низких концентрациях субстрата возрастает значительно быстрее, благодаря заполнению эффекторвого центра, что не свойственно мутантному белку (рис. 3). Второе объяснение предполагает, что введенная замена сделала невозможным присоединение эффектора. В этом случае кинетика гидролиза \fgPP, также будет подчиняться уравнению Михаэлиса-Ментен и будет описываться верхней строкой схемы (1).

Кинетические характеристики тримерной формы ¿та/ПСЫ-РРазы. Активность нативного гексамера определяется связыванием субстрата и заполнением эффекторного центра, диссоциация же до тримеров приводит к уменьшению сродства к эффектору. Для достижения тримерной формы активности гексамерной формы Е-РРазы необходимо значительное увеличение концентрации субстрата. Если предположить, что в Ьу511201л-РРазе эффекторный центр не функционирует, то превращение этого гексамера в тример не должно отражаться на его активности при высоких концентрациях субстрата, что я было показано. Оказалось, что тримерная форма Ьу$112СТп-РРазы обладает такой же активностью, что и гексамерная форма (290 МЕ), и константа связывания субстрата лежит в районе 4 мкМ. Отличия наблюдаются только в скоростях холодовой инактивации, которая уменьшается для тримерной формы этого мутантного варианта, по сравнению с другими тримерами.

Таким образом, отсутствие активации гидролиза \igPP, гексамерной и тримерной формами Ьу$112СТп-РРазы или ее двойными мутантными вариантами, содержащими замену ЬувШ, свидетельствует о том, что этот остаток играет существенную роль в функционировании эффекторного центра. При этом следует учитывать две возможности. Первая заключается в непосредственном связывании эффектора с 12. Однако образование прочного комплекса за счет ионных контактов на поверхности белка представляется мало вероятным. Вторая возможность влияния остатка Г-ув! 12 на состояние

РРаза УжМЕ Км, мкМ

ЬувтИп 294±4 2,8±0,2

Ьув112С1пЛ.у$115А1а 339±4 3,2±0,2

ЬувШ/Мвап 47±2 8,8±1,4

\*Т 680±13 3,2±0,3

эффекторного центра может быть связана с опосредованным изменением структуры белка в результате введения мутаций Известно, что такого рода опасения всегда возникают при мутагенезе. Уменьшение активности у Lysl12/148Gln-PPa3bi по сравнению с Lysl48GLn-РРазой и снижение скорости холодовой инактивации тримера Lysll2Gln-PPa3bt свидетельствует об изменении структуры белка при введении замены Lysl 12 Ниже мы еще вернемся к вопросу о роли остатка Lysl 12 в функционировании Е-РРазы

Влияние метилендифосфоната на гидролиз МяРР, нашивной РРазой и ее мутантными вариантами Еще один факт, свидетельствующий об изменении функционирования эффекторного центра при замене остатка Lysl 12, был получен при сопоставлении действия PCP на активность мутантных белков Факт активации фермента под действием PCP является прямым подтверждением того, что это соединение связывается с ферментом в центре, отличном от активного. В настоящей работе также была изучена кинетика гидролиза MgPP, мутантными вариантами в присутствии переменных концентраций PCP (рис. 5)

Оказалось, что для тех мутантных вариантов, у которых ухудшилось сродство к эффекгорному центру (Asp26Ala-, Arg43Gln-, Lysll5Ala- и Lysl48Gln)-PPa3 - наблюдается активация гидролиза MgPP, под действием PCP. В то же время активация отсутствовала у Lysll2Gln-, Lysl 12/148Gln- и Lysl 12Gln/l 15А1а-РРаз (рис 5).

Сделанные выше

предположения о возможном изменении структуры нашли подтверждение в опытах по термической и химической денатурации белков. Термическую стабильность нативной Е-РРазы и полученных мутантных вариантов характеризовали методом дифференциальной сканирующей калориметрии (рис 6), а химическую денатурацию проводили при увеличивающейся концентрации гуанидин гидрохлорида Оказалось, что все мутантные варианты более устойчивы к термической и химической

lPCPW м,(М

Рис. 5. Влияние метилендифосфонагга на скорость гидролиза 10 мкМ MgPP, нативной (2) и мутантными Е-РРазами- Arg43Gln-(l), Asp26Ala-(3)Lysl 15А1а-(4), Lysl48Gln-(5), Lysll2Gln-(6), Lysl 12/148Gln-(7) и Lysll2Gln/Lysll5Ala-(8)

Условия- 10 мМ Mg:\ pH 6,0 3a 100% принята активность фермента в отсутствие PCP при рН 6,0 в присутствии 10 мМ Mg2+ За 100% принята активность фермента в отсутствие PCP.

о" 2°°

100

< 400

^ 500-

S?

300

денатурации, чем \УТ-РРаза. Как следует из рис. 6 исключение составляет А8р26А1а-РРаза, которая менее стабильна, чем все остальные белки.

о-

50 СО 70 SO SO 100 Температура,"С

Рис. 6. Дифференциальная сканирующая калориметрия WT РРазы-(2) и ее мутаитных вариантов: Asp26Ala-(l), Lysl 12Gln/Lysl 15А1а-(3) Lysl 15А1а-(4), Lysl48Gln-(5), Arg43Gln-(6).

Условия: 0,1 M Hepes-NaOH, рН 7,5. Линии получены в результате непрерывного измерения ДСР.

Природа эффектора при ферментативном гидролизе ЩРР>.

Как обсуждалось выше, тримеру Ч/Т-РРазы и ряду мутактных вариантов для достижения максимальной активности при гидролизе \1gPP, требуется заполнение эффекторного центра. При этом предполагалось, что эффектором является свободный пирофосфат. В настоящей работе этот вопрос изучен более детально. Для этого получены зависимости скорости гидролиза в широком диапазоне \lgPP, при изменении концентрации ионов магния от 200 до 5000 мкМ и концентрации субстрата от 3 до 400 мкМ. Полученные зависимости представлены на рис. 7. Видно, что с увеличением концентрации ионов магния

Рис. 7. Гидролиз MgPP, тримерной формой WT-РРазы в присутствии переменной концентрации Mg2+: (1) - 0,2 мМ, (2) - 0,4 мМ, (3) - 0,6 мМ, (4) - 0,8 мМ, (5) - 1 мМ, (6) - 2 мМ и (7) - 5мМ.

ш 300

<е

200

500

400

100

0-1-.-,---,---,---,-,-,-.-,---г-

0 50 100 150 200 250 300 350

[MgPPJ, мкМ

(от 200 мкМ до 5 мМ) при фиксированной концентрации субстрата (свыше 30 мкМ, когда активный центр насыщен субстратом) активность растет, хотя концентрация свободного пирофосфата при этом уменьшается (с 12 мкМ до 0,5 мкМ). Таким образом, исключается активирующее

действие

свободного

пирофосфата. В этом случае рост скорости гидролиза можно было

бы приписать увеличению концентрации ионов магния. Однако при постоянной и высокой концентрации ионов магния с увеличением концентрации субстрата происходит рост ферментативной активности. Таким образом, увеличение скорости гидролиза происходит в основном, благодаря связыванию еще одной молекулы М^Р,, но в центре, отличном от активного.

