Пространственная структура неорганической пирофосфатаза Escherichiа coli при разрешении 2.2А тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКА£ ОРДЕНА. ТРУДОВОГО КРАф ИНСТИ'1'УТ КР ИСГАЛ А О ГР Д ф И,

На правах рукописи

ОГАНЕСЯН Ваге Юнови'1

УДК 548.737

ПРОСТРАНСТВЕН?ГАЯ СТРУКТУРА НЕОРГА1ШЧЕСКОЙ ПИРОФОСФАТАЗЫ Пнс1\епсЬцсоП ПРИ РАЗРЕШЕНИИ 2.2А.

Специальность 01.04.18 — Кристаллография,

физика кристаллов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физики — математических наук

Москва 1995'

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте Кристаллографии им. А.В.Шубпикова РАН

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Э.Г.Арупонян

Официальные оппонектыдоктор физико — математических наук,

Ведущая организация; Институт теоретической и

экспериментальной Биофизики РАН. Защита диссертации состоится " 24 " мая 1995г. в "1(>М" на заседании Специализированного совета Д.002.58.01. при Институте Кристаллографии им, Л.В.Шубникова РАН по адресу 117333 Москва, Ленинский проспект, 59.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН

профессор В.И.Иванов (ИМБ РАН), доктор химических наук, профессор Л.ААсланов (МГУ).

Автореферат разослан " 20 " апреля 1995г.

Ученый секретарь специализированно: кандидат физико-математических на;

В.М.Каневский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Неорганическая пирофосфатаза с участием ионов металла катализирует обратимую реакцию гидролиза — синтеза неорганического пирофосфата, обеспечивая строгое соответствие количества пирофосфата и фосфата в клетке. Неорганические пирофосфатазы выделены более чем из тридцати разных источников, для десяти из них известна аминокислотная последовательность. Несмотря на низкую гомологию, для всех пирофосфатаз характерно наличие консервативных аминокислотных остатков. Большинство этих остатков расположено в активном центре, что свидетельствует об общности механизма их действия. До недавнего времени структурно — функциональные исследования пирофосфатаз сдерживались отсутствием данных о пространственной структуре этих ферментов при высоком разрешении. Единственным ферментом этого класса, для которого была установлена пространственная структура нативного состояния при разрешении ЗА и комплекса с металлом —активатором и фосфатом при разрешении 2.35Ä, являлась неорганическая пирофосфатаза Saccharomyces cerevisiae.

Пирофосфатазы подразделяются на две группы: с гексамерной н димерной четвертичными структурами. Первая характерна для прокариот, вторая для зукариот. Неорганическая пирофосфатаза Escherichia coli один из наиболее полно исследованных белков этого класса. Для этого белка установлен механизм действия с участием четырех конов металла. Выполнен комплекс генноинженервых исследований с заменой аминокислотных остатков, предположительно входящих в состав активного центра. Таким ибразом, исследование этого белка методом рентгеноструктурного анализа, имея обеспеченную биохимическую базу, способно дать ответ на ряд важных вопросов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ заключалась в определении пространственной структуры пирофосфатазы E.coli методом рентгеноструктурного анализа.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ состоит в установлении пространственной структуры нативного фермента неорганической пирофосфатазы из прокариотического организма Escherichia coli с разрешением 2.2А. Проведен анализ вторичной, третичной и четвертичной структур молекулы и их сравнение с друшми известными неорганическими пирофосфатазами.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ работы заключается в том, что установленная атомная структура неорганической пирофосфатазы является основой для изучения механизма действия фермента путем изучения структур его комплексов с металлами — активаторами, металлами — ингибиторами, аналогами субстрата, а также комплексов полностью или частично неактивных мутантов фермента с субстратом.

ПУБЛИКА 1]ИИ. По материалам диссертации опубликованы три научные работы. Список публикаций приведен в конце автореферата.

ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и заключения. Она изложена на страницах с рисунками,

таблицами и списком цитируемой литературы.

научной конференции сотрудников ИК РАН (1988), полностью работа представлена на четвертом Европейском совещании по кристаллографии биологических макромолекул (Комо, Италия, 1995).

ВВЕДЕНИЕ. Во введении обоснована актуальность темы, содержится постановка задачи и сформулирована основная цель работы.

