рН-зависимость элементарных стадий катализа неорганической пирофосфатазой тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Список сокращений Введение

Ферментативные механизмы гидролиза/синтеза фосфоангидридной связи (обзор литературы) Пирофосфатаза О-белки АТРазы Экспериментальная часть Материалы Ферменты

Определение активности пирофосфатазы

Расчет общих концентраций ионов Мд2+, пирофосфата и фосфата Математическая обработка результатов Результаты и их обсуждение

1. Кинетический механизм ингибирования пирофосфатазы дрожжей фторид-ионом

1.1. Влияние иона Б" на гидролиз/синтез РР

1.2. Инактивация У-РРазы в равновесии с фосфатом

1.3. Влияние фторид-иона на образование связанного с ферментом пирофосфата

1.4. Константы скорости элементарных стадий катализа

2. Влияние замен консервативных остатков активного центра на функциональные свойства пирофосфатазы дрожжей

2.1. Влияние мутаций на каталитические свойства РРазы

2.2. Взаимодействие мутантных У-РРаз с фторид-ионом

2.3. Ингибирование фторид-ионом синтеза РР1 Б117Е-РРазой

3. Влияние рН на константы скоростей элементарных стадий катализа У-РРазой

3.1. Кинетика гидролиза РР1 в стационарном состоянии

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан BSA - альбумин сыворотки быка DTT - дитиотреитол

EGTA - этиленгликоль-бисф-аминоэтиловый эфир) N,N,N',N' -тетр аацетат

Е-РРаза - РРаза из Escherichia coli

MES - 4-морфолиноэтансульфоновая кислота

PIPES 1,4-пиперазиндиэтансульфоновая кислота

Pi - фосфат

PPi - пирофосфат

РРаза - неорганическая пирофосфатаза

TAPS - 3-{[2-гидрокси-1,1 -бис(гидроксиметил)этил]амино}-1 -пропансульфоновая кислота

TES - 3-{[2-гидрокси-1,1-бис(гидроксиметил)этил]амино}-1-этансульфоновая кислота WT - природный штамм

Y-РРаза - РРаза из дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Неорганические пирофосфатазы (КФ 3.6.1.1) являются необходимыми ферментами метаболизма и катализируют гидролиз/синтез фосфоангидридной связи (Kunitz & Robbins, 1961; Butler, 1971; Cooperman, 1982; Cooperman et al., 1992; Baykov et al., 1999a). Основной субстрат фермента, пирофосфат, образуется в результате многих АТР-зависимых процессов, таких как биосинтез белков, нуклеиновых кислот, фосфолипидов, и его гидролиз смещает равновесие этих реакций в направлении синтеза (Kornberg, 1962). Пирофосфатазы относятся к числу металлоактивируемых ферментов - присутствие ионов двухвалентных металлов абсолютно необходимо для проявления ими каталитических свойств (Kunitz & Robbins, 1961). Являясь простейшими фосфорилтрансферазами, пирофосфатазы представляют собой удобную модель для изучения этого класса ферментов.

Известны два типа пирофосфатаз - растворимые и мембранные. Они сильно различаются по размерам, первичной структуре и функциональным свойствам. Как было обнаружено в последнее время, растворимые пирофосфатазы, в свою очередь, делятся на два семейства с абсолютно различными аминокислотными последовательностями. Первое семейство включает в себя давно известные и наиболее изученные пирофосфатазы из Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Thermiis thermophilus и гомологичные им. Во второе семейство входит фермент из Bacillus subtilis и еще четырех бактерий (Sivula et al., 1999; Shintani et al., 1998; Young et al., 1998). Изучение пирофосфатаз второго семейства только начинается, в то время как некоторые ферменты первого семейства уже охарактеризованы достаточно полно: с высоким разрешением получены трехмерные структуры пирофосфатаз Е. coli (Kankare et al., 1996; Арутюнян и др., 1996; Avaeva et al., 1997; Harutyunyan et al., 1997), S. cerevisiae (Heikinheimo et al., 1996a; Harutyunyan et al., 1996), T. thermophilus (Teplyakov et al., 1994) и Sulfolobus acidocaldarius (Leppanen et al., 1999), определено строение активного центра фермента и предложены гипотетические механизмы катализа, кинетически подробно охарактеризован фермент дикого штамма Е. coli (Baykov et al., 1990) и S. cerevisiae (Baykov and Shestakov, 1992), исследованы эффекты мутаций консервативных остатков активного центра (Salminen et al., 1995; Heikinheimo et al., 1996b; Pohjanjoki et al., 1998 ) и зон контакта субъединиц (Baykov et al., 1995; Efimova et 6 а1., 1999) на каталитические свойства. Тем не менее, механизм действия пирофосфатаз, в частности, природа ионизирующихся групп, влияющих на активность, локализация и способы активации нуклеофильной молекулы воды в активном центре фермента остаются не выясненными.

Данная работа посвящена изучению роли ионогенных групп на элементарных стадиях катализа пирофосфатазой и механизма ингибирования фермента фторид-ионом с целью локализации существенных для катализа молекул воды.

Ферментативные механизмы гидролиза/синтеза фосфоангидридной связи (обзор литературы)

Пирофосфатазы специфически гидролизуют и синтезируют пирофосфат, являющийся простейшим представителем семейства полифосфатов. Результатом гидролиза является перенос фосфорильной группы на молекулу воды. Существует большое число других ферментов, катализирующих обратимый перенос фосфорильной группы на воду, но использующих более сложные субстраты, например нуклеозидтрифосфаты. Несмотря на большие различия в размерах, общей топологии и четвертичной структуре, фосфогидролазы имеют некоторые общие элементы структуры, обычно входящие в активный центр (Smith & Rayment, 1996а). Для катализа фосфогидролазам необходим, как минимум, один ион двухвалентного металла, связанный с атомами кислорода фосфорильной группы. Известны структуры нескольких фосфогидролаз, полученные с высоким разрешением методом рентгеноструктурного анализа, и сравнение предложенных на их основании механизмов катализа может позволить выявить общую стратегию, используемую ферментами для эффективного гидролиза/синтеза фосфоангидридной связи.

Пирофосфатаза

Строение фермента и его комплекса с фосфатом

В структурном отношении лучше всего исследованы пирофосфатазы, выделенные из пекарских дрожжей (5. cerevisiae) и Е. coli. Пирофосфатаза дрожжей состоит из двух одинаковых субъединиц с молекулярной массой 32 кДа (Cohen et al., 1978). Основу третичной структуры мономера составляют [З-слой и баррельная структура, состоящая из пяти Р-цепей (Heikinheimo et al., 1996а; Harutyunyan et al., 1996). Четыре а-спирали окружают баррель и находятся на поверхности субъединицы. Широкий Р-слой состоит из семи Р-цепей и отделен от растворителя а-спиралью.

На поверхности фермента было обнаружено шесть полостей, наибольшая из которых, диаметром 25 А, представляет собой активный центр, так как в ней связывается негидролизуемый аналог субстрата CaPPi (Терзян, 1994) или две молекулы фосфата вместе с четырьмя ионами Mn2+ (Harutyunyan et al., 1996; Heikinheimo et al., 1996a). Дно впадины активного центра гидрофобно, его образуют Туг89 (51, нумерация в скобках соответствует ферменту Е. coli), Туг93 (55), Lysl54 (104), Тгр188 (138), Phel89 (139) и Туг192 (141). Остальная часть впадины образована полярными остатками, которые можно разделить на два кластера: положительно заряженные остатки Lys56 (29), Arg7-8 (43), Lysl93 (142) и Lysl98 (148) и образующие противоположную стенку отрицательно заряженные Glu48 (20), Glu58 (31), Asp71 (42), Aspll5 (65), Aspll7 (67), Asp 120 (70), Aspl47 (97), Glul48 (98), Glul50 (101) и Aspl52 (102). Аминокислотные остатки отрицательно заряженного кластера играют основную роль в связывании ионов Мп2+ (рис. 1).

Ионы Мп2+ можщ) разделить на две пары. Mnl и Мп2, способные сязываться с белком и в отсутствие субстрата, расположены на дне активного центра, отделены от растворителя фосфатными группами и двумя другими ионами Мп2+ и взаимодействуют только с фосфатом Р2 (рис. 1). Mnl координируется кислородными атомами Р2 и боковых цепей Asp 115, Asp 120 и Asp 152 (по одному атому кислорода от каждого лиганда). В одной из субъединиц две молекулы воды дополняют координацию Mnl до октаэдрической, тогда как в другой субъединице эти молекулы воды не обнаружены. Мп2 взаимодействует со вторым кислородным атомом остатка Asp 120, служащего таким образом мостиком между Mnl и Мп2, и кислородом Р2. Четыре молекулы воды дополняют октаэдрическую координацию Мп2 в одной из субъединиц, в другой субъединкценаблюдается только одна молекула воды. Ионы Mnl и Мп2 вместе с боковыми цепями остатков лизина и аргинина создают положительно заряженную область связывания двух фосфатных групп в комплексе с двумя другими ионами Мп2+ (Heikinheimo et al., 1996а; Harutyunyan et al., 1996).

Вторая пара ионов металла, МпЗ и Мп4 образует мостики между двумя молекулами фосфата. Для МпЗ в обеих субъединицах наблюдается координация типа квадратной пирамиды: кроме кислородных атомов двух фосфатов он связан с кислородным атомом карбоксильной группы остатка Glu58 и двумя молекулами воды; основание пирамиды обращено к растворителю. Мп4 координирован кислородными атомами двух молекул фосфата и карбоксильных групп Asp 147, Asp 152. Две молекулы воды координированы Мп4 в одной субъединице и лишь одна в другой. Предполагается, что в действительности все ионы металла имеют октаэдрическое окружение, и вакантные позиции заняты молекулами воды с высоким температурным фактором; которые нельзя зарегистрировать анализом структуры.

Фосфатные группы взаимодействуют с боковыми цепями остатков аминокислот положительно заряженного и гидрофобного кластеров (рис. 1). PI связан с МпЗ и Мп4

Дер120 Аэр117

54

Рис. 1. Предполагаемые механизмы действия пирофосфатазы: а - нуклеофилом является молекула воды (или ион ОН"), находящаяся в координационной сфере Мп2 (НагЩуипуап е! а1., 1996); б - нуклеофилом является вода Watl (или ион ОН"), координированная с Мп1 и Мп2 и образующая водородную связь с Азр117 (Не1к1пЬе1шо е1 а1., 1996а). и образует водородные связи с Аг§78 (N£11 и N112), Ьуэ193, Туг192 и тремя молекулами воды, одна из которых находится в координационной сфере МпЗ. Р2 взаимодействует со всеми четырьмя ионами металла, Ьуз56, Туг53 и тремя молекулами воды, одна из которых (\Vatl) образует мостик между Мп1 и Мп2, вторая участвует в водородной связи с Туг89, а третья связана с Мп4 и Туг 192 (Не1ктЬе1то й а1., 1996а). В структуре Напйуипуап & а1. (1996) молекула воды не является мостиковой между Мп1 и Мп2.

Считается, что гидролиз пирофосфата протекает по механизму 8К2. Вода (или гидроксид-анион), Ow (см. ниже), атакует атом фосфора фосфатной группы Р2 со стороны, противоположной связи Р-ОЬ (рис. 1а). Бипирамидальная координация атома фосфора в переходном состоянии стабилизируется ионами металла и положительно заряженными боковыми цепями фермента, ослабляющими связи Р-0 (рис. 1а). После расщепления связи Р-ОЬ первым активный центр покидает Р1 в комплексе с Мп4, затем Р2 в комплексе с МпЗ. Предполагается, что такое же переходное состояние образуется и в обратной реакции синтеза пирофосфата - в этом случае в качестве нуклеофила выступает кислородный атом фосфатной группы Р1 (Напйуипуап е1 а1., 1996а).

ГО Не1кт11ет10 е1 а1. (1996а) нуклеофилом является вода (гидроксид-анион), \Vatl, координированная с Мп1 и Мп2 и образующая водородную связь с Аэр117 (рис. 16). Молекула воды \Vat6 предположительно выступает в роли общекислотного катализатора, наличие которого постулируется на основании зависимости каталитической константы гидролиза от рН (см. ниже). \Vat6 может протонировать молекулу Р1, понижая таким образом ее рПервым активный центр покидает Р2 (в комплексе с МпЗ), по мнению авторов, слабее связанный с ферментом, чем Р1. (Не1кш11ешш а1., 1996а). Этот механизм объясняет необходимость для катализа двух ионов металла, связанных с ферментом (см. ниже).

Позднее были получены трехмерные структуры двух мутантных форм пирофосфатазы дрожжей: Я78К с разрешением 1,85 А и Б117Е с разрешением 2,15 А в комплексе с ионами марганца и фосфатом (Тиоштеп е1 а1., 1998). Структуры обоих мутантных белков очень схожи со структурой фермента дикого штамма, однако имеют ряд важных особенностей, позволяющих уточнить ранее предложенные механизмы действия пирофосфатазы. Структуры вариантных белков хорошо согласуются с их каталитическими свойствами в растворе (РЫкшЪето е1 а1., 19966).

В структуре пирофосфатазы Я78К (Тиоштеп е1 а1., 1998) отсутствует фосфатная группа Р1, что согласуется с бидентатным взаимодействием боковой цепи А^78 с Р1 в природном ферменте и уменьшением сродства мутантного белка к фосфату в растворе. Показано также, что в структуре R78K-PPa3bi остаток Lys в положении 78 может образовывать водородную связь с Asp71, блокируя связывание Р1. Еще более важным является тот факт, что фосфатная группа Р2 оказывается повернутой относительно своего положения в структуре природного белка таким образом, что атом кислорода фосфата оказывается на месте предполагаемой атакующей молекулы воды (между Mnl и Мп2). Это соответствует положению продукта реакции сразу после гидролиза в механизме Heikinheimo et al. (1996а).

