F1F0-АТР-аза: строение мембранного сектора и импорт некоторых субъединиц в митохондриальный матрикс тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

РГБ ОД

ЗАЙЦЕВА ЛЮБОВЬ ГЕННАДЬЕВНА,

оч Дг.К ¿'К,-

I

Р^-АТР-аза: строение мембранного сектора и импорт некоторых субъединиц в митохондриальный матрикс

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва — 2000

Работа выполнена в учебно-научном центре Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова Российской академии наук и на кафедре биоорганической химии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научные руководители: кандидат химических наук,

с.н.с. Овчинникова Т.В.

кандидат химических наук, с.н.с. Гринкевич В.А.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

с.н.с. Гинодман Л. М.

доктор биологических наук, профессор Каменский А. А.

Ведущая организация: Московская государственная

академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 2000 года в часов на

заседании диссертационного совета Д 084.68.01 в Государственном научном центре по антибиотикам (ГНЦА) по адресу: Москва, 113105, ул. Нагатинская, 3 а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦА.

Автореферат разослан 2000 года.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Кузнецова С.М.

£о&. -Н сО

/-пл-а уу -У^. О

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актух1ьность проблемы Синтез и гидролиз АТР, сопряженные с транслокацией протонов через мембрану по градиенту электрохимического потенциата (Дцн+), осуществляется ферментом FiFo-ATP-азой (КФ 3.6.1.34.). Этот мембраносвязанный фермент играет важнейшую роль в энергообмене клетки.

FiFo-ATP-азы присутствуют во внутренней мембране митохондрий, тилакоидной мембране хлоропластов и цитоплазматической мембране бактерий. Несмотря на некоторые отличия с субъединичном составе и кататитических характеристиках FiFo-ATP-азы, выделенные из различных объектов, близки по строению и механизму действия.

Структурно и функционально митохондриатьная FiFo-ATP-аза может быть подразделена на два субкомплекса: периферический (Fi-ATP-аза), несущий центры синтеза и гидролиза АТР, и мембранный (сектор F0), осуществляющий трансмембранный перенос протонов. Каждый из субкомплексов имеет сложный полипептидный состав.

На данный момент хорошо изучено строение Fi-ATP-азы митохондрий. С помощью рентгенструктурного анатиза была определена ее трехмерная структура (Abrahams et al. 1994). Строение мембранного сектора F„ менее изучено. В настоящее время считается, что Fu митохондрий сердца млекопитающих может состоять примерно из 11 субъединиц (а. Ь. с. d. f. g, h, e. OSCP, Fi и A6L), стехиометрия и топография которых не совсем ясна. В настоящей работе нами были использованы различные липофильные фотоактивируемые метки для идентификации субъединиц F0 непосредственно контактирующих с липидами.

Важным направлением работы являлся также поиск веществ природного происхождения, оказывающих влияние на сопряжение транспорта протонов и синтеза АТР FiFo-ATP-азами. аналоги которых могут в датьнейшем использоваться для кросс-сшивающих экспериментов в структурных исследованиях.

Необходимо отметить, что только некоторые субъединицы F|F0-ATP-a3bi кодируются собственным митохондриальным геномом и синтезируются в матриксе митохондрий. Большинство субъединиц и, в частности, Р-субъединица Fi-ATP-азы кодируются ядерным геномом и синтезируются на цитоплазматических рибосомах как белки-предшественники. Белки-предшественники несут на N-конце сигнатьный пептид (пресиквенс). датее они импортируются в различные компартменты митохондрий при помощи спецнатьных препротеинтранслоказ (транслоказ белков-предшественников) и процессируются до зрелых форм соответствующих белков. Нарушения импорта белков-предшественников в митохондрии могут приводить к нарушению функционирования клеток. Исследование механизма импорта белков-предшественников субъединиц FiFo-ATP-азы позволит более полно представить условия, необходимые для нормального функционирования

митохондрий. Поэтому одной из задач данной работы явилось исследование импорта предшественника р-субъединицы FiFo-ATP-азы табака вида Nicotiana plumbaginifolia в митохондрии клубней картофеля.

Цель работы Целью работы являлось структурно-функциональное исследование F|Fc-АТР-азы. включающее в себя изучение строения Ра-сектора F;F0-ATP-a3bi митохондрий сердца быка и некоторых аспектов импорта предшественника Р-субъединицы FiFo-ATP-азы Nicotiana plumbaginifolia в матрикс митохондрий. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать при помощи липофильных фотоактивируемых меток в модельной системе (протеолипосомы) субъединицы Fo-сектора FiFo-ATP-азы митохондрий сердца быка, непосредственно контактирующих с липид&ми.

2. С целью поиска новых ингибиторов" или активаторов, действующих на F0 сектор FiF0-АТР-азы митохондрий, для последующего их использования в изучении строения F0 сектора, провести анализ ядов тропических жалящих муравьев (Paraponera clavata, Ectatoma tuberculatum и "tangarana".

3. Исследовать значимость свободных SH-rpynn импортируемого белка-предшественника и субъединиц транслоказ белков-предшественников внешней и внутренней мембран митохондрий (ТОМ- и TIM-комплексов) на импорт предшественника р-субъединицы FiFo-ATP-азы Nicotianaplumbaginifolia в митохондрии клубней картофеля.

Настоящая работа является частью комплексных исследований F|F„-ATP-a3Horo комплекса митохондрий, проводящихся в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и на кафедре биоорганической химии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научная новнзна и практическая ценность В настоящей работе впервые при помощи различных липофильных фотоактивируемых меток в модельной системе (протеолипосомы) было показано, что в FiFo-ATP-азном комплексе митохондрий сердца быка с- и Ь-субъединицы сектора F„ непосредствено контактируют с липидным бислоем. Эти данные могут служить подтверждением предложенной ранее Шнейдером и Альтендорфом модели строения F|F0-ATP-a3 (Schneider Е., Altendorf К., 19S7). Разработанные методы анализа идентификации кросс-сшитых продуктов аналогов липидов с мембранными белками и анализа мультисубъединичных белковых комплексов с помощью MALDI-масс-спектрометрии могут быть использованы при дальнейших исследованиях различных мембраносвязанных белковых комплексов.

Впервые был проведен анализ ядов жалящих тропических муравьев на наличие компонентов, оказывающих • влияние на каталитическую активность FiFo-ATP-азы

митохондрий сердца быка. Показано, что яд Paraponera clavata содержит белковые компоненты, незначительно стимулирующие АТР-азную активность, и низкомолекулярные вещества непептидной природы, обладающие сильной ингибирующей активностью. Компоненты яда P. clavata влияли только на каталитический Fi-комплекс FiF0-ATP-a3bi митохондрий сердца быка. Полученные результаты позволили разработать методы выделения различных компонентов ядов жалящих муравьев, которые в дальнейшем могут быть использованы для изучения структуры и механизма действия различных АТР-аз.