На основании этих данных Е-РРазу можно отнести к группе субстрат-акгивируемых ферментов. В этом случае схема, приведенная выше, и уравнение гидролиза субстрата приобретают более простой вид:

-(2)

где р - коэффициент увеличения скорости гидролиза (всегда больше 1), К s - константа диссоциации в эффекторном центре, кш и к^ - константы скорости каталитической реакции в отсутствие и в присутствии эффектора, соответственно. По уравнению (2) можно оценить кинетические параметры гидролиза тримерной формой Е-РРазы в присутствии активатора, что соответствует к«,, = 250 ME, р = 2,5 и Ks = 132 мкМ (рис. 8). Труднее описать сродство к

эффекторному центру в гексамерной форме Е-РРазы, так как активация фермента происходит уже при очень низких концентрациях субстрата, что свидетельствует о высоком сродстве к эффектору (рис. 3).

Более четкие результаты получаются, если активирующую молекулу субстрата в эффекторном центре заменить на PCP. На рис. 9 представлены результаты

гидролиза тримерной формой Е-РРазы нескольких фиксированных концентрацией субстрата в присутствии PCP.

* <2)

ssr}- J^Ubs+P

[МдРР,],мкМ

Рис. 8. Зависимость скорости гидролиза от концентрации MgPP1 тримерной \¥Т-РРазой; 5 мМ Мд2*, рН 7,5.. На основном графике кривая проведена по уравнению 2. На врезке представлены данные в координатах, используемых для расчетов.

300 __'

270

240 ш

^ 210-

1ВО V—^---

для 150- s

0 5 10 15 20 2S [MgPCP], мкМ

РН Рис. 9. Влияние MgPCP на гидролиз MgPP, -41)- 5 мкМ, (2)- 10 мкМ и (3) - 15 мкМ под действием тримерной формой Е-РРазы; 1 мМ Mg2+ и рН 7,5.

подтверждают, что MgPPi в эффекторном

Полученные данные указывают на существование в ферменте центра связывания метилендифосфоната,

заполнение которого активирует фермент.

Аналогичные результаты получены и гексамерной Е-РРазы. При низких концентрациях субстрата и 0,5 мМ при 7,5 активацию удается наблюдать только в том случае, когда реакционная смесь содержит сопоставимые с субстратом количества М§РСР. Эти наблюдения также : может быть замещен на \lgPCP

Следует отметить, что увеличение концентрации PCP при пиролизе 5 мкМ MgPP, Lysl 12Gln-PPa3ofi в присутствии 0,5 мМ Mg2+ не приводит к активации фермента. Данный факт подтверждает нарушение эффекторного центра в этом мутантном белке.

Сложностей в интерпретации результатов гидролиза MgPP, в присутствии эффектора, обусловленных многокомпонентностью системы, высокими скоростями процесса и большим сродством и субстрата, и эффектора, удается в значительной степени избежать, используя альтернативный субстрат - LaPP,.

[MgPPJ, A, ME A, ME

мкМ (7,5 мкМ

MgPCP)

2,5 82 142

5 178 232

10 268 317

15 360 360

Свойства эффекторного центра при гидролизе ЬаРР*.

Гидролиз ЬаРР, Е-РРазой и У-РРазой Использование в качестве субстрата ЬаРР, оказалось весьма плодотворным для изучения свойств эффекторного центра. Это соединение имеет существенное преимущество перед природным субстратом' реакционная смесь не содержит свободный пирофосфат, так как константа связывания лантана с пирофосфатом составляет 1017 М'1

Оказалось, что при гидролизе ЬаРР, нагивным ферментом проявляется положительная кооперативность в связывании субстрата, когда заполнение одной части субъединиц улучшает связывание в другой Кривая, хорошо описывающая экспериментальные данные, проведена по уравнению Хилла, где Ь = 2,4; Км более 300 мкМ и Утах 16 МБ (рис 10)

Наиболее вероятно, что неодинаковое поведение частей молекулы относится к двум тримерам.

Рис. 10. Зависимость скорости гидролиза отконцентрации ЬаРР, гексамерной формой Е-РРазы при рН 7,5 и 2 мМ Мк

ЦлРР|. шкМ

Рис. 11. Зависимость скорости гидролиза от концентрации ЬаРР, тримерной формой Е-РРазы при рН 7,5 и 2 мМ

И действительно, характер зависимости гидролиза 1_аРР, принципиально меняется в случае тримерной формы Е-РРазы (рис. 11). Активность фермента и в одном, и в другом случаях очень низкая, а связывание субстрата и при 200 мкМ не достигает насыщения.

Известно, что важным фактором, влияющим на ход гидролиза М^РР,, является концентрация ионов магния, поэтому необходимо было определить константу диссоциации активаторного иона металла (иона металла в центре М2) при гидролизе ЬаРР,.

Зависимость скорости гидролиза 50 мкМ ЬаРР, от концентрации (0,5-10 мМ) для Е-РРазы выявляет две константы диссоциации (Кп 1,28 мМ и 11,2 мМ) (рис.12). Ни одна из полученных констант не соответствует величине сродства ионов магния к фермент-субстратаному комплексу, полученной при гидролизе М§РР, (Ко = 0,3 мМ). Эти данные показали, что связывание в активном центре ЬаРР, очень сильно изменяет сродство к активному центру фермента. Поскольку связывание ЬаРР, приводит к появлению неодинаковых субъединиц, неудивительно, что выявляются две константы диссоциации металла. Однако увеличение в среде концентрации

М^ с 2 до 15 мМ,

достаточной для насыщения одного из обнаруженных центров, существенным образом меняет картину гидролиза (рис 13). Во-первых, происходит некоторое увеличение

Рис. 12. Зависимость скорости гидролиза 50 мкМ ЬаРР, от концентрации ионов магния для Е-РРазы при рН 7,5, данные представлены в двойных обратных координатах.

активности, во-вторых, что наиболее интересно, отсутствует сигмоидальный характер

зависимости скорости гидролиза от концентрации ЬаРР, (11=1), что означает исчезновение асимметрии субъединиц. В-третьих, происходит увеличение сродства субстрата к активному центру фермента. Вследствие этого Км для ЬаРР, становится равной 100 мкМ. Аналогичные закономерности

проявляются и при гидролизе ЬаРР, У-РРазой (рис. 14 (зависимосгь1)). Изучение зависимости скорости гидролиза 50 мкМ ЬаРР, от концентрации ионов магния для дрожжевого фермента также выявило две константы диссоциации (Ко 0,2 мМ и 2,3 мМ) (рис 15) Но как и в случае

о-1-------1---,----—

О 20 40 во 10

[ЬаРР,], мкМ

Рис. 13. Зависимость скорости гидролиза от концентрации ЬаРР, для Е-РРазы; 15 мМ и рН 7,5.

П.аРР^, мкМ

Рис. 14. Зависимость скорости гидролиза от концентрации ЬаРР, У-РРазой в присутствии (1) - 0,5 мМ и (2) - 2 мМ рН 7,5.

0,120,10-

0,020,00-1--->-,-,---,---,-,-.

0 4x10"* 8x104 1x10"1 2x10"* 2x10"1 1/1Мд**], им*

Рис 15.Зависимость скорости гидролиза 50 мкМ ЬаРР, от концентрации ионов магния для У-РРазы при рН 7,5, данные представлены в двойных обратных координатах.