Основным отличием структуры D117E-PPa3bi (Tuominen et al., 1998) является конформация Asp 117. Кислород карбоксила боковой цепи Aspll7 координируется Mnl и Мп2, занимая таким образом позицию нуклеофила, или, в другой возможной конформации, сдвигая молекулу воды в позицию, менее подходящую для атаки. Это объясняет очень низкую активность мутантного фермента (Heikinheimo et al., 19966). Обнаружено также сильное изменение положения иона МпЗ - в структуре мутантного белка он взаимодействует только с молекулой Р1. Полученные структуры в совокупности с каталитическими характеристиками согласуются с механизмом Heikinheimo et al. (1996а), согласно которому Watl осуществляет нуклеофильную атаку, а МЗ и Arg78 активируют уходящую группу Р1.

Пирофосфатаза Е. coli состоит из шести одинаковых субъединиц с молекулярной массой около 20 кДа (Wong et al., 1970). Ее третичная структура была определена с разрешением 2,7 A (Kankare et al., 1994), а затем с разрешением 2,2 А (Арутюнян и др., 1996; Kankare et al., 1996). Общее строение молекулы мономера такое же, как у фермента\гфожжей: ядро структуры составляют сильно изогнутый семицепочечный Р-слой и пятицепочечная баррельная структура. В структуре выделено шесть а-спиралей. Взаимное расположение основного р-слоя, баррельной Р-структуры и а-спиралей одинаково во всех исследованных пирофосфатазах. Наложение структур пирофосфатаз дрожжей и Е. c6li показывает, что третичная структура субъединиц и строение активных центров этих ферментов очень похожи (Kankare et al., 1996, Арутюнян и др., 1996, Harutyunyan et al., 1997). Вторая имеет более открытый активный центр, доступный растворителю.

Ренгеноструктурный анализ комплекса пирофосфатазы Е. coli с ионом Мп2+ (Арутюнян и др., 1996) показал, что в связывании металла принимают участие по одному карбоксильному атому кислорода боковых цепей трех остатков - Asp65, Asp70, Asp 102. Координационная сфера иона Мп2+ имеет форму искаженного октаэдра, и в ее состав входят три молекулы воды. Атомы кислорода карбоксильных групп и одна молекула воды расположены в вершинах квадрата.

Kankare et al., (1996) был проведен рентгеноструктурный анализ комплекса пирофосфатазы Е. coli, содержащего 1,5 иона Mg2+ на субъединицу фермента. Элементарная кристаллическая ячейка фермента содержала димер субъединиц. Один ион магния находится в центре высокого сродства, аналогичном по устройству центру связывания металла в структуре Арутюняна и др. (1996), второй расположен в зоне контакта субъединиц, отвечающей за образование гексамера из двух тримеров, и координирован с Asn24, А1а25 и Asp26 обоих мономеров через молекулы воды.

Арутюняном и др. была получена структура пирофосфатазы Е. coli в комплексе с 2,5 ионами магния на субъединицу (Harutyunyan et al., 1997), хорошо согласующаяся с имеющимися структурами марганцевых комплексов ферментов Е. coli и дрожжей. В активном центре связаны два иона Mg2+, относящиеся к центрам высокого сродства, описанным ранее. Молекулы воды, связанной с обоими ионами магния, обнаружено не было. Предполагаемая авторами нуклеофильная молекула воды связана с Mg2 (аналогичным Мп2 в структуре дрожжевого белка, рис. 1) и образует водородную связь с гидроксилом боковой цепи Туг55. Именно эти взаимодействия предполагаются ключевыми для активации нуклеофила при гидролизе.

Роль ионов металлов

Пирофосфатазы функционируют только в присутствии катионов двухвалентных металлов, таких как Mg2+, Mn2+, Zn2+, Со2+ (Josse et al., 1966, Cooperman et al., 1973). Многие катионы, особенно Ca2+, ингибируют ферментативную реакцию. Катализ протекает в четыре стадии: связывание субстрата, разрыв Р-0 связи путем прямой атаки молекулы воды без образования фосфорилированного фермента (Gonzalez et al., 1984) и последовательный выброс двух образовавшихся молекул фосфата (схема 1).

Схема 1. Минимальная схема катализа пирофосфатазой (М = Mg, п = 1 или-2).

К К К

ЕМ, ЕМ +,РР ~ ЕМ .,(Р ), * ЕМ .Р. 2 п+2 1 n+2v к2 п+1 1 * ЕЩ

Je. Je* 2 4 6 К

Роль ионов металлов в катализе многообразна. Субстратом пирофосфатазы является комплекс М^РР! и/или МРР1 (кинетически эти два случая неразличимы). Пирофосфат в комплексе с катионом металла приобретает более жесткую структуру, что важно для строгой ориентации субстрата в активном центре. Связывание двухвалентного катиона увеличивает электрофильность атома фосфора, облегчая тем -ч самым нуклеофильную атаку на него. Катионы взаимодействуют и с самим ферментом. При связывании ионов двухвалентных металлов в активном центре фермента формируется положительно заряженный кластер, отвечающий за связывание субстрата и стабилизирующий переходное состояние реакции гидролиза. Генерация нуклеофила, атакующего пирофосфат, предположительно гидроксид-иона (см. ниже), также, по-видимому, происходит с участием катионов металла.

Наиболее детально изучено взаимодействие пирофосфатазы Е. соИ с катионами магния. Константы диссоциации комплексов фермента с ионами магния определены методом равновесного диализа в диапазоне рН 6,0-9,3 (Ваукоу е1 а1., 1996). С увеличением рН наблюдается увеличение сродства фермента к ионам М§2+. Присоединению первого иона отвечает весьма низкая константа диссоциации металл-ферментного комплекса во всем диапазоне рН (Кт[ = 0,08 мМ при рН 7,2), второй ион связывается значительно хуже (Кт2 = 1,7 мМ при рН 7,2), связывание третьего иона наблюдается только при высоких значениях рН (Кт3 = 2,5 мМ при рН 8,5).

При рН 6,0-7,9 каталитическая константа гидролиза (£ь) монотонно возрастает с увеличением концентрации (Ваукоу е1 а1., 1996). При более высоких значениях рН (9,3-10,0) наблюдается ингибирование избытком магния. При постоянной концентрации (20 мМ) зависимость от рН описывается колоколообразной кривой с максимумом при рН 8,0 - 8,5. Предложена схема действия фермента, предполагающая наличие в активном центре двух ионизирующихся групп с рКл 6,1 и 10,0, важных для катализа (общий кислотно-основный катализ, схема 2). Каталитически активны фермент-субстратные комплексы, в которых депротонирована только одна группа, то есть НМ2Е8 и НМЕБ. При низких значениях рН связывание четвертого металла приводит к депротонированию группы с меньшим ри, соответственно, увеличению каталитической активности. При высоких значениях рН эта группа депротонирована, а связывание пятого иона магния при увеличении его концентрации ведет к депротонированию группы с большим рКа и ингибированию реакции. ' ;

Схема 2. Взаимодействия фермент-субстратного комплекса пирофосфатазы Е. coli с ионами Mg2+ и Н+при pH 6,0-10,0 (М = Mg, S = Mg2PPi). M3ES

Ч2 u h2m2es <-> hm2es <-> mjes

U u h2mes HMES H'

Для пирофосфатазы пекарских дрожжей скорости гидролиза и синтеза пирофосфата и равновесные количества связанного с ферментом пирофосфата были измерены в широком диапазоне концентраций ионов М§2+ и субстрата при рН 7,2 (Ваукоу е1 а1., 1992). Анализ этих данных позволил определить значения констант равновесия связывания М§2+ свободным ферментом и фермент-субстратным комплексом, а также константы скоростей для четырех стадий реакции в обоих направлениях: связывание-отщепление пирофосфата, синтез-гидролиз пирофосфата, присоединение-отщепление двух молекул фосфата (схема 1). Оказалось, что катализ протекает по двум параллельным путям с участием трех и четырех ионов магния. Для пути с четырьмя ионами металла отщепление продукта оказывается скорость-лимитирующей стадией при синтезе и гидролизе пирофосфата. В реакции гидролиза связывание субстрата (1У^2РР0 происходит быстрее для пути с четырьмя ионами металла, отщепление второй молекулы фосфата идет с большей скоростью для пути с тремя ионами магния, тогда как гидролиз пироосфата и отщепление первой молекулы фосфата протекают с приблизительно равными скоростями для обоих путей.

Роль аминокислотных остатков активного центра

Исследования роли отдельных аминокислотных остатков фермента методом ч, химической модификации проводились для пирофосфатаз дрожжей и Е. coli (Склянкина и др., 1975, Аваева и др., 1985, Разников и др., 1992, Cooperman et al., 1973, Raznikov et al., 1992, Kaneko et al., 1993). Более информативным методом является сайт-специфический мутагенез. К настоящему времени изучены 24 мутантные формы пирофосфатазы Е. coli и 17 форм фермента дрожжей. Замене подвергались все консервативные аминокислотные остатки активного центра и остатки, отвечающие за поддержание четвертичной структуры (Salminen et al., 1995; Avaeva et al., 1996; Efimova et al., 1999; Velichko et al., 1998; Pohjanjoki et al., 1998; Heikinheimo et al., 19966).

В ферменте E. coli мутации всех консервативных остатков, кроме трех (Туг51, GlulOl, Lysl48), привели к существенной или полной потере активности, а иногда и к нарушению четвертичной структуры белка, даже если замены были консервативными (кислота/кислота, основание/основание) (Salminen et al., 1995; Heikinheimo et al., 19966). Наибольшее падение активности вызывают замены Asp/Asn остатков аспартатного кластера, связывающих ионы металла (Avaeva et al., 1996). Замены неконсервативных остатков активного центра не сказываются на активности фермента (Lahtietal., 1991).

Пирофосфатаза дрожжей еще более чувствительна к заменам консервативных остатков. «Так, в стандартных условиях измерения активности (рН 7,2, избыток субстратов) мутантные формы E58D, D117Е, D120E и D152E практически полностью неактивны, а замены D147E и K193R имеют в пять раз более низкую относительную активность, чем соответствующие варианты D97E и K142R фермента Е. coli. С другой стороны, замены остатков активного центра пирофосфатазы дрожжей практически не влияют на четвертичную структуру фермента (Heikinheimo et al., 19966).

Для мутантных форм, лишь частично утративших свою активность, были определены влияния замен на отдельные параметры кинетической схемы действия фермента. Так, для варианта пирофосфатазы Е. coli D97E значительно уменьшаются скорости гидролиза и синтеза пирофосфата, дестабилизируется фермент-субстратный комплекс EMg4PPi, а также переходное состояние между ним и комплексом EMg2(MgPi)2, более чем на единицу возрастает рКа не только основной группы, важной для гидролиза и связывания пирофосфата (Kapyla et al., 1994), но и кислотной группы, по-видимому, не участвующей на стадии гидролиза (Fabrichniy et al., 19976). Замена также ухуДшаЬт сродство фермента к иону магния в отсутствие .субстрата и одному из ионов металл"а, связывающемуся с белком вместе с субстратом (Kapyla et al., 1994). Для проявления максимальной каталитической активности ферменту необходимо связать все четыре иона магния в активном центре (схема 2).

Замена Glu20 на Asp в ферменте Е. coli (Volk et al., 1996) привела к значительному уменьшению скорости гидролиза пирофосфата и возрастанию синтетазной активности (275% по сравнению с природным белком). Уменьшение гидролитической активности вызвано, в основном, увеличением р/С основной группы, важной для катализа. Как и для D97E-PPa3bi, катализ идет по пути с четырьмя ионами металла. При разбавлении Е2СЮ-РРаза легко диссоциирует на тримеры, то есть мутация дестабилизирует четвертичную структуру фермента.

При замене Asp/Asn остатков аспартатного кластера, связывающих ионы металла (D65N, D67N, D70N, D97N, D102N), уменьшается суммарный отрицательный заряд активного центра, но размер группы и возможность образования водородных связей сохраняются. Замены приводят к падению активности в 2000-3000 раз, но, в отличие от замен Asp/Glu, мало влияют на рКл ионизирующихся групп и связывание ионов Mg2+, измеренное методом дифференциальной спектроскопии (Avaeva et al., 1996а), который регистрирует связывание в центре М2.

Замена D42N приводит к трехкратному увеличению активности фермента при pH 8,0; рКа ионизирующихся групп практически не изменяются. Мутация не влияет на связывание второго иона Mg2+ и снимает ингибирующее действие избытка ионов магния. Предполагается, что увеличение каталитической активности у D42N-PPa3bi вызвано изменениями в центре М4 (Avaeva et al., 19966).

Поскольку мутации типа Asp/Glu, Arg/Lys всех консервативных остатков активного Центра пирофосфатаз Е. coli и дрожжей вызывают увеличение рК основной группы, необходимой для катализа и связывания субстрата, на 1-3 единицы (Salminen et al., 1995; Pohjanjoki et al., 1998), выдвинуто предположение, что нуклеофилом , атакующим пирофосфат в активном центре фермента, является гидроксид-ион, генерируемый в активном центре из молекулы воды. Величина ее рКа < 6,6 (в ферменте Е. coli) или < 5,5 (в ферменте дрожжей) за счет координации с ионами металла и, возможно, аминокислотными остатками белка (в частности Aspll7 в ферменте дрожжей). Тот факт, что пирофосфатазы ингибируются ионом F" (Baykov et al., 1979; Курилова и др., 1984) также может подтверждать гипотезу о гироксид-ионе в качестве нуклеофила: анионы F" и ОН" очень близки по размерам и заряду и возможно, что фторид-ион занимает место нуклеофила в активном центре. При заменах Asp/Asn (сохраняется размер мутируемой группы) существенных сдвигов рКл не происходит (Avaeva et al., 1996). Возможно, в этих случаях сохраняется система водородных связей, необходимая для понижения рКл молекулы воды, а падение активности вызвано другими причинами. Независимо от предполагаемой природы нуклеофила очевидно, что для успешного протекания катализа необходимо очень точное взаимное расположение консервативных аминокислотных остатков и молекул субстрата в активном центре.

G-белки

Суперсемейство GTP-гидролаз (GTPa3 или G-белков) включает в себя Ras-белки, факторы элонгации трансляции и гетеротримерные G-белки. Эти ферменты выполняют функцию передачи различных клеточных сигналов, используя гидролиз GTP в качестве способа переключения этих сигналов (Sprang,1997; Bourne et al., 1991).