Впервые было показано, что наличие свободных SH-rpynn в транслоказе белков-предшественников внутренней мембраны митохондрий (TIM-комплексе) является необходимым для осуществления процесса импорта белков-предшественников в матрикс митохондрий клубней картофеля. Также установлено, что критические для процесса импорта SH-группы TIM-комплекса локализованы вблизи внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий. В перспективе результаты проведенных исследований могут быть использованы в экспериментах по изучению регуляции процессов импорта белков в митохондрии.

Апробация работы Основные результаты работы были доложены на межлабораторном коллоквиуме в Институте биоорганической химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Москва, июнь 2000 г.). Результаты исследований были представлены на пяти конференциях: конференции, посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (Санкт-Петербург, октябрь 1998 г.), 4-ых чтениях, посвященых памяти акад. Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино. ноябрь 1998 г.). школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, май 2000 г.), международной конференции "Biocatalysis-2000: fundamentals and applycations" (Москва, июнь 2000 г.) и 18-м международном Конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Бирмингем. Великобритания, июль 2000 г.).

Публикации По материалам исследований было опубликовано 7 и приняты в печать 2 работы.

Структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований с изложением результатов и их обсуждения, описания материалов и методов исследования, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 115 стр. машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами и 31 рисунком. Список литературы включает 270 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Использование различных липофильных фотоактнвируемых меток для идентификации субъединиц Fn-сектора непосредственно контактирующих с липидамн.

К Н*-АТР-азам F-типа относятся АТР-синтазы (FiFo-ATP-азы) митохондрий, хлоропластов и бактерий. Их основная роль заключается в синтезе АТР за счет

трансмембранного потенциала Д|!н\ а в отдельных случаях - в поддержании этого потенциала за счет гидролиза АТР. Несмотря на некоторые отличия в субъединичном составе и каталитических характеристиках FiFo-ATP-азы различных организмов обладают сходным строением и высокой гомологией аминокислотных последовательностей консервативных субъединиц. Множество экспериментальных данных указывает на сходный механизм катализа для АТР-аз F-типа. Это позволяет допустить единый принцип строения и механизма работы F|F0-АТР-аз, что в свою очередь открывает возможность комбинировать данные, полученные на различных объектах, для выяснения общих принципиальных черт структуры и функции фермента.

Структурно АТР-азы F-типа подразделяют на интегрированный в мембрану Fo-сектор и каталитический Fi-сектор. Наиболее простое строение имеет бактериатьная F|F0-ATP-a3a. Фермент состоит из 9 типов субъединиц. Митохондриальный фермент содержит более 15 типов субъединиц. Структура FjFj-ATP-азы по форме напоминает гриб. Каталитический F|-комплекс составляет сферическую глобулу "шляпки", от неё отходит "ножка", которая состоит из субъединиц как Fi-комплекса, так и Fo-комплекса. У митохондриальной F|F0-АТР-азы в состав "ножки" входят еще и ряд так называемых дополнительных субъединиц. "Ножка" соединяет Fi-комплекс с интегрированным в мембрану Fo-комплексом, образующим толстое основание "ножки" Структура F0 до сих пор остается спорной. Наиболее популярна на данный момент модель, в которой олигомер е-субъединиц представляет собой кольцо, а субъединицы а и b расположены снаружи кольца c/j-олигомера

Рнс. 1. Схематическое изображение взаиморасположения субъединиц бактериальной F,Fj-ATP-азы. Согласно (Engelbrecht S. and Junge W.. 1997).

(Schneider E. and Altendorf K., 1987; Groth G. and Walker J.E., 1997; Engelbrecht S. and Junge W.. 1997) (рис. 1). Положение "дополнительных" субъединиц в FiFo-ATP-азе митохондрий сердца быка остается невыясненным.

Нами были использованы различные липофильные фотоактивируемые метки для идентификации субъединиц сектора F0, непосредственно контактирующих с липидамн в модельной системе. Образование бислойных протеолипосом было подтверждено электронной микроскопией (данные не приводятся). Размер частиц варьировал в зависимости от состава липидов от 275 нм до 1200 нм. Реконструированная в FiF0-ATP-a3a митохондрий сердца быка сохраняла 25-50% начальной олигомишш-чувствительной АТР-азной активности. Это указываю на наличие функционально активного фермента в данной модельной системе.

Использование фотоактивируемых лнпидов, несущих раднонзотопиую метку.

На первом этапе работы в качестве фотоактивируемых гидрофобных зондов были использованы 1-ацил-2-[12-(2-диазоциклопентадиенкарбониламино)-[12-14С]-додеканои.л]-.м-глицеро-3-фосфохолин ([14C]-Dcp-AD-PC) и 1-ацил-2-[11-([|ь1]-2-диазоциклопентадиен-карбонилокси)-ундеканоил]-зп-глицеро-3-фосфохолин (['~"I]-Dcp-OU-PC), где ацил это -остаток пальмитиновой (70%). либо стеариновой (30%) кислоты. При облучении фотоактивируемых липидов УФ-светом диазоциклопентадиеновая группа последних генерирует высокоактивный карбен. способный взаимодействовать с неактивированной связью С—Н. Выделенную из митохондрий FiFo-ATP-азу встраивали в липосомы. содержащие наряду с другими липидами [14C]-Dcp-AD-PC либо [l2"IJ-Dcp-OlI-PC. а затем полученные протеолипосомы облучали ртутной лампой при а-ЗЗО нм. Для удаления липидов протеолипосомы обрабатывались смесью хлороформ : метанол (1:2, v/v). При этом значительная часть белкового компонента выпадала в осадок, который анализирован! с помощью SDS-электрофореза. Авторадиографический анализ кросс-сшитых продуктов белковой фракции, разделенных SDS-электрофорезом в ПААГ, показал, что по-видимому, с липидами могут контактировать трансмембранные домены а- и с-субъединиц, а также, заякоренные в мембране субъединицы с! и A6L (табл. 1, рис. 2).

Образование полосы 3 (рис. 2 г) может быть объяснено [|4С]-Оср-АО-РС-модификацией как гидрофобной ¿-субъединицы (М 18.5 кДа). так и еще более гидрофобной а-субъеднницы (.1/ 24 кДа). В этом случае присоединение остатка(ов) липидного зонда к J- и а-субъединицам увеличивает молекулярную массу этих субъединиц и, вероятно, уменьшает отрицательный заряд комплекса {[14С]-Оср-АО-РС-а(У)-субъединица}' mSDS по сравнению с комплексом {а(</)-субъединица}- nSDS (где n>m).

Полоса 2 (рис. 2 ¿") может соответствовать [14С]-0ср-А0-РС-модификации относительно

(а) (б) (в) (г)

Рис. 2. Электрофорез в ПААГ в присутствии SDS FiFo-ATP-азы митохондрий сердца быка, модифицированной [MC]-Dcp-AD-PC. Субъединицы а и Д окраски кумасси R-250 (a); FiF„-ATP-aia. иооифицированная ["C]-Dcp-AD-PC. окраска кумасси R-250 (б): FiF„-ATP-a3a. модифицированная [uC]-Dcp-AD-PC. окраска серебром (к). аапшраОиограмма ':> Т - ATP ADP-/npaiic.ioKiin:op.