гидролиза К^РР„ при гидролизе ЬаРР, проявляется лучшее сродство к ионам магния у дрожжевого фермента по сравнению с Е-РРазой, поэтому более высокая скорость гидролиза и исчезновение асимметрии субъединиц наблюдалось уже при 2 мМ (рис. 14

(зависимость 2)).

Поскольку сигмоидальный характер зависимости исчезает при повышении концентрации ионов магния, необходимой для заполнения центра М2, по-видимому, состояние этого центра и определяет архитектуру молекулы фермента в целом

Гидролиз LaPPi в присутствии PCP. Наиболее интересные результаты были получены по влиянию PCP на гидролиз LaPP, под действием Е-РРазы, Y-РРазы, тримериой формы Е-РРазы и ее мутантных вариантов.

Поскольку скорость диссоциации и константа связывания La3* с метилендифосфонатом не определены, то необходимо было показать, что в условиях эксперимента не происходит образование LaPCP и высвобождение быстро гидролизующегося РР,. Это было доказано двумя независимыми опытами. Оказалось, что PCP связывает ионы La3* значительно хуже, чем РР, и образование LaPCP в условиях опыта не происходит.

Добавление 35 мкМ РСРобш резко изменяет картину гидролиза LaPP, (рис. 16). Видно, что метилендифосфонат резко увеличивает скорость гидролиза; в его присутствии исчезает

сигмоидальный характер зависимости и возрастает сродство LaPP, к активному центру (Км = 25 мкМ). Следует напомнить, что в отсутствие PCP насыщение активного центра LaPP, не наблюдается даже при 200 мкМ. Причем аналогичное исчезновение асимметрии субъединиц было отмечено выше при добавлении достаточно высоких концентраций Mg2*, но увеличение скорости при добавлении PCP, которое могло достигать скорости гидролиза природного субстрата - MgPP„ было неожиданным.

Далее необходимо было выяснить, какой из компонентов реакционной смеси - свободный метилендифосфонат или его магниевая соль - оказывают такое влияние на гидролиз LaPP,. Поскольку соотношения PCP, MgPCP и Mg2* связаны одним уравнением, вначале следовало проверить влияние переменных концентраций Mg2+. Из рис. 17

(UPPJ. им

Рис. 16. Гидролиз LaPP, Е-РРазой (кривая 1), и в присутствии 35 мкМ PCP (кривая 2); 2 мМ Mg2\ рН 7,5.

Рис. 17. Гидролиз 75 мкМ LaPP, Е-РРазой (1) -при переменных концентрациях Mg2*, (2) - при переменных концентрациях PCP и (3) - при переменных концентрациях MgPCP; рН 7,5.

(зависимость 1) видно, что увеличением скорости гидролиза LaPP, при увеличении концентрации Mg2* можно пренебречь и рассматривать только влияние PCP и MgPCP. Из рис 17 (зависимость 2) видно, что наблюдается 10-кратное увеличение активности при 20 мкМ MgPCP. При этом следует принимать во внимание, что наряду с неизбежным увеличением концентрации ионов магния (от 0,85 мМ до 5,1 мМ), концентрация РСРс>ов уменьшается (от 4 мкМ до 0,67 мкМ), однако при этом не наблюдается уменьшения активности. Общий рост активности в этом случае скорее всего обусловлен присутствием MgPCP и увеличением концентрации Mg2+. Когда же добавляется 2 мкМ РСРСВ06, (рис. 17 (зависимость 3)), а концентрация MgPCP изменяется от 10 до 60 мкМ, активация гидролиза LaPP, происходит более чем в 80 раз. Таким образом, основная роль в активации гидролиза LaPP, под действием эффектора PCP принадлежит MgPCP, что согласуется с данными, полученными при гидролизе природного субстрата -MgPP,.

Поскольку MgPCP является негидролизуемым аналогом субстрата, нельзя было исключить возможность активации за счет его связывания при гидролизе LaPP, с активным центром фермента. Литературные данные, которые были подтверждены в этой работе, показывают, что К, MgPCP для Е-РРазы составляет 330 мкМ, а для Y-РРазы - 1,1 мМ Если допустить, что изменения структуры фермента при связывании LaPP, существенно

увеличивают сродство MgPCP, то должна выявляться конкуренция между LaPP, и MgPCP. Приведенные на рис 18. данные показывают, что это не так. Не наблюдалась также конкуренция в условиях постоянной концентрации MgPCP и увеличивающейся концентрации LaPP, (рис 16) Следовательно, активация под действием MgPCP обусловлена заполнением эффекгорного центра.

Ниже приведена серия опытов, позволяющая сравнить влияние PCP на активность ряда ферментов. В каждом опыте ферментативная активность регистрировалась при переменной концентрации MgPCP и трех-пяти постоянных концентрациях PCP Полученные четыре зависимости (рис. 19-22) объединяет резкое увеличение скорости гидролиза LaPP, под действием MgPCP При этом каждый фермент имеет свои особенности Из рис 19 следует, что WT-РРаза наряду с MgPCP активируется и PCP Для РРазы из дрожжей (рис. 20) достигаемый уровень активности выше, чем для фермента из E.coh, хотя гидролиз MgPP, под действием этих ферментов протекает с аналогичными величинами Vmax

[MgPCP] ukM

Рис. 18. Влияние MgPCP на гидролиз 50 мкМ LaPP, Е-РРазой; 2 мМ Mg2+, рН 7,5.

240200- «в

160£ 120. < 8040 1 А б ■ «3 92

8

*

10 20 30 (МдРСР). мМ 40 50

Рис. 19. Зависимость скорости гщфолиза 50 мкМ ЬаРР, Е-РРазой от концентрации MgPCP при переменных концентрациях и постоянных концентрациях РСРсоб 0,75 мкМ (1), 1 мкМ (2), 1,25 мкМ (3), 1,5 мкМ (4) и 2 мкМ (5).

£ 30 <

20

[МдРСР], мяМ

Рис. 21. Зависимость скорости пщролиза 50 мкМ ЬаРР, тримерной формой Е-РРазы от концентрации М^РСР при переменных концентрациях и постоянных концентрациях РСРсо» 1 мкМ (1), 1,25 мкМ (2) и 1,5 мкМ (3).

Рис. 20. Зависимость скорости гидролиза 50 мкМ ЬаРР, У-РРазой от концентрации при переменных

концентрациях и постоянных

концентрациях РСРиов 0,75 мкМ (1), 1 мкМ (2), 1,25 мкМ (3) и 1,5 мкМ (4).

Рис. 22. Зависимость скорости гидролиза 50 мкМ ЬаРР, ЬувПгИп РРазой от концентрации М$РСР при переменных концентрациях М^* и постоянных концентрациях РСРоов 0,75 мкМ (1), 1 мкМ (2), 1,25 мкМ (3) и 1,5 мкМ (4).

Обращает на себя внимание факт разброса точек при низких концентрациях \lgPCP (а следовательно и более низких концентрациях М^*). Поскольку дрожжевой фермент обладает большим сродством к М^* в центре М2, нежели Е-РРаза, то этот "разброс" может указывать на слабую активацию У-РРазы и под действием РСР.