Ras-белок и родственные ему GTPa3bi

Со структурной точки зрения наиболее подробно изучена самая маленькая GTPa3a- онкогенный продукт Ras, белок с молекулярной массой 21 кДа (p21Ras) человека. Ras-белки играют ключевую роль в передаче сигнала роста извне во внутриклёточное пространство в качестве молекулярного переключателя: сигнал включен и узнается белками-эффекторами, когда с Ras связывается GTP, и выключен, если связан GDP. Ras имеет собственную, хотя и весьма низкую, ОТРазную активность, которая усиливается связыванием GAP-белка (Wittighofer and Pai, 1991). Структура фермента, определенная в комплексе с GDP[(3,y-CH2]P, негидролизуемым аналогом GTP, с разрешением 2,5 Á, состоит из шести Р-слоев, формирующих центральный Р-лист, пяти a-спиралей, расположенных с обеих сторон листа и десяти петель, связывающих a-спирали и Р-слои (Brunger et al., 1990). Выявлены центры связывания иона магния и нуклеотида (рис. 2). Ион Mg2+ координирован четырьмя атомами кислорода - по одному от Р- и у-фосфатных групп субстрата, а также от гидроксильных групп боковых цепей остатков Ser 17 и Thr35. Характерно окружение Р-фосфата аминокислотными остатками 14-17, образующими водородные связи исключительно NH-группами главной цепи. у-Фосфат удерживается четырьмя разными частями молекулы - координационной связью с Mg2+ и водородными связями с амидными группами главной цепи остатков Glyl3, Thr35 и GlyóO.

АналЬгичНая структура была получена в работе Schlichting et al. (1990), изучавших комплекс p21Ras с GDP и его возможные конформационные изменения при гидролизе.

Для этого использовалось фотолабильное производное ОТР, позволяющее зафиксировать структуру фермента в комплексе с истинным субстратом. Было обнаружено, что аминогруппа боковой цепи остатка Ьуэ16, инвариантного в фосфат-связывающей петле й-белков, образует водородные связи с атомами кислорода (3- и у-фосфатов, а амид главной цепи С1у13 способен образовывать водородную связь с мостиковым кислородом между р- и у-фосфатами. Авторы отмечают большое число взаимодействий концевых фосфатных групп субстрата с катионом металла и белком, увеличивающих электрофильность у-фосфата и, следовательно, его восприимчивость

Рис. 2. Схематическое изображение молекулы вБРИР, связанной в активном центре белка р21Каз (Ра1 е1 а1., 1990). к нуклеофильной атаке молекулой воды и усиливающих свойства (3-фосфата в качестве уходящей группы. Больших конформационных различий исследованных структур обнаружено не было.

Первый механизм действия р21Ка5 был предложен на основании структуры фермента в комплексе с ОБРЫР, аналогом ОТР, с разрешением 1,35 А (Ра! е! а1., 1990). Предполагается, что гидролиз идет по механизму нуклеофильного замещения 8Ы2, то есть с образованием пентаковалентного переходного состояния, где нуклеофил и уходящая группа занимают положения в вершинах тригональной бипирамиды. Таким образом, в момент атаки нуклеофил должен быть расположен строго напротив (3-фосфата, на линии разрываемой связи [3- и у-фосфатов. В структуре p21Ras были обнаружены две подходящие молекулы воды, Watl75 и Watl89 (рис. 2). Авторы считают, что нуклеофилом является молекула Watl75, потому что ее расположение лучше соответствует геометрии переходного состояния. Кроме того, карбонильный кислород главной цепи Thr35 достаточно близок к этой молекуле воды для образования с ней водородной связи, являясь, таким образом, ее потенциальным активатором; у второй молекулы воды нет источников увеличения ее нуклеофильности. В трехмерной структуре фермента был обнаружен участок петли, включающий аминокислотные остатки 61-67, с высоким температурным фактором. Для четырех остатков (Glnól, Glu62, Glu63 и Туг64) можно идентифицировать альтернативные позиции, возможно, отвечающие различным конформациям - активной и неактивной в гидролизе. В одном из положений карбонильный атом боковой цепи Gln61 достаточно близок для образования водородной связи с Wat 175. На основании этого, а также ввиду консервативности этого остатка, авторы предлагают механизм с дополнительной активацией Watl75 остатком Glnól (Pai et al., 1990; Wittighofer and Pai, 1991). Правильная ориентация остатка Glnól и увеличение его способности к оттягиванию протона задается взаимодействием с боковой цепью Glu63 (рис. 3). Ион Mg2+ и Lysló также способствуют катализу, увеличивая электрофильность у-фосфата или кислотность уходящей группы.

СН-СИ—он

Thr-3S| |

-NH-С'

Н-NH—С—О

1 Gln-61 J

I Э.7А I p.

->GMP О

I MC Gly-60 I I Lya-16

Рис. 3. Активная конформация p21Ras в гидролизе GTP (Pai et al., 1990).

Структура p21Ras также показала возможный способ увеличения гидролитической активности Ras белком-активатором GAP. В активном центре обнаружен остаток Туг32, связанный Ь у-фосфатом субстрата, но принадлежащий аминокислотной последовательности другой субъединицы. Это демонстрирует принципиальную возможность активации p21Ras путем предоставления дополнительных остатков в активный центр другим белком. Возможно, что GAP фиксирует «активную» для гидролиза конформацию петли, содержащей ключевой остаток Gln61 (Pai et al., 1990). Структура и возможный механизм гидролиза p21Ras были взяты за основу при дальнейшем изучении всего семейства G- белков.

Аналогичный механизм действия предполагается и для фактора элонгации трансляции EF-Tu, имеющего схожую общую трехмерную структуру каталитического домена (Kjeldgaard et al., 1993; Berchtold et al., 1993; Polekhina et al., 1996). Принципиальным отличием от p21Ras является наличие His (His85 в EF-Tu) вместо Gln61. Остаток His85 является потенциальным активатором нуклеофильной воды, однако, как и в р21Ras, его конформация даже в GTP-активированном ферменте не является оптимальной для катализа. Для возможности оттягивания протона у молекулы атакующей воды необходимо вращение, которое в сильной степени блокировано гидрофобными взаимодействиями сегментов структуры белка. Предполагается, что продуктивное взаимодействие с аминоацил-тРНК и последующие конформационные изменения молекулы EF-Tu снимает это блокирование.

Однако, позднее на основании анализа онкогенных точечных мутаций Ras, блокирующих ОТРазную активность, и структур мутантных форм p21Ras с заменами консервативных остатков G12V, Q61L и А59Т в комплексе с GDP и аналогом GTP (GDPCP) был предложен другой каталитический механизм стабилизации переходного состояния гидролиза (Prive et al., 1992). Было показано, что остаток Gln61 не требуется для фиксации молекулы воды в атакующей позиции, а ее активация достигается скорее сильными взаимодействиями с у-фосфатом и Thr35. Предполагается, что фермент понижает энергию активации переходного состояния путем стабилизации пентаковалентного фосфатного интермедиата реакции множеством положительных зарядов, сгруппированных в зоне связывания полифосфатной части молЪкулы субстрата, то есть за счет взаимодействия р~ и у-фосфатных групп с Mg2+, боковой цепью Lyslô и амидами главной цепи остатков 13-17, 35 и 60. Остаток Gln61 также играет ключевую роль в стабилизации переходного состояния, образуя с ним две водородные связи (рис. 4). Сильное понижение активности мутированных по остатку 61 белков Ras объясняется их неспособностью образовывать этот специфический комплекс. Структуры мутантных белков практически не отличаются от структуры фермента дикого штамма (Prive et al., 1992,;Tong et al., 1991; Wittighofer and Pai, 1991)

Thr-35

Glv-60

Gin-61

Lys-16

Рис. 4. Переходное состояние ракции гидролиза GTP белком p21Ras, стабилизированное остатком Gln61 (Prive et al., 1992). по-видимому, их онкогенные свойства можно объяснить небольшими стерическими или конформационными нарушениями расположения в активном центре важных для катализа групп.

Попытки идентифицировать общекислотный катализатор в белке Ras были предприняты Schweins et al. (1995). На основании структуры фермента и функциональных свойств мутантных форм p21Ras было показано, что ни один из аминокислотных остатков активного центра, являющихся вероятным кандидатом на роль общекислотного катализатора, таковым не является. Авторы предлагают механизм гидролиза GTP, в котором функцию каталитического основания выполняет сама молекула субстрата, связанная в активном центре. Основные доказательства этой гипотезы построены на измерении рК у-фосфата связанного с ферментом GTP (примерно 2,9 для Ras дикого штамма) методом 31Р-ЯМР и анализе зависимостей активности p21Ras и его мутантных форм от pH. Убедительным подтверждением предложенного механизма являются характерные линейные корреляции между скоростью гидролиза Ras и его мутантов и рКа у-фосфата GTP: самое высокая величина рКа связанного нуклеотида соответствует максимальной скорости гидролиза при нейтральных pH. Этот механизм имеет ряд преимуществ перед другими. Протонирование у-фосфата не только позволяет избежать образования высокоэнергетических интермедиатов в ходе реакции, но и сильно снижает активационный барьер нуклеофильной атаки, поскольку генерируемый ОН"- нуклеофил встречает меньшее электростатическое отталкивание при приближении к у-фосфату. Катализ с участием субстрата подтверждает тот факт, что в структуре активного центра молекула нуклеофильной воды связана водородной связью с единственным кислородом у-фосфата, не образующим других связей с белком или катионом магния (Pai et al., 1990). В соответствии с предполагаемым механизмом катализа, эффект многих онкогенных мутаций, сильно снижающих гидролитическую активность Ras, объясняется изменением электростатических свойств мутантных белков и понижением рКа у-фосфата GTP. Однако не исключаются и другие причины, в частности для остатка Gln61 предложены возможные схемы его участия в катализе в качестве донора или/и акцептора водородных связей, стабилизирующих образование нуклеофильного гидроксид-иона и/или пентаковалентного переходного состояния реакции (рис.5).

Катализ с участием субстрата предполагается и для других Ras-подобных GTPa3 - белков Rab, регулирующих определенные стадии во вне- и внутриклеточном везикулярном транспорте. Трехмерная структура белка Rab3A в комплексе с GDPNP, полученная с разрешением 2,0 Â (Dumas et al., 1999), продемонстрировала большое сходство с p21Ras в организации активного центра, однако

Gln6l

Г* Î V

-о I ро 9 о

-о—1GDP[ I H ч

Gln61

0-р-О—f i 1^0 Jl ,н о о

К/ N I H

Gln61

M-О-р-О—ÍGDP К

II о О /в ©

Н' I H

Рис. 5. Возможная роль Gin 61 в "катализе с помощью субстрата" (Schweins et al., 1995). обнаружены и некоторые взаимодействия фермента с замещаемой фосфатной группировкой, не найденные в других GTPa3ax. Помимо характерных контактов аминокислотных остатков активного центра с нуклеотидом и ионом Mg2+, гидроксилы боковых цепей остатков Ser31 и Ser53 образуют водородные связи с атомом кислорода у-фосфата. Эти остатки консервативны в Rab белках, но не присутствуют в других GTPa3ax, где на их месте обычно находятся остатки глицина. Боковая группа Ser31 ориентирована оптимально для связывания с* у-фосфатом, а связь, образуемая остатком Ser53, значительно слабее. В структуре также обнаружен остаток Gln81 в позиции, аналогичной Gln61 Ras, однако его боковая цепь взаимодействует только с предполагаемой нуклеофильной водой, а стабилизирующий переходное состояние контакт с переносимой фосфорильной группой (Prive et al., 1992) стерически блокирован боковой цепью Ser31. Мутация остатка Ser31 на

Ser53-О

Ser31

Ser31 H н H Gln81 o. \ i M ' 4.-Gln81

Ъ \Í©-ч H í o-P 4-í>0 \ I

V H o© o Л

Thr54

GTP-форма

Ser53 — O O H

H .-• o o / o — D —o' / 4

-Gln81

GDP

GDP H O Л

Thr54

Пентаковалентный интермедиат

Рис. 6. Механизм перехода ОТР-связанной формы ЯаЬЗА в предполагаемое переходное состояние гидролиза йТР (Битаэ е1 а1., 1999).

01у в несколько раз увеличивает вТРазную активность ЯаЬЗА, то есть он играет роль негативней детерминанты гидролиза, предпочтительно стабилизируя активное основное состояние фермента. В то же время предполагается, что вращение связи Са-Ср могло бы позволить гидроксилу боковой цепи 8ег53 поддерживать или даже улучшать геометрию водородной связи с у-фосфатом именно в пентаковалентном переходном состояниии гидролиза, таким образом стабилизируя его. В приведенном на рис. 6 механизме

Диссоциативный н + "О—Р—ов

Н -¿ (-2) ов ч р-----р.----OR н' -о' о

-1+6-) н^.1? 6. о

- (-2+5-)

X".

HO-J

X'

НО—^ —О" ♦ "OR о"

Ассоциативный

Рис. 7. Схема переноса фосфорильной группы на молекулу воды по диссоциативному и ассоциативному механизмам (Мае§1еуе1а1., 1996). образования переходного состояния у-фосфат выступает в роли акцептора протона нуклеофильной воды (катализ с участием субстрата), а остатки Ser31 и Ser53 оказывают активирующее действие на нуклеофил, увеличивая основность у-фосфата. Во всех обсуждавшихся до этого моделях катализа Ras предполагается ассоциативный механизм. Однако, модельные исследования показали, что механизм гидролиза GTP в растворе является скорее диссоциативным, т.е. включает образование метафосфат-иона. В диссоциативном состоянии преобладает расщепление связи с уходящей группой (большой ô-), а связь с нуклеофилом сформирована слабо (маленький ô+), откуда следует потеря заряда на переносимой фосфорильной группе (рис. 7). В ассоциативном механизме ситуация обратная. На основании этого для Ras был предложен альтернативный каталитический механизм, базирующийся на наличии водородной связи фермента с р,у - мостиковым кислородом субстрата (Maegley et al., 1996). Квантовомеханические расчеты привели к выводу, что гидролиз GTP идет по диссоциативному механизму, но нельзя исключить, что координация у - фосфата ионом магния и аминокислотными остатками в активном центре фермента увеличивает его электрофильность настолько, что характер переходного состояния изменяется. Авторы показали, что имеющиеся данные не противоречат диссоциативному механизму и не доказывают, что фермент изменяет характер переходного состояния реакции. Предлагается механизм каталитической стабилизации уходящей группм, GDP. Полагая, что каталитическое взаимодействие должно быть направлено на атом, претерпевающий максимальные изменения заряда при достижении переходного состояния (в случае GTP это мостйковый кислород между и у- фосфатами, приобретающий в диссоциативном механизме сильный отрицательный заряд, почти как в GDP), авторы приписывают ключевую роль в катализе консервативному остатку Glyl3, образующего водородную связь амидом главной цепи с мостиковым кислородом и в структурах и с GTP, и с GDP (Schlichting et al., 1990; Pai et al., 1990; Prive et al., 1992). Важную роль в диссоциативном механизме также могут играть взаимодействия иона Mg2+ и Lys 16 с (3-фосфатом, компенсирующие возникающий отрицательный заряд на уходящей группе.

