Na+, K+-АТФаза: топография мембранного сектора тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Ц О 11 9 л

' АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ 5ИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ нмЛШЛ1ЕМЯКИНА

на правах рукописи

ЧЕРТОВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

Иа+ Д+-АТФ-аза: ТОПОГРАФИЯ МЕМБРАННОГО СЕКТОРА

специальность 0X00.10 - биооргашческая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНД ИДАТА ХИМИЧЕСКИХ НАУК

Москва - 1991

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии им. Н. И. Шемякина АН СССР

Научный руководитель - доктор химических наук H.H. Модянов

Официальные оппоненты: доктор химических наук Н.Г. Абдулаев; доктор биологических наук С.Н. Кочетков

Ведущая организация: Научный центр по разработке и внедрен современных методов молекулярной диагностики Минздрава СССР.

Защита состоится Шэ- февраля. 1991 г. в часов на заседании Специализированного совета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР по адресу: II7871, ГСП Москва, В-437, ул. Ыиклухо-Маклая 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. Ы. М. Шемякина АН СССР

1991 г.

Ученый секретарь специализированного Совета,-кандидат химических наук

В. А. Несмеянов

1 Актуальность ггооблемы. Изучение транспорта веществ и ионов биологические мембраны является актуальной проблемой физихо-химической бислогик. и ее разработка во многом определяет прогресс в познании механизмов биоэнергетических и регуляторных процессов в клетке. Наиболее распространенной системой активного транспорта ионов является Ма1", к+-актиаируемая. мд2+-зависимая аденозинтрифссфатаза СКФ 3.6.1.3) - натрий-калиевый насос, входящий в состав плазматических мембран практически всех клеток. Фермент осуществляет перекос ионов натрия и калия против градиенте^ их эл&ктрохимлческил потенциалов, участвуя тдм самым в регуляции ионного гомеостазз, якзненно важного для многих клеточных процессов.

Молекула йернентз состоит из зкзимолярных количеств двух т^тов субьедкниц: каталитической а СМ. м. 112.000) и гликозилированной Р (М.м. белковой части - 35.500. углеводной -7.000), выполняющей. предположительно, функцию "якоря" для «-субъединицы при сборке фермента в мембране в процессе биосинтеза.

В настоящее время установлены первичные структуры ряда Ех -Е2~АТФ-аз, в семейство которых входит к Ма+,к+-АТФ-аза; предл^гкны схе;.(н их пространственной организации в мембране, а такте начаты структурные исследования функционально ватных доменов белков. Возмогзгссть выделения кембранно-связаняого комплекса Ыа+,К+-АТФ-азы в индивидуальном состоянии, с полностью сохраняющейся ферментативной активность®, делзет его удобной модельной системой для изучения обэдх проблем мембранолзг;:.!!. Одной из такозых в настоящее время является вопрос о динамической архитектуре кокных каналов.

Установление первиной структуры о<5эих субъединиц натрий-калиевого насоса открыло пирокие возможности для исследования молекулярных ссноз его функционирования. Дачные электронной микроскопии двумерных кристаллов позволили получить - обз;ее представление о строении Енутримембраняого домена Ка+,к^-ЛТФ-азы, осуществлявшего, собственно, процесс транслохации ионоз. 3 данной ситуации предстг.зляет особый иктерзо установление 33aiair.org рчопелег-энпя гидрофобных согнзнтоб субьединиц V их пространственной сриентш,":;. э также изучение роорган;га=ацик это;- структуры при конгорнэцкснн'-'-Х пс-рз:-:одах белка в

процессе функционирования, как необходимый шаг к понимании механизма трансмембранного переноса катионов.

Цель работы. Настолщая работа является частью проводимого з ИБХ им. U.IL Шемякина АН СССР комплексного структурно-функционального исследования ка+,к+-АТФ-азы и посвящена анализу строения ее мембранной части- В задачу работы входило изучение

пространственной организации гидрофобного сектора молекулы, а именно взаимное расположение субъединиц и отдельных участков их полипептидных цепей относительно липидного матрикса мембраны.