И тример Е-РРазы, и ЬуяШОЬ-РРаза гидролизуют ЬаРР, с чрезвычайно низкой скоростью (активность при гидролизе 50 мкМ ЬаРР, в присутствии 2 мМ М^2* составляет примерно 0,5 МЕ). Поэтому достигаемая активность в присутствии МдРСР (55 я 75 МЕ соответственно) (рис. 21 и рис. 22) также свидетельствует об очень высокой степени

Вклад в активацию гидролиза LaPP, как MgPCP, так и PCP под действием WT-РРазы демонстрирует рис. 23 на котором приведены зависимости скорости гидролиза при

переменной концентрации MgPCP (зависимость 1) и при переменной концентрации PCP (зависимость 2). Видно, что с ростом концентрации ионов магния вклад в активацию MgPCP растет, а вклад PCP уменьшается. Достигаемая при этом ферментативная активность очень высока и становится сопоставимой со скоростью гидролиза MgPP,.

Удивление вызывает способность Lys И 20!п-РРазы к активации при связывании MgPCP в эффекторном центре. Выше было показано, что при гидролизе MgPP, этот мутантный вариант утрачивает способность к связыванию эффектора, что позволило предположить решающую роль остатка Lysll2 в функционировании и, может быть, в формировании эффекгорного центра. Однако прочное связывание MgPCP, который активирует гидролиз как MgPP,, так и LaPP,, с катионным центром на поверхности белковой глобулы еще менее вероятно, чем связывание свободного пирофосфата, что вызывает сомнение в правильности данного предположения. Надо также принимать во внимание, что Е-РРаза и Y-РРаза демонстрируют очень близкие свойства при взаимодействии с MgPCP, однако, эти ферменты существенно отличаются молекулярным весом субъединиц (20 и 32 кДа соответственно), ландшафтом поверхности и возможными путями передачи информации от эффектора, находящегося на поверхности к активному центру.

Влияние F на гидролиз LaPP, Еще одно интересное свойство Е-РРазы выявлено при действии ионов F на гидролиз LaPP,. Известно, что при гидролизе MgPPj ионы фтора являются эффективными ингибиторами РРаз. Ингибирование наступает в результате замещения ионом фтора молекулы воды, которая служит нуклеофилом при гидролизе фосфоангидридной связи; константа ингибирования Е-РРазы составляет около 0,1 мМ Однако, при гидролизе LaPP, в присутствии ионов F оказалось, что скорость гидролиза этого субстрата растет при увеличении концентрации фторид-иона и достигает максимальной величины при концентрации F 3 мМ. При гидролизе переменных концентраций LaPP, в присутствии 3 мМ фторид-иона выявляется не только увеличение скорости гидролиза, но и улучшение связывания субстрата (Км = 64 мкМ) и исчезновение сигмоидального характера

200- ■ о

160- 1 ■

^ 120. < во. о о ■

40- о

2 4 6 [Мв2-].«» 10 12

Рис. 23. Гидролиз 50 мкМ ЬаРР, \¥Т-РРазой, рН 7,5 при переменных концентрациях Mg2+ и (1) - при постоянной РСРспв 1,5 мкМ и (2) - при постоянной MgPCP 50 мкМ.

зависимости (рис 24) Эффекты, оказываемые фторид-ионом на гидролиз LaPP,, подобны эффектам ионов магния, описанным выше. Для РРазы из дрожжей известно (для Е-РРазы нет данных), что F' способен связываться с ионом магния в центре М2 до появления субстрата с константой диссоциации равной 3 мМ. Можно предположить, что при гидролизе LaPP, Е-РРазой нарушена координация между металлами в центрах М1 и М2, что в какой-то мере

нивелируется присоединением фторид иона к одному из ионов металла активного центра.

Существенно также, что активация гидролиза LaPP, проявляется при сходных концентрациях MgPCP для столь разных ферментов - гексамера Е-РРазы, димера Y-РРазы, тримера Е-РРазы и мутантного варианта с заменой Lys на нейтральную аминокислоту в катионном центре. Следовательно, центр связывания эффектора должен обладать свойствами, присущими всем изученным белкам В качестве гипотезы можно рассмотреть возможность связывания MgPCP, как и Mg2* с центром М2. Это предположение основывается на том, что все три способа изменения активности при гидролизе LaPP,: увеличение концентрации Mg* ', добавление фторид-иона и воздействие MgPCP приводят к одинаковому результату - росту активности, исчезновению асимметрии субьединиц и увеличению сродства субстрата к активному центру. Как было показано в обзоре литературы ион магния в центре М2 имеет один единственный белковый лиганд - это остаток Asp70, который одновременно связывает два металла в центрах М1 и М2. Связывание MgPCP в центре М2 означает снижение дефицита электронов на ионе металла и ускорение ухода продукта, а, следовательно, и ускорение скорость-лимитирующей стадии. В этом случае ферменты Е-РРаза и Y-РРаза - представители первого семейства - сближаются с РРазами второго семейства, для котороых типично большее количество лигандов у второго иона металла. Конкуренция MgPCP с M g2* за центр М2 не исключает возможность активации под действием РР, за счет прямого взаимодействия РР, с Mg2* в центре М2. Если такое предположение когда-либо подтвердится, то станет понятным необъясненное пока влияние полифосфатов на увеличение скорости распада комплекса, состоящего из фермента, пирофосфата, двух ионов Mg и иона фторида. Уменьшение в этом случае положительного заряда на Mg2* в центре М2 должно ослаблять связь Mg-F и приводить к диссоциации F" и исчезновению ингибирования.

Рис 24 Зависимость скорости гидролиза от концентрации LaPP1 при рН 7,5 и 2 мМ без (1) и в присутствии 3 мМ Р" (2).

ВЫВОДЫ

1. Показано, что в молекуле неорганической РРазы из E.coli в эффекторном центре

связывается еще одна молекула субстрата (MgPP,), что приводит к активации фермента. Таким образом, Е-РРаза является субстрат-ахтивируемым ферментом. В эффекторном центре могут также связываться другие активаторы гидролиза: MgPCP и PCP.

2. Изучен гидролиз LaPP, Е-РРазой, который выявил следующие свойства фермента и

характеристики эффекторного центра:

- наличие эффекторного центра, связывающего негидролгоуемый аналог субстрата;

- проявление положительной кооператнвности тримеров при связывании LaPP,;

- исчезновение асимметрии субъединиц, увеличение скорости гидролиза и улучшение связывания субстрата при добавлении либо MgPCP, либо фторид-иона, либо высоких концентраций Mg2*.

3. Связывание LaPPi с Y-РРазой, как и с Е-РРазой приводит к асимметрии субъединиц и многократному увеличению скорости гидролиза при связывании MgPCP в эффекторном центре.

4. Изучение мутантных вариантов Е-РРазы (Asp26Ala-, Arg43Gln-, Lys 115Ala-, Lys 148Gln-, Lysl 12Gln-, Lysl 12Gln/Lysl 15А1а- и Lysl 12/148Gln-) показало:

- замены Asp26, Arg43, Lysl 15 и Lys 148 приводят к уменьшению сродства к эффекторному центру;

- введение мутационных замен приводит к изменению активности, эффективных

параметров термической и химической денатурация;

- Е-РРаза с заменой Lysll2GIn и в гексамерной, и в тримерной форме имеет одинаковую активность, которая не увеличивается в присутствии эффектора при гидролизе MgPP,, но растет на два порядок при гидролизе LaPP,.

5. Высказано предположение о возможной локализации эффекторного центра.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Sitnik, T.S., Vainonen, J.P., Rodina, E.V., Nazarova, T.I., Kurilova, S.A., Vorobyeva, N.N., Avaeva, S.M. (2003) Effectory site in Escherichia colt inorganic pyrophosphatase is revealed upon mutation at the intertrimeric interface. IUBMB Life, 55,37-41.