Трехмерная структура белка Ras в комплексе с его активатором GAP (Schefízek et al., 1997) позволила подтвердить оба предложенных ранее (Pai et al., 1990) механизма увеличения им скорости гидролиза GTP на четыре-пять порядков: предполагается, Что GAP ускоряет скорость-лимитирующую изомеризацию Ras в активную для гидролиза конформацию. а также предоставляет каталитический аминокислотный Остаток в активный центр GTP-азы.

Методом рентгеноструктурного анализа была получена структура комплекса Ras-GDP-GAP в присутствии фторида алюминия с разрешением 2,5 Â. Важнейшим оказался тот факт, что тригональный A1F3 связывается в активном центре Ras на месте у-фосфата и предположительно имитирует переходное состояние СТРазной реакции.

Рис. 8. Переходное состояние реакции гидролиза GTP белком Ras при участи GAP (Scheffzek et al., 1997).

Молекула GDP и ион магния связаны как описывалось ранее (Schlichting et al., 1990; Pai et al., 1990), кроме того появляется дополнительное связывание З'-ОН-группы рибозы субстрата с остатком Thr785 GAP. Молекула A1F3 образует контакты атомами фтора с Mg2+, Thr35(NH), Lysl6(NH3+), Gln61(NH2) и, что существенно для катализа, с положительно заряженной гуанидиновой группой остатка Arg789, предоставленного GAP (так называемый «аргининовый палец»). Arg789 также связан карбонилом главной цепи с амидом боковой цепи Gln61 Ras. Геометрию атома А1 в виде тригональной бипирамиды дополняют аксиальные кислороды: один из уходящей группы, а второй -из нуклеофильной воды Watl75 (рис. 8).

По Maegley et al. (1996) в ходе фосфорилтрансферазной реакции образуется частичный отрицательный заряд - если он возникает на у-фосфате, то реакцйя ассоциативная и идет через пентаковалентный интермедиат фосфата, если же заряд возникает на уходящей группе, то механизм диссоциативный и образуется переходное состояние типа метафосфата. Структура Scheffzek et al. (1997) показывает наличие полярного взаимодействия между боковой цепью Arg789 GAP и атомом фтора A1F3. На основании этого авторы считают, что каталитическое действие GAP заключается именно в нейтрализации возникающего в переходном состоянии отрицательного заряда на у-фосфате, что, следовательно, говорит о преимущественно ассоциативном механизме гидролиза. Вторым важным моментом каталитического действии GAP считается стабилизация активной конформации петли, содержащей остаток Gln61, которая в исследованной структуре оказалась значительно менее лабильной, чем в изолированном Ras (Pai et al., 1990). Удалось также найти структурные объяснения онкогенности мутантов Ras по остатку Glyl2. Он находится в Ван-дер-Ваальсовом контакте своим Са углеродным атомом с карбонилом главной цепи Arg789 (GAP) любая замена стерически блокирует активацию гидролиза GAPom, нарушая важное взаимодействие Arg789 (GAP) с Glnól(Ras). Тот факт, что мутанты по остатку 12 связывают GAP как фермент дикого штамма, но не активируются им, говорит о том, что указанный контакт важен именно в переходном состоянии реакции. Показано, что по аналогичному механизму действует белок-активатор другой GTPa3bi, Rho, родственной Ras (RittingerK et al., 1997). Активация другого Ras-подобного белка ARF1, участвующего в сборке транспортных визикул, также идет с помощью специфического белка GAP, который, вероятно, только стабилизирует правильную конформацию активного центра. СТРазная активность ARF1 еще значительно возрастает при одновременном связывании эффектора - белка визикулярной оболочки - который, как предполагается, может предоставлять «аргининовый палец» в активный центр фермента (Goldberg, 1999).

Природу переходного состояния также пытались установить с помощью дифференциальной спектроскопии FTIR, позволяющей изучать ферментативные механизмы в растворе (Cepus et al., 1998). Изучались комплексы Ras со связанным фотолабильным производным GTP с 018-мечеными a-, Р- и у-фосфатами. Было обнаружено сйльное уменьшение кратности связи Р-0 в р-фосфате GTP. связанного с ферментом, по сравнению с GTP в растворе, объясняемое сильными взаимодействиями атомов кислорода в р-фосфате с окружением в активном центре белка, делающими Р-фосфор электрон-дефицитным. На основании этого, происходит смещение электронной плотности и от р,у- мостикового кислорода, ослабляющее связь с у-фосфатом. Для комплекса Ras-GDP найдена одна Р-0 связь в р-фосфате со значительно большим порядком связи, отнесенная к мостиковому атому кислорода, образующему после разрыва связи в ходе гидролиза почти двойную связь с Р-атомом фосфора; два других атома кислорода остаются сильно связанными с белком. В у-фосфате GTP, связанного с Ras, обнаружено увеличение кратности связи, то есть как минимум один из атомов кислорода у-фосфата, не взаимодействующий с катионом магния, слабее связан с белком, чем атомы кислорода р-фосфата. Таким образом, данные FTIR-спектроскопии показывают, что р-фосфат связан с белком значительно сильнее, чем у-фосфат. Такой результат хорошо согласуется с ранее предположенным диссоциативным характером гидролиза GTP (Maegley et al., 1996). Однако авторы замечают, что стабилизация отрицательного заряда на (3-фосфате и ослаблении Р-0 связи между Р- и у-фосфатами не являются антикаталитическими и в ассоциативном механизме, так как увеличивают электрофильность у-фосфора, а следовательно его восприимчивость к нуклеофильной атаке. Тот факт, что в GAP-активированном катализе «аргининовый палец»,, компенсирует отрицательный заряд на у-фосфате в пентаковалентном переходном состоянии реакции (Scheffzek et al., 1997), свидетельствует в пользу ассоциативного механизма, однако, собственный катализ Ras и катализ с участием GAP могут идти разными путями. По-видимому, при функционировании фермент использует свойства обоих механизмов. а-Субъединицы гетеротримерных G-белков

Гетеротримерные G-белки передают различные сигналы извне на внутриклеточные эффекторы, активируясь путем взаимодействия со специфическими трансмембранными рецепторами. Сигнал регулируется обменом GDP на GTP в активном центре Оа-субъединицы: когда с ферментом связан GTP, идет передача сигнала, после гидролиза с Ga в комплексе с GDP связывается димер G/Gy, ингибирующий Оа-субъединицу и прекращающий таким образом передачу сигнала. Са-субъединицы обладают значительно более высокой собственной СТРазной активностью, чем Ras-белки (Sprang, 1997).

Несмотря на малое сходство аминокислотных последовательностей, общая трехмерная структура Ga очень похожа на структуру p21Ras, однако имеется ряд принципиальных отличий. Структура 0(а-субъединицы трансдуцина в комплексе с GTPyS, негидролизуемым аналогом GTP (Noel et al., 1993), представляет собой два домена, фланкирующих глубокую нуклеотидсвязывающую впадину. Один домен состоит из (3-листа, образованного шестью (3-слоями и окруженного пятью а-спиралями. Другой домен преимущественно спиральный, свойственный Ga-субъединицам гетеротримерных G-белков. Домены плотно смыкаются, делая связанную молекулу GTPyS с ассоциированным ионом Mg2+ практически недоступной. Это говорит о том, что для обмена гуаниннуклеотидов требуются конформационные изменения, открывающие впадину активного центра.

Трифосфатная часть молекулы субстрата координирует катион Mg2+IH образует водородные связи с амидными группами главной цепи остатков Glu39, Gly41, Lys42, Ser43, Thrl77, Glyl99 и боковых цепей остатков Lys42 и Argl74. Ион магния находится в октаэдрическом окружении, два его лиганда - атомы кислорода Р- и у-фосфатов, два других - гидроксилы боковых цепей Ser43 и Thrl77 и еще два - молекулы воды, также связанные с боковыми цепями Ser43, Thrl44, Aspl96 и кислородным атомом a-фосфата. Связывание амидов главной цепи остатков Ser43 и Thrl77 с р- и у-фосфатными группами дает возможность их боковым цепям взаимодействовать с ионом магния и связанными с ним молекулами воды. Боковая цепь Argl74 образует л Aig174 водородные связи с атомом серы у-фосфата, мостиковым кислородом между Р- и у-фосфатами и кислородом a-фосфата (Noel et al., 1993).

В структуре Gta есть две важные для гидролиза особенности, не обларуженные в структурах Ras: консервативный остаток Argl 74, непосредственно связанный с у-фосфатом, и кандидат на роль общеосновного катализатора в реакции гидролиза - остаток Glu203. Как указывалось выше, Argl 74 образует водородные связи с а- и у-фосфатными группами, а также мостиковым кислородом между Р- и у-фосфатами. Эти прямые контакты удачно расположены для нейтрализации отрицательного заряда, образующегося в предполагаемом пентаковалентном переходном состоянии гидролиза и, таким образом, способствуют отщеплению у-фосфата (Noel et al., 1993). В структуре обнаружена молекула воды, аналогичная найденной в р21Ras, которая может служить нуклеофилом. атакующим у-фосфат по механизму SN2 замещения. Вероятно, эта вода действительно является нуклеофилом в ОТРазном механизме, однако в структуре Ras не удалось выявить активирующего ее основания. В Gta карбоксилат боковой цепи Glu203 расположен таким образом, что вращение вокруг его связи Ср-Су помещает отрицательный заряд в удобную позицию для образования водородной связи с этой молекулой воды, то есть ее активации (рис. 9). Этот остаток Glu консервативен в семействе Оа-субъединиц, что подтверждает его важность для катализа. Авторы полагают, что более высокая собственная ОТРазная активность Оа-субъединиц по сравнению с Ras объясняется лучшей укладке активного центра, обеспечивающей правильное расположение основания без помощи GAP, и присутствием стабилизирующего переходное состояние взаимодействия с боковой цепью Argl74.

Предложенный механизм катализа а-субъединицей трансдуцина впоследствии был модифицирован на основании трехмерной структуры комплекса Gta-GDP-A1F4" с разрешением 1,7 Á (Sondek et al., 1994). Ион алюминия связывается в активном центре в позиции, эквивалентной положению у-фосфата, и октаэдрически координирован четырьмя ионами F' в экваториальной плоскости и двумя атомами кислорода в вершинах: один, от Р-фосфата, являющийся аналогом Р,у-мостикового кислорода в трифосфате, другой предоставляется молекулой воды, то есть его геометрия сходна с пентаковалентным интермедиатом гидролиза GTP. Наибольшие отличия от структуры Noel et al. (1993) наблюдаются в конформациях двух аминокислотных остатков, Thrl77 и Gln200. В ранее описанной структуре Gta-GTPyS предполагаемая атакующая молекула воды удерживается амидом главной цепи Gln200 и карбонилом главной цепи Thrl77. В структуре Gta-GDP-A1F4" обнаружен изгиб пептидной цепи на 180° в остатке Thrl78, сопряженный с освобождением NH-группы главной цепи Gln200, что позволяет эквивалентной молекуле воды приблизиться примерно на 1 Á к р-фосфату GDP. Эта молекула воды находится в вершине комплекса GDP-AIF4'-H20 и образует практически У н-jfe н

G 1а 200

Ъ \ Y

I ;/ н / ,о—Г HV i X rn

GlaGTPfS

HN

H-Ve ^ / nr\ X

Tbf 177

0(uCDP-AIF,--HjO

An 17«

4 H

H4® v I 0 e 1

Tbrl77 GTP-форма tniU

4/

Н-Л H Gin 20

V \ / /

OOP \ II

09 / A

Им 177 к л'л и

Н Л уИ " ©о о' k I н

0—р—а I

H»ll7

Пентаковалвнтный интермедиат

Ai, 174

Ч /• ^ в>« л 0 1 Иг 177

GTP-форма

Пентаковалвнтный интермедиат

Рис. 10. Стереохимия ОТРазного механизма 0(а. а - ключевые взаимодействия СТРуБ и 0БР-А1Р4"-Н20 с активным центром белка; б, в - альтернативные механизмы гидролиза ОТР (Зопаек & а1., 1994). идеальную водородную связь с карбонилом Thrl77. Боковая цепь Gln200, занимавшая функционально нейтральную позицию в структуре Gta-GTPyS реориентируется, образуя две сильные водородные связи с идеальной геометрией с A1F4"-H20: одну между амидной NH-группой и F", другую - между карбонильным кислородом и молекулой воды. A1F4' также стабилизируется взаимодействиями атомов фтора с гуанидиновой группой Argl74, аминогруппой Lys42, амидами главной цепи остатков 39, 177 и 199, а также катионом металла. Авторы считают, что эти взаимодействия выполняют главную роль в образовании и стабилизации именно пентаковалентного переходного состояния в гидролизе GTP. Предложены два возможных механизма катализа, позволяющих депротонировать атакующую молекулу воды и преодолеть энергетический барьер реакции снижением отрицательного заряда на атакуемом у-фосфате (рис. 10). Первый механизм включает в себя оттягивание протона от атакующей воды боковой цепью Gln200 с одновременной передачей протона кислородному атому у-фосфата по аналогии с каталитическими механизмами, базирующимися на равновесии таутомерных форм. Переходное состояние стабилизируется в таком случае водородными связями иминотаутомера Gln200 с ориентацией как в структуре Gta-GDP-A1F4"-H20. Второй вариант предполагает, что атакующая вода может переносить протон непосредственно на у-фосфат. Это возможно, так как для структуры Gta-GTPyS показано, что нуклеофильная молекула воды расположена почти в идеальной геометрии для прямого переноса протона. В этом случае переходное состояние стабилизируется водородной связью амида боковой цепи Gln200 в ориентации, противоположной описанной в первом механизме. В обоих случаях у-фосфат сам выступает в роли обобщенного основания, как это уже предполагалось для Ras (Schweins et al., 1995). Остаток Arg 174 стабилизирует уходящую группу.

