Локализация и функциональные свойства пирофосфотазы митохондрий животных тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА. ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени П. В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ДУБНОВА Елена Борисовна

УДК 577.^33.33

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ПИРОФОСФАТАЗЫ МИТОХОНДРИИ ЖИВОТНЫХ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и Физиологически активных вевесто

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени • кандидата химических наук •

Москва - 1991

Работа выполнена в МежФакультетскоЯ 1ШЛ молекулярной биологии и биоорганической химии им. А.П. Белозерского Московского государственного университета им. И.В. Ломоносова

Научния руководитель доктор химических наук А.А. ВаПков

Официальные доктор биологических кандидат химических

оппоненты 1

наук Л.С. ЯгукинскиЯ наук А.В. Кузнецов

Ведущая организация i Институт молекулярноЯ биологии АН СССР

Защиита состоится —1991 года в_1х__часов на

заседании специализированного ученого совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Химическом Факультете МГУ по адресу! 119899, ГСП-3. Москва, Ленинские гори, МГУ. Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического Факультета МГУ.

года

»

11. Г. Смирнова

Автореферат разослан

м.

Jj£-

.1991

Учений секретарь совета кандидат химических наук

ОВЩАЯ XAi'AK'mwrimA PAIWIII

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. ФосФоангидрилная структура -1>-()-|>-является одной им центральных и биологии и служит основным химическим передатчиком анергии в живых клетках. Простейшее соединение, содержащее эту структуры - пнрофосфат (Н1Ч). Он образуется в качестве побочного продукта в основных виосиитетических процессах, в том числе, синтезе белков и нуклеиновых кислот, при окислении жирных кислот и др. Нирофосфат регулирует эти м другие важные процессы в клетке, и поэтому существует эффективный механизм поддержани» его концентрации. Центральным звеном этого механизма является неорганическая пирофосфатаза (КФ 3.6.1.1). Этот фермент есть в цитоплазма любой клетки, и его функция там состоит в гидролизе №1 . Иитоплазматические нирофоефатазы интенсивно исследуются, и можно ожидать, что в ближайшие годы, благодаря атому, станет ясен химический механизм Ферментативного гидролиза полифосфатов.

Значительно меньше изучена мембранная Форма этого Фермента, впервые она вила обнаружена и фотосинтеэируницих бактериях и способна синтезировать PHI в количествах, значительно превышающих равновесные для системы PPi « Pi. за счет сопряжения этого процесса с изменением электрохимического потенциала i;oiiob водорода. Существует предположение, что такая пирофосфатаза есть и в митохондриях эукариот. Метаболизм PHi в них представляет особып интерес. Митохондрии содержат около 90* клеточного пирофосфата, хотя занимают небольшую долю об'ема клетки. Есть данные в пользу того, что от концентрации пирофосфата зависит об'ем матрикса митохондрия и. как следствие, скорости протекающих в них процессов (дыхание, окисление жирных кислот, карбоксилирование пирувата и др.). Эта зависимость. вероятно, лежит в основе влияния гормонов, вызывающих увеличение внутриклеточной концентрации Cai+. на эти процесы (Хеплстрап, 1987), поскольку Са^+ оказывает мощное ингибирукнцее действие нд пирофосфатазу. Изучение миточондриальной пироФосФатази может дать таким образом важную информации о регуляции важнейших свойств митохондрия, а также о механизме сопряжения гидролиза и синтеза HPi с транспортом II через мембрану, если этот фермент действительно обладает такап способность«.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. В работе ставились следующие основные задачи! установить локализацию пирофосфатазы и ее активного центра в митохондриях клеток животных! сравнить каталитические свойства пироФосФатазн митохондрия в изолированной и связанной с мембраной Формах) исследовать влияние Фторид-иона на активность пирофосфатаэн в митохондриях и использовать полученную информацию для оценки концентрации свободного пирофосфата в матриксе.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧ1. ЖАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Получены прямее доказательства существования мембранной пирофосфатазы в митохондриях животных. Показано, что активный центр пирофосфатазы ориентирован в матрикс митохондрий и Фе]чент поэтому неактивен по отношению к пироФосФату. находящемуся снаружи. Методом химической модификации проведено первичное изучение топографии комплекса Фермента с мембраной и получены указания на существование прямого контакта ее с каталитическими суб ' ед! [ницами.