Научная новизна и практическая ценность работы. Для исследования топографии мембранного сектора Ка"г,к+-АТФ-азы проведено фотомечение мэмбранно-связанного фермента в Ej- и Ep-конформациях с помощью гидрофобных карбе н-генерирующих

-jot; 1 о с

реагентов: З-фгорметил-З-См-[ ЦйодофенилТ-дказирина ( [ ijtid) и фотоахтивируемого фссфолигида [Зы]ptfc/11, преимущественно модифицирующих полипептидные цепи, находящиеся в контакте с лшшдами. Подобраны оптимальные условия для проведения модификации фермента. Показано, что и [3h]ptpc/ii, и [j"25i]tid модифицирует обе субъединицы фермента, причем соотношения включения б субъединицы (а/р) близки для обоих реагентов, что говорит о сходном характере модификации данными реагентами. Установлено, что для обоих реагентов соотношение включения метки в субъединицы (а/р) фермента в иа+-фэрме С Ej) меньше, чем в 1:+-форме СЕ-1, причем в (3-субъединицу в обоих случаях Еключается одинаковое количество радиоактивной метки. Выявлено, что в процессе Ej - Е^ перехода динамическим изменениям подвергается гидрофобный сектор а-, но- не f>-субъединицы, что указывает на структурные перестройки «-субъединицы, изменяющие доступность мембранно-связанных фрагментов для гидрофобных реагентов.

Подобраны условия разделения [12 51]tid-модифицированных пептидов, полученных в результате расщепления индивидуальных а- и р-субъединиц Ый+,к|'-АТФ-аз1>1 трипсином. Анализ N-концевой аминокислотной последовательности выделенных фрагментов позволил выявить все компоненты мембранной части N а +, к+- АТФ-аз ы.

Полученная структурная информация о модифицированных пептидах

1 9е!

и отдельных [ i]tid-меченых аминокислотных остатках послужила основой для более детальной модели трансмембранной молекулярной

организации натрий-калиевого насоса плазматических мембран. Сделан вывод о периферическом положении О-субъединицы в мембранном секторе ка+,К+-АТФ-азы. >

Разработанные в процессе исследования методические подходы ногут быть использозаны при изучении пространственной организации высокомолекулярных, мембранные белковых комплексов.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на стр.

машинописного текста и состоит из введения, трех глав, выводов. Список цитируемой литературы содержит наименований.

Литературный обзор посвящен использовании гидрофобных реагентов для изучения пространственной организации мембранных белков.

Анализ пространственной организации ма+,К+-А'ГФ-азм в Е1~ и Е^-кокформациях с помощью гидрофобного фотомечения.

I. Включение гидрофобных реагентов в субьедшнщы ка+,кт-АТФ-ззы, стабилизированной а различных кенфорнациоякнх состояниях.

Ранее, на основании результатов ограниченного протеолиза мембранно-связанного препарата фермента, химической модификации и иммунохимического анализа были идентифицированы фрагменты, экспонированные в цитоплазну и на внешнею клеточную поверхность. Эти данниэ позволили предложить двумерную схему трансмембранной организации молекулы ,к+-АТФ-азы. Для подтверждения и уточнения предложенной модели белка, для выявления фрагментов, входящих з состав мембранно-связанного сектора в настоящей работе применен метод селективной модификации с помощью гидрофобных фотоактивируемых реагентов.

Активный транспорт одновалентны:;: катионов является сложным нкогостадийным процессом, сопряженный с , изменениями ксиформационного .состояния фермента (Е^-Е^, переход}. Е^-форма фермента стабилизируется з присутствии ионоз Яа"', а Е£-ферма стабилизируется ионами к'. Поскольку конформационный переход Е^ -Е^ связан со структурной реорганизацией фермента, можно было ожидать , что данные изменения затрагивают и кеибранный сектор Ыа+,к+-АТФ-азы. Поэтому при исследовании топографии мембранного сектора изучалось, вклвчеше гидрофобных реагентов в субъединицы

фермента, стабилизированного в и Е^-конформационных состояниях.

Для модификации фермента было признано целесообразным использовать соединения, проникающие в мембрану вследствие своей липофильнооти и образующие при фотсактивации короткожизущие радикалы (карбенн), обладающие высокой .реакционной способностью и широкой специфичностью по отношению к различным химических группам. Зти реагенты модифицируют полипептидные цепи преимущественно в области белок-липидного контакта. Фотомочекие мембранно-связанного преларата Ка+,к+-АТФ-азы проводили с помощью

3-фторметил-3-См-[1251]йодс|екил)-д11азирина С (1251]тю) и фотоактивируеыого фосфолишда 1-пальмитоил-2-[ 11-[1-[ 3-С трифтор-13 СЗ " 'РС/

а

■э

метил )диазиринил] фенил] [2- Н] ундекапоил]-сп-глицеро-з-фосфарилхолина ([Зн] ртрои) :