гидрофильной й-субъединицы (присоединение гидрофобной метки. увеличивая гидрофобность этой субъединицы, уменьшает кажущуюся молекулярную массу модифицированной субъединнцы!.

Кросс-сшигый продукт, соответствующий полосе чуть ниже полосы /-субьедиппцы (полоса 1 на рис. 2 .') скорее всего мог образоваться за счет взаимодействия [,4Cl-Dcp-AD-PC с ATP/ADP-транслокатором (М~ 33 кДа. высокогидрофобный белок), незначительные количества которого всегда присутствовали в препаратах FiFo-ATP-азы. Эти количества практически не видны при окрашивании ПААГ кумасси R-250 (рис. 2 о), но могут быть выявлены при обработке геля серебром пли при окрашивании кумасси R-250 субъединиц FiF.rATP-азы. предварительно перенесенных с ПААГ на PVDF-.мембрану. Образование полосы 1 может быть, в принципе, объяснено также и [uC]-Dcp-AD-PC- модификацией •/-субьединицы. когда молекулы присоединившегося липидного зонда могут дополнительно маскировать положительные заряды >субъединицы.

В дальнейшем были проведены эксперименты по идентификации кросс-сшитых продуктов с помощью поликлональных антител к отдельным субъедпнпцам F|F„-ATP-a3b[ митоходрий сердца быка (табл. 1). Были получены антитела к а-, /?-. у-субъединицам и OSCP. по к сожалению нам не удалось получить антитела к а-. Ь-. с-, d- и другим гидрофобным субъединицам Fo-сектора. Это объяснялось как очень сложным методом выделения этих субьединиц (и вследствии этого, невозможностью наработать значительных количеств чистых субъединиц), так и их крайне низкой антигенном активностью.

Таблица 1.

Модификация субъединиц РтРо-АТР-азы митохондрий сердца быка липофильными _фотоактивируемыми метками, содержащими радиоизотопы. _

Субкомплекс Субъелчницы р|Р0-АТР-азы Модификация [|4С]-Оср-АО- Модификация [1:*1]-Оср-Ои- Модификация [1:![]-ТГО Использование антител для

митохондрий РС РС идентификации

АТР-азы сердца оыка положения объединицы

а - - - да

Р - - ± да

Р, У ± ! ± да

0 - - - нет

5 о о нет

(«СР - ! да

а + + | нет

Ь ± + нет

с + + нет

Р.) ± ± 1 нет

е - - \ нет

Г п о ? 1 нет

а ? ? •> нет

Рб нет

А61_ ± ± нет

"+" - модификация: - вероятная модификация: ••—■• - отсутствие модификации; "'.'" -затруднено точное определение положения на авторадиограмме полосы, соответствующей данной су оъединице.

Чтобы повысить удельную радиоактивность зонда, в лаборатории химии липидов ИБХ РАН был разработан новый метод синтеза зонда с включением не [14С]. а ['""^-изотопа. Результаты, полученные с [1:'1]-Оср-Ои-РС. оказались сходными с полученными в экспериментах с [|4С]-Оср-.АО-РС (табл. 1).

Модификация Р^.гАТР-аш фотоактпвнруемым реагентом ['"'1|-ТШ.

Итак, как видно из вышеизложенного, перед нами возникли определенные трудности при определении на авторадиограммах местоположения полос, соответствующих кросс-сшптым продуктам. Поэтому в качестве липофильной метки был также использован фотоактпвнруемым реагент 3-(трифторметил)-3-(т|:'[-иодфенил)диазирнн (['"1]-ТЮ). имеющий гораздо меньшую молекулярную массу. Р^-АТР-аза встраивалась в липосомы из фосфолипидов бобов сои. Затем протеолипосомы инкубировали с [|:Т]-ТГО и облучали УФ-светом. Основное включение метки приходилось на субъединицы а, с и Ь (табл. 1. рис. 3).

Вероятно, что ['":1]-ТЮ включается также в субъединицу А6Ь. Таким образом, видимость модификации л-субьединицы (рис. 2) либо [12"1]-Оср-Ои-РС

(табл. 1) вероятнее всего может объясняться изменением электрофоретической подвижности модифицированной а-субьединицы. При данной концентрации ['"Т]-ТГО модифицировал также у-субьединицу р.-АТР-азы. а при более высокой - даже /?-субъединицу. которая не имеет контактов с мембраной (табл. 1). Этот факт указыват на то. что [1:'Т]-ТЮ является

ИИ

1

Ъ-шт *

а- и Щ

5—

А6Ь-

с-

II

(г) (б)

Рнс. 3. Электрофорез в ПААГ в присутствии БЭЭ Р|Р0-АТР-азы митохондрий сердца быка, модифицированного ['"31]-ТЮ. Окраска кумасси Я-250 (а), авторадиограмлш (6). Г - АТР'АОР-трапс.юкатор.

неспецнфичнон меткой и способен включатся не только в липидный бнслой. но н в гидрофобные карманы субъедипиц Р|Р0-АТР-азы.

Использование .МЛЬОЬмасс-спеьпромегрни для идентификации суиъсдшшц Р()-сектора Р|К„-АТР-азы, модифицированных фотоактивируемыми липилами.

Возникшие осложнения при анализе кросс-сшитых продуктов (субъединиц Р„ меченых |'4С|-Оср-АО-РС либо ['"'[¡-Оср-Ои-РС) заставили нас прибегнуть к новой методологии с применением МА1.01-масс-спектрометрни. Мы использовали нерадиоактивные аналоги фотоактивируемых липидов- Рср-АО-РС и Оср-ОЬ'-РС. Чистота и строение Оср-АО-РС н Оср-Ои-РС наряду с обычными методами были подтверждены также методом \-IALDI-Macc-спектрометрии (данные не приводяться).