Изучена кинетика действия пирофосфатазы в митохондриях, в которых искусственно-создана проницаемость для пирофосфата. • Обнаружено практически полное совпадение каталитических свойств Фермента в изолированном и мембраносвязашгам состояниях.

Всесторонне исследовано вдинние специфического ингибитора пирофосфатази - фторид-иона. на активность Фермента в митохондриях и на основании полученных результатов вИдвшота гипотеза о существовании механизма связывания пирофосфата внутри митохондрий. Найдены условия для селективной инактивации пирофосфатази матрикса. Показано, что с помощью Фторид- иона можно изменять в широком диапазоне содержание пирофосфата в изолированных митохондриях.

Полученные данные вносят вклад в изучение метаболизма пирофосфата и его регуляшш в тггохондриях.

ОБ'ЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, оозора литературы по мсмбранним пирофосфатазам, изложение результатов, экспериментальной части, шшодов и списка цитированной литературы ( 2>?С названия). Об'ем работы 15£ страниц машинописного текста, включая Хо рисунков и IH таблиц.

о

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

А. Локализация пирофосфатази а клетках млекопитающих Субклеточная локализация пирофосфатази в печени крнсщ При электрофорезе о гомогенате печени крыси вили обнаружены три Формы пирофосфатази. обозначенные цифрами 1.П и 111 в порядке уменьшения их подвижности. Количественное денситометрировашш геля, окрашенного с помощью метилового зеленого, показало, что пирофосфатаза 1 составляет 80-90% обиеп пирофосфатазнон активности клетки. Для отнесения пирофосфатази к структурным элементам клетки било проведено Фракционирование гомогената Нетодом дифференциального центрифугирования в растворах 'сахарозн различной плотности. Для идентификации Форм фермента бил Проведен электрофорез и определен« относительные подвижности зон (ИГ). Кроме того, для оценкн степени загрязнения Фракций митохондриями била измерена активность цитохромоксидазы. Полученные данные представлены а табл.1.

Таблица 1

Активность пироФосФатозн и цитохромоксндазы в

субклеточных Фракциях печени крысы

Исходное количество ткани 30 г. Подчеркнутые значения ИГ соответствуют преобладающей Форме пирофосфатази.

Белок. Пирофосфата- 1 Шггохром- 1

мг за, икмоль юксидаза. 1

фракция РП/мин на 1мкг-атом 1 яг

1 мг Ю /мин на|

1 1 мг 1

Гомогенат 4800 0.110 1 0.015 10. 161 0,26) о. 36

Гиалоплазма 1100 0.380 1 0 ( 0.261 0, 36

Митохондрии 150 0,080 1 0,082 10. 16, 0,261

Нихросомм 390 0,016 1 0.004 10. 161 0 лб

Плазматические 1 1

нембрани 10 0.032 1 0.043 10. 161 0.27; 0 35

Ядра 73 о,ооа 1 0,005 10. 16: 0.26: 0, 36

Как видно, основная часть пирофосфатази находится во Фракции гиалоплазмы. Значительно меньшие количества фермента присутствует в митохондриях и кикросомах и совсем небольшие - а плазматических мембранах и ядрах. Элестрофоретическия анализ

