Локализация и функциональные свойства пирофосфатазы митохондрий животных тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

® V' : - 1

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСШГФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ДУБНОВА Елена Ворисовна

УДК 577.^53.33

ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ПИРОФОСФАТАЗЫ МИТОХОНДРИЯ ЖИВОТНЫХ

02.00.10 - сиоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени • кандидыта химических наук •

Москва - 1991

Работа выполнена в ИежФакультетскon НИЛ молекулярной биологии и биоорганической химии им. A.II. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель доктор химических наук A.A. Вайков

Официальные оппоненты! доктор биологических наук л. С. ЯгужинскиЯ кандидат химических наук A.B. Кузнецов

Ведущая организация■ Институт молекулярной биологии АН СССР

Защиита состоится -A3 " _1991 года в /^часов на

заседании специализированного ученого совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Химическом Факультете ИГУ по адресу■ 119899. ГСП-3. Москва. Ленинские гори, МГУ. Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического Факультета ИГУ.

Автореферат разослан " __1991 года

Ученый секретарь совета кандидат химических наук

И.Г.Смирнова

UL, , OtiLUAVI ХАРАКТЕРИСТИКА 1'АПОТЫ

^ерггций |

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. фосфоангидридная структура -Р-О-Р-яилиется одной из центральных в биологии и служит основным химическим пе|)|"латч1!М)Н энергии п живых клетках. Простейшее соединение, содержащее эту структуры - пирофосфат (РР1). Он образуется в качестве полочного продукта и основных биосинтетнческих процессах. в той числе, синтезе Аелкон и нуклеиновых кислот, при окислении жирных кислот и др. ни|>офосфаТ регулирует эти к другие нажние процесс»! и клетке, и поэтому существует аффектииныя механизм поддержания его концентрации. Центральным звеном атого механизма является неорганическая пирофосфатаза (Кф 3.6.1.11. Этот Фермент есть и цитоплазма любой клетки, и его функция там состоит в гидролизе PPt. Шггоплаэматические пирофосфатази интенсивно исследуются, и можно ожидать, что а ближайшие годи, благодаря этому, станет ясен химический механизм Ферментативного гидролиза полифосфатов.

Значительно меньше изучена мембранная форма этого Фермента. Впервые она била обнаружена и фотосннтезирующих бактериях и способна сшп-езировать РР( в количествах, значительно превышающих равновесные для системы PPi » Pi, за счет сопряжения этого процесса с изменением электрохимического потенциала конов водорода. Существует предположение. что такая пирофосфатаза есть и и митохондриях эукариот. Метаболизм РР1 в них представляет особый интерес. Митохондрии содержат около У0\ клеточного пирофосфата. хотя занимают небольшую доли об'ема клетки. Есть данные в пользу того, что от концентрации пирофосфата зависит об'ем матрикса митохондрий и, как следствие, скорости протекающих в них процессов (дыхание, окисление жирных кислот, карбоксилырование пирувата и др.). Эта зависимость, вероятна, лежит в основе влияния гормонов, вызывающих увеличение внутриклеточная концентрации Са1+. на эти процеси (Хеялстрап, 1987), поскольку Са^* оказывает мощное ингнбнруюцее действие нд пирофосфатаэу. Изучение митохондриальной пирофосфатази может дать таким Образом важную информации о регуляции важнейших свойств митохондрия, а также о механизме сопряжения гидролиза и синтеза PPi с транспортом (I+" через мембрану, если этот фермент действительно обладает такой способности» •

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. В работе ставились следующие основные задачиГ установить локализации пироФосФатазы и ее активного центра в митохондриях клеток животных) сравнить каталитические свойства пироФосФатазы митохондрия в изолированной и связанной с мембраной Формах! исследовать влияние Фторид-иона на активность пироФосФатазы в митохондриях и использовать полученную информации для оценки концентрации свободного лирофосфата в матриксе.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКГИЧК ЖАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Получены прямее доказательства существования мембранной пирофосфатази в митохондриях животных. Показано, что активный центр пирофосфатази ориентирован в матрикс китохонлрий и фегчент поэтому неактивен по отношению к пироФосФату, находящемуся снаружи, методом химической модификации проведено первичное изучение топографии комплекса Фермента с ненораной и получены указания на существование прямого контакта ее с каталитическиНи суб' е Д1 опшами.