2. Ситник T.C., Аваева C.M. (2005) Катионный кластер аминокислотных остатков неорганической пирофосфатазы Escherichia coli как возможный центр связывания эффектора. Биоорганическая химия, 31,251-258.

3. Sitnik Т. and Avaeva S.M. (2004) Substrate activation of the pyrophosphate hydrolysis by inorganic pyrophosphate from Escherichia coli. 29"1 Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies, EJB, 271 (Supplement 1), p. 78.

4. Ситник T.C., Аваева C.M. (2004) Замены аминокислотных остатков в катионном центре неорганической пирофосфатазы Escherichia coli. Тезисы 8 Путинской школы-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", с. 32.

5. Ситник Т.С., Аваева С.М. (2004) Поиск аминокислотных остатков, формирующих эффекторный центр неорганической пирофосфатазы E.coli. Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2004" (секция Химия), 1, с. 117.

6. Rodina, Е., Vorobyeva, N., Kurilova, S., Nazarova, Т., Vainonen, Ju., Sitnik, Т., Suhanova, I., Moiseev, V., Pavlova, О, Avaeva, S. (2004) Conformational flexibility of E coli soluble inorganic pyrophosphatase: a new role for the enzyme regulation in vivo. Proceedings of the 3rd International Meeting on Inorganic Pyrophosphatases "Recent Advances in Inorganic Pyrophosphatase Research", p. 51.

,200£А аг 4 53 1

Подписано в печать 26 февраля 2006 г. Заказ 626. Формат 60 х 90/16. Тираж 100 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ. Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. РОЛЬ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ПИРОФОСФАТАЗ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. пирофосфатазы-их роль, функционирование в клетке.

1.2. Первое семейство пирофосфатаз.

Свойства ионов металлов в центре Ml.

Свойства ионов металлов в ifenmpe М2.

Свойства ионов металлов в г\ентре МЗ.

Взаимодействие центров Ml и М2 и их роль в катализе.

Свойства иона металла в центре М4.

Свойства межтримерных ионов магния.

1.3. Второе семейство пирофосфатаз.

Влияние различных ионов металлов в центрах Ml и М2 на структуру и каталитические свойства пирофосфатаз семейства II.

Константы диссоциации ионов металлов в ifeitmpe высокого сродства.

Изучение функционирования и свойств РРаз семейства II с использованием мутантных вариантов.

Сравнение структур и механизмов гидролиза пирофосфатаз двух семейств.

2. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭФФЕКТОРНОГО ЦЕНТРА НЕОРГАНИЧЕСКОЙ

ПИРОФОСФАТАЗЫ ESCHERICHIA COLI.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ).

2.1. Характеристика мутантных вариантов неорганической пирофосфатазы

E.coli.

Получение мутантных вариантов.

Связывание Mg2+ с ферментами и с фермент-субстратными комплексами.

Кинетика гидролиза субстрата мутантными вариантами Е- РРазы.

Кинетические характеристики тримерной формы Lysl 12Gln-PPa3bi.

Влияние метилендифосфоната на гидролиз субстрата нашивной РРазой и ее мутантными вариантами.

Термическая и химическая денатурация.

2.2. Установление природы эффектора при ферментативном гидролизе MgPP,.

3. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ЭФФЕКТОРНОГО ЦЕНТРА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

LAPP, В КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТА.

3.1. Гидролиз LaPP, Е-РРазой и Y-РРазой.

3.2. Влияние метилендифосфоната на гидролиз LaPP,.

Проверка возможности комплексообразования La с РСР.

Гидролиз LaPPj в присутствии РСР.

3.3. Влияние F" на гидролиз LaPP,.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.1. Исходные вещества.

4.2. Методы исследования.

Обессоливание растворов белка.

Определение концентраций веществ.

Определение ферментативной активности.

Определение олигомерных форм ферментов. Седиментационный анализ.

Спектрофотометрическое титрование.

4.3. Расчет концентраций компонентов реакционной смеси.

4.4. Изучение зависимости скорости гидролиза MgPP, от концентрации свободных ионов магния.

Определение константы связывания Mg2+ в центре М2.

Определение константы связывания Mg2+ в центре М4.

4.5. Дифференциальная сканирующая калориметрия.

4.6. Химическая денатурация.

4.7. Получение тримерных форм Е-РРазы и изучение их свойств.

4.8. Гидролиза субстрата гексамерными формами мутантных вариантов Е-РРазы.

4.9. Влияние метилендифосфоната на гидролиз MgPP,.

4.10 Гидролиз LaPP, нативной и мутантными вариантами Е-РРазы.

Гидролиз LaPPj гексамерной и тримерной формами нативной Е-РРазы и Y

Р Раз ой.

Зависимость скорости гидролиза LaPPj от концентрации свободных ионов магния.

4.11. Влияние метилендифосфоната на гидролиз LaPP,.

Гидролиз фиксированной концентрации LaPPj в широком диапазоне концентраций

Влияние фиксированной концентрации РСР на гидролиз LaPPi.

4.12. Влияние F" на гидролиз LaPP,.

4.13. Влияние F'и метилендифосфоната на гидролиз LaPP, и MgPP,.

4.14. Попытки кристаллизации комплексов нативной Е-РРазы с LaPP, и MgPCP.

Кристаллизация Е-РРазы в присутствии LaPPj.

Кристаллизация Е-РРазы в присутствии РСР.

ВЫВОДЫ.

Синтез многих важнейших компонентов клетки протекает с образованием пирофосфата (PPj). К таким процессам относятся, например, синтез белков, нуклеиновых и жирных кислот. Эффективность протекаиия сиитеза обеспечивается смещением термодинамического равновесия за счет элиминирования PPj. Это достигается с помощью неорганических пирофосфатаз, которые с очень высокими скоростями гидроилуют пирофосфат и тем самым регулируют его концентрацию. Такая ключевая роль РРаз в метаболизме создает возможность их выделения практически из любого представителя царства живого.

Пирофосфатазы относятся к конститутивным ферментам, то есть регуляция их активности достигается не на уровне экспрессии генов, а на уровне уже синтезированного белка.

Цитоплазматические пирофосфатазы подразделяются па два семейства. Наиболее хорошо изученными представителями семейства I являются пирофосфтазы из дрожжей и из Escherichia coli (КФ З.6.1.1.; РРазы). Эти ферменты обладают сходным строением активных центров и механизмом действия. Однако отличаются олигомерпым строением (пирофосфатаза из E.coli - гексамер, а из дрожжей - димер), числом аминокислотных остатков в субъедипице (175 для E.coli и 286 для дрожжей), расположением функциональных групп па поверхности и строением межсубъединичных контактов. Для пирофосфатазы из E.coli главная роль в образовании контактов между тримерами отводится ионным парам Hisl36-Aspl43' и Aspl43 -Hisl36, а также гидрофобному контакту Hisl40-Hisl40'. Другая область контакта сформирована симметрично боковыми цепями участков Asn24, А1а25 и Asp26 двух соседних субъединиц, связывающих межтримерпый иоп магния. В дрожжевой пирофосфатазе межсубъедипичпый контакт образован за счет гидрофобных взаимодействий ароматических колец Trp52, His87, Тгр 289 с симметрично расположенными остатками в другой субъедипице.