показал, что гиплоплаэма содержит Формы фермента 1 и П с Ж 0.36 и 0,26, соответственно. Форма II присутствует и во Фракции митохондрий, однако преобладает в ней Форма Ней! 0,16. Последняя форма является основной и во Фракции плазматических мембран, но. судя по тому, что Фермента в ней мало и отношение активностей пирофосфагазн и цитохромоксидаэы такое же как в митохондриях, причиной этого является наличие примеси митохондрий. Присутствие пирофосф&тазы в микросомах можно объяснить тем, что при их образовании из Фрагментов мембран эндоплазматической сети происходит частичный захват содержимого гиалоплазмы внутрь. ИнроФосФатазная активность ядер, ь-роятно. также обусловлена примесью основного Фермента гиалоплазмы. Полученные данные показывают наличие соответственной пирофо<:Ф(паэи в гиалоплаэме и митохондриях.

1.уп читохондриальнаи локализация пирофосфатазц 1 Для Фракционирования митохондрия печени крысы было использовано несколько методик. Первая из них состояла я последовательном разрушении мембранных «пилочек детергентами - дигитонином•и « лубрчлом НХ. в качестве маркеров наружной мембраны и натрикса использовали моноаминооксидазу и малатдегидрогеназу. Суммарная Фракция внешних мембран и межмемОранного пространства содержала 66* псмиамчиоксидазч и вообще не проявляла пирофосфатаэну» активность. По данным электрофореза обе Формы пирофосфатазы полностью оставались в митопластах и их соотношение не изменялось. Полученные митопласти в дальнейшем обрабатывали лубролом НХ. в результате чего в раствор переходило 7Ь\ иалатдегидригеназы и пнрофосфатазы. Остальная часть пирофосфатазы осаждалась имеете с Фрагментами внутренней мембраны при центрифугировании. При электрофорезе в осадке била обнаружена одна активная зона с И! 0.11-0,10, (пирофосфатаэа Ш). а в надосадочной жидкости - одна активная зона с Я1 0.26-0,29 (пироФосФатаза 11). Денситограммы гелей показаны на рис.1.

Полученные результаты являдагся прямым указанием на то. что пирофосфатаэа Ш расположена во внутренней мембране митохондрий. Пирофосфатаэа П. по-видимому, находится в матриксе и не связана с внутренней мембраной, так как переходила в раствор в той же степени, что и малатдегидрогеназа при изменении конш'нпмппн детергента (->ис,2). Аналогичные данные были палл'И'нн лчч ми'гохонлуий ■ ч'рлча крысы.

Рис.1 Денситограмми гелей при 660 им после электрофореза Фракция митохондрии печени крысы, полученных обработкой лубролом ИХ, и проявления на пирофосфатазнуи активность« а - целме митохондрии, б - внутренняя мембрана, в - метрике

Рис.2 Солвбилиэаиия пирофосфатаза (1) и налатдегиарогеиазм 421 митохондрий печени крысы дувролом их

Опыты по фракционированию митохондрип другими методами подтвердили мембранную локализацию пирофосфатазы Ш в митохондриях печени крысы. Так. субмитохондриальные частицы (СМЧ1. полученные обработкой митохондрий ультразвуком, содержали 28* исходной пирофосфатазноп активности митохондрии. Связанный с частицами фермент полностью находился в Форме Ш. Солюбилиэация малатдегидрогеназы пру. озвучивании происходила на 80%. При 3-кратном эамораживании-оттаичании в сочетании с осмотическим шоком пирофосфатаза 11 также полностью переходила в раствор, тогда как основная часть пирофосфатазы Ш оставалась связанной с Фрагментами митохондрии.

Таким образом, в клетках печени и сердца крысы есть 3 Формы пирофосфатазы, локализованные в гиалоплазме 187* по активности! и митохондриях (13*). Другие субклеточные структуры,' ■по-видимому, не имеют собственной пироФосФатазнои активности. В митохондриях печени преобладает мембранная форма (Ш), в сердце крыси ина является практически единственной формой этого фермента в митохондриях. На основании этих данных можно охидаоъ. что метаболизм РР1 в митохондриях существенно отличается от метаболизма в шггозоле, где присутствует только растворимая пирофосфатаза.