ГЛАВА 1 посвящена обзору имеющихся в литературе данных о физико — химических свойствах пирофосфатазы Escherichia coli (E.coli).

Неорганическая пирофосфатаза (пирофосфат фосфогидролаза, КФ 3.6.1.1) E.coli это узкоспециализированный металлозависимый фермент, катализирующий превращение неорганического пирофосфата РР, в

Промежуточные результаты докладывались на

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

фосфат Р) [1]. Молекула фермента имеет массу 120 кДа и состоит из шести химически идентичных субъединиц [2]. Для каталитического действия пирофосфатазе необходимо присутствие в каждой из субъединиц двух двухвалентных ионов металла — активатора. В клетке эту роль выполняют ионы Мд2+, однако в присутствии Мп2+, 2п2+, и Со2+ фермент также проявляет активность [1]. Ионы Са2+ ингабируют фермент. Истинным субстратом является не ион пирофосфата, а его комплекс с ионом магния [3]. Известно также, что связывание субстрата облегчает присоединение четвертого иона металла [4]. Механизм функционирования фермента может быть представлен следующей схемой Г41:

К„4=1ЕМ9(МдРи!ШМд]/[НМд2(МдР1)2!; К^- [ЕМд(МдР1)1;Мд]/1ЕМд2МдР1); К , =

Аминокислотная последовательность пирофосфатазы Е.со11 полностью была выведена из нуклеотидной последовательности гена [5]. Субъединица состоит из 175 аминокислотных остатков.

Первичная структура дот другого хорошо изученного фермента пирофосфатазы ЯассЬаготусея сеге-пыае /Хсегекк/ае^ была установлена еще в 1978 году [6] и уточнена по нуклеотидной последовательности гена [7]. Для пирофосфатазы из этого источника определена пространственная структура нативного белка с разрешением З.ОА [8] и комплексов с Ь'022 ТЬ3+, Мд2+, СаРР], Мп—Pi [9]. Установлены элементы вторичной структуры и аминокислотные остатки активного центра. Данные о первичней структуре пирофосфатаз из других источников показали, что несмотря на большое различие в длине полипеытидкой цепи,

<=> ЕМдг + МдР,,

Кт5=1ЕМд][Мд|/[ЕМд2|; Кт3 = [ЕМд3РР1][Мд|/[ЕМд,РР,];

Е

Кт1 = (Е](Мд!ЛЕМд);

функциональные ipynnbi, обращенные в полость активного центра пирофосфатазы S.cerevisiae, проявляют ярко выраженную консервативность во всех нирофосфатазах. На рис.1 приведены выравненные аминокислотные последовательности трех наиболее изученных пирофосфатаз. Гомология по всем известным аминокислотным последовательностям составляет около 24%. В работе [23] показано, что при их разделении на две группы степень гомологии возрастает до 50—60%. Одну группу составляют прокариотические ферменты, другую — эукариотические.

10 20 30 40 50 60 70

5-TYTTRQ(CAKNTI..EYKVY:EKDGKPVSAFHDIjPLYADKENNIPNMWHFRWTNAAX£1TKEETLNPI Ю£ г- AN LKSL/VG'DKAPEWHM M£V/'RGSGNAYíYDPDL* 'GAiKL/J

Е- SLLNV/>AG'KDLPE D 1 YV VIH ¡/"AÑADÍ"!AYHDKES" 'GAI.FV.

10 20 30 40

80 90 100 110 120 130 140

S~ GKL^FVRNCFPHHG Í1HN KGAt'PQ 7WEDPNVSHPETKAVG0NDFÍDVIEIGET]AYIGQ VKQVK ALG1M.

Г----tfVLPGA' ' ' QF FPGD ¡'Orí PS 7L AE........* * ' •/X}l>JlIKj£VLS7YPLLPGV W EVRWGLL1

E- * * 'JÍFMSTA* ' ' MFIPCN J'GYINH 7L SL............/JGDÍVITVZVPTPYPLQPGSVI RCRPVGVU

50 60 70 80 90

150 ¡ 60 170 180 190 200 210

S~Z>£GETJ3WAVIAIDÍND* •PLAPKLNíJlEWEKYFPGLLRATNEW/RIiXlPD* * 'GÁPENQFAKSGEAKNK.KY r-CMGGOA^GWAED'^RLDHWaGi7VP"-EGVKQElQHE/ETKAALEAKKGiíWVKV""TGWRDRKA £'-Z>MGEÍ3AKLVAVPHSKLSKEYDHIKBVNOLP-"ELLKAQ1A11F/EH}'KDLE' • КGKSNV К V'"" E G W [ • NАН/ 100 110 120 130 140 150