[1251]ТЮ

I л

3Н 9н2осо (сн2)ксн3 1СИ2!Э-СН-С02СН

' С^ОР^ОЮ^^ЖСНз^

[3Н]РТРС/11

125

При модификации [ НПО мембранно-СЕЯзанкый препарат Ыа+,к+-АТФ-азы ресуспендирсзали в буфере, обеспечивающем стабильность ферментативной активности и, следовательно,

125

сохраняющем нативную структуру белка. Известно, что [ 1]тю может взаимодействовать не только с мембранными фрагментами, но и с гидрофобными кластерами молекул глобулярных белков. Дчя увеличения селективности ыечения мембранного сектора фермента к суспензии препарата мембранно-связанной Ыа+,К+-АТФ-азы добавляли глутатион. связывающий радикалы в растворе, что позволяет габежать присоединения реагента к гидрофобным участкам полипептидных цепей фермента вне мембраны. В случае модификации мембранно-связанной ма+, к+-АТФ-езы фотоактивируемиы производным фосфолипи.ца 13н] ртрс/и фермент инкубировали с реагентом в присутствия белка-обменника

фосфэлипидов. Модификация кембракно-связанного препарата Ка+,к+-АТР-азы как в ма+-. так и в К+-фориах обоими реагентами приводила к включении метки в липиды и в обе субъединицы' фермента (рис.1).

260 1125| НПО,сет «И4

Рис.1. Разделение субъединиц ма+,к+-АТР-азы. модифицированной [1251]тгр в Е1- и Е^-форма::. Условия разделения: колонка Ш'сгароге тзк-зооозто, уравновешенная 0,1 Ы ка+-ацэтат1плк буфером, рН 7.0, содержащий 0.2% зоз. Заштрихованные области - распределение радиоактивности, сплетзная линия - поглощение при 280 ни.

Включение метки в субьединицн, как правило, составляло не более 2-3% для [1251]тчэ-1/.еченых препаратов и 0.1-0.2% ■ для г'н] ртрс/11 от общего вюшчения метки. Включение реагентов в субьединицы подтзерздалось при анализе как препарата модифицированного феркс-кта. так и вилр-лекных с помощью гэль-ф;1ль'гр£цм: субъед^гкиц , "+-А7Ф-азн :'.отодом эл?ктрофзррза в полиакриламидном геле. Конч'рол&м на специфичность включения з случае [~к] рхрс/11 были образцы без белке-ебненника фосфолипидов. В зтом случае общее включение тритиевой метки в мембранный препзрат.

содержащий Ыа+,к+-АТФ-азу, уменьшалось в 2 раза, а с- и

р-субьединицы не содержали метку (рис.2). Наличие метки в «- и

р-субъединицах указывает на то, что обе субъединицы участвует в

формировании гидрофобного сектора Ка+,к+-АТФ-азы и имеют контакт с липидным бислоем.

Рис.2. Включение [Зн]ртрс/11 в субъединицы на+,к+-АТФ-азы в фосфатном буфере в отсутствие белка - обменника (а) и в его присутствии (б).

1Ъдификация К'а+,к+-АТФ-азы в Е^- и Е^-формах показало, что включение обоих гидрофобных реагентов в р-субъединицу не изменяется

при смене конформационных состояний фермента, в то вр>емя как включение в <*-субьединицу при переходе из Е^- в Е^-конформацию возрастает. '

Для подтверждения. данных гель-хроматографии и количественной сценки удельного включения метки в субъединицы проводили электрофоретическое разделение субъединиц модифицированного фермента, авторадиографию и денситометрию полиакриламидных гелей и авторадиограым. На основании полученных результатов были определены соотношения включения метки в субъединицы в различных конформационных состояниях. Результаты представлены в таблице I.

реагент ; Е1 е2

125 .....* [ I ÏTID 2.5 3,2

[3Н 1РТРС/11 2,8 3,0

Таблица 1. Соотношение включения радиоактивной метки в субъединицы Na+,K+-AT$-a3H Cct/P)

Изменение степени модификации а-субъединицы в разных формах

фермента указывает на ее структурные перестройки, в результате

которых изменяется доступность мембранно- связанных фрагментов для

мечекия гидрофобными реагентами.

Следует отметить, что [3Ш ртрс/ii является более селективны«

реагентом, чем [125I]tid, который способен помимо мембранных

фрагментов модифицировать и внемембраннкэ гидрофобные области

белка. Тем . не менее, определение соотношения включения

радиоактивности в субъединицы для обоих реагентов дало близкие

величины (таблица I), что свидетельствует о высокой специфичности 1?5

взаимодействия [ Х]тю с мембранным сектором фермента.

2. Выделение и харэктеризация [1251]тю-мечэных Фрагментов Р-субъедикицы Na+,к+-АТФ-азы.