Изучена кинетика действии пироФосФатазы в митохондриях, в которых искусственно-создана проницаемость для пирофосфата. ' Обнаружено практически полное совпадение каталитических свойств Фермента а изолированном и мембраносвязанном состояниях.

Всесторонне исследовано влияние специфического ингибитора пирофосфатази - Фторка-иона, на активность фермента в митохондриях и на основании полученных результатов выдвинута гипотеза о существовании механизма связывания пирофосфата внутри митохондрий. Найдены условия для селективной инактивации пирофосфатази матрикса. Показано, что с помооью Фторид- иона можно изменять в широком диапазоне содержание пирофосфата в изолированных митохондриях.

Полученные данные вносят вклад в изучение метаболизма пирофосфата и его регуляции в митохондриях.

ОБ'ЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы по мембранным гшрофосфатазам, изложения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы ( 5И~ назвонил). Об'ем работы № страниц машинописного текста, шслгочая t-" рнсунков и |t- таблиц.

■J

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

А. Локализация пирофосфатази в клетках млекопитающих СуСклеточная локализация пирофосфатази в печени крисш При электрофорезе в гоногенате печени криси били овнаружени три Форми пирофосфатази. обозначенные цифрами 1, п и Ш в порядке уненыиення их подвижности. Количественное денситометрнрование геля, окрашенного с помощь» метилового зеленого, показало, что пирофосфатаза 1 составляет 80-90* обшеп пирофосфатазной активности клетки. Для отнесения пирофосфатази к структурным элементам клетки било проведено Фракционирование гомогената методом дифференциального центрифугирования в растворах 'сахарозы разлитой плотности. Для идентификации Форм фермента вил Проведен электрофорез и определены относительные подвижности зон <Rf). Кроме того, для оценки степени загрязнения фракций митохондриями вила измерена.активность шггохромоксидази. Получешше данние представлени в тавл.1.

Таблица 1

Активность пирофосфатази и шггохромоксидази в

субклеточных фракциях печени криси

Исходное количество ткани 30 г. Подчеркнутие значения Bf соответствует преобладающей форме пирофосфатази.

---------------I——|-------------1---------1---------------

1 Белок.I Пирофосфата-|Цитохром-I

I мг I за. мкмоль юксидаэа.1 '

Фракция I I PPJ/мин на tnxr-атом I Rf

I .1 1 мг (0 /мин Hat

It 1 1 мг 1

Гомогенат 1 1 4800 1 0.110 1 0.015 10. 16 J 0, ,26| J0, 36

Гиалоплаэна 1 1 1100 1 0,380 1 0 1 0 .261 0, 36

Питохондрнн I 1 ISO 1 0 .ООО 1 0,082 10. 16 с 0, ,261

Пикросоми 1 1 390 1 0,016 1 0.004 10. 16> 0. j6

Плазматические 1 I. 1 1 1

мембраны 1 1 10 1 0,032 1 0,043 to. 16i 0, .271 0, 35

Ядра 1 1 75 1 0,008 1 0,005 to. 16! 0, .26: 0, 36

-------------,-------,,------;-------,---■------,----------------

Как видно, основная часть пирофосфатази находится во фракции гиалоплазмы. Значительно меньшие количества фермента ррнсутствуит а митохондриях и микросомах и совсем небольшие - в Плазматических мембранах и ядрах. Элестрскроретическия анализ