В. Структурные аспекты взаимодействия пирофосфатазы с мембраной митохондрип !

1. Молекулярные массы пироФосФатаз митохондрий печени крысы

Имеющиеся оценки молекулярных масс пироФосФатаз митохоидрип печени крысы и сердца быка сильно различается, поэтому мы провели тшательные определения Ферментного состава митохондрип печени крысы и молекулярных масс методом электрофореза в градиентном полиакриамидном геле. Поскольку в процессе, выделения пирофосфатазы не исключена ее деградация, в этих огагтах использовали экстракт митохондрий, а окраску гелей производили по активности Фермента. Молекулярные массы пироФосФатаз П и Ш по наши» данным, составляют 7Ь±6 и 164±14 кДа, что близко к величинам, полученным ранее Для митохондрий сердца. Величины И! ферментов и соотношение интенсивностей окрашенных зон не зависели от способа разрушения митохондрии. котор<ч- прополи.т эаморахиваняем-отгаиванием и сочетании с осмотическим »"-> 1

обработкой ультразвуком или детергентами различной природы (холатом натрия, тритоном Х-100 и лубролом ИХ). Уто означало, что в процессе солгабилизации пирофосфатазы не происходило ее заметной деградации. Для того чтобы определить, не происходит ли превращение одноп формы Фермента в другую в процессе электрофореза, было пропедено двухмерное разделение (рис.3). При электрофорезе во втором направлении каждая зона мигрировала в виде отдельного пятна. Это означает, что диффузногть зоны, соответствующей гшрофосфатазе с наименьшей массой (гл Ш, раздел А), не связана с диссоциацией этого фермента.

Таким образом, -в митохондриях сердца быка и печени крысы существуют практически одинаковые пары пирофосфатаз, судя по их молекулярным массам.

2. ориентация активного центра фермента

Активны!» центр Фермента, снизанного со внутренней мембраной митохондрия, может быть ориентирован 3 «»«мембранное пространство, метрике или толщу мембраны. В двух последних случаях фермент не должен проявлять активность в натипных митохондриях по отношению к экзогенному субстрату, если он, как РР1, не способен проникать в мембрану.

Митохондрии, обработанные тритоном Х-100, гидролизовали РР1 со скоростью ~0.1 мкГмоль/мин мг белка. В отсутствие детергента скорость гидролиза РР1 составляла 8-15% от этой величины, но это связано с наличием поврежденных митохондрия. Если митохондрии осаждали в градиенте сахарозы (15-454) с таким расчетон. чтобы они не достигали дна, а оставались п средней трети пробирки, вследствие чего плотный осадок не образовывался и митохондрии не повреждались при суспендировали» осадка, то активность в отсутствие тритона Х-100 уменьшалась до 2%. Эти результаты показывают, что в иктактных митохондриях пирофосфатаза практически неактивна, С другой стороны, в митохондриях, в которых обработкой толуолом индуцирована проницаеность для низкомолекуляркых соединения типа РР1, активность пирофосфатази по отношении к экзогенному РР1 составляет 90-10041 активности митохондриального экстракта.

Кроме того, активность пирофосфатазы а СМЧ, в которых обращена наружу та сторона мембраны, которая в митохондриях

го

обретена в метрике, составляла 0.03-0.05 икмиль рьм/нин на 1 мг белка как в присутствии.тритона х-100, так и без него.

Из этих опытов следует, что активный центр мембранной пирофосфатазы ориентирован в метрике и она, следовательно, участвует в метаболизме РН1 внутри митохондрий.