Структуры комплексов с негидролизуемым аналогом GTPyS, GDP-A1F4", а также белков с замененными ключевыми остатками Arg и Gin активного центра были определены и для Оа-субъединицы другого белка трансмембранной сигнальной системы, Gial (Coleman et al., 1994). Структуры оказались практически идентичными с полученными для а-субъединицы трансдуцина (Noel et al., 1993; Sondek et al., 1994) за исключением того, что Argl78 в молекуле Gjal (аналог Argl74 Gta) не контактирует со связанным нуклеотидом. Наиболее важной для понимания механизма авторы называют структуру Gjal-GDP-A1F4", поскольку тот факт, что A1F4" активирует ингибированную связанным GDP Gial, показывает, что A1F4" действительно может замещать и

Рис. 11. Связывание A1F4" в активном центре Gictl (слева) и модель переходного состояние гидролиза GTP (справа) (Coleman et al., 1994). имитировать у-фосфат GTP, то есть комплекс GDP-A1F4" служит хорошей моделью переходного состояния. На основании трехмерных структур мутантных форм Gial с заменами Q204L и R178K было показано, что эти консервативные остатки не участвуют в катализе в основном состоянии, но после сильной реориентации в активном центре становятся критически важными для стабилизации переходного состояния. Аналогичный результат был получен для Glnól белка Ras (аналога Gln204 в Gial) (Prive et al., 1992). Предложенный Coleman et al. ( 1994) механизм гиролиза (рис. 11) практически не отличается от механизма линейной атаки нуклеофила на у-фосфат с прямым переносом протона (Sondek et al., 1994), однако говорит о более ассоциативной природе переходного состояния, поскольку ключевой остаток Agrl78 нейтрализует возникающий в нем отрицательный заряда только на у-фосфате. Тот факт, что остатки Gln204 и Argl78 взаимодействуют с нуклеотидом только в переходном состоянии гидролиза подтверждает механизм катализа с участием субстрата, так как наличие положительного заряда около у-фосфата в основном состоянии имело бы антикаталитический эффект (Schweins et al., 1995).

Обобщая имеющиеся на сегодняшний день структурные данные, очевидно, что укладка активного центра, отвечающего за гидролиз GTP, высококонсервативна во всем семействе G- белков, несмотря на многообразие выполняемых ими функций. Ядром структуры является гуаниннуклеотид-связывающий домен, состоящий из 200 аминокислотных остатков и представляющий собой шестислойный Р-лк-ст, окруженный а- спиралями. Пять петель этого домена (G1-G5), которые формируют активный центр, являются самыми консервативными элементами структуры. Дифосфат-связывающая петля (G1 или Р-петля) имеет характерную аминокислотную последовательность GXXXXGK(S/T) и взаимодействует с а- и Р- фосфатами GTP. Петля G2 содержит консервативный остаток Thr, отвечающий за координацию катиона Mg2+ и молекулы воды - предполагаемого нуклеофила. Петля G3 с фрагментом DXXG обеспечивает связывание иона магния и у-фосфата, а также содержит важный для гидролиза аминокислотный остаток (аналог Glnól в Ras). Гуаниновое кольцо связывается, в частности, последовательностью гидрофобных или неполярных остатков (N/T)(K/Q)XD из G4. Петля G5 содержит участок узнавания гуанинового основания (T/G)(C/S)A. (Bourne et al., 1991; Sprang, 1997). Механизм действия GTPa3 до сих пор нельзя считать окончательно изученным - остается открытым вопрос о природе переходного состояния и способах его стабилизации. Вероятно, G-белки используют смешанный тип катализа, в котором присутствуют черты и ассоциативной) и диссоциативного механизмов . Рассмотренные ферменты не являются * высокоэффективными гидролазами, и вызывает интерес механизм их активации специфическими GAP-белками, который, возможно, также универсален. Наиболее активны GTPa3bi а-субъединиц гетеротримерных G-белков, что можно объяснить собственной внутримолекулярной активацией также по механизму «аргининового пальца» - роль активатора играет характерный спиральный домен, отсутствующий в других ферментах G-семейства.

АТРазы Моторные белки

Подвижность - одна из характерных особенностей многих живых организмов ^ включает перевод химической энергии в механическую. В настоящий момент известно три основных класса молекулярных моторов: миозин, кинезин и динеин. Из них наиболее распространенным является миозин, играющий структурную и ферментативную роль в мышечном сокращении и внутриклеточной подвижности.

Кинезин - основной представитель связанных с микротрубочками моторных белков, обеспечивающих транспорт везикул и клеточных органелл.

Миозин состоит из двух тяжелых цепей и двух пар легких цепей, его молекула весьма асимметрична и представляет собой две глобулярные головки, прикрепленные к V длинному хвосту. В головке (субфрагмент S1) содержатся центры связывания АТР, актина и двух легких цепей. Каждая глобулярная головка миозина, полученная ограниченным протеолизом, содержит фрагмент тяжелой цепи и две легкие цепи, не участвующие в гидролизе АТР. Трехмерная структура субфрагмента S1 миозина грудных мышц цыпленка была получена методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 2,8 Ä (Rayment et al., 1993). Во вторичной структуре S1 доминируют а-спирали. Часть молекулы, в которой связываются актин и молекула нуклеотида, имеет сложную укладку сегментов вторичной структуры, сконцентрированных в основном вокруг большого структурного мотива - семислойного ß- листа. Центральный слой соответствует связывающему мотиву слой-петля-слой с последовательностью GESGAGKT, консервативной в фосфат-связывающей петле как семейства G-белков, так и других нуклеотид-связывающих ферментов (Smith and Rayment, 1996). Спираль Lys 185-Ile 199 - основа нуклеотид-связывающей полости. ц

Для понимания механизма гидролиза АТР миозином, большой интерес^ представляют структуры S1 в комлексе с MgADP, полученные в присутствии фторидов бериллия и алюминия с разрешением 2,0 и 2,6 Ä соответственно (Fisher et al., 1995). Предполагается, что комплекс MgADP-BeFx имитирует структуру комплекса с АТР, а структура MgADP-AlF4" аналогична переходному состоянию гидролиза.

Общая структура лучше разрешенного комплекса Sl-MgADP-BeFx оказалась очень близкой к описанной ранее структуре моторного домена миозина (Rayment et al., 1993). Отмечается малое количество специфических контактов белка с пуриновым кольцом, что объясняет способность миозина использовать в качестве субстрата не только АТР, но и другие нуклеотиды и органические трифосфаты. Связывание а- и ß-фосфатных групп в структурах с ионами бериллия и алюминия очень сходно, но наблюдается значительная разница в координации фторида металла, а- и ß-фосфаты нуктеотида и фторид металла располагаются в узком туннеле, образованном фосфат-связывающей петлей (остатки Glyl79 - Vall87) с одной стороны и остатками Asn233-Gly240 с другой. Ион Mg2+ находится в вершине туннеля практически в октаэдрическом окружении и играет ключевую роль в связывании нуклеотида взаимодействиями с ß-фосфатом и BeF . Mg2+ также координирован двумя белковыми лигандами - гидроксилами боковых цепей Thrl 86 и Ser237, а также двумя молекулами воды, которые также входят в координационную систему Нуклеотида. Одна из них образует водородные связи с карбоксилом боковой цепи Asp454 и атомом F" BeFx, а другая взаимодействует с карбонйлом главной цепи Asn235 и атомом кислорода Р-фосфата. Координация иона Be соответствует трем лигандам F", но отличить их от анионов ОН" не представляется возможнйм. Геометрия катиона Be и предсказанные длины связей соответствуют приблизительно тетраэдрическому BeF30, соответствующему у-фосфату в молекуле АТР. В структуре были обнаружены три высокоупорядоченные молекулы воды, расположенные в области связывания у-фосфата. Одна из них образует короткую водородную связь с одним из атомов F" и находится строго напротив псевдомостикового кислорода Р-фосфата. Предполагается, что гидролиз АТР идет по механизму SN2 замещения и эта молекула воды выступает в качестве нуклеофила, атакующего у-фосфат.

В структуре Sl-MgADP-AIF4' в области связывания у-фосфата находится катион алюминия в октаэдрическом окружении. Один из лигандов - атом кислорода Р-фосфата, четыре других лежат в плоскости и представляют собой анионы F", положение молекулы Н20, аксиальной псевдомостиковому атому кислорода, не определено, но, вероятнее'всего, соответствует описанному выше. Длина связи с псевдомостиковым кислородом в комплексе с алюминием значительно больше, чем в комлексе с бериллиём, что позволяет одному из атомов фтора A1F4" образовать водородную связь с NH-группой главной цепи остатка Gly457, консервативного в семействе миозинов. Авторы считают, что структура Sl-MgADP-AlF4~ имитирует переходное состояние реакции Гидролиза, как это уже предполагалось для Gta и Gjal (Sondek et al., 1994, Coleman et al., 1994). Изучение зоны предполагаемого связывания у-фосфата не выявило аминокислотных остатков активного центра, которые могли бы выступать в

Ser 236

Ser 236

Р—AIMP О

Рис. 12. Предполагаемая модель гидролиза АТР миозином с переносом протона через

Ser236 (Fisher et al., 1995). качестве обобщенного основания и активировать атакующую молекулу воды. В соответствии с этим, предлагается механизм, в котором молекула воды Действует как нуклеофил с прямым переносом протона на у-фосфат, а каталитическое действие белка заключается в стабилизации переходного состояния гидролиза, что соответствует механизму катализа с помощью субстрата, предложенного для p21Ras и Gta (Schweins et al., 1995; Sondek et al., 1994). В альтернативном механизме гидролиза полагается, что один из остатков Ser из области связывания у-фосфата мог бы участвовать в обмене протонами, но не в качестве каталитического основания (рис. 12). Возможным кандидатом для переноса протона называется Ser236. В обеих исследованных структурах его боковая цепь связана с ионом F" и расположена подходящим образом для взаимодействия с нуклеофилом.Этот механизм мог бы обеспечить лучшую стереохимию переноса протона на у-фосфат, чем в случае прямого переноса.

Корректность рассмотрения комплекса Sl-MgADP-AlF4" как аналога переходного состояния в гиролизе АТР миозином была подтверждена в работе Smith and Rayment (1996). Ими была получена с разрешением 1,9 Ä трехмерная структура S1 в комплексе с V043", который является более точным аналогом фосфата в переходном состоянии. Ортованадат - мощный ингибитор многих ферментов, катализирующих перёнос фосфорильной группы, так как очень схож по размеру и заряду с неорганическим фосфатом, способен увеличивать координационную сферу до пяти лигандов и обладает пластичностью в длинах связей, что позволяет ему принимать координацию тригональной бипирамиды, соответствующую конформации фосфатной группы в переходном состоянии, предполагаемом для реакции переноса фосфорила. Структура Sl-MgADP-V04 оказалась практически идентичной структуре со фторидом алюминия (Fisher et al., 1995), несмотря на лишний лиганд и другую конформацию атома AI, и имеет практически те же отличия от структуры со фторидом бериллия (Fisher et al., 1995). Из этого следует, что структуры основного и переходного состояния реакции гидролиза АТР различаются только длиной связи Р-0 между у-фосфором и мостиковым кислородом. Однако, это не дает ответа на вопрос о диссоциативной или ассоциативной природе переходного состояния.

Молекула кинезина содержит две одинаковые цепи с глобулярным моторным доменом на N-концах, образующие димер путем переплетения центральных спиральных областей. В литературе описаны трехмерные структуры моторных доменов некоторых представителей семейства кинезинов в комплексе с ADP (Kuli et al., 1996; Sablin et al., 1996; Kozielski et al., 1997; Sack et al., 1997). Несмотря на отсутствие гомологии аминокислотных последовательностей, обнаруживается большое сходство вторичной структуры каталитических доменов кинезина и миозина. Центральную часть структуры кинезина занимает ß-лист, состоящий из восьми слоев и окруженный шестью а-спиралями - по три с каждой стороны. Очень схоже окружение области с характерными участками NXXSSR и DXXGXE, в которой связывается у-фосфат субстрата, причем не только между кинезином и миозином, но и с G-белками (Sack et al., 1999). В структуре кинезина также присутствует консервативная последовательность GXXXGKS/T фосфат-связывающей петли, взаимодействующей с а- и ß- фосфатами субстрата (Smith and Rayment, 1996). Механизм катализа ферментами семейства кинезина пока не известен.

Fj-АТРаза

АТР-синтаза (F,F0-ATPa3a) - центральный фермент в превращении энергии в митохондриях, хлоропластах и бактериях. Он использует трансмембранную разность протонного потенциала для синтеза АТР из ADP и фосфата. Его мультисубъединичный комплекс состоит из глобулярного домена F, и мембранного домена FQ, связанных ножкой. F, имеет почти сферическую форму и содержит каталитические центры связывания субстратов. Энергия протона от F0 передается на каталитический домен, вероятно, путем конформационных изменений ножки. Для синтеза одной молекулы АТР через мембрану должны пройти не менее трех протонов (Weber and Senior, 1997).