(

показал, что гиплоплазма содержит Формы Фермента 1 и П с КГ 0,36 и 0,26, соответственно. Форма 11 присутствует и во Фракции митохондрий, однако преобладает в ней форма Ш с Ж 0,16, Последняя Форма являптся основной и во Фракции плазматических мембран, но, судя по тому, что Фермента в ней мало и отношение активностей пнрофосфагазы и интохромоксидазы такое *е как в митохондриях. причиной этого является наличие примеси митохондрий. Присутствие пироФосФатазы в мик|юсомах можно объяснить тем, что при их образовании из Фрагментов мембран эндоплазматической сети П|юисходиг частичный захват содержимого гиалошшзпы внутрь. Пнрофосфатазная активность ядер, >, -роятно. также обусловлена примесьи основного Фермента гиалиплаэми. Полученные дшшш» показшшкгг наличие соответственной пирофо< :фатаэы в гиалоилазне и митохондриях.

Сугг-штохондрнальнаи локализация пироФосФатазт Для Фракционирования митохондрий неченн крысы было использовано несколько методик. Первая из них состояла о последовательном разрушении мембранных »пилочек детергентами - дигитонином■и « лубролом ИХ. П качестпе наркероп наружной мембраны и матрикса использовали моноаминооксидазу и малатдегидрогеназу. Суммарная Фракция внешних мембран и межмембранного пространства содержала 66\ моноаминоксилазы и вообще не проявляла пироФосФатазнув активность. Но данным электрофореза обе Формы пироФосФатозы полностью оставались в митопластах и их соотношение не изменялась. Полученные митопласты в дальнейшем обрабатывали лубролом ИХ. п результате чего в раствор переходило 76* малагдегилрогеназы и 32\ иирофосфатазы. Остальная часть пирофосфатазн осаждалась имеете с Фрагментами внутренней мембраны при центрифугировании. При электрофорезе в осадке била обнаружена одна активная зона с КГ 0.11-0,10, (пироФосФатаза ■), а в нвдосадочной жидкости - одна активная зона с И! 0,26-0,29 (пироФосФатаза II). Денситогракмы гелей показаны на рис.1.

Полученные результаты является прямым указанием на то. что пироФосФатаза Ш расположена во внутренней мембране митохондрий. ПироФосФатаза П, ло-пидимому. находится в матриксе и не связана с внутренней мембраной, так как переходила в раствор в топ же степени, что и малатдегидрогеназп при изменении кшшпщмшт детергента О-шс.2). Аналогичные донные были пил) 'ичш лчч гоггохонл',""' >'.ердн|» крысы.

Рис Л Денситограммы гелеп при 660 ни после электро<?ореза Фракция митохондрии печени крысы, полученных обработкой луоролом ЫХ. н проявления на пирофосфатазну» активность! а - целив митохондрии, в - внутренняя мембрана, в - метрике

Рис.2 Солюоилиэаяия пнрофосфатаза (1) и иалатдегиярогенаэм (2) митохондрия печени крысы лубролон их

Опыты по Фракционированию митохондрии другими методами подтвердили мембранную локализации пироФосФатазы Ш в митохондриях печени крысы. Так. субмитохондрнальные частицы (СМЧ). полученные обработкой митохондрий ультразвуком, содержали 2В\ исходной пирофосфатазноп активности митохондрии. Связанный с частицами фермент полностью находился и форме ш. Солюбшшзация малатдегидрогеназы при озвучивании происходила на 80*. При з-кратном заморажиианим-оттаечашш ц сочетании с осмотическим шоком пироФосФатаза 11 также полностью переходила о раствор, тогда как основная часть пироФосФатазы Ш оставалась связанной с Фрагментам» митохондрии.

Таким образом, в клетках печени и сердца крысы есть з Форш пироФосФатазы, локализованные в гиалоплазме (В7\ по активности) и к;ггохондринх (13%). Другие субклеточные структуры, по-видимому, не имеют собственной пироФосФатазной активности. В мито.чондриих печени преобладает мембранная форма Ш>. в сердце крысы она является практически единственной Формой этого фермента в митохондриях. На основании этих данных можно ожидать, что метаболизм РР1 в митохондриях существенно отличается от метаболизма п шггозоле. где присутствует только растворимая пирофосфатоза.