3. Влияние ВН-реагектои на активность митахондриальной пирофосфатазы

Пространственная организация полипептидного комплекса мембранного белка может быть определена изучением доступности его субъединиц для различных агентов. В настоящей работе в качестве первого подхода к этой проблеме мы использовали метод химической модификации БН-реагентами,

Очищенный Фермент| в этой части работы определили значение ВН-групп для активности очищенной пирофосфатазы матрикса митохондрий печени крысы, которая, по-видимому, представляет собой каталитическую часть мембранной пирофосфатазы. Модификация сульФгидрильных групп снижала Ферментативную активность, на не уничтожала ее полностью (табл.2). Степень инактивации сильно зависела от природы модифицирующего агента. Увеличение времени реакции и концентрации ЗН-реагентов не приводило к более глубокой инактивации пирофосфатазы. Эти данные показывают, что БН-группы не входят в активный центр мембранной пирофосфатазы и причиной снижения активности служит не сам Факт блокирования БН-групп. а взаимодействие остатка модифицирующего агента с молекулой белка.

Однозначное подтверждение этого вывода было получено при изучении взаимодействия мембранной пирофосфатазы с серией И-(V-карбоксиалкил)калеимидов строения

Заметное снижение активности этими соединениями происходило лияь при условии п > 8 (рис.«(. Отсутствие или значителыюр уменьаекие эффекта при п ( В не было связано с неполнотой модификации. В пользу этого свидетельствовало то. чти <■"■.'•,►.«

(П - 1.2.3,4.5,6.8,10.12)

Первое разделение

п)

О

О

Второе разделение

Рис.Э разделение двух форм пирофосфатази экстракте митохондрия печени криси двухмерным электрофорезом в полиакриламидном геле с окрашиванием по активности

П

Рис.4 Остаточная активность пирофосфатази печени криси. модифицированной в растворе I мМ м-(¡¿"-карбоксилкил) малеимидами, в зависимости от числа углеродных атомов в карбоксиалкилъноя части реагента

1 Фермента И- < V-карооксиэтил)маленмидом (п « 2) практически полиостью предотвращала инактивации |ьх-карооксидодеиил) малеимидой (п ■ 12) и ДДФМ. Инактивация Фермента И-(и*--карбоксидецил)малеимидом происходила и в присутствии субстрата. концентрация которого в 100 раз превышала константу Михаэлиса. В отдельных опытах выло показано, что константа Михаэлиса не изменялась сколько-нибудь существенно в результате модификации фермента и, следовательно, наблюдаемый аффект не связан со снижением его сродства к субстрату. Таким образом, и реагирующая БН-группа и остаток модифицирующего агента удалены от активного центра я причина инактивации. по-видимому, заключается в ограничении конформационной подвижности молекулы белка.

Таблица 2

Влияние природы Ь'Н-реагентов на степень ннактивашш . пирофосфатазы митохондрий.печени крысы в изолированном состоянии и в СМЧ

Реагент 1 концентрация,мМ Остаточная активность,% изолированный 1 фермент 1 СМЧ

- 100 100

Н8С1г 1 0 1 72 1,5 -

Мерсалил 1 1 8 ±1,5 5б£ 2

п-Хлормёркури-

бензоат 1 1 42± 2 _

п-Хлормеркури-

бензосульфонат 1 1 201 3.5 55 £ 5

Я-Эгилмалеимид 1 8 89+4 _

Я-Феншиалеимид ; 1 йЗ£ 2 _

И-14-Диметилакино-

-3,5-Линитрофенил)

иалеимид (ДДФР1) I 0 025 26 ± 2 68£ 6

5,5'-Литиобис(2-

-шггровензоат) I 1 24± 5 37 £ 5

Фермент в составе СМЧ; Способ получения СМЧ. использованный В данной работе, обеспечивает оаратнуи ориентации мембраны по сравнений с митохондриями. Следовательно, актшишя центр Фермента ориентирован наружу, что позволило, как и в случае свободного Фермента, проводить прямые измерения его активности в присутствии ЕН-реагентов.

Пирофосфатаза, связанная с субмитохондриальтми частицами.