220 230 240 250 200 270 280

5-DIIKETHDSWÍQLIAGKSSDSKGIDLTNVTLPDTPTYSKAASDA1PP/\SPKADAP1DKS1DKWFFISGSV Г-EEVRACIARYJÍG •E-AEÍVASFERAJÍNK 170

Рис.1. Приведенные а соответствие первичные структуры пирофосфатаз S— S.cerevisiae, 1- Thermus tbermophilus и Е- EcolL Жирными буквами выделены коиссрютишшс аиинокйсло-тыз остатки, симкол » означает отсутствие аминокислотного, остатке;

верхняя нумерация для пирофосфатазы S.cerevisiae, нижняя E.coli.

Существенный прогресс в изучении пространственной структуры пирофосфатаз был достигнут в 1994 году, когда одновременно были опубликованы три работы, посвященные рентгеноструктурному анализу этих ферментов, в том числе результаты настоящего исследования. Знание деталей пространственной структуры является важнейшим этапом на пути познания механизма действия и функционирования пирофосфатаз.

ГЛАВА 2. Экспериментальная часть.

Неорганическая пирофосфатаза Е.со11 выделялась из штамма .ГМ109 с рекомбинантной плазмидой р1}С19 в Московском государственном университете. Кристаллы апоформы были получены в 1985 году [11]. Они относятся к пространственной группе Я32 с параметрами ячейки 3=110.4.4, с= 154.7А. Независимая часть элементарной ячейки содержит две субъединицы. Позже были полугены кристаллы с вдвое меньшим параметром с. Они содержат од1гу субъединпцу в независимой части ячейки. Эта кристаллическая форма явилась предметом диссертационного

исследования. Кристаллизация проводилась при температуре 25-30';С методом висячей капли из раствора белка ( 4тд/т] ) и хлорида аммония ( 4 М ) в 0.1М трис — НС1 буфере ( рН 7.5). Максимальный размер кристаллов достигал 0.6 х 0.6 х 0.5 мм. Пространственная группа кристаллов К.32, параметры элементарной ячейки а= 110.4Л, с=76.ВА.

В решении пространственной структуры использовался метод полиизоморфных замещений. При настаивании кристаллов для получения тяжелоатомных производных применялись специфические добавки. Для модификации остатка цистеина, один из которых доступен для молекул растворителя |11], использовался парахлормеркурбензоат. Второе тяжелоатомное производное получено на основании аналогии с пирофосфатазой Я. сегеу1$1ае, где были использованы соли лантаноидов |8]. Условия получения производных я параметры элементарных ячеек их кристаллов приведены в таблице 1. Диффракционные данные для нативных кристаллов и для кристаллов тяжелоатомных производных были

Таблица 1. Условия получения и кристаллографические данные для тяжелоатомных производных.

11роизводное 48 Ей

Добавка рСМВ Еи(Ш3)3

Концентрация, М 1(Н 10"4

Время настаивания, часы 48 24+30

Параметр а,А 110.6 110.9

Параметр с,А 77.0 77.1

собраны на автоматическом диффрактометре КАРД—6 [12] с двумерным детектором в Институте Кристаллографии А.Н.Поповым.

Характеристики наборов данных приведены в таблице 2. Обработка наборов данных, а также последующая расшифровка производных, расчет

Таблица 2. Характеристики наборов данных.

Набор Нагшишш т 1-й

2.19 2.30 2.50

N 26800 22100 18400

9116 7253 С169

1>ст.% 87 81 92

Р о/ 1Ч!)ТП'/С 6.3 8.3 8.0

^ЛашЬ''" 5.0 10.0 7.0

Полнота,% 97 89 97

N — полное число измеренных отражений; ¡N¡„1 — число независимых отражений; о — средне—квадратичная ошибка измерения щп'енсивностей; К1> — I I / X <]>;

П^а^сЩ/Т I.

изоморфных фаз и их уточнение проводились с использованием комплекса программ "BLANC" А.А.Вагина [13J на персональном компьютере PC —386. Полнота набора для нативных кристаллов составила в среднем 97.9%.