В. Структурные аспекты взаимодействия пироФосФатазы с мембраной митохондрий

1. Молекулярные массы пироФосФатаз митохондрий печени крысы

Имевшиеся оценки молекулярных масс пироФосФатаз митохондрий печени крысы и сердца быка сильно различаются, поэтому ми провели тщательные определения Ферментного состава митохондрий печени крысы и молекулярных масс методом электрофореза в градиентном полиакриамидном геле. Поскольку в процессе.выделения пирофосфатази не исключена ее деградация, р этих опытах использовали экстракт митохондрий, а окраску гелей производили по активности фермента. Молекулярные массы пирофосфатаз П и Ш по нашим данным. составляют 7В±6 и 1642:14 кДа, что близко к величинам, полученным ранее для митохондрий сердца. Величины ПГ ферментов и соотношение иитенсишюстей окрашенных зон но зависели от срособа разрушения митохондрии, которое прмпюм.тн заморажнваклем-оттаиванием в сочетании с осмотическим «к -1'

обработкой ультразвуком или детергентами различной мрирчди {холатом натрия. тритоном Х-100 и лубролом ЫХ). -гто означало, что о процессе солювилизации пирофосфатази не происходило ее заметной деградации. Для того чтови определить, не происходит ли превращение одной форми фермента в другую в процессе электрофореза, било пропедено дпухмерное разделение (рис.31. При электрофорезе во сторон направлении каждая зона мигрировала в виде отдельного пятна. Это означает, что ди4>фузность зон», соответствующей пнрофосфатазе с наименьшей массой (гл Ы, раздел А), не связана с диссоциацией этого Фермента.

Таким образом, в митохондриях сердца бнка и печени криси существуют практически одинаковое пари пнроФосФатаз, судя по их молекулярным массам.

Ориентация активного центра Фермента

Активный центр Фермента, снизанного со внутренней мембраной митохондрий, может бить ориентирован в межмембранное пространство, матрикс или толщу мембранм. В двух последних случаях фермент не должен проявлять активность в натипнмх митохондриях по отношении к экзогенному субстрату, если он, как РРЙ, не способен проникать в мембрану.

Митохондрии, обработанные тритоном Х-100, гндролизовали РР1 со скоростьга -0,1 н^моль/мин иг белка. В отсутствие детергента скорость гидролиза РР1 составляла 8-15* от этой величины, но это связано с наличием поврежденных митохондрия. Если митохондрии осаждали в градиенте сахарозы (15-45*) с таким расчетом, чтобы они не достигали дна, а оставались в средней трети пробирки, вследствие чего плотный осадок не образовывался и митохондрии не повреждались при суспендировали!« осадка, то активность в отсутствие тритона Х-100 уменьшалась до 2*. Эти результаты показывает, что в иктактиых митохондриях пирофосфатаза практически неактивна. С другой стороны, о митохондриях, в которых обработкой толуолом индуцирована проницаемость для ниэкомолекулярных соединений типа РР1, активность пирофосфатази по отношении к экзогенному РР( составляет 90-100* активности митохондрнального экстракта.

Кроме того, активность пирехросфатазы и СМЧ, в которых обращена наружу та сторона мембраны. которая в митохондриях

то

обрайона о метрике, составляла 0,03-0.05 мкмоль РР|/шш на I иг Оелка как в присутствии тритона Х-ЮО, так и без него.

Из »тих опытов следует, что активный иентр мембранной пирофосфатазы ориентирован а матрикс и она. следовательно, участвует в метаболизме РР1 внутри митохондрий.