В масс-спектре Р|Р„-АТР-азы (в дальнейшем будет обозначаться как "стандарт") (рис. 4) практически все субъединицы, входящие в его состав, присутствуют в виде молекулярных ионов ( [МП. Так, пики с /л/г 5659,3, 7969,2, 8084, 8950.4. 10210.2, 11264,7. 15062,3, 18534.3. 20830,1, 24741,1, 30134.6, 51,512,7. 55149,1 с учетом погрешности метода можно соотнести с молекулярными ионами субъединиц е (М 5651 Да). А61. (М 7937 Да), е (М 8189 Да). Р6 (Л/ 8958 Да)./(Л/ 10164 Да), £ (М 11286 Да). 5 (ЛП5065 Да), Л(.V/ 18560 Да), ОБСР (Л/20945 Да). а (.1/24788 Да), у (Л/30236 Да)./? (Л/51563 Да)и а (Л/55261 Да), соответственно. Кроме того, некоторые субъединицы в условиях получения данного масс-спектра образуют двузарядные ноны, соответствующие пикам с пь; 27592,8 (а-субъединица). 25719 (/(-субъединица). 12325,6 (й-субъединица) и 3846.0 (с-субъединица). Необходимо подчеркнуть, что

субъедншша b фиксируется в масс-спектре только а виде двузарядного иона. Пик с mz 17178.6 соответствует трехзарядночу нону /У-с\бъединнцы. Слбъеднница с в масс-спектре присутствует в виде кластерного нона [М-К]* (пик с mz 7641.8). Пик с mz 33055 был соотнесен с молекулярным ионом ADP'ATP-транслокатора (ряс. 4). Определенные ¡атруднення возникли при соотнесении пиков с m/z 14630.2 и 22893. При соотнесении масс-спектров Fi F.,-А ТР-азы и изолированного F,-комплекса (данные не приводяться) был сделан вывод о том. что цик с m/z 14630.2 является, по всей видимости, продуктом распада молекулярного нона, соответствующего 3- субъедижше.

50 -

40

"341 3

IQ-jj 2 / Й]1" ИГ-и.' ' ) 1

/¡¡р.

JHW 1 1с -V /mimoW

Рт:. 4. Масс-спектр Г' F - \ i Р-л ¡ы мигочиндркн сердца оыка в ^5% м ;.рлп[>:ш<)й кислоге (Maipnua 0.i5M Л.э-дигиарокспбетойноп khc.ioic и смеси 25"'о мсгано;ь0.'| % трифторуксусмач кислота. мощность лачера 75%. число лазерных ударов 145) Г - АСР'ДТР-транслокатор.

Образцы для масс-спектрочетрнческото анализа немоднфнцнрованной F|F,,-ATP-au.i готовились следующим образом: F|F„-ATP-a3a встраивалась методом диализа в липосочы. содержащие дичирпстонлфосфагидилхолпн : падьмитоилолеоилфосфатиднлхолнн (I : Ii. :ак-м проверялась чувствительность АГР-азной активности встроенного фермента к олигомишшу. После делипидизацни протеолипосом смесью хлоро<|)орм-метанол (1:2 \-/\ ) и последующего перерастворения белкового осадка в 75"'о НСООН в его масс-спектре <рнс. 5 ч) пленiпфицпру ю гея пики, соответствующие молекулярным ионам следующих субьедпшш ферме!Iга: г: ( n/z 5679). / \m/i 10355). ц (n/z 1 1333). <) 1mz 151 10). d (m/z 18731 i. OSC'P (n/z 21N92). и Ui/z 24773). (m/z 30382). ß (m/z 51497). а (m z 55199). Кроме того, как н в случае eian.iapia. а- и /Лсуоъедпшшы в условиях получения данного масс-спектра образуют двухрядные ионы (пики с m/i 27628 (¿-суоъединина). m/z 25871 (//-субьедшпша)). Ь-(.уоъсдинппа присутствует в масс-спектре только в форме двузарядного попа (ник с т/

12403). Пик с m/z 17360 соответствует трехзарядному иону /i-субъедшшцы. Субъединцца с (тог 7628) в данном масс-спектре присутствовала в виде кластерного иона [M+Na]+. Следует отметить, что субъединица с всегда присутствовала в спектрах в виде кластерных ионов с калием или натрием, но никогда в виде молекулярного иона, не содержащего катионов этих металлов. Этот факт подтверждается также в работах Гриффитса (персональное сообщение), касающихся масс-спектрометрии субъединицы с. выделенной разными методами из различных источников. Присутствие ионов Na' или К' в субъединице с (или их ассоциация с ней) зависит как от условий выделения FiFo-ATP-азы, так и от длительности хлороформ-метанольной экстракции.

В масс-спектре хлороформ-метанольной фракции (рис. 5 о) идентифицированы пики, соответствующие молекулярному (m/z 24725) и двузарядному (m/z 12503) ионам а-субъединицы, с-субъединица в данном масс-спектре образует кластерный ион [М + К]+ (m/z 7650) и двузарядный ион (m/z 3843). Пик с m/z 15353, вероятно, соответствует молекулярному иону ¿-субъединицы. Таким образом, масс-спектрометрический анализ этой фракции показал, что при делипидизации смесью хлороформ-метанол (1:2) в хлороформ-метанольной фракции частично содержаться субъединицы я и с, а также субъединица 5.

Для анализа модифицированного фермента была использована F|F0-ATP-a3a, встроенная в липосомы, содержащие Dcp-OU-PC либо Dcp-AD-PC наряду с другими липидами. После УФ-облучения протеолипосом и их последующей делипидизации в масс-спектре фракции белкового осадка модифицированного фермента (рис. 5 а) присутствует полный набор пиков, характерных для аналогичной фракции немодифицированной FiFo-ATP-азы — это пики, соответствующие молекулярным ионам следующих субъединиц: s (m/z 5685), / (m/z 10410), g (m/z 11341), S (m/z 15108), d (nv'z 18731),OSCP (m/z 20943), a (m/z 24762), у (m/z 30339), ß (m/z 51540), a (m/z 55320). /?-Субъединица в данном масс-спектре, регистрируется также в виде двузарядного (пик с m/z и 25845) и трехзарядного (пик с m/z 17360) ионов. Необходимо отметить отсутствие пиков, соответствующих двузарядным ионам а- и Ь-субъединиц, которые присутствовали в спектрах стандарта и белкового осадка немодифицированной F|F0-ATP-a3bi (рис. 5 а). Субъединица с (m/z 7649) в масс-спектре присутствует в виде кластерного иона состава [М+К]+.

Наряду с пиками, описанными выше, в масс-спектре белкового осадка модифицированного фермента отмечено появление новых пиков. Появление пика с m/z 8305 можно объяснить присоединением одной молекулы фотоактивируемого липида к с-субъединице (m'z 7649), что является доказательством непосредственного контакта олигомера с-субъединиц в составе сектора F0 с мембранным бислоем. Появление плохо разрешенного пика в районе 14000 m/z, а также отсутствие пика, соответствующего

двузарядному иону b-субъединицы, позволило сделать вывод о модификации фотоактивируемым липидным зондом ¿»-субъединицы FiFo-ATP-азы, и следовательно, о ее непосредственном контакте с мембранными липидами. Полученные данные подтверждают модель, предложенную рядом исследователей (Groth G. and Walker J.E., 1997; Engelbrecht S. and Junge W., 1997, Schneider E. and Altendorf R., 1987). При масс-спектрометрическом анализе FiFo-ATP-азы, полученной после- УФ-облучения протеолипосом, содержащих фотоактивируемые липиды, не были идентифицированны кросс-сшитые продукты гидрофобных субъединиц A6L и а с этими липидами. Однако на основании этих фактов нельзя однозначно утверждать, что A6L и я-субъединица не контактируют с липидами мембраны. Отсутствие модификаций субъединиц A6L и а-субъединицы может объясняться

1 i

Рис. 5. Сравнение масс-спектров модифицированной и немодифицированной FiFo-ATP-азы: белкового осадка полученного после делипидизации протеолипосом (а), хлороформ-метанольной фракции (б). Масс-спектры стандарта (Р - 75%, N - 145) (черная линия (1)) (а, б), белковых осадков: немодифицированной (Р - 75%, N - 160) (светлосерая линия (2)) (а) и модифицированной F|F0-ATP-азы (Р - 84%, N - 174) (темносерая линия(З)) (а), хлороформ-метанольных фракций: немодифицированной (Р - 80%, N - 139) (светлосерая линия(2)) (б) и модифицированной F,F0-ATP-азы (Р - 84%, N - 153) (темносерая линия(З)) (б) в матрице 0,15М 2.5-дигидроксибензойная кислота в смеси 25%метанол/0,1 % трифторуксусная кислота. Р- мощность лазера, N - число лазерных ударов.