о

имела значительна меньшую чувствительность к непроникающим в мембрану реагентам - нерсалилу, п-хлормеркурибензосульФо^ату и ДДМФ (табл.2), по сравнению с очищенной пирофосфатазой. Косвенное подтверждение мембранной локализации SH-rpynn каталитических субьединиц било получено также при сравнении реакционной способности свободной и мембраносвязанной пирофосфатази по отношению к проникающему реагенту N-этилмалеимиду. Поскольку модификация пирофосфатази N-этилмалеимияом почта не изменяет ее активность (табл.2), для определения глубини реакции измеряли чувствительность Фермента к IlgClj..В СМЧ нембраносвязанннй Фермент модифицировался наполовину за 5 мин при концентрации N-этилмалеимида 2 мЯ. а свободный Фермент в этих условиях вообще не модифицировался. Причина повышенной реакционной способности ЭП в реакции с мембраносвязанной пирофосфатазой митохондрий, по-видимому, состоит в том, что. будучи сравнительно гидрофобным соединением, реагент распределяется таким образом, что его концентрация в мембране вше,-чем в растворе.

'. Фермент в составе митохондрий! Ланние, подтверждающие - различную локализацию пироФосФатаз п и 0 о митохондрии печени криси били Получены при -сравнении степени их модификации N-этилмалеимидом в нативнмх митохондриях. Активность Фермента после модификации измеряли в присутствии ионов ртути. Мотивирование. мембранной пирофосфатази ионами ртути (осадок после обработки лубролом ИХ и центрифугирования) составило 4*. а немембранной (супернатант) - 54*. Эти ланние показывают, что мембранная лироФосФатаза прореагировала с N-зтилмалеимидом в большей стелешь чем пироФосФатаза матрикса. что и следовало ожидать на основании локализации этих Ферментов.

Таким образом, рассмотрение активности Фермента и реакционной способности его SB-групп приводит к выводу, что часть поверхности каталитических суа'единиц, содержащая активный центр, экспонирована в матрикс митохондрий, а другая находится а толще мембраны. "Якорем", удерживающим каталитичеосу» часть Фермента в мембране, по-видимому, служат некаталитические суб*единицы. мембрана делает недоступными SH-rpynrm каталитических cyö'единиц для реагентов, не способных проникать в литшшя бислоп, и облегчает реакции в случае N-этилмалеимида, для которого гидрофобная фаза предпочтительна.

В. Функциональные свойства пирофосфатазы

1. Каталитические свойстве пирофосфатоэы в митохондриях печени крысы

В »той части работы использовали митохондрии, в которых обработкой толуолом была индуцирована проницаемость для №1. начальные скорости гидролиза РР1 митохондриими, обработанными толуолом, а также очищенной пирофосфатазоя били измерены в ■ироких диапазонах концентрация П8-РР1 (0,2-100 нкм> и свободного иона Не2* (0,05-20 мМ). Реакция подчинялась уравнении Михаэлиса-Ментен при Фиксированиях концентрациях М81+. Полученные данные были проанализированы по следующей схеме«

, к4 кг Е --Г. ЕМ -----

К IV

ЕЖМР1 ) -т ЕМ»1МРР)

1' I"

Механизм катализа вк .»чает таким образом возмозаюсть протекания реакции двумя парвллельшйи путями, соотношение которых определяется концентрацией не"21". Комплекс Па-РР! служит исгйони субстратом для обоих путей, а ион Ивг+ - активатором Фермента. и Кг представляют собой константы диссоциации комплексов Фермента с металлом. Кл и К^' - константы Михаэлиса, а V и V' -максимальные скорости для друх т ..л. Численные значения параметров били определены одн .,^ с. , иноа обработкой всего массива данных по скорости гидролиза (214 независимых измерений для проницаемых митохондрия и 158 для очищенного Фермента) на ЭВМ и приведены в табл.3.