Характерным для РРаз является способность к конформационным перестройкам высокоинтегрировапиой структуры белков. Действительно, известно, что введение мутационных замен приводит к изменению ряда важнейших свойств ферментов. При взаимодействии с обратимыми ингибиторами проявляется отрицательная кооперативпость активных центров. Уменьшение олигомеризации (диссоциация на тримеры или димеры), приводящее к спижешио активности, по-видимому, является также следствием перестройки структуры.

Одним путем регуляции активности неорганической пирофосфатазы из E.coli, является наличие эффекторного центра. Впервые он был обнаружен при гидролизе MgPPj тримерной формой фермента. Оказалось, что зависимость скорости гидролиза от концентрации субстрата невозможно описать уравнением Михаэлиса - Ментен, что было объяснено заполнением эффекторного центра за счет связывания с ним свободного пирофосфата. Существование этого центра было подтверждено данными равновесной гель-фильтрации, показывающими включение двух молей пирофосфата на моль субъединицы, и активацией гидролиза субстрата под действием негидролизуемого аналога - метилендифосфоната.

Важно также, что пирофосфатазы являются металл-зависимыми ферментами. Известно, что физиологический диапазон концентраций Mg2+B клетке составляет 1-1,5 мМ, а для насыщения активного центра Е-РРазы необходимо 5-6 мМ Mg2+. Поэтому in vivo, по-видимому, этот фермент не насыщен ионами магния, однако, высокая активность пирофосфатаз может указывать на существование некоего компенсаторного механизма.

В задачу настоящего исследования входила детальная характеристика эффекторных свойств РРазы из E.coli. Работа включала три части. В первой части были получены и изучены свойства ряда мутантпых форм Е-РРазы. Характерным для них оказалось нарушение эффекторного центра, перестройка структуры и изменение эффективных параметров химической и термической денатурации. Для мутантных вариантов, содержащих замену Lysl 12, действие эффектора проявлялось только при гидролизе LaPPj, но не MgPPj. Во второй части исследований установили природу эффектора, активирующего гидролиз субстрата, показали, что Е-РРаза является субстрат-активируемым ферментом. При использовании в качестве альтернативного субстрата - LaPPj в последней части работы была выявлена положительная ^оперативность активных центров в гексамерной Е-РРазе. Кооперативность была характерна также для димерной молекулы дрожжевого фермента. Связывание в эффекторпом центре негидролизуемого аналога субстрата - магний метилендифосфоната вызывает ускорение гидролиза LaPPj под действием не только Е-РРазы, ее мутантных вариантов и тримерной формы этого фермента, а также дрожжевой РРазы, причем удается достичь скорости гидролиза LaPPj близкой к той, с которой гидролизуется природный субстрат - MgPPj. В присутствии эффектора не только растет скорость гидролиза, но также происходит исчезновение асимметрии субъединиц и сильно возрастает сродство ферментов к LaPPj.

Обзор литературы посвящен роли ионов металлов в функционировании пирофосфатаз обоих семейств. Характерной особенностью этих ферментов является участие в катализе 3-4 ионов двух валентных металлов, среди которых наибольшая активность в семействе РРаз I проявляется в присутствии ионов магния, а в семействе II -ионов марганца.

выводы

Показано, что в молекуле неорганической РРазы из E.coli в эффекторпом центре связывается еще одна молекула субстрата (MgPPj), что приводит к активации фермента. Таким образом, Е-РРаза является субстрат-активируемым ферментом. В эффекторпом центре могут также связываться другие активаторы гидролиза: MgPCP и РСР.

Изучен гидролиз LaPPj Е-РРазой, который выявил следующие свойства фермента и характеристики эффекторного центра:

- наличие эффекторного центра, связывающего негидролизуемый аналог субстрата;

- проявление положительной кооперативное™ тримеров при связывании LaPPj;

- исчезновение асимметрии субъединиц, увеличение скорости гидролиза и улучшение связывания субстрата при добавлении либо MgPCP, либо фторид-иона, либо высоких концентраций Mg2+.

Связывание LaPPi с Y-РРазой, как и с Е-РРазой приводит к асимметрии субъединиц и многократному увеличению скорости гидролиза при связывании MgPCP в эффекторпом центре.

Изучение мутантных вариантов Е-РРазы (Asp26Ala-, Arg43Gln-, Lysll5Ala-, Lysl48Gln-, Lysl 12Gln-, Lysl 12Gln/Lysl 15А1а- и Lysl 12/148Gln-) показало:

- замены Asp26, Arg43, Lysl 15 и Lysl48 приводят к уменьшению сродства к эффекторному центру; введение мутационных замен приводит к изменению активности, эффективных параметров термической и химической денатурации;

- Е-РРаза с заменой Lysl 12Gln и в гексамерной, и в тримерной формах имеет одинаковую активность, которая не увеличивается в присутствии эффектора при гидролизе MgPPj, но растет на два порядка при гидролизе LaPPj.

Высказано предположение о возможной локализации эффекторного центра.

1. Heinonen, J.К. (2001), Biological role of inorganic pyrophosphate, kluwer Academic Publishers, Inc., Boston., 123-177.

2. Kornberg, A. (1962) in Horizons in biochemistry, Kasha, H., Pullman, B. Academic Press, New York, 251.

3. Heikinheimo, P., Lehtonen, J., Baykov, A.A., Lahti, R., Cooperman, B.S., Goldman, A. (1996) The structural basis for pyrophosphatase catalysis. Structure, 4, 1491-1508.

4. Zyryanov, A.B., Pohjanjoki, P., Kasho, V.N., Shestakov, A.S., Goldman, A., Lahti, R., Baykov, A.A. (2001) The Electrophilic and Leaving Group Phosphates in the Catalytic Mechanism of Yeast Pyrophosphatase. J. Biol. Chem.,216, 17629-17634.

5. Teplyakov, A., Obmolova, G., Wilson, K.S., Ishii, K., Kaji, H., Samejima, Т., Kuranova, I. (1994) Crystal structure of inorganic pyrophosphatase from Thermus thermophilic. Protein Sci., 3, 1098-1107.

6. Avaeva, S.M., Rodina, E.V., Kurilova, S.A., Nazarova, T.I., Vorobyeva, N.N. (1996) Effect of D42N substitution in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase on catalytic activity and Mg2+ binding. FEBS Letters, 392, 91-94.

7. Kankare, J.; Salminen, Т.; Lahti, R.; Cooperman, B. S.; Baykov, A. A.; Goldman, A. (1996) Crystallographic Identification of Metal-Binding Sites in Escherichia coli Inorganic Pyrophosphatase. Biochemistry, 35 (15), 4670-4677.

8. Heikinheimo, P., Lehtonen, J., Baykov, A.A., Lahti, R., Cooperman, B.S., Goldman, A. (1996) The structural basis for pyrophosphatase catalysis. Structure, 4, 1491-1508.

9. Harutyunyan, E.G., Kuranova, I.P., Vainstein, B.K., Hohne, W.E., Lamzin, V.S., Dauter Z., Teplyakov, A.V., Wilson, K.S. (1996) X-ray structure of yeast inorganic pyrophosphatase complexed with manganese and phosphate. Eur. J. Biochem.,. 239, 220-228.