либо недостаточной концентрацией продуктов кросс-сшивок, либо затруднениями при их анатизе методом MALDI- масс-спектрометрии.

В масс-спектре хлороформ-метанольной фракции модифицированной FiFo-ATP-азы (рис. 5 б) идентифицированы пики, соответствующие молекулярному (m/z 24853) и двузарядному (m/z 12457) ионам а-субъединицы, с-субъединица в данном масс-спектре образует кластерный ион [М+К]* (т/: 7643). Пик с m/z 15353 соответствует молекулярному иону 5-субъединицы, а пик с m/z 9014 — молекулярному иону субъединицы F6. Наличие пика с m/'z 8095 можно объяснить присоединением одной молекулы фотоактивируемого зонда к с-субъединице (m/z 7642), что также является окончательным подтверждением непосредственного контакта с-субъединицы в составе сектора Fa с мембранным бислоем.

Таким образом, с использованием фотоактивируемых анатогов липидов, а так же 3-(трифторметил)-3-(т1251-иодфенил)диазирина показано, что в F0Fi-ATP-a3e митохондрий сердца быка с- и 6-субъединицы протон-транслоцирующего сектора F0 непосредственно контактируют с липидным бислоем. Это подтверждает предложенную ранее Шнейдером и Альтендорфом модель строения АТР-синтаз F-типа.

Анализ ядов тропических муравьев на наличне компонентом, оказывающих влнянне на каталитическую активность FiFo-ATP-азы митохондрий сердца быка.

Основная задача этого этапа исследования состояла в поиске новых регуляторов (ингибиторов или стимуляторов) АТР-азной активности FiFo-ATP-азы митохондрий, взаимодействующих с мембранным сектором F0 этого фермента (с целью дальнейшего их использования в качестве молекулярных инструментов для изучения строения F0). Как известно из литературных данных, одной из возможных мишеней биологического действия ядов перепончатокрылых (например, яда Vespa orientalis) (Barr-Nea L. et al., 1988) являются митохондрии и, в частности, система окислительного фосфорилирования.

В экспериментах были использованы ядов трех тропических муравьев Рагаропега clavata (PcV), Ectatoma tuberculatum (EtV) и "tangarana" (TV).

Было исследовано влияние этих ядов на каталитическую активность ключевого фермента системы окислительного фосфорилирования - FiFo-ATP-азы митохондрий сердца быка. Как видно из таблицы 2, яды EtV и TV не оказывали влияния на АТР-азную активность СМЧ, полученных из митохондрий сердца быка, в то время как яд PcV заметно ее ингибировач, причем степень ингибирования активности зависела от концентрации яда.

При гель-хроматографии PcV на биогеле Р-30 (область фракционирования 2,5 - 40 кДа) в неденатурирующих условиях (рис. 6) около 74% всего белка PcV элюироватось в составе фракции PcV-1. Согласно данным анатитического SDS-электрофореза, фракция PcV-1 содержала полипептиды с М90,44,25,22, 19 и 13 кДа. С большой долей вероятности можно

Таблица 2.

Влияние яда тропических муравьев на АТР-азную активность СМЧ.

Добавленный яд'

Относительная АТР-азная _активность. %_

100

TV

-100

EtV

-100

PcV

65

Яд был добавлен в концентрации 0,3 мг/мп. Время предварительной инкубации с ядом 10-15 мин.

было предположить, что в состав РсУ полипептиды с М 13, 19, 22 и 25 кДа входят в виде полисубъединичных белков, состоящих из двух или более субъединиц. Фракция РсУ-2, согласно данным аналитического электрофореза, содержала полипептиды с М ~ 3-4 кДа. а также полипептид с М ~ 2,7 кДа, являющиийся по результат^ ^-концевого секвенирования нейротоксином понеротоксином. Фракции РсУ-З - РсУ-5 содержали низкомолекулярные вещества непептидной природы, которые по данным К.А. Плужникова с соавторами (РШгЬгнкоу К.А. и а1., 1991) являются ацилированными и фосфорилированными производными димера К-аиетилглюкозамина. содержащими ковхтентно связанный остаток урацила.

10 20 30 40 50 60 70 80 мл Рис. 6. Хроматография PcV на колонке (1 х 90 см) с биогелем Р-30 (тонкий), в 20 чМ бикарбонате аммония, рН 8,0 Скорость элюции 10 мл/ч, V0 = 24 мл.

Было исследовано влияние различных фракций PcV, полученных после гель-хроматографии (рис. 6), на каталитическую активность FiFo-ATP-азы митохондрий сердца быка (табл. 3). Как видно из таблицы 3, фракции PcV-2, PcV-4 и PcV-5 не оказывали влияния на АТР-азную активость СМЧ, комплексов FiF0 и F| митохондрий сердца быка. Сильной ингибирующей активностью обладали лишь низкомолекулярные вещества непептидной природы (PcV-З), тогда как белки фракции PcV-1 незначительно (~30%) стимулировали АТР-азную активность. Причем вещества, содержащиеся как во фракции PcV-1, так и во фракции PcV-З влияли только на каталитический Fi-комплекс FiFo-ATP-азы митохондрий сердца быка.

^zao 0.2 -

0.1

J

Таблица 3.

Влияние фракций яла РсУ на АТР-азную активность СМЧ, комплексов Р1Р0 и Р| митохондрий

сердца быка.

Добавленные Изменение АТР-азной активности

компоненты яда

PcV СМЧ F,F„ F,

PcV-1 + + +

PcV-2 0 0 0

PcV-3 - - -

PcV-4 0 0 0

PcV-5 0 0 0

Условные обозначения: "+" - стимуляция активности;"'-" - ингибирование активности; "'О" -нет влияния на активность. Компоненты РсУ были добавлены в концентрации 0,5 мг/мл. Время предварительной инкубации с компонентами яда 10-15 мин.