Определение положения тяжелых атомов проведено по разностным синтезам Паттерсона и перекрестным разностным синтезам Фурье. Оба производных имели по одному месту присоединения тяжа\ого атома. Разностные синтезы Фурье по объединенному набору фаа не выявили дополнительных мест связывания атомов тяжелых металлов. Фазы, рассчитанные после уточнения параметров тяжелых атомов, характеризовались фактором достоверности <т>=0.51. Соответствующий синтез электронной плотности при разрешении 2.5Â позволил установить лишь границы гексамерной молекулы. Данные по размерам молекулы были использованы для последующего улучшения качества фаз по методу Ванга, учитывающего вклад молекул растворителя [14]. Эти фазы

Phi (degrees)

Pïic.2. Карта Рамачгшдрана для модели лирофосфатазы.

комбинировались с фазами, полученными методом полиизоморфных замещений. Четыре цикла такой итеративной процедуры кривели к повышению фактора достоверности фаз <т> до 0.7?, одновременно

уменьшилось значение фактора расходимости Н(К.=Х(Г'оЬ5— Рет1С)/ХРо1к) с 0.49 до 0.32 и повысилась величина корреляционного фактора

С(С = I(Fobs- <Fobs>){Pcalc - <F«(c>)/(E(F.bs-<Fobs>)2 X(Fralc-<FraJC>)2f с

0.71 до 0.88, где Fobs и Fcalc соответственно наблюдаемые и вычисленные структурные факторы.

ГЛАВА 3, Получение и уточнение модели.

Синтез электронной плотности, рассчитанный по комбинированным фазам, позволил практически однозначно установить ход полипептидной цени. При проведении полипептидной цепи и последующих ручных правках модели использовалась программа "О' [15,16] на графической станции Evans & Sutherland PS 330. На начальном этане определения структуры в синтезе электронной плотности были локализованы две длинные а—спирали и семицепочечный р—слой, расположение которых оказалось таким же как в известной структуре нирофосфатазы S,cerevisiae. Полмпептидная цепь в этом ферменте на 111 аминокислотных остатков длиннее, чем в пирофосфатазе E.coli, однако сравнение

F.-factor

0.5

0.4

0.3

0,3

о.:

0.03 0.08 0.14 0.23

Рис.3. Оценка точности в положениях атомов по методу Луззати.

первичных структур этих пирофосфатаз позволило выделить те участки в структуре S.cerevisiae, которые могут быть идентичными в обоих белках. Эти участки следующие: 27 N—концевых, 61 С —концевых остатков и участки 72 — 77 и 202—213. Они были удалены из модели S.cerevisiae. Оставшаяся пасть была совмещена со скелетной моделью пирофосфатазы E.coli, полученной с помощью программы "BONES". Остатки, для которых не было электронной плотности в области боковой цепи, были заменены остатками аланина. Полученная таким образом частично полиаланиновая модель явилась исходной для установления полной структуры пирофосфатазы £.coli. Фактор расходимости R на этом этапе составил 48% при разрешении 2.5А. Последующее определение структуры сводилось к последовательному включению в модель отсутствующих боковых групп по мере их выявления по синтезам электронной плотности в результате уточнения, постепенному расширению разрешения до 2.2А и исправлению хода полипептидной цепи преимущественно на нерегулярных участках. Эти ручные правки модели на графической станции чередовались с уточнением со стереохимическими ограничениями В. Хендриксона и Дж. Концерта [17], совмещенного с алгоритмом быстрого преобразования Фурье Агарвала [18], реализованного и развитого Э. Додсон в программе "PROLSQ" комплекса программ ССР4 [19]. В уточнении использовались все

отражения без срезки по ст. Всего было выполнено около 500 циклов уточнения с исправлениями на графической станции через каждые 20 циклов. На первых стадиях определения структуры на переходных участках между элементами вторичной структуры наблюдались разрывы в электронной плотности, а некоторые ее участки были трудно интерпретируемыми. Участки 98—101 и 147—150 удалось локализовать лишь на заключительных стадиях уточнения. 1То достижении фактора расходимости R=22% в модель структуры добавлялись молекулы растворителя. Для этого использовались разностные синтезы электронной плотности с коэффициентами (2Fobs—Fra!c) и (F0bs"~Fca)e)- Сначала включались те молекулы воды, для которых расстояние до атомов

молекулы белка не превышало 3.2А. На заключительных стадиях это ограничение было снято, однако молекулы воды, для которых температурный фактор при уточнении превышал 60А2, исключались из рассмотрения. Конечная модель пирофосфатазы Е.соН содержит 1380 неводородных атомов белка одной субъединицы молекулы белка и 115 кристаллографически независимых молекул растворителя. Фактор расходимости Я составил 16% в интервале разрешения 10.0+2.2А. Координаты атомов представлены в белковый банк данных РОВ [20].