Используй полученные данные, можно рассчитать активность пирофосфатазы в митохондриях. Она равна по меныиеп мере. 50* от максимальной, т.е. 45 нлоль/мин на 1 мг белка.

2. «торид-ион как ингибитор пирофосфатазы в митохондриях вторид считается специфическим ингибитором пирофосфатазы,

т.к., хотя он действует на другие Ферменты, они существенно менее чувствительны к нему. Механизм ингибирооакия Фермента в отсутствие мембраны ьил подробно исследован (Смирнова и др.. 19841. Инактивация пр .екает в две стадии. Сначала но» р~ быстро

и обратимо присоединяется к Фермент-субстратному комплексу, после чего образовавшийся тройной комплекс медленно иэомеризуется с константой скорости 5 мин с полной потерей активности. Реактивация Фермента после удаления избытка. ингибитора из раствора протекает с полупериодом В мин, т.е. довольно медленно. Поэтому оказалось возможним использовать для . солпбилиэации пирофосфатазы после инкубации митохондрий с КГ обработку тритоном Х-loo. которая занимала - 1 ими. Основная опасность при атом состояла в тон, что инактивация пирофосфатазы ногла продолжаться и во время инкубации с детергентом, однако контрольные опиты показали, что благодаря удачному выбору условий солпбилиэации дополнительная инактивация происходила не более чен на 5\.

Таблица 3

Параметры кинетической схемы для гидролиза PPi проницаемши митохондриями И очищенной пирофосфатазой при рН 7,2

Параметр Проницаемые Очищенная

митохондрии пироФосФатаза

1С,, , Mfl 0.0+0,4

к»,- Mil 1.3+1, .6 19+ 3

К*. , мкМ 20+ 2 1S + 2

к;. мкМ 0,30+0, ,03 0,4± 0,1

V, В мг 0,023£ 0, ,002 17.2+1

V , Е мг 0,089+ 0, .002 37.А+1,2

Картина ингиоирования активности Фермента в составе субмитохондриальных частиц и митохондрий, проницаемых для пирофосфата, практически не отличалась от описанной для очинённого Фермента.

Для идентификации форм Фермента, реагирующих с КР, использовали электроФоретическия анализ. После инкубации митохондрия с КГ две формы пирофосфатазы разделяли действием луброла ИХ. как описано выше. В результате было найдено, что при 25° инактивирувтся обе Форт, фермента, а при 0° только матриксная. Падение оошей актинности пирофосфатазы при 0° составляло 20-30%. Эти результаты подтверждают наличие двух Форм

Фермента а митохондриях.

Рис.5 показывает изменение активности пирофосфатазы в процессе инкубации митохондрий с КК при 37". Инактивация Фермента происходила в отсутствие Мв1* и пирофосфата в среде инкубации, которые абсолютно необходимы для ингибирования фермента в растворе. Вероятно, это связано с тем, что , митохондрии содержат значительные кличества Ив'* и пирофосфата 150 икм в расчете на общий ос'ем митохондрия). В присутствии КР содержание пирофосфата возрастало а 20 раз (рис.5).

Наиболее существенным результатом является то, что скорость инактицации Фермента в митохондриях в десятки раз.меньше, чем о растворе при концентрации пирофосфата I 50 нкМ. Это служит косвенным указанием на то. что основная часть пирофосфата в митохондриях находится в связанном виде и недоступна для Фермента.

Известно, что пирофосфат образуется в митохондриях при окислении жирных кислот, в частности, бутирата. скорость инактивации пироФосФатазы фторид-ионом в присутствии бутирата возрастала в 2 раза, но была, все-таки, намного ниже, чем в растворе. Общее содержание пирофосфата при этом возрастало до 2-3 нмоль/мг. Эти наблюдения показывают, что концентрации свободного пирофосфата в матриксе в присутствии бутирата несколько возрастает, но основная часть образумщегося пирофосфата также связывается внутри митохондрий.