10. Арутюнян, Э.Г., Оганесян, В.IO., Оганесян, Н.Н., Терзян, С.С., Попов, А.Н., Рубинский, С.В., Вайнштейн, Б.К., Назарова, Т.Н., Курилова, С.А., Воробьева,

11. Н.Н., Аваева, С.М. (1996) Структура неорганической пирофосфатазы Е. coli и ее комплекса с ионом Мп2+ при разрешении 2,2 А. Кристаллография, 41, 84-96.

12. Samygina, V.R., Popov, A.N., Rodina, E.V., Vorobyeva, N.N., Lamzin, V.S., Polyakov, K.M., Kurilova, S.A., Nazarova, T.I., Avaeva, S.M. (2001) JMB, 314 (3), 633-645.

13. Heikinheimo, P., Tuominen, V., Ahonen, A.-K., Teplyakov, A., Cooperman, B.S., Baykov, A.A., Lahti, R., Goldman, A. (2001) Toward a quantum-mechanical description of metal-assisted phosphoryl transfer in pyrophosphatase. PNAS, 98, 31213126.

14. Rodina, E.V. (2003) in Protein Structures: Kaleidoscope of Structural Properties and Functions (Uversky, V.N., ed.) Research Signpost, Kerala, India, 627-650.

15. Вайпоиеи, IO.П., Воробьева, H.H., Родина, Е.В., Назарова, Т.И., Курилова, С.А., Скоблов, Ю.С., Аваева, С.М. (2005) Свободный PPi активирует гидролиз MgPPi неорганической пирофосфатазы Escherichia coli. Биохимия, 70, 85-96.

16. Alberts В., Bray D., Zewis Z., Raff M., Roberts K., Watson Z. D. (1983) Molecular biology of the cell. Garland Publishing, Ink., 286.

17. Smith D., (1995) Magbesium as the catalytic centre RNA enzymes. In The Biological Chemistry of Magnesium (Cowan, J.A., Ed). 111-137, VCH Publishers, Inc., New York.

18. Шафрапский, Ю.А., Байков, А.А., Апдрукович, П.Ф., Аваева, С.М. (1977) Сравнительное изучение кинетики Mg2+ активируемого гидролиза пирофосфата и триполифосфата неорганической пирофосфатазой. Биохимия, 42, 1244-1254.

19. Wong S.C.K., Hall D.C., Josse J., (1970) Constitutive inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli. 3. Molecular weight and physical properties of the enzyme and its subunits JBC, 245, 4335-4345.

20. Zyryanov, А.В., Pohjanjoki, P., Kasho, V.N., Shestakov, A.S., Goldman, A., Lahti, R., Baykov, A.A. (2001) The Electrophilic and Leaving Group Phosphates in the Catalytic Mechanism of Yeast Pyrophosphatase. J. Biol. Chem., 276, 17629-17634.

21. Байков А.А., Аваева С.М., (1974) Влияние двухвалентных катионов на гидролиз АТР дрожжевой неорганической пирофосфатазой. Биохимия, 39, 342-347.

22. Tono, Н. Kornberg, А. (1967) Biochemical studies of bacterial sporulation. 3. Inorganic pyrophosphatase of vegetative cells and spores of Bacillus subtilis. JBC, 242,2375-2382.

23. Fabrichniy, I.P., Lehtio, L., Salminen, A., Zyryanov, А.В., Baykov, A.A., Lahti, R., Goldman, A. (2004) Structural studies of metal ions in family II pyrophosphatases: the requirement for a Janus ion. Biochemistry, 43, 14403-14411.

24. Mercel, M.C., Fabrichniy, I.P., Salminen, A., Kalkkinen, N., Baykov, A.A., Lahti, R., Goldman, A. (2001) Crystal structure of Streptococcus mutans pyrophosphatase: a new fold for an old mechanism. Structure, 9, 289-297.

25. Mercel, M.C., Fabrichniy, I.P., Salminen, A., Kalkkinen, N., Baykov, A.A., Lahti, R., Goldman, A. (2001) Crystal structure of Streptococcus mutans pyrophosphatase: a new fold for an old mechanism. Structure, 9, 289-297.

26. Avaeva, S., Ignatov, P., Kurilova, S., Nazarova, Т., Rodina, E., Vorobyeva, N., Oganessyan, V., Harutyunyan, E. (1996) Escherichia coli inorganic pyrophosphatase : site-directed mutagenesis of the metal binding sites. FEBS Letters, 399, 99-102.

27. Kankare, J., Neal, G.S., Salminen, Т., Glumoff, Т., Cooperman, В., Lahti, R., Goldman, A. (1994). The structure of E. coli soluble inorganic pyrophosphatase at 2.7 A resolution. Protein Eng. 7, 823-830.

28. Курилова С.А., Богданова А.В., Назарова Т.Н., Аваева С.М., (1984). Изменение активности неорганической пирофосфатазы из E.coli при взаимодействии с ионами магния, цинка, кальция и фтора. Биоорганическая химия, 10, 1153-1160.

29. Hyytia, Т.; Halonen, P.; Salminen, A.; Goldman, A.; Lahti, R.; Cooperman, B. S. (2001) Ligand Binding Sites in Escherichia coli Inorganic Pyrophosphatase: Effects of Active Site Mutations. Biochemistry, 40 (15), 4645-4653.

30. Baykov, A.A., Hyytia, Т., Turkina, M.V., Efimova, I.S., Kasho, V.N., Goldman, A., Cooperman, B.S., Lahti, R. (1999) Functional characterization of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase in zwitterionic buffers. Eur. J. Biochem., 260, 308-317.

31. Pohjanjoki, P., Fabrichniy, I.P., Kasho, V.N., Cooperman, B.S., Goldman, A., Baykov, A.A., Lahti, R. (2001) Probing Essential Water in Yeast Pyrophosphatase by Directed Mutagenesis and Fluoride Inhibition Measurements. J. Biol. Chem., 276, 434-441.

32. Ridlington, J.W., Butler. L.G. (1972) Binding of pyrophosphate, metal ion, and ion-pyrophosphate complexes. JBC. 247, 7303-7307.

33. Baykov, A. A.; Hyytia, Т.; Volk, S. E.; Kasho, V. N.; Vener, A. V.; Goldman, A.; Lahti, R.; Cooperman, B. S. (1996) Catalysis by Escherichia coli Inorganic Pyrophosphatase: pH and Mg Dependence. Biochemistry, 35 (15), 4655-4661.

34. Аваева, C.M., Воробьева, H.H., Курилова, С.А., Назарова, Т.И., Поляков, К.М., Родина, Е.В., Самыгина, В.Р. (2000) Механизм ингибирования неорганической пирофосфатазы Escherichia coli ионами кальция. Биохимия, 65, 442-458.

35. Avaeva, S.M., Rodina, E.V., Kurilova, S.A., Nazarova, T.I., Vorobyeva, N.N. (1996) Effect of D42N substitution in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase on catalytic activity and Mg2+ binding. FEBS Letters, 392, 91-94.

36. Kapyla, J., Hyytia, Т., Lahti, R., Goldman, A., Baykov, A.A., Cooperman B.S. (1995) Effect of D97E Substitution on the Kinetic and Thermodynamic Properties of Escherichia coli Inorganic Pyrophosphatase. Biochemistry, 34 (3), 792-800.