Статистические характеристики уточненной модели приведены в таблице 3. Карта Рамачандрана для торсионных ф и у углов основной цепи всех аминокислотных остатков приведена на рис. 2. Модель соответствует всем стереохимическим требованиям, предъявляемым к структурам высокого разрешения [21]. На рис. 3 приведена интегральная оценка точности в положениях атомов по методу Луззати [22]. Она составляет 0.25А. Максимальное отклонение длин связей от идеальных составляет

0.061А (С —N Ьу.я29), а максимальное отклонение валентных углов — 13.3° (Ы-СА-С РЬе44).

На рис. 4 приведена схема четвертичной структуры молекулы гексамера. Шесть субъединиц молекулы пирофосфатазы расположены в вершинах

Описание и анализ модели.

Рис.4. Схема четвертичной структуры юксамсрной молекулы.

тригональной антипризмы с точечной симметрией D3=32. Молекулярная симметрия совпадает с кристаллографической. Центр молекулы расположен в специальном положении в элементарной ячейке в точке пересечения осей второго и третьего порядков с координатами (0, 0, 1/2). Таким образом, все шесть субъединиц и химически и кристаллографически эквивалентны. Полипептидная цепь мономера пирофосфатазы Е,coll свернута в глобулу размерами 30х42х43А (рис.5). В таблице 4 представлено распределение аминокислотных остатков по

элементам вторичной и сверхвторичной структур (рис.6). Выделение р — цепей проводилось по значениям конформационных углов <р и \]i основной цепи. В состав а —спиралей включались все остатки, которые участвуют в формировании внутриспиральных водородных связей и по ф и \j( углам основной цепи. Установлено шесть а —спиралей (30% аминокислотных остатков) и тринадцать р —цепей (51%). Структура субъединицы относится к классу а/р.

РисА Стереоизображение хода полипентидной ципи п субъедиггицс пирофосфатазы BcoU

Основу сверхвторичной структуры составляет семицепочечный изогнутый р —слой. Он проходит через весь мономер и составлен цепями ¡310, (52, рб, р8, (511, р 10, [513, причем за исключением пары р8 и р11 слой

является антипараллельным (рис.7). Наиболее длинная цепь Э10 участвует в этом слое дважды.

Участки 14-19 цепи Р2, 54-59 цепи Р6, 69-75 цепи 08, 83-90 ¡510 и 103—109 цепи р11, участвуя в образовании семицепочечнош р —слоя,

одновременно образуют пятицепочечный р —баррель (рис.8).

Особняком в структуре расположена двухцепочечная антипараллельная лента, составленная цепями рЗ и р4.

Элементы вторичной структуры аЗ, а5, ао, семицепочечный р — слой, р — баррель и лента, по—видимому, весьма консервативны, поскольку обнаружены во всех структурно исследованных пирофосфатазах [23,24].

В гексамере тримеры развернуты друг относительно друга на 60°, создавая ряд контактов для каждой субъединицы.

,' ¡но ',

»[НМлИ 1—

/{ек:

мГЕЗШч

---- т )-/

N ИЯУГОХ

Рис.6. Топологическая схема субъсдиницы: молекулы иирофосфатазы Е.соЛ.

В непосредственной близости от оси третьего порядка на поверхности гексамера расположены Г4 — конец и нерегулярный участок 35 — 37 всех трех субъединиц. N — когщевые серины образуют попарно водородные связи с соседней субъединицей (рис.9). Те же 14 — концевые серины образуют еще одну водородную связь с карбонилом серина 36 той же соседней субъединицы. Тем самым возникает одно из взаимодействий между субъединицами, которые обуславливают более прочную связь субъединиц в тримере по сравнению со связью между тримерами. Вблизи оси третьего порядка других контактов между субъединицами нет. Здесь формируется канал диаметром 8-^9А, постепенно расширяющийся к центру гексамера. Он содержит молекулы воды, которые образуют водородные связи как между собой, так и с атомами белка.