Для идентификации меченых фрагментов и выявления модифицированных аминокислотных остатков в работе попользовали препараты n а + ,кг-АТФ-азы, меченые [125i]tid. Данный реагент

обеспечивает более высокое удельное мечение, чем аналог фосфолипида [3н]РТРС/11, а, как было сказано выше,- специфичность мечения данными реагентами практически совпадает (таблица I).

Согласно теоретическим расчетам и предсказаниям профиля гидрофобности в молекуле Ь'а+,к+-АТФ-язы гидрофобные фрагменты входят в состав крупных триптических пептидов с нслекулярной массой больше' 3000 Да. Поэтому выделенные субъединицы ка+,к+-АТФ-азы обрабатывали трипсином, который позволяет получить набор коротких гидрофильных фрагментов, составляющих основу внеме^бранной части субъединиц фермента, и гидрофобные фрагменты пслипептидных цепей з составе высокомолекулярных пептидов. Анализ гидролизата (рис.3)

aja и i12sihio%

1 25

Рис.3. Разделение триптического гидролизата [ цтю-меченой р-субъединкцы на колонке uitroPac TSK-2000SW, уравновешенной 0.1 И на+-ацетатным буфером, рН 7.0, содержащим 0.2% sds. За 100% принято суммарное значение метки во всех фракциях. Гистограмма представляет профиль радиоактивности. Аналогичные результаты были получены при разделении триптического гидролизата Р-субъединицы, модифицированной [3Н]РТРС/11.

с немощью гель-проникающей хроматографии.на колонке с тзк-2000 эк С рис. 3) показал, что для обеих реагентов вся метка оказывается связанной с фракцией высокомолекулярных фрагментов (фракции 1-2, рис.3), в то время как низкомолекулярные, продукты (фракции 3-8, рис.3). образующиеся в результате исчерпывающего триптического гидролиза, практически не содержат метки. Аналогичная картина была получена при разделении фрагментов а-субъединицы. Таким образом, отсутствие метки в области выхода низкомолекулярных пептидов косвенно подтверждает высокую селективность мечения.

Разделение модифицированных фрагментов р-субьединицы проводили с помощью хроматографии на обращенной фазе Кис1еопз.1 5С^-зоо (4.6x100 мм) (рис.4). Как видно из рисунка, большая часть метки выходит при элюировании буфером С (2:1 гцетонитрил-изопропанол в 0.1%-ной трифторуксусной кислоте (ТФУ)). причем ее выход не совпадает с пика;« поглощения, а следует непосредственно за ними.

0,05

ергп 10

12 -9 ■5 ■3

150 мин

Рис.

125 _

Разделение триггл пес ких [ 1]Т1В-меченых пептидов Р-субъедикицы на колонке Кис1еоэ11 бс^-зоо (4.6x100 мм}. Штриховой линией показано изменение процентного содержания буфера С, гистограмма представляет профиль радиоактивности, !»] ПеПТИД ТЬг27-Агд?1-.

фракция, содержащая гомогенный

Следозало ожидать, что в результате модификации для каждого

мембранного фрагмента образуется гетерогенная смесь меченых пептидов за счет различий в количестве (моль) включившейся метки и ее положениях (точках модификации). Выделение всех таких пептидов трудноосуществимо и, на самом деле, " в этом нет необходимости, поскольку из экспериментальных данных, полученных с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, известно, что все предполагаемые мембранно-связанные фрагменты Ыа+,к+-АТФ-азы находятся в а-спиралькай конформации. Поэтому принципиальное значение имело выявление участков поверхности с;-спиралей, контактирующих с липидами, для чего достаточно было выделить и охарактеризовать несколько модифицированных пептидов, соответствующих участкам транснеыбранных фрагментов, меченых с наибольшей удельной активностью. Смещение Еыхода метки по отношению к пику поглощения связан, по-видимому с тем, что только 2-3% разделяемого материала являются мечеными, а модификация [х251]т1в угеличивает гидрофобность и, следовательно, время выхода меченых пептидов по отношению к немеченым при использовании пбращенно-фазовой хроматографии, к-кокцевой анализ радиоактивных Фракций показал, что все фракции с наибольшим количеством мотки (эти фракции на рис. i заштрихованы) содержали в качестве концевой аюшокислоти - остаток треонина. Для идентификации нодифицированных аминокислотных остатков выбрали максимально меченую фракцию.

Первичную структуру пептидов определяли с помощью газофазного секвенатора по стандартной программе. Установление аминокислотной г-тслэдователъности (таблица 2) показало, что. действительно, радиоактивные фракции содержат один и тот же фрагмент £-субъединицы, а именно, тьг27-Агд71.