3. Влияние БН-реагекгов на активность митохондриальиой пирофосфатазы

Пространственная организация полипептидного комплекса мембранного сел*а может бить определена изучением доступности его субьединиц для различных агентов. В настоящей работе в качестве первого подхода к этой проблеме мы использовали метод химической модификации БН-реагеитами,

Очищенный ФерментI Б атой части работы определили значение ВИ-групп для активности очищенной пирофосфатазы матрикса митохондрий печени крысы, которая, по-пидимому. представляет собой каталитическую часть мембранной пирофосфатазы. Модификация сульфгилрильных групп снижала Ферментативную активность, но не уничтожала ее полностыв (табл.2). Степень инактивации сильно зависела от природы модифицирующего агента. Увеличение времени реакции и концентрации ЫН-реагентов не приводило к более глубокой инактивации пирофосфатазы. Ути данные показывают, что БН-группы не входят п активный центр мембранной пирофосфатазы и причиной снижения активности служит не сам Факт блокирования БН-групп, а взаимодействие остатка модифицирующего агента с молекулой белка.

Однозначное подтверждение этого вывода било получено при изучении взаимодействия мембранной пирофосфатазы с серией Н-Iъг-кароохсиалккл)малеимидеш строения

Заметное снижение активности этими соединениями происходило лиаь при условии П > 8 (рис.4). Отсутствие или значительное умеиьвение эффекта при п ^ В не Аыло связано с ноиилнотои модификации. В пользу этого свидетельствовало то. 'п• 1 ■ ■■■ 1К.<

(П - 1.2.3.4,5.6.0,10.12).

Первое разделение

О

и

Второе разделение

Рис.3 Разделение двух форм пирофосфатази экстракта митохондрип печени крысы двухмерным электрофорезом в Полиакриламидном геле с окрашиванием по активности

10

12

Рис.4 Остаточная активность пирофосфатази печени крысы, модифицированной в рагтвп|х? 1 мМ М-1У-карвоксилкил) малеимидами. п зависимости от числа углеродных атомов в карбоксиалкилыюП части реагента

Фермента N-<1/ -карОоксиэтшп малеимндом (п « 2) практически полностью предотвращала инактивацию м-IV-карбоксидодешиО малеимидой (п » 12) и ДД4М. Инактивация фермента К- (•иг- ' -карбоксидецшималеимидом происходила и и присутствии субстрата, концентрация которого в 100 раз превышала константу Михаэлиса. В отдельных опытах было показано, что константа Михаэлиса не изменялась сколько-нибудь существенно в результате модификации Фермента и, следовательно, наблюдаемый эффект не связан со снижением его сродства к субстрату. Таким образом, и реагирующая ЬН-группа и остаток модифицирующего агента удалены от октишгаго центра и причина инактивации, по-видимому, заключается в ограничении конФормационной подвижности молекулы белка.

Таблица 2

Влияние природы ИН-реагентов на степень инактивации пирофосфатазы митохондрия.печени крысы в изолированном состоят»! и в СМЧ

(---------------1---------'----------------

1 1 Остаточная активность,*

Реагент 1 Концентрация,мМ1 1 1 1 1 изолированный фермент СИЧ

- 1 - 1 100 100

Н«С1г 1 0.1 1 1± 1,5 -

Мерсалил 1 1 1 8 ±1.5 56 — 2

п-Хлормеркури- 1 1

бензоат 1 1 1 42± 2 -

п-Хлормеркури- 1 1

вензосульфонат 1 1 1 20+3,5 55 £ 5

М-Эшлмалеимид 18 1 891 4

Н-векилиалеинид : 1 1 В3£ 2 -

М-14-Дииетиламшга- 1 1

-3,5-ДинитроФенил) 1 1

молеинид (ДДФМ) 1 0,025 1 26± 2 681: 6

5,5'-Днтиобис12- 1 1

-шггрооензоат 1 1 1 1 24± 5 37±5

Фермент в составе СМЧ: Способ получения СМЧ. использованный о данной работе, обеспечивает обратную ориентацию мембраны по сровнешоэ с митохондриями. Следовательно, активный центр Ферменте ориентирован наружу, что позволило, как и в случае свободного Фермента, проводить прямые измерения его активности в присутстио» ЕН-реагентов.