F, содержит пять различных типов субъединиц: три а, три ß и по одной у, 5 и е. В отсутствие FQ F, проявляет только гидролазную активность. Каталитические центры находится в ß-субъединицах, причем работают высококооперативно; а- субъединицы связывают нуклеотид в некаталитических центрах (Weber and Senior, 1997; Boyer, 1997). Abrahams et al. (1994) определили трехмерную структуру F,-ATPa3bi митохондрий сердца быка методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 2,8 А в присутствии негидролизуемого аналога АТР (ADPNP) и ADP. а- и р-Субъединицы имеют почти идентичную структуру и уложены поочередно вокруг а-спирального домена у-субъединицы. Их структура состоит из N-концевого шестислойного Р-барреля, центрального а-Р-домена, содержащего центр связывания нуклеотида, и С-концевого пучка семи и шести спиралей соответственно. Нуклеотид-связывающий домен представляет собой ß-лист, содержащий девять слоев и ассоциированный с девятью а-спиралями. АТР связывается в обеих субъединицах одинаково, за исключением аденозиновой части. Центры связывания нуклеотида располагаются в зоне контакта а-и ß-субъединиц. Каталитические центры располагается преимущественно в ß-субъединицах с небольшим вкладом боковых цепей остатков а-субъединиц. В некатали'гйчееких центрах связывания АТР ситуация обратная. Общая структура F,-АТРазы оказалась сильно асимметричной: каждая ß-субъединица принимает различную ориентацию относительно соответствующей а-субъединицы, участвующей в образовании ее активного центра. Таким образом, в кристалле активные центры ß-субъединиц находятся в разных конформациях и содержат различные нуклеотиды: ßTp, как и все а-субъединицы, содержит ADPNP, ßDp содержит ADP, a ßE имеет незаполненный активный центр и нарушенную конформацию. В соответствии с этим, предполагается, что кристаллическая структура отвечает одному из предполагаемых состояний циклического механизма переменного связывания (Abrahams et al., 1994). Наиболее важные остатки, отвечающие за связывание полифосфатной группировки субстрата, находятся в фосфат-связываюгцей петле, содержащей характерный мотив GXXXXGKT/S, наблюдаемый в соответствующих участках структур всех рассмотренных выше ферментов. Катион Mg2+ координирован двумя фосфатами и остатком Thrl>63. В ртр-субъединице обнаружена молекула воды, расположенная в подходящей геометрии для линейной нуклеофильной атаки на у-фосфат. Эта вода образует водородную связь с карбоксилатом ß-Glul88, являющегося, таким образом, ее возможным активатором. Гуанидиновая группа a-Arg373 может стабилизировать отрицательный заряд, возникающий на концевой фосфатной группе в пентаковалентном переходном состоянии. Необходимость Arg373 для катализа также подтверждает тот факт, что изолированные ß-субъединицы неактивны. Аналогичная укладка боковых цепей остатков Glu и Arg уже отмечалась в структуре активного центра трансдуцина (Noel et al., 1993). Структура и предположенный механизм катализа дает объяснение отсутствию каталитической активности в центрах связывания АТР в а-субъединицах: в них отсутствует пространственный эквивалент остатка Glul88, замененного на Gln208 с боковой цепью, повернутой в сторону от у-фосфата. Наиболее значительным различием структур активного центра ßTP- и ß^-субъединиц оказался сдвиг oc-Arg373 к ß-фосфату в случае ßDp. Это позволило предположить важную роль Arg373 в передаче конформационных изменений между активными центрами в циклическом механизме действия фермента (Weber and Senior, 1997).

Ключевая каталитическая роль отводится остатку Glul88 и в обратной реакции синтеза АТР из ADP и фосфата (Bianchet et al., 1998). Авторы получили трехмерную

Рис. 13. Схема связывания нуклеотида ß- субъединицей F,- АТРазой (Bianchet et al., 1998). структуру Fj-АТРазы печени крысы, закристаллизованную в присутствии более высоких концентраций АТР и Pi, но в отсутствие магния. В отличие от структуры Abrahams et al. (1994) все ß-субъединицы содержали связанный нуклеотид, а две из них еще и связанную молекулу фосфата, и находились в сходной конформации. Структуры активного центра в обеих работах практически одинаковы. Важным для катализа фактом оказалось наличие водородной связи между между остатком Glul88 и атомом кислорода фосфата, связанного вместе с ADP. Авторы считают, что Glul88 является вероятным кандидатом на прямое участие в синтезе АТР, в котором он предоставляет протон, необходимый для удаления воды (рис. 13). Соответственно, в реакции гидролиза он, как указывалось ранее (Abrahams et al., 1994), мог бы быть каталитическим основанием.

Следует, однако, заметить, что на оновании анализа множества экспериментальных данных, собранных для F,-ATPa3bi, Weber and Senior (1997) считают участие общеосновного катализатора в работе АТР не доказанным окончательно. Возможно, основной вклад в катализ вносит энергия множественных взаимодействий белка с субстратом.

В заключение, следует отметить, что структуры активных центров ферментов, катализирующих фосфогидролазные реакции с участием нуклеотидов, имеют ряд общих черт, что, по-видимому, является следствием сходства механизмов катализа. Все эти ферменты используют в катализе один ион Mg2+ на молекулу субстрата и не образует ковалентные интермедиаты. Предложено много вариантов механизма действия этих ферментов, однако, на настоящий момент трудно сделать выбор между ними.

39

Большинство авторов считают, что ферментативный перенос фосфорильной группы на молекулу воды протекает по ассоциативному механизму через образование пентаковалентного переходного состояния. Функция фермента заключается в снижении энергетического барьера реакции и стабилизации интермедиата путем нейтрализации отрицательного заряда, возникающего на атакуемой нуклеофилом молекуле фосфата. Однако, нельзя исключить и диссоциативный механизм, в котором фермент ослабляет связь переносимого фосфорильного иона с уходящей группой. Вероятно также, что катализ является смешанным и ему присущи черты обоих механизмов.

Для эффективного катализа важна точная координация субстратов группами активного центра, обеспечивающая правильную геометрию для атаки молекулы воды на субстрат, а также, возможно, активирующая нуклеофил и увеличивающая электрофильность атакуемого фосфата. Важная роль в связывании субстрата отводится катиону магния, необходимому для катализа. Его возможные функции включают экранирование отрицательного заряда на атакуемом у-фосфате, увеличение кислотности уходящей группы ф-фосфата) или активацию нуклеофила, а также стабилизацию переходного состояния реакции.

Пирофосфатаза является наиболее эффективной из рассмотренных фосфогидролаз. Механизм ее действия, по-видимому, существенно отличается, и участие в катализе 3-4 ионов М§2+ на молекулу субстрата является одним из проявлений этого.

Экспериментальная часть

1. Материалы

В работе использованы трис, TES, TAPS, CHfES, PIPES, MES, EGTA, краситель метиловый зеленый, аденозин-5-фосфосульфат, Тритон Х-305, фторид натрия фирмы "Sigma" (США), пирофосфат натрия (Na4P207-10H20), ортофосфорная кислота фирмы "Fluka" (Швейцария), хлорид магния (MgCl2-6H20) фирмы "Fisher" (США). Остальные реактивы были отечественного производства квалификации не ниже "х.ч.".

Запасные растворы готовили по навескам. Составы буферных растворов приведены в табл. 1. В работе использовали, в основном, цвиттерионные буферы, поскольку было показано, что традиционные буферные системы на основе аминоспиртов (например, трис-HCl) могут оказывать существенное влияние на каталитические свойства пирофосфатазы (Baykov et al., 1999b). Требуемые величины pH устанавливали добавлением гидроксида калия, а в случае трис - соляной кислоты.

Таблица 1. Состав буферных систем. pH Буфер р/С (25°) Основной компонент, M KCl, M EGTA, мкМ

4,8 Уксусная кислота/ КОН 4,7 0,020 0 100

5,5 MES/KOH 6Д 0,063 0,037 100

6,3 PIPES/KOH 6,8 0,040 0 100

7,2 г. TES/KOH 7,4 0,083 0,017 . 50

8,5 TAPS/KOH 8,4 0,090 0 5

9,3 CHES/KOH 9,5 0,100 0 1 0

ЕОТА связывает Са2+ и ионы других металлов, являющихся ингибиторами пирофосфатазы, но в использованных концентрациях практически не связывает ионы Mg2+. Запасные растворы фосфата готовили из фосфорной кислоты, подвергнутой кипячению в течение 3 ч для удаления полифосфатов, нужное значение рН устанавливали гидроксидом калия. Все растворы готовили на деионизованной воде с удельным сопротивлением не ниже 10 МОм-см. Приведенные значения рН буферных растворов соответствуют температуре 25°, при которой проводились все измерения.

ГОСТДАРСТ

2. Ферменты

Использованные в данной работе пирофосфатазы были предоставлены проф. Лахти (Университет г. Турку, Финляндия). Пирофосфатаза дрожжей и ее мутантные формы (Heikinheimo et al., 1996b), а также мутантные формы пирофосфатазы Е. coli (Lahti et al., 1990). были получены экспрессией соответствующих генов в Е. coli. Белки хранили в виде замороженных растворов при -50°. Необходимые для эксперимента порции белка размораживали при комнатной температуре и хранили при 4° в течение, по меньшей мере, недели без существенной потери активности. Запасные растворы ферментов готовили на буфере трис/HCl, pH 7,2, содержавшем 2 мМ Mg2+ для стабилизации белка. Концентрации растворов пирофосфатаз определяли спектрофотометрически, на основании молекулярной массы субъединицы 32 кДа (Cohen et al., 1978) и удельного коэфициента поглощения А1%28о= 14,5 (Kunitz, 1952) в случае пирофосфатазы дрожжей, и, соответственно, 20 кДа (Josse, 1966а) и А1%280 =

11,8 (Wong et al., 1970) в случае пирофосфатазы Е. coli.

Люцифераза и АТР-сульфурилаза, использованные для определения пирофосфата, были от фирмы "Sigma" (США).

3. Определение активности пирофосфатазы В

Гидролазную активность фермента определяли на автоматическом анализаторе фосфата непрерывным методом (Baykov & Avaeva, 1981), основанным на непрерывном отборе порций реакционной среды, смешивании их с растворами молибдата аммония и красителя метилового зеленого и регистрации светопоглощения смеси проточным фотометром при 660 нм. Определение начальных скоростей гидролиза PPi проводили при чувствительности прибора от 3 до 40 мкМ Pi на шкалу самописца. Реакционная смесь объемом 10-25 мл находилась в термостатируемом сосуде и содержала буфер, MgCh и PPi в количествах, необходимых для создания требуемых концентраций свободных ионов Mg2+ и комплекса Mg2PPi или сумм комплексов MgPPi и Mg2PPi. Реакцию начинали прибавлением фермента. Скорость реакции определяли по начальному наклону кривых накопления фосфата. В большинстве случаев процесс протекал линейно в течение всего наблюдаемого отрезка времени.

42

Синтетазную активность фермента, а также количество связанного с белком PPi в условиях равновесия реакции PPi <-» 2Pi измеряли с помощью сопряженной ферментной системы, содержавшей АТР-сульфурилазу и аденозин-5'-фосфосульфат для перевода образующегося PPi в АТР и люциферазу для регистрации количества ATP (Nyren & Lundin, 1985; Baykov et al., 1990, Fabrichniy et al., 1997a). Для измерения люминесценции использовали люминометр 1250 (LKB, Швеция).

Для определения количества связанного с белком PPi реакционную смесь (50 мкл), содержавшую РРазу, MgCb и Pi и соответствующий буфер инкубировали при 25° в течение 5 мин для установления равновесия, инактивировали фермент добавлением 10 мкл 5 M трифторуксусной кислоты, выдерживали при комнатной температуре около 5 мин и центрифугировали 2 мин при 5000g. Аликвоту супернатанта объемом 5 мкл помещали в кювету с 0,3 мл смеси для определения пирофосфата и измеряли люминесценцию. Чувствительность составляла 15-80 мкМ PPi на шкалу самописца и контролировалась по раствору PPi известной концентрации в каждом измерении. Смесь для определения PPi готовили смешиванием 6 мл буфера Трис/НС1 (0,2 М, рН 8,0), содержавшего 1 мМ DTT, 0,8 мг/мл BSA и 30 мкМ EGTA, 40 мкл раствора АТР-сульфурилазы (67 Е/мл), 200 мкл раствора люциферин/люциферазного реагента и 60 мкл 1 мМ раствора аденозин-5-фосфосульфата.

Синтетазную активность пирофосфатазы при рН 7,2 и 8,5 определяли непрерывным методом, регистрируя скорость образования АТР во времени при чувствительности 70-150 мкМ PPi на шкалу. Реакционная смесь объемом 0,2 мл помимо РРазы, MgCb, Pi и соответствующего буфера содержала люциферазу, АТР-сульфурилазу и аденозин-5'-фосфосульфат, а также BSA и DTT для их стабилизации. Концентрация АТР-сульфурилазы была подобрана так, чтобы скорость конверсии PPi в АТР превышала скорость образования PPi не менее чем в 20 раз. В связи с нестабильностью люциферазы при рН 6,3 и 9,3 ее не включали в состав инкубационной среды. В этом случае через определенные промежутки времени отбирали аликвоты, останавливали реакцию трифторуксусной кислотой и измеряли количество АТР при помощи люциферазной реакции при рН 8,0.

Обмен атомов кислорода между фосфатом и водой измеряли, используя фосфат, содержащий > 98% 180 (Baykov et al., 1990). Реакцию проводили в условиях, аналогичных используемым для измерения количества связанного с белком PPi.

43

Количество каждого изотопомера [180]Pi в реакционной смеси определяли масс-спектрометр ически. Автор выражает благодарность В. Н. Кашо (университет г. Лос-Анжелеса) за проведение масс-спектрометрического анализа образцов.

4. Расчет общих концентраций ионов Mg2"1", пирофосфата и фосфата

Общие концентрации MgCb, PPi и Pi, необходимые для создания требуемых концентраций свободных ионов Mg2+ и субстратов (Mg2PPi и MgPi), расчитывали на основании констант равновесий в системах PPi-Mg2+-K+ и Pi-Mg2+, приведенных в табл. 2, по уравнениям 1-3.

Mgt - [Mg2+] + £A2[Mg2PPi]/[Mg2+] + ^AS^PPiJ/tMg2"]2 PPit = [Mg2PPi](l+ KJ[M.£+] + i:A1^A2/[Mg2+]2) Mgt = [Mg2+](l+Pit/(rB+[Mg2+]))

При расчетах общей концентрации Mg2+ в экспериментах по ингибированию пирофосфатазы фторид-ионом учитывали образование комплекса MgF (Ка = 48 шМ; Aziz &Lyle, 1969).