При установлена аминокислотной последовательности третью часть образующихся фенилтиогидантоинов (ФТГ) аминокислот попользовали для идентификации отщепляемого аминокислотного остатка, а остальное количество - для измерения радиоактивности. Мечеными оказалось несколько остатков (табл.2), причем величина радиоактивности была невысокой (100-200 ерш), в то время как метка, оставшаяся на фильтре по окончании секвенированкя, составила 2000 ерш или 1/5 внесенного количества. Как видно из приведенных выше результатов (рис.4 и табл.2) выделенный пептид является чрезвычайно

гидрофобным. поэтому низкий выход радиоактивности можно объяснить вымыванием модифицированного пептида органическими растворителями.

Таблица 2. Определение аминокислотной последовательности модифицированного фрагмента Thr27-Arg71.

N аминокислотный выход N аминокислотный выход

цикла остаток пмоль цикла остаток пмоль

1 Thr 400 23 Phe -

2 Gly 400 24 Ile 26

3 Gly 500 25 Gly -

4 Ser 300 26 Thr -

5 Trp - 27 Ile 27

6 Phe 60 26 Gin -

7 Lys 67 29 * Val -

3 A lie 99 30 Met 12

о Leu 80 31 Leu е;

10 Leu 100 32 Leu It!

11 Phe 77 33 Thr* 1 1 1

12 Tyr 75 34 Ile 4 i

13 Val 70 35 Ser -- !

14 lie 50 36 Glu *

15 Phe* 51 37 Phe

16 * Туг 38 38 Lys +

17 Gly 30 39 Pro -

18 A Cys - 40 Thr -

19 Leu 24 41 Tyr -

20 Ala 30 42 Gin -

21 Gly 10 43 Asp +

22 lie 17 44 Arg -

[•»] - [ I)тiD-меченые остатки аминокислот;-[+] - идентифицированные ФТГ-аминокислоты; [-] - неидентифицирсванные ФТГ-аминокислоты

используемыми при определении первичной структуры. Это и было доказано при сборе этилэцетата, гептана и особенно хлорбутана на стадиях промывания фильтра ео время секвенирования: все они содержали метку.

Согласно расчетам вторичной структуры фрагмент Ьуб33-Ис61 является в-спиральным. Расположение остатков на диаграмме а-спираля (рис.5) показало, что меченые остатки сосредоточены преимущественно по одну сторону спирали.

ДС11е ЗЗиуз 581еи ^У Д/.Су5

351-е и

дзау

5СШс

39\Ы 571еи

37Р1-|е.55Уа! 4811е

Рис. 5. Аксиальная

проекция а-спиралънсго Д1РЬе БЭТЬг фрагмента ьу?33-Пе61

р-субъединицн. Выделены ЗА Не 52ТЬг модифицированные аминокислотные остатки.

¿Ыеи 38Туг 55Ме1

53Не

бОг.е

Это указкзает на то, что фрагмент тьг27-Лгд71 р-субъединицы дейстьительно является мембранно-связанным, причем одня из сторон а-спирали, формируемой этим фрагментом, экспонирована в" липидный оислой, а другая контактирует с а-субъединицей.

3, Выделение и характеризация [1251]тю-ыеченых фрагментов а-субъедишщы ка+, к+-АТФ-азы. .

Основной задачей при идентификации меченых фрагментов а-субъединицы было выявление всех гидрофобных фрагментов, входящих

в состав мембранного сектора, для белка, стабилизированного в Е|- и Ер-конфсрмационньк состояниях. Следующий этап исследований заключался в установлении участков поверхности а-спиральных полипептидных цепей, контактирующих с липидами. Модифицированные фрагменты а-субъединицы так же, как и в случае р-субъединицы, разделяли с помощью хроматографии на обращенной фазе (Кис1еоз11 -300, 4.5 X 32 ММ) (Рис. 6).

Рис. 6. Разделение [125х]тт-меченых пептидов а-субъединицы, модифицированной в Е^- и Е2~конформациях. на колонке Мис1еояИ 5С4-300, 4.5 х 32 мм. Штриховой линией показано изменение процентного содержания буфера С, гистограммой обозначен профиль радиоактивности.

Хотя разделение субъединиц, их гидролиз и выделение фрагментов проводили в идентичных условиях, распределение радиоактивности во фракциях различается для Е^- и Е2~$орк. Все фракции, содержание радиоактивный материал, были проанализированы для обоих препаратов фермента и было показано, что набор пептидов, подвергшихся меченив, одинаков (Таблица 3). Таким образом, различия в интенсивности мечения а-субъединицы в Е|- и ^-конформационных состояниях объясняется изменением соотношения мечения тех же самых пептидов.