Таким образом, с целью поиска новых природных ингибиторов F0Fi-ATP-a3 митохондрий был проведен анализ ядов тропических муравьев Ectatomma tuberculatum, Paraponera clavata, "tangarana". Установлено что только яд Paraponera clavata содержит компоненты небелковой природы, ингибирующие АТР-азную активность Fi-комплекса F0F|-АТР-азы. Все три яда не содержат компонентов, непосредственно взаимодействующих с протон-транслоцирующим сектором F0 F0F]-ATP-a3bi митохондрий сердца быка.

Исследование влнянии свободных SH-групп на различные стадии импорта предшественника В-субъединнцы FiF„-ATP-aiM Nicntiana plumbaqinifolia в митохондрии клубней картофеля

Следующим направлением работы было исследование процесса импорта субъединиц АТР-азмого комплекса в матрикс митохондрий. Для изучения этого процесса были использованы предшественник Р-субъединицы FiFo-ATP-азы табака вида Nicotiana plumbaginifolia (синтезированный в бесклеточной системе лнзата ретикулоцитов кролика) и свежевыделенные митохондрии клубней картофеля.

Следует отметить, что в настоящеее время является общепризнанным тот факт, что для импорта белка-предшественника в матрикс митохондрий, его молекула должна быть развернута. В процессе развертывания молекулы белка-предшественника участвуют различные шапероны (Hsp 70, MSF, PBF). Развернутый белок-предшественник импортируется в матрикс. Импорт белков-предшественников в матрикс осуществляют две транслоказы белков-предшественников, локализованных во внешней (ТОМ-комплекс) и внутренней (TIM-комплекс) мембранах митохондрий (рис. 7). Обе транслоказы представляют собой мультисубъединичные белковые комплексы, строение которых не совсем ясно. Только в момент импорта ТОМ- и TIM-комплексы взаимодействуют друг с другом, образуя канат импорта (т.н. "'импортную машину"), через который и протягивается развернутая полипептидная цепь белка-предшественника.

Остальное время ТОМ- и TIM-комплексьг существуют независимо друг от друга, подвергаясь латеральной диффузии во внешней и внутренней мембране митохондрий соответственно. Для импорта белка-предшественника необходимо наличие: а) разности электрохимических потенциалов на внутренней мембране митохондрий, б) АТР в системе импорта.

Согласно литературным данным процесс импорта белков-предшественников в органеллы клетки чувствителен к влиянию реагентов способных модифицировать экспонированные SH-группы остатков Cys в белках системы импорта (Hachiya N. et al., 1993; Sheffield W. P. et al., 1990; Friedman A.L. and Keegstra K„ 1989; PilonM. Et al., 1992; Seedorf M. and Soll J., 1995; Wagner С. et al.. 1994).

В экспериментах, представленных в данной работе, были использованы следующие реагенты: восстанавливающий - дитиотреитол (ДТТ). модифицирующий проникающий -

Рис. 7. Схема импорта процессируемых белков-предшественников, кодируемых ядерным геномом, в чатрикс митохондрий (согласно (РГаппег N. е! а1., 1997)). Цифрами обозначены субъединицы ТОМ-комплекса и Т1М-субкомплекса в соответствии с их молекулярными массами, знаком •'?" - возможные неидентифицированные компоненты Т1М-комплекса. А - рецепция белка-предшественника с у б к о м пл е кс о м То т> 7-Го гп 70-То гп 7 2; Б - рецепция белка-предшественника субкомплексоч Тош20-Тош22.

Межмембранное пространство

фолдинг

Зрелый белок

С

1(1

Л'-этнлматеимпд (ЫЕМ). модифицирующий непроникающий - 3-(Л-мпенмидопропионил)бкотин (МРВ). а также реагент тнол-дисульфидного обмена 5.5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота) (ОТ^'В. реактив Эллмана ) и окисляющий реагент Си"*. Два последних реагента способны индуцировать образование внутри- и межмолекулярных дисульфидных мостиков.

Влияние реагентов, модифицирующих 5Н-грунпы, на импорт предшественника (3-субьедшшцы Р|Г„-АТР-азы (ррГ^в митохондрии

Предшественник [5Р| (59 кДа) импортировался в митохондрии и протеолнтически процессировался в магриксе после импорта до зрелого белка (53 кДа) (рис. 8). Эффективность импорта вычислялась по количеству зрелого белка в митохондриях после обработки последних протеиназой К. Так как эффективность импорта варьировала ог одного эксперимента к другому в зависимости от качества клубней картофеля в каждом жеперименте сравнивали эффективность импорта и связывания с соответствующими показателями в контрольном эксперименте без добавления реагентов на БН-грутшы. которые принимали за 100"о.

Введение в систему импорта 1мМ ДТТ стимулировало процесс импорта на 50%. Добавление 1мМ МКМ. 1мМ МРВ. 1м\1 ЭТМВ пли 100 мкМ Си"" ингабировато импорт на 80-99%. Влияние Си"' могло быть нейтрализовано добавлением 1мМ ДТТ. в результате чего эффективность импорта восстанавливается (рис. 9). Как известно, импорт белков в митохондрии требует нагичия разности электрохимических потенциалов на внутренней мембране митохондрий (Дч/). со ¡лающейся и результате функционирования дыхательной цепи мпюхоидрий. Поэтому было исследовано влияние модификации УН-групп па дыхание митохондрий клубней картофеля. Митохондрии инкубировались с реагентами, модифицирующими 5Н-группы. в тех же условиях, которые применялись в экспериментах по импорту. Преипкубация митохондрий с реагентам» на БН-группы (1мМ МЕМ. 100 мкМ Си"') не оказывата какого-либо влияния на показатели дыхательной активности митохондрий.

- рк |»рк1-рк1<-рк|-рк,*рк

Щ'И1 ||>||

контроль 1 1 1 2

Рнс. 8. Влияние реагентов, модифицирующих БН-группы, на импорт рРР( в митохондрии клубней картофеля. Авторадиограмма образцов после электрофореза в Г1ААГ в присутствии 505. Цифрами обозначены образцы после обработки: 1 - 1 чМ МРВ. 2 - 1 ч.М йТМВ. 3 - I мМ ДТТ. 4 - 1 «М N£N1. 5 - 100 мкМ СиС1;, 6 - 100 мкМ СпС1: с последующим добавлением 1 чМ ДТТ. П - предшественник (3-субьедипнцы Гi-ATP-aii.il 3 - зрелая форма Р-субъединицы Р|-АТР-а1ы. РК - протеина ¡а К.

Рис. 9. Эффективность импорта pßF, в митохондрии клубней картофеля, обработанные: 1 - I мМ ДТТ. 2 - 1 мМ NEM, 3 -1 мМ МРВ, 4 -1 чМ DTNB. 5 - 100 чк.М CuSO.. 6 - 100 мкМ CuSOj с последующим добавлением 1 мМ ДТТ (усреднение данных 8 экспериментов). За 100% принимался импорт pßF, в митохондрии клубней картофеля в экспериментах без добавления реагентов на SH-группы.