Таблица 2. Величины pH-зависимых констант диссоциации комплексов Mg2+ с PPi и Pia. pH £ai6 (ЦМ) К J (шМ) Квв (mM)

4.8 4.47 463 148

5.5 1.74 53.8 80

6.3 0.477 8.87 26

7.2 0.1123 2.84 8.5

8.5 0.0102 2.04 6.1

9.3 0.00444 2.01 6.0

10.0 0.00356 2.00 6.0 а Определения параметров: Км = [Mg][PPi]t/[MgPPi]t; К^ = [Mg][MgPPi]t/[Mg2PPi]; Кв = [Mg][Pi]t /[MgPi]t. 6 Расчитаны по литературным данным (Baykov et al., 1993). в Расчитаны на основании величины, полученной для pH 7,2 (Smirnova et al., 1989) в предположении, что при pH >5,5 присутствует только форма MgHPO^ при pH <5,5 учитывали образование формы MgH^PO/ с константой диссоциации 190 мМ (Childs, 1970).

1) (2) (3)

44

5. Математическая обработка результатов

Обработку экспериментальных зависимостей проводили при помощи программ нелинейного регрессионного анализа DNRP-54 (Duggleby, 1984), "Scientist" (MicroMath) и "Sigmaplot" (Jandel Scientific).

45

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

1. Анализом ингибирования пирофосфатазы дрожжей фторид-ионом и измерением констант скорости элементарных стадий катализа обнаружена неизвестная ранее стадия в каталитическом цикле, представляющая собой изомеризацию комплекса фермент-пирофосфат.

2. Установлен механизм синкаталитического ингибирования пирофосфатазы дрожжей фторид-ионом. Показано, что мишенью для него служат два каталитических интермедиата: комплекс фермент-фосфат, связывающий ингибитор быстро, и один из двух комплексов фермент-пирофосфат, связывающий его в минутной шкале времени.

3. Анализом ингибирования шести мутантных форм фермента фторид-ионом показано, что он, вероятнее всего, замещает молекулу воды, связанную с двумя ионами металла и остатком Аэр 117 в активном центре. Этот результат подтверждает гипотезу, что эта молекула воды является нуклеофилом в реакции гидролиза пирофосфата.

4. Показано, что скорость-лимитирующей стадией в гидролизе пирофосфата при рН < 5,5 является изомеризация фермент-субстратного комплекса, контролируемая группой фермента с рКа >7,1. Падение активности пирофосфатазы в щелочной среде связано с депротонированием группы фермента, не существенной для катализа.

99

Заключение

Приведенная ниже схема, показывающая ионизацию промежуточных соединений в катализе РРазой, суммирует полученные данные (числа у стрелок обозначают величины р/4).

Схема катализа Y-РРазой h н2м2е -X H2M2E*MnPPi • k2

П 8,8 П >7,1

Kes кг hi нм2е HM2E*M„PPi ^ HM2EM„PPi * HM2EMn(Pi)2 ^ м2е п 8,2 м2ем„РР; ->

Наиболее важным результатом работы является обнаружение не известной ранее стадии в каталитическом цикле Y-РРазы - изомеризации фермент-субстратного комплекса. Равновесие E*Mn+2PPi <-» EMn+2PPi зависит от рН и в кислой области сдвигается влево. Этот процесс связан с протонированием группы с рКа >7,1, относящейся к комплексу E*Mn+2PPi. Это означает также, что в комплексе EMn+2PPi рКа этой группы существенно ниже и в нейтральной среде она, в основном, депротонирована. Весьма вероятно, что этой группой является молекула воды. Wat 1, связанная с ионами металла М1 и М2 и остатком Aspl 17 и являющаяся наиболее вероятным нуклеофилом при гидролизе PP¡. В таком случае изомеризация фермент-субстратного комплекса имеет вполне конкретную функцию - она облегчает превращение этой молекулы воды в гидроксид-ион и таким образом увеличивает ее нуклеофильность. По-видимому, изомеризация происходит в результате существенных конформационных перестроек в области активного центра, судя по тому, что ее скорость невелика, особенно, в кислой среде.

Если сказанное выше верно, то замена незаряженной Watl в комплексе E*Mn+2PPi на отрицательно заряженный ион фтора должна происходить значительно легче, чем замена отрицательно заряженного гидроксид-иона в комплексе EM„+2PPi.

Это, вероятнее всего, и объясняет различную связывающую способность двух фермент-субстратных комплексов по отношению к фторид-иону.

Таким образом, падение активности РРазы в кислой среде вызвано тем, что изомеризация фермент-субстратного комплекса в активную для гидролиза конформацию становится скорость-лимитирующей стадией катализа, что связано с протонированием группы с рКа >7,1. Падение активности РРазы в щелочной среде объясняется депротонированием кислотной группы фермента с р« 8,8. Ио-видимому, эта группа не несет конкретной каталитической функции и важна для поддержания общей структуры фермента, поскольку ее депротонирование приводит к падению скоростей сразу нескольких стадий катализа.

Изучение свойств мутантны'х пирофосфатаз с заменами аминокислотных остатков, участвующих в формировании центра связывания предполагаемого нуклеофила, показало ключевую каталитическую функцию катионов металла в центрах высокого сродства М1 и М2. Мутации их лигандов привели к максимальному "ухудшению" каталитических свойств РРазы, а также к неспособности комплексов мутантных ферментов с РР1 связывать фторид-ион. Очевидно, ионы металла М1 и М2 абсолютно необходимы для фиксации молекулы воды в правильной позиции для нуклеофильной атаки и, возможно, также для ее активации. Несмотря на существование связи Азр117-\Уа1:1 в природной РРазе, 17Е-РРаза мало отличается от нее по свойствам. Это говорит о том, что роль Азр117 в активации нуклеофильной молекулы воды невелика по сравнению с ролью ионов металла. !

Механизм ингибирования пирофосфатазы фторид-ионом, установленный в этой работе, подтверждает предположение, что Б" замещает нуклеофильную молекулу воды в активном центре и хорошо согласуется со структурными данными, полученными ранее. Его ключевым свойством является то, что две протекающие в разной шкаде времени стадии связывания фторида являются бимолекулярными и относятся к разным интермедиатам на каталитическом пути реакции. Тот факт, что ингибирование происходит синкаталитически означает, что центр связывания нуклеофила окончательно формируется только после связывания РР1 в активном центре. Это подтверждается сравнением трехмерных структур апофермента (Капкаге е! а1., 1996)) и комплекса РРазы с фосфатом (ТМктЬето е1 а1., 1996а), показывающим значительные изменения структуры активного центра, в частности сближение металлов М1 и М2, после связывания субстрата, в результате чего удаляется одна из двух молекул воды, связанных с каждым ионом металла, а вторая (\Vatl) становится мостиковой между ними. По-видимому, \Vatl связывается достаточно прочно, и замещение молекулы воды фторид-ионом происходит медленно, при этом связывание Б" электростатически затрудняется карбоксильной группой Азр117. Молекула \Vatl необходима на каталитической стадии гидролиза, поэтому комплекс фермента с РР1 и Б" является тупиковым. После гидролиза РР1 и удаления первой молекулы Р1 активный центр, вероятно, принимает "релаксированную" структуру с двумя вакантными позициями молекул воды, которые занимаются ионами Р на быстрой стадии ингибирования. Возможно, речь идет об одном центре связывания, относящемся к разным комплексам фермента - с одной и двумя молекулами Р1. В таком случае, связывание Б" с комплексом фермент-(Р1)2 более затруднено, особенно при повышении рН. Как следует из ненулевой величины начальной скорости при ее аппроксимации к бесконечной концентрации фторида, связывание Р на быстрой стадии не приводит к полному блокированию гидролитической реакции, что подтверждает замещение ингибитором нуклеофильной воды, которая играет ключевую роль только на стадии гидролиза, но не так важна при удалении продуктов реакции. С другой стороны, взаимодействие с фторид-ионом на быстрой стадии все же ведет к весьма значительному падению гидролитической активности РРазы, поэтому можно предположить, что Б' быстро и обратимо связывается также на месте другой молекулы воды, существенной на стадиях освобождения продукта, например протонирующей молекулу Р1 В таком случае, именно влияние этого взаимодействия приводит к падению начальной скорости в реакции гидролиза. В обратной реакции может быть необходимо наличие воды в обеих этих позициях, и это может также служить возможным объяснением обнаруженного влияния двух фторид-ионов на реакцию синтеза.

98

1. Аваева, С.М., Назарова, Т.И. (1985) Структура и особенности функционированиянеорганической пирофосфатазы пекарских дрожжей. Усп. биол. хим., 26, 42-63.

2. Арутюнян, Э.Г., Оганесян, В.Ю., Оганесян, Н.Н., Терзян, С.С., Попов, А.Н.,

3. Рубинский, С.В., Вайнштейн, Б.К., Назарова, Т.П., Курилова, С.А., Воробьева, Н.Н., Аваева, С.М. (1996) Структура неорганической пирофосфатазы Е. coli и ее комплекса с ионом Мп2+ при разрешении 2.2 А. Кристаллография, 41, 84-96.

4. Курилова, С.А., Богданова, А.В., Назарова, Т.И., Аваева, С.М. (1984) Изменениеактивности неорганической- пирофосфатазы из Е. coli при взаимодействии с ионами магния, цинка, кальция и фтора. Биоорган, химия, 10, 1153-1160.

5. Разников, А.В., Егоров, Т.А., Миргородская, О.В., Склянкина, В.А., Аваева, С.М. (1992) Функционально важные остатки глютаминовой кислоты в пирофосфатазе Е. coli. I. Химическая модификация и локализация в первичной структуре. Биохимия, 57, 1902-1912.

6. Склянкина, В.А., Суранова, Е.Д., Аваева, С.М. (1975) Лизин в активном центренеорганической пирофосфатазы из дрожжей. Биоорган, химия, 1, 1352-1356.

7. Смирнова, И.Н., Байков, А.А. (1983) Двухстадийный механизм ингибирования неорганической пирофосфатазы фторид-ионом. Биохимия, 48, 1643-1653.

8. Терзян, С.С., Воронова, А.А, Смирнова, Е.А., Куранова, И.П., Некрасов, Ю.В.,

9. Арутюнян, Э.Г., Вайнштейн, Б.К., Хене, В., Хансен, Г. (1984) Пространственная структура неорганической пирофосфатазы дрожжей при разрешении 3 А . Биоорган, химия., 10, 1469-1482.

10. Abrahams, J.P., Leslie, A.G.W., Lutter, R., Walker, J.E. (1994) Structure at 2.8 A resolution of Fi-ATPase from bovine heart mitochondria. Nature, 370, 621-628.

11. Avaeva, S., Ignatov, P., Kurilova, S., Nazarova, Т., Rodina, E., Vorobyeva, N., Oganessyan, V., Harutyunyan, E. (1996a) Escherichia coli inorganic pyrophosphatase: site-directed mutagenesis of the metal binding sites. FEBS Lett., 399, 99-102.

12. Avaeva, S., Kurilova, S., Nazarova, Т., Rodina, E., Vorobyeva, N., Sklyankina, y.,

13. Grigorjeva, O., Harutyunyan, E., Oganessyan, V., Wilson, K., Dauter, Z., Huber, R., Mather, T. (1997) Crystal structure of Escherichia coli inorganic pyrophosphatasecomplexed with S042'. FEBS Lett. ,410, 502-508.

14. Avaeva, S.M., Rodina, E.V., Kurilova, S.A., Nazarova, T.I., Vorobyeva, N.N. (1996b) Effect of D42N substitution in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase on catalytic activity and Mg2+ binding. FEBSLett., 392, 91-94.

15. Aziz, A., & Lyle, S. (1969) Anal. Chim. Acta 47, 49-56.

16. Baykov, A. A., Alexandrov, A. P., Smirnova, I. N. (1992) A two-step mechanism of fluoride inhibition of rat liver inorganic pyrophosphatase. Arch. Biochem. Biophys., 294, 238-243.

17. Baykov, A. A., Artjukov, A. A., Avaeva, S. M. (1976) Fluoride inhibition of inorganicpyrophosphatase. I. Kinetic studies in a Mg2+-PPi system using a new continuous enzyme assay. Biochim Biophys Acta. Biochim. Biophys. Acta 429, 982-992.

18. Baykov, A.A. & Avaeva, S.M. (1981) A simple and sensitive apparatus for continuous monitoring of orthophosphate in the oresence of acid-labile compounds. Anal. Biochem., 116, 1-4.

19. Baykov, A. A., Bakuleva, N. P., Rea, P. A. (1993) Steady-state kinetics of substratehydrolysis by vacuolar H(+)-pyrophosphatase. A simple three-state model. Eur. J. Biochem., 217, 755-762.

20. Baykov, A.A., Cooperman, B.S., Goldman, A., Lahti, R. (1999a) Cytoplasmic Inorganic Pyrophosphatase. Prog. Mol. Subcell. Biol., 23, 127-150.

21. Baykov, A. A., Hyytia, T., Turkina, M.V., Efimova, I.S., Kasho, V.N., Goldman, A.,

22. Cooperman, B.S., Lahti, R. (1999b) Functional characterization of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase in zwitterionic buffers. Eur. J. Biochem., 260, 308-317.

23. Baykov, A.A., Hyytia, T., Volk, S.E., Kasho, V.N., Vener, A.V., Goldman, A., Lahti, R.,

24. Cooperman, B.S. (1996) Catalysis by Escherichia coli inorganic pyrophosphatase: pH3 101and Mg2+ dependence. Biochemistry, 35, 4655-4661.

25. Baykov, A.A., Shestakov, A.S. (1992) Two pathways of pyrophosphate hydrolysis and synthesis by yeast inorganic pyrophosphatase. Eur. J. Biochem., 206, 463-470.

26. Baykov, A.A., Shestakov, A.S., Kasho, V.N., Vener, A.V., Ivanov, A.H. (1990) Kinetics and thermodynamics of catalysis by the inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli in both directions. Eur. J. Biochem., 194, 879-887.