Таблица 3. [Х251]тт-меченые триптические пептиды а-субъединицы.

В таблице приведены аминокислотные остатки, установленные с помощью автоматического секвенатора.

68

Азр -С1у-Рго-Азп-А1а-Ьеи-Т11Г-Рго-Ргс>-Рго-ТЬг-ТЬг-Рго-С1и-Тгр-

142

-\'а1-Ьу8-РЬе-Суз-Агд-С1п-Ьеи-РЬе-. . .-Ьуз

11е2б5-А1а-ТЫг-Ьеи-А1а-Зег-С1у-...-Ьуз341

Уа1545-Ьеи-С1у-РЬе-Суз-Н1з-РЬе-Ьеи-Рго-Азр-...-Агд589

Зег770-11о-А1а-Туг-ТЬг-Зег-Азп-11е-Рго-С1и-11е-...-ЬуБ826 ЙЛ 7

Ьеи -11е-Зег-МеС-А1а-Туг-С1у-С1п-11е-С1у-Ме^11е-С1п-А1а-Ьеи--С1у-01у-РЬе-РЬе-ТЬг-Туг-РЬе-Уа1-11е-Ьеи-А1а-С1и-Азп-С1у-

. 870 -РЬе-...-Агд

Азп93б-Зег-Уа1-РЬе-С1п-01п-С1у-Ме1-Ьуз-Азп-Ьуз-11е-Ьеи-11е--РЬе-...-Агд972

973 999

Мес -Туг-Рго-Ьеи-Ьуэ-Рго-ТЬг-...-Агд

На основании ранее полученных результатов исследования топографии фермента была предложена схема трансмембранной организации субъединиц. На рис. 7 показаны идентифицированные в

настоящей работе [125i] TiD-меченые пептиды.

Рис. 7. Схема пространственной организации aß-протомера Na+, к+-АТФазы. Приведены аминокислотные последовательности [125i]tiö-меченых фрагментов.

Как видно, мечеными сказались не только фрагменты, являющиеся согласно предсказаниям , трзнсмембранными, но и фрагменты

545 5R9 974 999

Val -Arg и Met -Arg . Совокупность наших и ранее

полученных результатов позволяет предположить, что данные фрагменты

не являются истинно трансмембранными. При ограниченном трипсинолизе

мембранно-связанного препарата Ка+,к+-АТФ-азы после осаждения

мембранной фракции среди отщепившихся фрагментов с высоким выходом

был выделен пептид val545-Arg589. íparaeirr Het973-Arg999 также был

идентифицирован в супернатанте после осаждения мембран,

подвергпихся ограниченному триптическому гидролизу в экспериментах

по модификации остатков триптофана и цистеина. Наличие этих

пептидов в супернатанте, полученном при ограниченном трипоинолизе, и среди пептидов, модифицированных гидрофобными реагентами, указывает на то, что они не пронизьтают мембрану, а либо частично погружены в нее, либо находятся в тесном контакте с липидами бислоя. Не исключено, что данные фрагменты формируют гидрофобные полости, способные избирательно связывать липофильные реагенты.

Изменение условия разделения триптического гидролизата а-субъединицы фермента, модифицированного в Е^-конформации, на колонке с характеристиками 4.6 х 100 мм вместо 4.5 х 32 км удалось выделить фрагменты Ьеи842-Агд870- и Уа1545-Агд589 в индивидуальном состоянии (Рис. 8).

Рис. 8. Разделение триптз-гческих пептидов а-субъединицы, выделенной из фермента, модифицированного в Е| -конформации, на колонке Нис1соБ11 5С4-300 (4.6хЮ0 мм). Штриховой линией показано изменение процентного содержания буфера С, гистограммой обозначен профиль радиоактивности. Заштрихованные области - фракции, содержащие гомогенные пептиды: I - Ьеи812-Агд870 И 2 - Уа1545-Агд585.

фрагмент Ьец£42-Агд870 согласно расчетам вторичной структуры является «-спиральным. Поэтому для него была сделана аналогичная случаи с р-субъединицей попытка установить точки модификации с целью определения стороны контакта а-спирали с липидами. Для

определения радиоактивности ФТГ-аминокислот з процессе

R4 2 87 С

секьенироБения пептида Leu -Arg 20% ацетонитрил заменяли на этилацетат для лучшего растворения модифицированных

ФТГ-аминокислот и определяли радиоактивность в полученном образце, что позволило установить точки модификации. Расположение остатков на диаграмме «-спирали (Рис.9) показало, что меченые остатки сосредоточены преимущественно по одну сторону а-спирали, экспонированной, по-видимому, в липидный бислой мембраны.