Пирофосфатаза, связанная с субмитохондрмалькымм част>иа>»1.

о

имела значительно меньшую чувствительность к непроникающим в нембрану реагентам - мерсалилу, п-хлормеркурибензосульФоНату и ДДМФ (табл.2), по сравнении с очищенной пирофосфатазой. Косвенное подтверждение мембранной локализации БН-групп каталитических субъелиниц било получено также при сравнении реакционной способности свободной и мембраносвяэанной пирофосфатазы по отношению к проникающему реагенту М-этнлмалоимилу. Поскольку модификация гагроФосФатазн М-этилмалеимидом почти не изменяет ее активность (табл.2), для определения глубины реакции измеряли чувствительность Фермента к ПвШд. В СМЧ мембраносвязанный Фермент модифицировался наполовину за 5 мнн при концентрации гьэтилмалеимида 2 м.1, а свободный Фермент в этих условиях вообще не модифицировался. Причина повышенной реакционной способности ЭМ в реакции с мембраносвяэанной пирофосфатазой митохондрий, по-видимому, состоит в том, что. будучи сравнительно гидрофобный соединением, реагент распределяется таким образом, что его концентрация в мембране выше, чем в растворе.

• Фермент в составе митохондрий! Данные, подтверждающие . различную локализацию пирофосфатаз П и О а митохондрии печени крысы были получены при сравнении степени их модификации Н-этилмалоимидом в нативных митохондриях. Активность Фермента после модификации измеряли в присутствии ионов ртути. Илгмбированио мембранной пирофосфатазы ионами ртути (осадок после обработки лубролом НХ и центрифугирования) составило 4», а немембранной (супернатант) - 54*. Эти данные показывают, что мембранная пироФосФатаза прореагировала с М-этилмалеинидом в большей степени, чем пироФосФатаза матрикса, что и следовало ожидать на основании локализации этих Ферментов.

Таким образом, рассмотрение активности Фермента и реакционной способности его БН-групп приводит к выводу, что часть поверхности каталитических суб'единиц, содержащая активный центр, экспонирована в метрике митохондрии, а другая находится а топте мембраны. "Якорем", удержипагашгм катал!гпгческуи часть Фермента в мембране, по-видимому, служат некаталнтическне суб'единицы. Мембрана делает недоступными БН-группи катал!ггичреких суб'единиц для реагентов, не способных проникать в липиднып бислой, и облегчает реакции в случае Н-этилмалеимида, для которого гидрофобная фаза предпочтительна.

В. функциональные свойства пирофосфатозы

1. Каталитические свойства пнрофосфатази в митохондриях печени крысы

В этой части работы использовали митохондрии, в которых обработкой толуолом была индуцирована проницаемость для №1. Начальные скорости гидролиза РР1 митохондриями, обработанными толуолом, а также очищенной пирофосфатозоп были измерены в широких диапазонах концентраций Ма-РИЧ 10,2-100 мкИ) и свободного иона Мвг+ 10.05-20 мМ). Реакция подчинялась уравнении Михаэлиса-Ментен при Фиксированных концентрациях На*"*". Полученные данные были проанализированы по следующей схеме!

«ч

• ЕМ -----г ЕМ,

"К IV

ЕМ(МР1 )■*-—у ЕМ2(МРР)

V

I"

Механизм катализа вк .ючает таким образом возможность протекания реакции двумя параллельными путями. соотношение которых определяется концентрацией Не'*'1'. Комплекс Н8-РР1 служит истинным субстратом для обоих путей, а ион Мвг+ - активатором фермента. К^ и Кг представляют собой константы диссоциации комплексов Фермента с металлом, ^ и Кц' - константы Нихаэлиса, а V и V" -максимальные скорости для дяух <:'•.-л. Численные значения параметров были определены .. . иной обработкой всего

массива данных по скорости гидролиза (214 независимых измерения Для проницаемых митохондрия и 138 для очищенного фермента! на ЭВМ и приведены в табл.3.