37. Rodina, E.V., Vainonen, Y.P., Vorobyeva, N.N., Kurilova, S.A., Nazarova, T.I., Avaeva, S.M. (2001) The role of Asp42 in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase functioning. Eur. J. Biochem., 268, 3851-3857

38. Ting, Se-J., Dunaway ~ Mariano, D. (1984) Investigation of the role of the substrate metal ion in the yeast inorganic oyri\ophosphatease reaction. FEBS Lett, 165, 251-253.

39. Аваева, C.M., Воробьева, H.H., Курилова, С.А., Назарова, Т.Н., Поляков, К.М., Родина, Е.В., Самыгина, В.Р. (2000) Механизм ингибировапия неорганической пирофосфатазы Escherichia coli ионами кальция. Биохимия, 65, 442-458.

40. Baykov, A.A., Shestakov, A.S., Kasho, V.N., Vener, A.V., Ivanov, A.H. (1990) Kinetics and thermodynamics of catalysis by the inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli in both directions. Eur. J. Biochem., 194, 879-887.

41. Braga, E.A., Avaeva, S.M. (1972) The interaction of yeast inorganic pyrophosphatase with bivalent cations and pyrophosphate. FEBS Lett., 27. 251-255.

42. Petukhov, M., Pychkov, G., Firsov, L., Serrano, L. (2004) H-bonding in protein hydration revisited. Protein Science, 13, 2120-2129.

43. Zyryanov, A.B., Pohjanjoki, P., Kasho, V.N., Shestakov, A.S., Goldman, A., Lahti, R., Baykov, A.A. (2001) The Electrophilic and Leaving Group Phosphates in the Catalytic Mechanism of Yeast Pyrophosphatase. J. Biol. Chem.,216, 17629-17634.

44. Zyryanov, А.В., Vener, A.V., Salminen, A., Goldman, A., Lahti, R., Baykov, A.A. (2004) Rates of elementary catalytic steps for different metal forms of the family II pyrophosphatase from Streptococcus gordonii. Biochemistry, 43, 1065-1074.

45. Zyryanov, А.В., Vener, A.V., Salminen, A., Goldman, A., Lahti, R., Baykov, A.A. (2004) Rates of elementary catalytic steps for different metal forms of the family II pyrophosphatase from Streptococcus gordonii. Biochemistry, 43, 1065-1074.

46. Ahn, S., Milner, A.J., Futterer, К., Konopka, M., Ilias, M., Young, M.W., White, S.A. (2001) The "open" and "closed" structures of the type-C inorganic pyrophosphatases from Bacillus subtilis and Streptococcus gordonii. JMB, 313 (4), 797-811

47. Zyryanov, А.В., Tammenkoski, M., Salminen, A., Kolomiytseva, G.Y., Fabrichniy, I.P., Goldman, A., Lahti, R., Baykov, A.A. (2004) Site-specific effects of zinc on the activity of family II pyrophosphatase. Biochemistry, 43, 14395-14402.

48. Аваева, C.M. (2000) Взаимодействие активных центров в олигомерных структурах неорганических пирофосфатаз. Биохимия, 65, 428-441.

49. Бакулева Н.П., Костенко Е.Б., Байков А.А., Аваева С.М. (1981) Обнаружение и характеристика дополнительного центра присоединения субстрата и его аналогов у неорганической пирофосфатазы. Биохимия, 46, 832-839.

50. Буробип, А.В., Ломонова, М.В., Склянкина, В.А., Аваева, С.М. (1997) Необратимое специфическое ингибироваиие неорганической пирофосфатазы E.coli аминами. Биоорг. химия, 23, 104-109.

51. Вайнонен, Ю.П., Воробьева, Н.Н., Родина, Е.В., Назарова, Т.Н., Курилова, С.А., Скоблов, Ю.С., Аваева, С.М. (2005) Свободный PPi активирует гидролиз MgPPi неорганической пирофосфатазы Escherichia coli. Биохимия, 70, 85-96.

52. Satherland G.R.J., Aust S.D. (1997) Thermodynamics of binding of the distal calcium to manganese peroxidase. Biochemistry, 36, 8567-8573

53. Вайнонен, IO.П., Курилова, C.A., Аваева, С.М. (2001) Гексамерная, тримерная, димерная и мономерная формы неорганической пирофосфатазы Escherichia coli. Биооргаи. химия, 28, 426-433.

54. Sarakatsannis J.N., Duan Yo. (2005) Statistical chatacterization of salt bridges in proteins. Proteins-.structure, function and bioinformatis, 60, 732-739.

55. Sutherland, G.R.J, and Aust, S.D. (1997) Thermodynamics of binding of the distal calcium to manganese peroxidase. Biochemistry, 36, 8567-5873.

56. Raibekas A.A., Bures E.J., Siska C.C., Kohno Т., Latypov R.F, Kervvin B.A. (2005) Anion binding and controlled aggregation of human interleukin-1 receptor antagonist. Biochemistry, 44, 9871-9879.

57. Privalov, P.L. (1979) Stability of proteins: small globular proteins. Adv. Prot. Chem., 33, 167-241.

58. Cooperman, B.S. (1982) The mechanism of action of yeast inorganic pyrophosphatase. Methods Enzymol., 87, 526-548.

59. Tanford, C. (1970) Protein denaturation. C. Theoretical models for the mechanism of denaturation. Adv. Prot. Chem., 24, 1-95.

60. Morgan, C.J., Wilkins, D.K., Smith, L.J., Kawata, Y., Dobson, C.M. (2000) A compact monomeric intermediate identified by NMR in the denaturation of dimeric triose phosphate isomerase. J. Mol. Biol., 300, 11-16.

61. Березин И.В., Клесов А.А. (1976) Практический курс химической и ферментативной кинетики, Изд-во Московского университета, 113-114.

62. Smirnova I.N., Kudryavtseva N.A., Komissarenko S.V., Tarusova N.B., Baykov А.А. (1988) Diphosphonate are potent inhibitors of mammalian inorganic pyrophosphatase. Arch. Biochem. Biophys., 267, 280-284.

63. Josse, J. (1966) Constitutive inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli. 1. Purification and catalytic properties., J. Biol. Chem., 241, 1938-1957.

64. Baykov, A. A.; Fabrichniy, I. P.; Pohjanjoki, P.; Zyryanov, А. В.; Lahti, R. (2000) Fluoride Effects along the Reaction Pathway of Pyrophosphatase: Evidence for a Second Enzyme-Pyrophosphate Intermediate. Biochemistry, 39 (39), 11939-11947.

65. Бакулева Н.П., Костенко Е.Б., Байков A.A., Аваева С.М. (1981) Обнаружение и характеристика дополнительного центра присоединения субстрата и его аналогов у неорганической пирофосфатазы. Биохимия, 46, 832-839.

66. Baykov A.A., Avaeva S.M., (1981) A simple and sensitive apparatus for continuous monitoring of orthophosphate in the presence of acid-labile compounds. Anal. Biochem., 116, 1-4.

67. Chervenka C.H. (1972) Methods for Analytical Ultracentrifuge, Spinco Division of Beckman Instruments Inc. Palo Alto.

68. Шафранский, Ю.А., Байков, A.A., Андрукович, П.Ф., Аваева, С.М. (1977) Сравнительное изучение кинетики Mg2+ активируемого гидролиза пирофосфата и триполифосфата неорганической пирофосфатазой. Биохимия, 42, 1244-1254.