Наиболее интенсивная зона контактов при объединении субъединиц в тример достигается за счет их парных взаимодействий. Ее формируют в

основном гидрофобные остатки, к (34 одной субъединицы и [310 и а2 другой. Установлено также несколько водородных связей.

Взаимодействию тримеров, связанных осью второго порядка, отвечают две зоны контактов. Одна из них выражена очень слабо. Здесь расстояния

Рис.7. Стереоизображение ссмицспотсчеого изогнутого [¡—слоя.

между атомами соседних субъедипид превышают 4А. Вторая зона выражена более ярко. В этой области попарно сближены спирали <х5,

нерегулярные участки 145—14?, 24 — 27, петли 47 — 48, и цепи [55. Вероятно, аспартато — гистидиновый кластер, формирующийся за счет кар Н)б136, НЫ40, Авр143 спиралей <х5 (рис.10), функционально важен, поскольку противоиоложные стороны этих спиралей обращены в полость активного центра. Здесь локализовано множество водородных связей.

Рис.8. Стереоизображение Р —барреля.

В структуре обнаружено 115 молекул растворителя, что составляет около 8% от общего количества белковых атомов в субъединице. Они участвуют как во внутри молекулярных взаимодействиях, так и в контакте между соседними молекулами в кристалле.

Активный центр субъединицы сформирован следующими участками полипептидной цепи: 19 —23 ß2, ß3, 42 — 46 ß4, нерегулярным участком 47 — 48, ß5, ß6, петлей 64 - 68, 69 - 72 ß8, 93-97 ßlO, 101-104 [Ml, 131-141 «5, 148-152 ßl3.

РисЛО. Аспартато — гистидиновый кластер.

Таблица 3. Показатели уточненной модели неорганической пирофосфатазы E.coIi

X арактеристика Стандартное отклоните а

Валентные связи,А

Расстояния 1 - 2 0.012 0.020

Расстояшт 1 - 3 0.028 0.030

Расстояния 1 - Л 0.045 0.050

Плоские группы,к 0.015 0.020

Хиральные объемы,А3 0.222 0.300

Невалентные контакты,А

Близкие 0.194 0.300

Дальние 0.237 0.300

Двуграшше углы, град.

Пептидные 2.710 5.000

Алифатические 17.900 20.000

Ароматические 24.310 30.000

Тепловые факторы,А2

1 - 2 главной цепи 3.700 4.000

1-3 главной цени 5.100 6.000

1-2 боковой цепи 7.300 8.000

1-3 боковой цепи 9.900 10.000

Боковые группы аминокислотных остатков (Мр42, Аярбб, АБр67, Аяр70, АарЭ?, ЛБрЮг, С1и20, С1и31, С.1и98, С1и145, ЬуэШ, ЬукМб, Ьуз148, Агд43, Тут51, Туг55 и Туг141) направлены в полость активного центра (рис.11).

Таблица 4. Список элементов вторичной структуры пирофосфатазы E.coli.

Элемент Начало Конец Сверхструктура

al 1 4 -

ßl 5 7 -

ß2 14 19 7цепоч.слой, ß-бар

ß3 28 34 лента

ß4 38 46 лента

B5 49 52 -

ß6 54 59 7цепоч.слой, ß-бар

ß7 61 63 -

ß8 69 75 7ценоч.слой, ß-бар

ß9 77 80 -

ßlO 83 97 7цспоч.слой, ß-бар

ß11 101 109 7цепоч.слой, ß-бар

a2 110 114 -

«3 115 12) -

a4 122 125 -

ß12 126 128 -

a5 129 144 -

ßl3 148 157 7цепочечный слой

aß 158 174 -

Ион Еи3+, использованный как тяжелоатомная добавка, локализован в глубине активного центра. Он связан с пятью остатками аспарагиновой кислоты: А$рб5, Аьрб?, Азр70, Аяр97 и Аяр102.