Используя полученные данные, можно рассчитать активность пирофосфатазы в митохондриях. Она равна по меньшей мере, 50% от максимальной, т.о. 45 нмоль/нин на 1 мг белка.

2. оторид-ион как ингибитор пирофосфатазы в митохондриях Оторид считается специфическим ингибитором пнрофосфатази, т.к.. хотя он действует на другие Ферменты, они существенна менее чувствительны к нему. Механизм ингибирооалия Фермента в отсутствие мембраны ьыл подробно исследован (Ощрнова >1 др. . 1984). Инактивация пр .екает в две стадии. Сначала ион Р" быстро

и обратимо присоединяется к Фермент-субстратному комплексу, после чего образовавшийся тройной комплекс медленно иэомериэуется с константой скорости 5 мин с полной потерей активности. Реактивация Фермента после удаления иэбипса. ингибитора из раствора протекает с полупериодом 8 мин. т.е. довольно медленно. Поэтому оказалось возможным использовать для солпбилизаиии пирофосфатазы после инкубации митохондрий с КР обработку тритоном Х-100, которая занимала - 1 мин. Основная опасность при этом состояла в том, что инактивация пирофосфатазы могла продолжаться и во время инкубации с детергентом, однако контрольные опыты показали, что благодаря удачному выбору условия солюбилиэации дополнительная инактивация происходила не более чем на 5\.

Таблица 3

Параметры кинетической схеми для гидролиза РР1 проницаемыми митохондриями И очищенной пирофосфатазоп при рН 7.2

Параметр Проницаемые Очищенная

митохондрии пироФосФатаза

К,, мм Кг. мМ К^. мкМ К^. мкП V. е мг v, е мг

1.3+1,6 20 + 2 0,30+0,03 0,023+ 0.002 0,089+ 0.002

0.0 + 0,* 19± 3 13± 2 0.4 ± 0,1 17,2+ 1 37.4 + 1,2

Картина ингноирования активности Фермента в составе субмитохондриальних частиц и мш-охондрий, проницаемых для пирофосфата. практически не отличалась от описанной для очищенного Фермента.

Для идентификации Форм Фермента, реагируюиих с КК, использовали электрофоретический анализ. После инкубации митохондрия с КГ две Формы пирофосфатазы разделяли действием луброла ИХ. как описано выше. В результате было найдено, что при 25° инактнвирувтся обе Форш. ферме»гга. а при о" только натриксная. Падение общей актинности пирофосфатазы при о" составляло 20-30%. эти результаты подтверждают наличие двух Форм

Фермента в митохондриях.

Рис.5 показывает изменение активности пирофосфатазы в процессе инкубации митохондрия с КК при 37°. Инактивация Фермента происходила в отсутствие И«**и пирофосфата в среде инкубации, которые абсолютно необходимы для ннгибирования фермента в растворе. Вероятно, это связано с тем. что митохондрии содержат значительные количества Ив'* и пирофосфата (50 нкН в расчете на общий об'ем митохондрий). В присутствии содержание пирофосфата возрастало в 20 раз (рис.5).

Наиболее существенным результатом является то. что скорость инактивации Фермента в митохондриях в десятки раз.Меньше, чем в растворе при концентрации пирофосфата >50 мкМ. Это служит косвенным указанием на то. что основная часть пирофосфата в -митохондриях находится в связанном виде и недоступна для Фермента.

, Известно, что пирофосфат образуется в митохондриях при окислении жирных кислот, в частности, бутнрата. Скорость инактивации пирофосфатазы Фторид-ионом в присутствии Сутирата возрастала в 2 раза; но была, все-таки, намного ниже, чем в растворе. Общее содержание пирофосфата при этом возрастало до 2-3 нмолъ/нг. Эти наблмдения показывают. что концентрации свободного пирофосфата а матриксе в присутствии бутирата несколько возрастает, но основная часть образующегося пирофосфата также связывается внутри митохондрий.