27. Berchtold, H., Reshetnikova, L., Reiser, C.O., Schirmer, N.K., Sprinzl, M., Hilgenfeld, R. (1993) Crystal structure of active elongation factor Tu reveals major domain rearrangements. Nature, 365, 126-132. .

28. Bianchet, M.A., Hullihen, J., Pedersen, P.L., Amzel, L.M. (1998) The 2.8-A structure of rat liver Fi-ATPase: configuration of a critical intermediate in ATP synthesis/hydrolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 11065-11070.

29. Bourne, H.R., Sanders, D.A., McCormick, F. (1991) The GTPase superfamily: conserved structure and molecular mechanism. Nature, 349, 117-127.

30. Boyer, P.D. (1997) The ATP synthase-a splendid molecular machine. Amu. Rev. Biochem., 66, 717-749.

31. Brunger, A.T., Milburn, M.V., Tong, L, deVos, A.M., Jancarik, J., Yamaizumi, Z.,

32. Nishimura, S., Ohtsuka, E., Kim, S-H. (1990) Crystal structure of an active form of RAS protein, a complex of a GTP analog and the HRAS p21 catalytic domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 4849-4853.

33. Butler, L.G. (1971) Yeast and other inorganic pyrophosphatases. In The enzymes, vol. 4, 3rd edn. (Boyer, P.D. ed) Academic Press, New York, pp. 529-541.

34. Calvo, C. (1967)yicia Cryst. 23, 289-295.

35. Cepus, V., Scheidig, A.J., Goody, R.S., Gerwert, K. (1998) Time-resolved FTIR studies of the GTPase reaction of H-itos P21 reveal a key role for the P-phosphate. Biochemistry, 37, 10263 -10271.

36. Childs, C. W. (1970) Inorg. Chem., 9, 2465-2469.

37. Cohen, S.A., Sterner, R., Keim, P.S., Heinrikson, R.L. (1978) Covalent structural analysis of yeast inorganic pyrophosphatase. J. Biol. Chem., 253, 889-897.

38. Coleman, D.E., Berghuis, A.M., Lee, E., Linder, M.E., Gilman, A.G., Sprang, S.R.1994) Structures of active conformations of Gjai and the mechanism of GTP hydrolysis. Science, 265, 1405-1412.

39. Cooperman, B.S. (1976) The role of divalent metal ions in phosphoryl and nucleotidyl transfer. In Metal ions in biological systems, vol. 5, (Sigel, H. ed), Dekker, New York, pp. 79-125.

40. Cooperman, B.S. (1982) The mechanism of action of yeast inorganic pyrophosphatase.

41. Goldberg, J. (1999) Structural and functional analysis of the ARF1-ARFGAP complex reveals a role for coatomer in GTP hydrolysis.Cell, 96, 893-902.

42. Gonzalez, M.A., Webb, M.R., Welsh, K.M., Cooperman, B.S. (1984) Evidence that catalysis by yeast inorganic pyrophosphatase proceeds by direct phosphoryl transfer to water and not via a phosphoryl enzyme intermediate. Biochemistry, 23, 797-801.

43. Hackney, D.D. (1980) Theoretical analysis of distribution of 180.Pi species during exchange with water. Application to exchanges catalyzed by yeast inorganic pyrophosphatase. J. Biol. Chem., 255, 5320-5328.

44. Harutyunyan, E.H., Kuranova, I.P., Vainshtein, B.K., Hohne, W.E., Lamzin, V.S., Dauter, Z., Teplyakov, A.V., Wilson, K.S (1996) X-ray structure of yeast inorganic pyrophosphatase complexed with manganese and phosphate. Eur. J. Biochem., 239, 220-228.

45. Heikinheimo, P., Lehtonen, J., Baykov, A., Lahti, R., Cooperman, B.S., Goldman, A.1996a) The structural basis for pyrophosphatase catalysis. Structure, 4, 1491-1508.

46. Huang, C.Y. (1979) Derivation and initial velocity and isotope exchange rate equations. Meth. Enzymol., 63, 54-84.

47. Janson, C.A., Degani, C., Boyer, P.D. (1979) The formation of enzyme-bound andmedium pyrophosphate and the molecular basis of the oxygen exchange reaction of yeast inorganic pyrophosphatase. J. Biol. Chem., 254, 3743-3749.

48. Josse, J. (1966a) Constitutive inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli. I. Purification and catalytic properties. J. Biol. Chem., 241, 1938-1947.

49. Josse, J. (1966b) Constitutive inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli. II. Nature and binding of active substrate and the role of magnesium. J. Biol. Chem., 241, 19481955.

50. Kambara, T., Rhodes, T.E., Ikebe, R., Yamada, M., White, H.D., Ikebe, M. (1999)

51. Functional significance of the conserved residues in the flexible hinge region of the myosin motor domain. J. Biol. Chem., 21 A, 16400-16406.

52. Kaneko, S., Ichiba, T., Hirano, N., Hachimori, A. (1993) Modification of tryptophan 149 of inorganic pyrophosphatase from Escherichia coli. Int. J. Biochem., 25, 233-238.

53. Kankare, J., Neal, G.S., Salminen, T., Glumhoff, T., Cooperman, B.S., Lahti, R., Goldman, A. (1994) The structure of E. coli soluble inorganic pyrophosphatase at 2.7 A resolution. Protein Eng., 7, 823-830.

54. Kankare, J., Salminen, T., Lahti, R., Cooperman, B.S., Baykov, A.A., Goldman, A. (1996) Structure of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase at 2.2 A resolution.' Cryst, D52, 551-563.

55. Kapyla, J., Hyytia, T., Lahti, R., Goldman, A., Baykov, A.A., Cooperman, B.S. (1995) Effect of D97E substitution on the kinetic and thermodynamic properties of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase. Biochemistry, 34, 792-800.

56. Kasho, V.N. & Baykov, A. A. (1989) Two pathways for phosphate/water oxygen exchange by yeast inorganic pyrophosphatase. Biochem Biophys Res Commvn., 161, 475-480.

57. Kjeldgaard, M., Nissen, P., Thirup, S., Nyborg, J. (1993) The crystal structure of elongation factor EF-Tu from Thermus aquaticus in the GTP conformation. Structure, 1, 35-50.

58. Kornberg A. (1962) On the metabolic significance of phosphorolytic and pyrophosphorolytic reactions. In Horizons in Biochemistry (Kasha, H., & Pullman, P. eds) Academic Press, New York, pp. 251-264.

59. Kozielski, F., Sack, S., Marx, A., Thormahlen, M., Schonbrunn, E., Biou, V., Thompson, A., Mandelkow, E-M., Mandelkow, E. (1997) The crystal structure of dimeric kjnesin and implications for microtubule-dependent motility. Cell, 91, 985-994.

60. Kull, F.J., Sablin, E.P., Lau, R., Fletterick, R.J., Vale, R.D. (1996) Crystal structure of thekinesin motor domain reveals a structural similarity to myosin. Nature, 380, 550 -555.

61. Kunitz, M. (1952) Crystalline inorganic pyrophosphatase isolated from baker's yeast. J. Gen. Physiol., 35, 423-449.

62. Sulfolobus acidocaldarius inorganic pyrophosphatase: structure, thermostability, and effect of metal ion in an archael pyrophosphatase. Protein Sci., 8, 1218-1231.

63. Maegley, K.A., Admiraal, S.J., Herschlag, D. (1996) Ras-catalyzed hydrolysis of GTP: a new perspective from model studies. Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 93, 8160-8166.

64. Noel, J.P., Hamm, H.E., Sigler, P.B. (1993) The 2.2 A crystal structure of transducin-a complexed with GTPyS. Nature, 366, 654-663.

65. Nyren, P. & Lundin, A. (1985) Enzymatic method for continuous monitoring of inorganic pyrophosphate synthesis. Anal. Biochem., 151, 504 -509.

66. Pai, E.F., Krengel, U., Petsko, G.A., Goody, R.S., Kabsch, W., Wittinghofer, A. (1990) Refined crystal structure of the triphosphate conformation of H-7-as p21 at 1.35 A resolution: implications for the mechanism of GTP hydrolysis. EMBO J., 9, 23512359.

67. Polekhina G, Thirup S, Kjeldgaard M, Nissen P, Lippmann C, Nyborg J (1996) Helixunwinding in the effector region of elongation factor EF-Tu-GDP. Structure, 4, 11411151.

68. Rayment, I., Rypniewski, W.R., Schmidt-Base, K., Smith, R., Tomchick, D.R., Benning,

69. M.M., Winkelmann, D.A., Wesenberg, G., Holden, H.M. (1993) Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science, 261, 50-58.

70. Raznikov, A.V., Sklyankina, V.A., Avaeva, S.M. (1992) Tyrosine-89 is important forenzymatic activity of S. cerevisiae inorganic pyrophosphatase. FEBSLett, 308, 62-64.

71. Rittinger, K., Walker, PA., Eccleston, J.F., Smerdon, S.J., Gamblin, SJ. (1997) Structure at 1.65 A of RhoA and its GTPase-activating protein in complex with a transitionstate analogue. Nature, 389, 758-762.

72. Sablin, E.P., Kull, F.J., Cooke, R., Vale, R.D., Fletterick, R.J. (1996) Crystal structure of the motor domain of the kinesin-related motor ncd. Nature, 380, 555-559.

73. Sack, S., Kull, F. J., Mandelkow, E. (1999) Motor proteins of the kinesin family. Structures, variations, and nucleotide binding sites. Eur. J. Biochem., 262, 1-11.

74. Sack, S., Muller, J., Marx, A., Thormahlen, M., Mandelkow, E.-M., Brady, S.T., Mandelkow, E. (1997) X-ray structure of motor and neck domains from rat brain kinesin. Biochemistry, 36,16155-16165.

75. SchefFzek, K., Ahmadian, M.R., Kabsch, W., Wiesmuller, L., Lautwein, A., Schmitz, F., Wittighofer, A. (1997) The Ras-RasGAP complex: structural basis for GTPase activation and its loss in oncogenic Ras mutants. Science, 277, 333-338.

76. Schweins, T., Geyer, M., SchefFzek, K., Warshel, A., Kalbitzer, H.R., Wittighofer, A. (1995) Substrate-assisted catalysis as a mechanism for GTP hydrolysis of p21ras and other GTP-binding proteins. Nat. Struct. Biol., 2, 36-44.

77. Shintani, T., Uchiumi, T., Yonezawa, T., Salminen, A., Baykov, A.A., Lahti, R., Hachimori,

78. A. (1998) Cloning and expression of a unique inorganic pyrophosphatase from Bacillus subtilis: evidence for a new family of enzymes. FEBS Lett., 439, 263-266.

79. Sivula, T., Salminen, A., Parfenyev, A.N., Pohjanjoki, P., Goldman, A., Cooperman,

80. B.S., Baykov, A. A., Lahti, R. (1999) Evolutionary aspects of inorganicpyrophosphatase. FEBSLett., 454, 75-80.

81. Smirnova, I. N., Shestakov, A. S., Dubnova, E. B., Baykov, A. A. (1989) Spectral and kinetic studies of phosphate and magnesium ion binding to yeast inorganic pyrophosphatase. Eur. J. Biochem., 182, 451-456.

82. Smith, C.A., Rayment, I. (1996a) Active site comparisons highlight structural similarities between myosin and other P-loop proteins. Biophys. J., 70, 1590-1602.

83. Smith, C.A. & Rayment, I. (1996b) X-ray structure of the magnesium (II)-ADP-vanadate complex of the Dictyostelium discoideum myosin motor domain to 1.9 A resolution. Biochemistry, 35, 5404-5417.

84. Sondek, J., Lambright, D.G., Noel, J.P., Hamm, H.E., Sigler, P.B. (1994) GTPase mechanism of G proteins from the 1.7-A crystal structure of transducin a-GDP-AlF4'. Nature, 372, 276-279.

85. Sprang, S.R. (1997) G protein mechanisms: insights from structural analysis. Annu. Rev. Biochem., 66, 639-678.

86. Springs, B., Welsh, K.M., Cooperman, B.S. (1981) Thermodynamics, kinetics, and mechanism in yeast inorganic pyrophosphatase catalysis of inorganic pyrophosphate: inorganic phosphate equilibration. Biochemistry, 20, 6384-6391.

87. Teplyakov, A., Obmolova, G., Wilson, K.S., Ishii, K., Kaji, H., Samejima, T., Kuranova, I. (1994) Crystal structure of inorganic pyrophosphatase from Thermus thermophilic. Protein Sci., 3, 1098-1107.

88. Tong, L., deVos, A.M., Milburn, M.V., Kim, S-H. (1991) Crystal structure at 2.2 Aresolution of the catalytic domains of normal ras protein and an oncogenic mutant complexed with GDP. J. Mol. Biol., 217, 503-516.

89. Tuominen, V., Heikinheimo, P., Kajander, T., Torkkel, T., Hyytia, T., Kapyla, J., Lahti, R.,

90. Cooperman, B.S., Goldman, A. (1998) The R78K and D117E active-site variants of Saccharomyces cerevisiae soluble inorganic pyrophosphatase: structural studies and mechanistic implications. J. Mol. Biol., 284, 1565-1580.

91. Velichko, I.S., Mikalahti, K., Kasho, V.N., Dudarenkov, V.Yu., Hyytia, T„ Goldman, A., Cooperman, B.S., Lahti, R., Baykov, A.A. (1998) Trimeric inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli obtained by directed mutagenesis. Biochemistry, 37, 734-740.

92. Volk, S. E., Baykov, A. A., Duzhenko, V. S., Avaeva, S. M. (1982) Kinetic studies on theinteractions of two forms of inorganic pyrophosphatase of heart mitochondria with physiological ligands. Eur. J. Biochem., 125, 215-220.

93. Weber, J. & Senior, A.E. (1997) Catalytic mechanism ofFl-ATPase. Biochim. Biophys. Acta, 1319, 19-58.

94. Wittighofer, A. & Pai, E.F. (1991) The structure of Ras protein: a model for a universal molecular switch. TIBS, 16, 382-387.

95. Wong, S.C.K., Hall, D.C., Josse, J., (1970) Constitutive inorganic pyrophosphatase of

96. Escherichia coli. III. Molecular weight and physical properties of the enzyme and its subunits./. Biol Chem., 245, 4335-4345.