Проведено сравнение структуры субъединицы пирофосфатазы Е.соИ со структурой субъединицы фермента З.сеге\7$1ае. Установлено, что структура пирофосфатазы Е.соИ вписывается в структуру пирофосфатазы Хсегемж/ае, составляя ее ядро. Несмотря на отличие в длинах полипептидиых цепей (175 и 286 аминокислотных остатков соответственно) и количестве субъединиц в составе олигомера (6 и 2), "лишние" участки цепи в пирофосфатазе Лсегеив/ае в большинстве своем нерегулярные, расположены на поверхности молекулы, экранируя ее ядро от контакта с растворителем. В прокариотических пирофосфатазах эту роль, по-видимому, выполняют соседние субъединицы олигомерной молекулы. В 1994 году, параллельно с настоящим исследованием, определены пространственные структуры двух прокариотических пирофосфатаз — ТЬеппт 1ЬеШорЫ1из с разрешением 2.0А (23] и Е.со11 с разрешением 2.7А [24), причем вторая, в отличие от данной работы установлена для другой кристаллической формы: с двумя субьединицами в независимой части элементарной ячейки. Сравнение пространственных структур подтвердило вывод, сделанный при сопоставлении аминокислотных последовательностей, об их вероятном сходстве.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1.Методом полиизоморфных замещений решена структура неорганической пирофосфатазы Е.со11 и уточнена ее модель до И—фактора 16% в интервале разрешений 10-ь2.2 А.

2.Проведен анализ элементов вторичной и третичной структур пирофосфатазы Е.соН. Описаны контакты субъединиц при образовании четвертичной структуры.

3.Локализован активный центр фермента и выделены все потенциальные белковые лиганды металлов—активаторов, металлов — ингибиторов и субстрата.

4. Проведено сравнение пространственной структуры пирофосфатазы E.coIi со структурами других неорганических пкрофосфатаз.

1.Мороз О.В., Строкопытов Б.В., Оганесян В.Ю., Айрумян Л.Г., Некрасов Ю.В., Назарова Т.И., Курилова С.А., Воробьева Н.Н., Терзян С .С., Аваева С.М., Арутюнян Э.Г. Исследование неорганической пирофосфатазы из E.coli с разрешением 5А. 1991 Кристаллография, 36:454 — 458.

2. V.Yu.Oganessyan, S.A.Kurilova, N.N.Vorobyeva, T.I.Nazarova, A.N.Popov, A.A.Lebedev, S.M.Avaeva, E.H.Harutyunyan. X —Ray crystallographic studies of recombinant inorganic pyrophosphatase from E.coli. FEBS Letters 348,(1994), pp. 301-304.

3. Оганесян В.Ю.,Курилова C.A., Воробьева H.H., Назарова Т.И.,Оганесян

H.Н., Терзян С.С., Аваева С.М., Арутюнян Э.Г. Пространственная структура неорганической пирофосфатазы E.coli при разрешении 2.2А. Кристаллография, в печати.

Цитированная литература.

I. Josse, J. (1966) Constitutive Inorganic Pyrophosphatase of Escherichia coli. I. Purification and catalytic properties. J. Biol. Chem., v.241, 9, 1938—1947.

2. Wong, S.C.K., Hall,D.C., Josse, J. (1970) Constitutive Inorganic Pyrophosphatase of Escherichia coli. III. Molecular Weght and physical properties of the Enzyme and its subunits. J.Biol. Chcm.>v.245, 17, 4335 — 4345.

3. Josse, J. (1966) Constitutive Inorganic Pyrophosphatase of Escherichia coli. H. Nature and Binding of Active Substrate and the Role of Magnesium. J. Bio], Chem. v.241, 9, 1948- 195?.

4. Baykov, Л.А., Shestakov, A.S., Kasho, V.N., Vener, A.V., Ivanov, A.H. (1990) Kinetics and thermodynamics of catalysis by the inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli in both directions. Eur. J. Biochem., v. 194, 12, 879 — 887.

5. Lahti, R., Pitkaranta, Т., Valve, E., Ilta, I., Kukko — Kalske, E.,Hemonen, J., (1990) Cloning and characterisation of the gene encoding inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli K— 12. J. Bacterioi. v. 170, 12, 5901 — 5907.

6. Cohen, S.A., Sterner, R., Keim, P.S., Heinrikson, R.L. (1978) Covalenl

Structural Analysis of Yeast Inorganic Pyrophosphatase. J. Biol. Chem., v.253, 3, 889-897.