860Phe 867AIO S¿2Leu 8Д9СЧП 853Ue

S56Leu 84oA!o ,864Vol

845Met

SSTGIy

850iie.668Gki 8¿3Ile.861Thr

854Gln

847 Tvr. 865Ile 858Glv

8USer 862Ту r

851 Gly

g«л 867

Рис. 9. Аксиальная проекция a-спирального фрагмента Lea *-А1а a-субъединицы. Выделены модифицированное аминокислотные остатки.

Общая топография мембранного сектора Ыа+,к+-АТФ-азы

Полученные различныш методами результаты позволят- сделать вывод о том, что «-субьединица имеет семь трансмембранных фрагментов, а Р-субъединица - один. Результаты по гидрофобному фотокечени» свидетельствуют о том, что первый и/или второй, третий и/Или четвертый (указать точнее пока не удалось, так как эти фрагменты не имеют специфической точки расщепления для трипсина

между первым и вторым, третьим и четвертым трансмембранными участками), пятый, шестой и седьмой сегменты находятся в контакте с липидным бислоем. Удельная радиоактивность мембранной части Р-субъединицы ыа+.к+-АТФ-азы более чем в три раза превышает удельную радиоактивность соответствующей области «-суб-ьединицы, что указывает на периферическое положение Р-субъединицы в олигомерноы

мембоанном комплексе. „

1

Совокупность этих экспериментальных данных стала основой для моделирования пространственной структуры вкутримембранного домена молекулы натрий-калиевого насоса. В ходе работы были построены объемные модели всех транснембранных фрагментов белка (расчеты выполнил Р. Г. Ефремов), и оценены различные варианты их взаимного расположения в объеме мембранного домена. Наиболее вероятная пространственная форма и объем последнего были определены ранее в нашем Институте с помощью электронно-микроскопических исследований двумерных кристаллов Na+,К^-АТФ-азы (Ovchinnikov, Yu.А., 1985). Схема, иллюстрирующая один из возможных вариантов отроения внутримеыбранной части фермента, приведена на рис. 10.

Расположение трансмембранного сегмента р-субъединицы: выбрано таким образок, что обеспечивается наибольшая площадь контакта с липидным бислоем. Укладка «-спиральных фрагментов а-субъединицы является гипотетической, но при этом было учтено, что сегменты I и 2, так же, как 3 и 4, соединенные короткими гидрофильными перемычками, располагаются, по-видимому, попарно; отрицательно

327

заряженные аминокислотные остатки глутаыиновой кислоты (Glu

953 954-»

Glu и Glu ) и другие потенциальные компонента ион-проводящих путей ориентированы во внутрь белковой молекулы. На рисунке вццелены аминокислотные .остатки, подвергшиеся модификации. Локализация модифицированных аминокислотных остатков в остальных мембранных фрагментах позволит создать более реалистичную модель пространственного строения мембранного домена ка+,к+-АТФ-азы.

юА

Рис. 10. Гипотетическая схема расположения трансмембранных

а-сшральных фрагментов Ма+,к+-АТФ-азы в плоскости сечения мембранной части трехмерной модели фермента, построенной на данных исследования двумерных кристаллов. Контуры сечений параллельно плоскости мембраны соответствуют границе внешней поверхности клеточной мембраны (I), середине лнпидного бислоя (2) и цитоплазматической поверхности мембраны (3). Крузками указано положение [1251]Т1С-мэченых аминокислотных остатков. Выделены гидрофильные остатки.

3 ы в о д ы

1. Проведено фотомечение мембранно-связанного препарата Ыа+,К+-АТФ-гзы в Ет- и Ep-конфорыациях с помощью гидрофобных

125

карбен-генерирующих реагентов: 3-фггорметил-3-(и-[Цйодофенил)-диазирина С[125i]tid) и фотоактивируемого фоофолипида [3Н)ртрс/11.

2. Показано, что удельная радиоактивность мембранной части

Р-субъединицы Na ,к+-АТФ-азы превышает удельную радиоактивность соответствующей области а-субъединицы, на основании чего сделан вывод о периферическом положении Р-субъэдиницы в олигомерном мембранном комплексе.