0 5 Время, мин

Рис.5. Кинетика инактивации пмрофог-фата (I) и накопления пирофосфата (21 в митохондриях печени крысы под действием 5 иП КГ

выводы

1. В митохондриях печени крысы присутствуют две Формы пирофосфатазы, одна из которых (И • 164 кДа> связана с . внутренней мембраной, а другая (И » 78 кДа) находится в натриксе. В митохондриях сердца крысы пирофосфатаза представлена практически одной мембранной Формой.

2. Интактные метохондрии печени крысы не гидролиэуягг пирофосфат. находящихся-снаружи. В то же время, пирофосфатаэная активность полностью проявляется в митохондриях, в которых обработкой толуолом индуцирована проницаемость для низкомолекулярных соединений, а также в субмитохондриальных частицах с обратной ориентацией мембраны. Отсюда следует, что активный центр мембранной пирофосфатазы ориентирован а метрике митохондрий. '

3. Связывание пирофосфатазы с мембраной различным образом изменяет скорость ее модификации ЭН-реагентами разной степени . гидроФобности. что свидетельствует о контакте каталитических• суб1единиц Фермента с внутренней мембраной митохондрий.

4. Скорости гидролиза тфоФосФата очииенноЯ пирофосфатаэой и митохондриями, обработанными толуолом, сходным образом зависят от концентраций субстрата и . Простейшая схема катализа предполагает, что в обоих случаях сушествутот два пути реакции, субстратом слуззгг комплекс Н8-РР1, а ион металла активирует Фермент. 8 Физиологических условиях активность Фермента в митохондриях составляет около 50 нмолеп/мин на 1 мг белка.

5. Несмотря на високуга активность пирофосфатазы. выделенные митохондрии содержат около 0,05 нмоля пирофосфата на 1 мг белка, что с учетом об'ема матрикса на несколько порядков превышает равновесную концентрацию для системы РР1—2Р1. Инкубация со Фторид-ионом при 37° увеличивает содержание РР1 в митохондриях в 20 раз.

6. Низкая скорость инактивации пирофосфатазы в митохондриях Фторид-ионом указывает на то, что лишь незначительная доля пироФосФата находится в митохондриях в свободном виде.

Основные результата диссертации изложены в следующих работах I

1. костенко К.Б.. Смирнова И.П., Байкой А.А., Акаева С.П. Субклеточная и субмитохондриальная локализация неорганической пирофосфатазы в сердце и печени млекопитающих.//Биохимия,-1983,- Т.АН. N 5.- С.707-7J3.

2. Дубнова Е.Б., Америк A.M., Байкой А.А. Мембранная неорганическая пирофосфатаза. Инактивация фторидом в митохондриях и субмитохондриальных частицах.//Виол, мембраны,-1985.- Т.2. N 2,- С.181-189.

3. Байков А.А.. Дубнова Е.В., Пашков А.Ю., Аваева С.М. Мембранная неорганическая пирофосфатаза. Различная реакционная способность ьн-гругш свободного и мембранно-связанного Фермента. //Виол, мембраны.- 1987." Т.*. N 10,- С.1019-1025.

A. Vol к S.E., Ilaykov A. A.. Kostenko К.В., Avaeva S.M. Isolation, suhunlt structure and localization of Inorganic pyrophosphatase ot heart and liver Mitochondria.//Biochla. et biophys. acta.- 1983,- V,7A*. N 1,-P.127-1ЭА.

5. UayKov A.A., Unguryte A., Dubnova Ё.В., Salrnova 1.М.. Kasha V.N. Coaparison of the structure and catalytic properties ot the cytosolic and Mitochondrial pyrophosphatases of aamaallan cells.//Internetional syaposiua "Molecular organization of biological structures". Abstract booK. - 1989.- Moscow.- P.1-2.

Зака) 64, Тирам MQ.

Tml. лгпти.