7. Kolakowski, L.F., SI cesser, M., Cooperman, B.S. (1988) Cloning, molecular characterisation and chromosome localisation of the inorganic pyrophosphatase (ppa) gene from Saccharomyces cerevisiae. NAR, v.16, 22, 10441 — 10452.

8. Терзян C.C., Воронова A.A., Смирнова E.A., Куранова И.О., Некрасов Ю.В., Арутюнян З.Г., Вайнштейн Б.К., Хене В., Хансен Г. (1984) Пространственная структура неорганической пирофосфатазьг дрожжей при разрешении 3.0А. Биоорг. химия, 10, 1469—1482.

9. Чиргадзе Н.Ю., Куранова И.П., Невская Н.А., Тепляков А.В., Вильсон К.С., Строкопытов Б.В., Арутюнян Э.Г., Хене В.Е. (1991) Кристаллическая структура МпР, комплекса неорганической пирофосфатазы дрожжей нри разрешении 2.35А. Кристаллография, 36, 128—132.

10. Vihinen, М., Lundin, М., Baitscheffsky, Н., (1992) Computer modeling of two inorganic pyrophosphatases. BBRC, v.186, 1, 122—128.

11. Айрумян Л.Г., Назарова Т.И., Курилова C.A., Аваева С.М. (1990) Рентгенострухтурное исследование неорганической пирофосфатазы из Е. coli. 1. Выращивание кристаллов, получение тяжелоатомных производных. Вестник МГУ, сер 2, т.32, 1, 98- 100.

12. Попов, А.Н., Андрианова М.Е., Буренков, Г.П., Хейкер, Д.М. (1994) Метод съемки макромолекулярных монокристаллов в рентгеновском дифрактометре КАРД—6 с двумерным многопроволочным детектором. Кристаллография, том 39, выц.З, 415 — 421.

13. Вагин Л.А. (1983) Использование некристаллографической симметрии в структурной кристаллографии белков Кандидатская диссертация, Институт Кристаллографии РАН, Москва.

14. Wang, B.C. (1985) Methods in enzymology, 15,90-112.

15. Jones, T.A., Zou, S.-Y.. Cowan, S.W. and Kjeldgaard, M. (1991) Acta Cryst., A47, 110-119.

16. Jones, T.A., Kjeldgaard, M. (1991) О — the Manual, 1— 166, Uppsala, Sweden.

17. Ikndrickson, W.A. & Ronneit, J .H. (1980). Incorporation of stereochemical information into cristallographie refinement. In Camputinc/ m Crystallography (Diamond, R, Ramaseshan, S. &Venkatesan, K., etc.), Indian Academy of Sciences, Bangalore, 1301 - 1323.

18. Agarwal, R.C.,(1980) New result on fast Fourier least—square refinement technique. In.Kefinement of protein structure, (Machin, P.A., Carupell, ,T.W, Elder, M., etc.),SERC' Daresbury Laboratory, UK.

19. CCP4 (1979) The SERC (UK) collaborative project No.4, a suite of programs for protein crystallography. Daresbury Laboratory, Warrington, WA4 -IAD, UK.

20. Bernstein, .P.C., Koet/Ie, T.F., Williams, G.J.B , Meyer, К F. Jr., Brice, M.D., Rogers, J.R., Kennard. O., Shimanouchi, T., Tasunu, M (1977) The Protein Data Bank: A computer —based archiva) file for macromulecular structures. J.Mol. Biol. 122:535-542.

21. Morris, A.N., MacArthur, M.W., Hutchinson, E.G. & Thornton, Л.М. (1992) Stereochemical quality of protein structure coordinates. Proteins: structure, function and genetics. 12, 345 — 364.

22. Luzzati, V. (1952), Tratement statistique des erreurs dans la determination des structures cristallines. Acta Ciyst., 5, 802 — 810,

23. Teplyakov, A., Obmolova, G..Wilson, К S., ishii, K., Kaji, H.,Samejima, T., Kuranova, I. (1994) Crystal structure ol' inorganic pyrophosphatase from Ihcrmus Ihermophilus. Protein Science,3, 1098 ■ 1107,

24 Kankare, J., Neal, G.S., Salniinen, 'Г., Giumhoff, 7'., Gooperman, B.S., Lahli, R., and Goldman, A. (1994) The structure of E.coii soluble inorganic pyrophosphatase at 2.7A resolution. Protein Engineering, vol,?, 823 — 830.