Остатки Суз присутствуют в различных компонентах системы импорта белка в митохондрии (Tom-70 (Hase T. et al.. 1983). Тот37 (Gratzer S. et al.. 1995). Tom40 (Baker K.P. et al. 1990). Tom20 (Heins L.and Schmitz U.K.. 1996). Tim 17 (Börner U. et al.. 1996), Tim23 (Börner U. et al.. 1996). mtHsp70 (Watts F.Z. et al., 1992)), а также в самом предшественнике ß-субъедшпшы F|F„-ATP-03bi .V. plumbaginifoliu (Boutry M. and Chua N'.-H.. 1985). Следовательно, было интересно выяснить SH-группы каких из этих компонентов важны для импорта белков-предшественников в митохондрии.

Влияние реагентов, модифицирующих SH-группы, на свшывание pßFi с митохондриями

Связывание белка-предшественника опосредовано наличием рецепторов ТОМ-ко.мплекса (рис. 7), так как обработка митохондрий протеиназой К перед добавлением белков-предшественников снижает эффективность связывания до 2% от исходного.

Оценка связывания белков-предшественников с поверхностью митохондрий в условиях нормального импорта показывает, что ДТТ не оказываю какого-либо влияния на этот процесс, а присутствие NEM. DTNB либо Си"* увеличивало эффективность связывания на 70-80°о. тогда как МРВ ингибировало связывание на 40% (рис. 10 а).

В случае ингибирования импорта при отсутствии разности электрохимических потенциалов на внутренней мембране митохондрий (Дч/) после добавления олигомицина или валиномнцина наблюдалась сходная картина: стимуляция связывания белков-предшественников с митохондриями в присутствии ДТТ. NEM. DTNB либо Си"' и ингибирование связывания добавлением МРВ (рис. 10 о). Стимуляция связывания может быть обусловлена индукцией неспецифических сайтов связывания за счет конформационных изменений после модификации SH-rpynn либо формирования днеульфидных мостиков.

Уменьшение эффективности связывания в присутствии МРВ можно объяснить стерическими причинами Этот вывод подтверждается и тем фактом, что меньший по размеру 1МЕМ. модифицирующий БН-группы сходным образом, не ингибирует связывание.

Итак, можно сделать вывод, что ингибирование импорта N£N<1. ОТОВ и Си"* не может быть объяснено уменьшением числа сайтов связывания в ТОМ-комплексе или снижением их аффинности к белку-предшественнику после модификации БН-групп ТОМ-комплекса.

00 (б)

Рис. 10. Влияние реагентов, модифицирующих SH-группы, на связывание p[5F| с митохондриями клубней картофеля. Эффективность связывания pPF, с митохондриями при наличии мембранного потенциала Ду (усреднение данных 8 экспериментов) (я) и в отсутствие мембранного потенциала Ду (усреднение данных 5 экспериментов) (о) после обработки митохондрий: 1 - 1 мМ ДТТ. 2 - 1 мМ NEM, 3 -1 мМ МРВ. 4 -1 мМ DTNB. 5 - 100 мкМ CuSOj, 6 - 100 мкМ CuSO, с последующим добавлением 1 мМ ДТТ. За 100% принималось связывание pPF] с митохондриями кл\бней картофеля в экспериментах без добавления реагентов на SH-группы.

Влияние модификации SH-rpvnn белка-предшественника ppFi на его импорт в митохондрии

Белок-предшественник pPFi обладает двумя остатками Cys: Cys97 и Cys214 (Boutry М. and Chua N.-H., 1985). Для ответа на вопрос о том. не является ли ингибирование импорта реагентами на SH-группы результатом модификации этих Cys, была проведена предварительная инкубация белка-предшественника с NEM. МРВ, DTNB и Си2* перед импортом. Было показано, что модификация p(3Fi не оказывала влияния на связывание белка-предшественника с митохондриями (рис. 11 а), тогда как эффективность импорта варьировала в зависимости от реагента (рис. 11 б). Импорт NEM-модифицированного ppFi стимулировался на 63%. МРВ модификация ингибировала импорт на 23%. Поскольку NEM не ингибировал импорт, то эффект, оказываемый модификацией МРВ. может быть связан со стерическими помехами.

Преинкубация белка-предшественника с Си2+ ингибировата импорт на 14%. тогда как в случае DTNB-модификацни наблюдалось ингибирование на 80%. Проверка положения соответствующих остатков Cys в трехмерной модели структуры Р-субъединицы Fi-ATP-азы митохондрий сердца быка (Abrahams J.P. et al.. 1994) показала, что остатки Cys в р-

(а) (б)

Рис. 11. Связывание (усреднение данных 5 экспериментов) (я) и импорт (усреднение данных 5 экспериментов) («) рРР|, модифицированного реагентами на БН-группы: 2 - 1 мМ \Е\1. 3 -! мМ МРВ. 4 -1 мМ ОТ^В. 5 - 100 мкМ СиБСЬ 1 (а) и 1 (б) - уровень связывания с митохондриями и импорта в матрикс (^модифицированного ррр:. соответственно.

субъединице Е|-АТР-азы Л' Р1итЬарт(Ыш вероятно, локализованы в одном домене. Эти остатки могут формировать внутримолекулярные дисульфидные мостики при обработке ЭТХВ пли Си"", что приводит к формированию импорт-некомпетентной конфирмации белка-предшественннка н ингноирует импорт. С другой стороны, стимулирующий эффект М:М показывает, что необратимая модификация остатка Суэ в белке-предшественнике способствует его разворачиванию и. как следствие этого, облегчению процесса импорта. Возможность того, что \'ЕМ-модифицнрованный рР Р | .V. Р1итЬарпИ'оИа частично рашернут. поддерживает и тот факт, что обработка р(ЗР■ 6М мочевиной стимулировала импорт, а дополнительная обработка такого белка-предшеетвешшка \ЕМ не вызывала дополнительной стимуляции импорта.

Таким образом, можно отметить, что ингибирующий эффект \ЕМ на импорт не может быть объяснен модификацией белка-предшественника этим реагентом.

Было также исследовано влияние реагентов на ЭН-группы на импорт МЕМ-модифнцированного рРРI Митохондрии были преинкубированны с реагентами на 5Н-группы с последующей инкубацией в системе импорта с >.'ЕМ-модифицированным предшественником (3Р, (рис. 12).

(Сак зидно. ДТТ не оказывал влияния на импорт, гогда как \ЕМ. МРВ. ОГ\В и Си" ингибнровали этот процесс. Эффект Си"" мог быть нейтрализован добавлением ДТТ. Эти результаты подтверждают предположение, что остатки Суя белка-предшественника не вовлечены во взаимодействие с 5Н-г?уппами "импортной машины митохондрий ".

■V -

„^ -

и

Г

г.

4i т

: -,

Ш

Рис. 12. Эффективность импорта NEM-модифицированного pPF| в митохондрии клубней картофеля, обработанные: 3 - 1 мМ ДТТ, 4 - 1 мМ NEM. S -1 мМ МРВ, 6 -1 мМ DTNB, 7 - 100 мкМ CuSOj, 8-100 мкМ CuSCXi с последующим добавлением I мМ ДТТ. Уровень импорта в митохондрии не обработанные реагентами на SH-группы: 1 - немодифицированого pPFb 2 -NEM-модифицированного pPF|. Усреднение данных"5 экспериментов.