л

1.3 §

ш о

о

5

Время, нин

Рис.5, кинетика инактивации пирофог-фатв (I) и накопления пирофосфата |2) о митохондриях печени крысы под действием 3 мн КР

выводы

1. В митохондриях печени крысы присутствует две Форм» пирофосфатаэч. одна из которых (М • 16* кЛа) связана с . внутренней мембраной, а другая (И » 78 кДа) находится в матриксе. В митохондриях сердца крысы пИроФосФатаза представлена практически одной мембранной Формой.

2. Интактные метохондрии печени крысы не гидролизувт пирофосфат, находящихся- снаружи. В то же время, пирофосфатазная активность полностыв проявляется в митохондриях, в которых обработкой толуолом индуцирована проницаемость для низкомолекулярных соединений, а также в субмитохондриальных частицах с обратной ориентацией мембраны. Отсюда следует, что. активный центр мембранной пирофосфатазы ориентирован в матрихс митохондрий.

3. Связывание пироФосФатазы с мембраной различным образоН изменяет скорость ее модификации БН-реагентами разной степени . гидроФобности, что свидетельствует о контакте каталитических• суо'единиц Фермента с внутренней мембраной митохондрий.

4. Скорости гидролиза пирофосфата очищенной пирофосфатазой и митохондриями. обработанными толуолом, сходным образом зависят от концентрация субстрата и Ка1*. Простейшая схема катализа предполагает, что в обоих случаях существуют два пути реохиии. субстратом служит комплекс Мв-РР1, а ион металла активирует Фермент. В Физиологических условиях активность Фермента в митохондриях составляет около 50 нмолей/кин на 1 мг белка.

5. Несмотря на пысокуи активность пироФосФатазы, выделенные митохондрии содержат около 0,03 нмоля пирофосфата на 1 мг белка, что с учетом об'ема матрикса на несколько порядков превышает равновеснуя концентрация для системы РР1»"2Р1. Инкубация со Фторид-ионом при 37® увеличивает содержание РР( в митохондриях в 20 раз. _ 1 '■ .' --

: 6. Низкая скорость инактивации пирофосфатазы в митохондриях Фторид-ионом указывает на то, что лишь незначительная доля пирофосфата находится в митохондриях в свободном виде.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах I

1. Костенко £.В.. Смирнова И.Н.. Банков А.А., Аыаева С. М. Субклеточная и субмитохондриальная локализация неорганическоя лирофосфатази в сердце и печени млекопитающих.//Биохимия.-198J.- Т.48. N 5,- С.707-713.

2. Дубнова Е.Б., Америк A.U., Банков А.А. Мембранная неорганическая пирофосфатаза. Инактивация Фторидом в нитохонлриях и субмитохондриальных частицах.//Биол. мембраны.-1965,- Т.2, N г.- С.1В1-1В9.

3. Байкой А.А. . Дубнова Ё.В. , Пашков А.К). , Аваева С.И. Мембранная неорганическая пирофосфатаза. Различная реакционная способность ЬН-групп свободного и мембранно-связанного Фермента. //Виол, мембраны.- 1987.- Т.*. N 10,- С.1019-1025.

4. Volk S.E.. Uaykov A.A., Kostenko К.В., Avaeva S.H. Isolation, subunlt structure and localization of inorganic pyrophosphatase ot heart and liver aitochondria.//Biochin. et blopliys. acta.- 1983.- V.744. N 1 .-H.127-134.

5. Uaykov A.A., Unguryte A.. Oubnova E.B., Sairnova I.N., Kasho V.N. Comparison ot the structure and catalytic properties ot the cytosollc and altochondrial pyrophosphatases of o&mnalian cells.//International syaposium "Molecular organization ot biological structures", Abstract book. 7 1989,- Hobcow.- P.1-2.

Ъаш 64, Тирам Ш. Ттг. ЛГЛТИ.