3. Установлено, что соотношение включения метки для обоих реагентов в субъединицы С «/р) фермента в Na+-форме меньше, чей в к+-форме, причем в Р-субъединицу в обоих случаях включается одинаковое количество метки. Изменение степени модификации в разных формах фермента указывает на структурные перестройки а-субъединицы, что изменяет доступность мембранно-связанных фрагментов для гидрофобных реагентов.

ч О С

4. Выделены [ HTiD-мечэные фрагменты, входящие в состав мембранного сектора: трансмембранные, а так же частично погруженные в липидный бислой. Показано, что нэбср радиоактивно-меченых пептидов идентичен для Ej- и Eg-форм фермента, т. е. переход из одного состояния в другое изменяет лишь интенсивность мечения одних и тех же фрагментов.

5. Определена пространственная ориентация относительно липидного

84? ода

бислоя фрагмента Leu - Arg а-субъедкницы и фрагмента Thr - Arg р-субъедкницы.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах

1. Арзамазовг И. 1L . Аристархова Е. А.. Гевондян Н. 11., Гаврильева Е. Е. .■ Азизова Г. И. , Чертова Е. Н, Клименко А. С.. Модяноз Н. Н. Двучстадийный ограниченный протеолиз мембранно-связанной Na+,KT-AT5>a3H. Детализация модели пространственной организации субьединиц. - Бислсгическип .мембраны ISS7, т. 4, N12, стр. 5G0-599.

2. Modyanov M.N., Arzamazova N.M., Arystarchova Е.А. , Gevondyan N.M. , Gavrilyeva E.E., Dzhandzhugazyan K.N. , Lutsenko S.V., Luneva N.M. , Shafieva G.I. , Chertova E.11.iia* ,K+-pump: structural organization. In Ovchinnikov Yu.A.,Hucho F.(eds):®Receptors and Ion Channels©,Berlin,New York:Walter ae Gruyter. 1987, p.287-294.

3. Chertova E. , Gavrilyeva E. , Gevondyan N.. Arystarkhova E., Arzamazova N. Analysis of topography of p-subunit of Na+,K+-ATPase. - 14*"*1 International Congress of Biochemystry, Prague. 1988, Th-393

4. Луценко С. 3., Джанджугазян К. Н. . Берников JI. Р., Чертова Е. Н., Уодянов Н.Н. Адресная модификация в исследования На+,к+-АТФазы. -Материалы vn симпозиума СССР-ФРГ по химик пептидов и белков, Дилиган, 1089, стр.49.

5. Cher'cova E.N. , Lutsenko E.V., Levina N.B. and N.N.Modyanov.

Probing the topography of the intramembrane part of Na+,K+- ATPase

1 ?5

by photolabelling with 3-(trifluorcmethyl)-3-(m-[ I]-iodophenyl)-diazirine. Analysis of the hydrophobic domain of the p-subunit. FEBS Letters. 1989, V.254, p.13-16.

6. Svetlana Lutsenko, Elena Chertova, Nikolay Modyanov. Hydrophobic photochemical labelling of. Na+,K+-ATPase. 44lh Annual Meeting Society of General Physiologists, Woods Hole, Massachusetts, USA. 1990, p.29a.

7. Lutsenko S.V., Chertova S.N., Bernikov L.R. Topography of Na+,K+-ATPase studied by target modification. 20th Meeting of the FEBS, Budapest, Hungary. 1990, p.293.

8. Modyanov N.. Lutsenko S., Chertova E. and Efremov R. Architecture of the sodium pump raolekule. Probing the folding of the hydrophobic domain. Статья В сборник "Na+-pump" - ИТОГИ VI международной конференции no *Na"t',K+-AT'i>a3e. 1990, (принята к печати5.

9. Чертова Е.H., Луценко С.В.. Модянов H.Н. Гидрофобное фотомечение Na+,к+-АТФазы. Всесоюзный симпозиум по химии белков, Тбилиси, 1990, стр.26.

10. Чертова E.H., Луценко C.B., Модянов H.H. Анализ пространственной организации Na+,к+-АТФазы в Ej- и Е2~конформациях с помощью гидрофобного фотомечения. Биологические мембраны IS9I, т.8, N2, (принята к печати).

Материалы диссертации бьти доложены на xi v Международном Биохимическом Конгрессе (Прага, I08S), на VII совместном СССР-ФРГ симпозиуме по химии пептидов и белков (Дилижан, IQ89), ка Всесоюзном симпозиуме по химии белков (Тбилиси, 1990), на XX Международном симпозиуме ФЕБО (Будапешт, 1930), на 44й ежегодной конференции Общества Общей Физиологии (Вудс Хол, США, 1990).