Влияние реагентов, модифицирующих SH-группы, на импорт pPFi в митопласты

Для уточнения локализации SH-групп. которые оказывают влияние на импорт, был исследован импорт белка-предшественника в митопласты, то есть в митохондрии с удаленной внешней мембраной. Получение митопластов проводили с помощью осмотического шока. Разрушение внешней мембраны проверяли по наличию цианид-чувствительной цитохром с оксидазной активности (Douce R. et al., 1972). Целостность внутренней мембраны митопластов проверялась вестерн-блоттом с антителами противмитохондриатьного матриксного белка серингидроксилметилтрансферазы.

Как можно видеть, ДТТ (так же как и в случае митохондрий) незначительно стимулировал импорт, тогда как NEM, МРВ, DTNB и Си2+ ингибировати импорт на 50-85% (рис. 13). Эффект Си2+ мог быть нейтратизован добавлением ДТТ. Таким образом, удатение

s

S 40

1

il

т

1 2 3 4 5

7 »

Рис. 13. Эффективность импорта ррр| в митопласты. обработанные: 3 - 1 мМ ДТТ, 4 - I мМ МЕМ, 5 -1 мМ МРВ, 6 -1 мМ ОШВ, 7 - 100 мкМ Си504, 8 - 100 мкМ Си504 с последующим добавлением 1 мМ ДТТ. Уровень импорта в условиях без обработки реагентами на БН-группы: 1 — в митохондрии, 2 - в митопласты. Усреднение данных 7 экспериментов.

внешних мембран митохондрий не привело к изменению влияния реагентов на SH-группы на импорт pßF i в матрикс. Более того, наблюдалось ингибирование импорта в митопласты непроникающим реагентом МРВ, что подтверждает предположение о наличии важных для импорта SH-групп на внешней стороне внутренней мембраны митохондрий.

Таким образом было показано, что наличие свободных SH-групп в транслоказе белков-предшественников внутренней мембраны митохондрий (TIM-комплексе) является необходимым для осуществления процесса импорта белков-предшественников в матрикс митохондрий клубней картофеля. Также установлено, что SH-группы TIM-комплекса, необходимые для осуществления импорта белков-предшественников з матрикс митохондрий, локализованы вблизи внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий.

ВЫВОДЫ

1. С использованием фотоактивируемых аналогов липидов, а также 3-(трифторметил)-3-(/и1351-иодфенил)диазирина показано, что в F|F„-ATP-a3e митохондрий сердца быка с- и Ь-субъединицы протон-транслоцирующего сектора F0 непосредственно контактируют с липидным бислоем. Это подтверждает предложенную ранее Шнейдером и Альтендорфом модель строения FiF„-ATP-a3.

2. С целью поиска новых природных ингибиторов F]F0-ATP-a3 митохондрий проведен анатиз ядов тропических Муравьев Ectatomma tubercidatum, Paraponera chivata, "uingarana". Установлено, что только яд Paraponera clavara содержит компоненты небелковой природы, ингибирующие АТР-азную активность Fi-комплекса FiFo-ATP-азы. Все три яда не содержат компонентов, непосредственно взаимодействующих с протон-транслоцирующим F0 сектором FiFo-ATP-азы митохондрий сердца быка.

3. Показано, что наличие свободных SH-групп в транслоказе белков-предшественников внутренней мембраны митохондрий (TIM-комплексе) является необходимым для осуществления процесса импорта белков-предшественников в матрикс митохондрий клубней картофеля.

4. Установлено, что SH-группы TIM-комплекса, необходимые для осуществления импорта белков-предшественников в матрикс митохондрий, локатизованы вблизи внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Зайцева Л.Г., Зайцев В.Г., Фенюк Б.А.. Павлов П.Ф., Виленская Н.Д., Овчинникова Т.В.,

Плужников К.А., Гришин Е.В., Гринкевич В.А. "Исследование белкового состава ядов

некоторых видов тропических муравьев и их влияние на Н*-АТР-азу митохондрий"// Биоорганическая химия, 1995, т. 21, с. 563-570.

2. Зайцева Л.Г., Овчинникова Т.В., Гринкевич В.А., фон Стедингк Д.М.. Павлов П.Ф.. Глазер Э. "Влияние сульфгидрильных реагентов на импорт предшественника (3-субъединицы АТР-синтазы Sicotiana plumbaginifolia в митохондрии"// Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии. Труды научной конференции, посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. 199&,.

I

Санкт-Петербург, т. 1, с. 230-234.

3. Зайцева Л.Г., Овчинникова Т.В., Водовозова Е.Л.. Молотковский Юл.Г., Гринкевич В.А. "Исследование строения мембранного сектора митохондрнальной АТР-синтазы сердца быка"// Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии. Труды научной конференции, посвященной 100-летию кафедры биохимии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. 1998, Санкт-Петербург, т. 1,с. 234-237.

4. Гринкевич В.А.. Зайцева Л.Г.. Овчинникова Т.В. "Импорт белков-предшественников в митохондрии"// Тезисы докладов IV чтений, посвященных памяти акад. IO.A. Овчинникова. 1998, Москва, с. 40.

5. Zaitseva L.G., Ovchinnikova T.V., Vodovozova E.L.. Molotkovsky J.G.. Polyakov N.B.. Esipov S.E., Grinkevich V.A. "The investigation of the structure of the proton-translocating portion of mitochondrial ATP synthase"// Abstracts of the international conference "Biocatalysis-2000: Fundamentals & Applications". 2000, Moscow, p. 94.

6. Zaitseva L.G., Ovchinnikova T.V., Vodovozova E.L.. Molotkovsky J.G., Polyakov N.B., Esipov S.E., Grinkevich V.A. "Structural studies on the proton-translocating portionof mitochondrial ATP synthase"// Abstract book of the 18й1 International Congress of Biochemistry and Molecular Biology "Beyond the Genom", 2000, Birmingham, UK, p. 179.

7. Зайцева Л.Г., Овчинникова Т.В., Гринкевич В.А "Импорт белков в митохондрии"// Биоорганическая химия, 2000, т. 26 , с. 643-661.

8. Зайцева Л.Г., Овчинникова Т.В., Водовозова Е.Л.. Молотковский Юл.Г., Поляков Н.Б., Есипов С.Е., Гринкевич В.А. "Изучение строения протон-транслоцирующей части АТР-синтазы митохондрий "// Вестник МГУ. Серия Химия, 2000, т. 6 (в печати)

9. Зайцева Л.Г., Овчинникова Т.В., Гринкевич В.А."Импорт предшественника р-субъединицы АТР-синтазы в матрикс митохондрии"// Тезизы докладов школы-конференции "Горизонты физико-химической биологии", 2000, Пущино. т.2 (в печати)