Функциональная роль изоформ Na, K-АТФазы:тканеспецифичность экспрессии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЯ ХИМИИ имени И.И.Шемякина

На правах рукописи

МАРЦЕН Елана Оскаровна

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ИЗОвОРМ №.К-ЛТФазы; ТКАНЕЫШМФИЧНОСТЬ ЭКСПРЕССИИ

02.00.I0 - Биоорганическая хиикя, химия природных и Сязиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации аа соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте биоорганической химии имени М.и.Шемякина Академии наук СССР

Научный руководитель -член-корреспондент АН СССР, профессор Е.Д.Свердлов

Официальные оппоненты -доктор биологических наук В.М.Захарьев кандидат Оиологических наук Княткин Н.И.

Ведущая организация - Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Минмедмикрооиопрома.

19Э2Г . в^'

, С-0

Завита состоится '^у-ц-1 1992г. в ™ часов на

заседании Специализированного совета Д 002.3S.CI при Институте сиоорганической химии им.М.И.Шемякина АН СССР по адресу; 117281, Москва. В-43?, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Оиоорганической химки им. И.М.Шемякина АН СССР.

~ Л

Автореферат разослан ", ' "_"Ч гъ^мыь- х9Э2 г.

Ученый секретарь Специализированного совета ИБХ АН СССР

кандидат химических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На,к-АТФаза плазматических мембран животных клеток обеспечивает постоянство ионного состава внутриклеточной среды, осуществляя транспорт ионов Ка+ и к+ против их концентрационных градиентов за счет энергии гидролиза

АТФ. Работа этого Фермента способствует поддерханию мембранного * ^

потенциала клетки, оказывает существенное влияние на внутриклеточный транспорт различных питательных веществ, включая глюкозу и аминокислоты, ионов, поддерживает осмотический баланс клетки и ее объем.

Огромный экспериментальный материал, накопленный к настоящему времена, позволил пролить свет на общую структуру На,к-АТФазы,.строение субъединиц фермента (а и &), укладку их в плазматической мембране, -локализовать активные центры ка!,алитической а-субъедииици,. а также предоставил информацию о существовании множественных изоформ для каждой' из субъединиц. Показано существование семейств генов, кодирующее эти изоформы, причем число гомологичных последовательностей", входящих в состав семейств, превышает количество идентифицированных белковых изоформ. в связи с этим возник вопрос о функциональном значении каждого из .этих генов и о биологической роли различных изоформ КаД-АТФазы. Исследование этой проблемы необходимо для более полного понимания механизмов функционирования на.к-АТФазы.

цель работы. данная работа проводилась в рамках осуществляемых в Институте биоорганической химия им. М.М.Шемякина АН СССР комплексных структурно-функциональных исследований На.к-АТФазы человека. Настоящая работа представляет собой один из этапов изучения экспрессии генов На.К-АТФазы человека и посвящена

изучению экспрессии трех генов а-субъединицы и двух генов ß-субъединицы Ка,к-АТФаэы в широком наборе тканей человека, а также в человеческих клеточных линиях.

В связи с этии в данной работе были поставлены следующие задачи:

1. получить препарата суммарной клеточной РНК, а также Фракции polyi А+ >-РНК из различных тканей и клеточных линий человека;

2. подобрать оптимальные условия для полуколичественной оценки экспресса? генов 3-х изоформ ec-субъединицы и 2-х изоформ 6-субъединицы Ва,к-АТФазы с помощь» метода полимеразной цепной реакции (PCR).

3. сравнить экспрессию каждого из этих генов в нормальных тканях и клеточных линиях человека.

Научная новизна и практическая ценность работы В результате проделанной работы разработан основанный на PCR метод оценки содержания индивидуальных мРНК различных изоформ Na.K-АТФазы в тканях и клеточных линиях человека. Показана тканеспецифическая экспрессия 3-х изоформ а-субъединицы и 2-х изоформ ß-субъединицы в тканях человека.. Экспрессия генов cd- и 'ßl- изоформ йаД-АТФазы осувествляется повсеместно, экспрессия генов а2- и аЗ- изоформ наблюдается только в электровозбудимых тканях. Проанализировано распределение mfhk изоформ НаД-АТФазы в человеческих клетках лимфоидного и нейронального происхождения. Показано достоверное уменьшение количества мРНК ег-субъединицы в малигнизированных клетках, что позволило высказать предположение о дополнительна функциях 02-субъединицы. На.к-АТФази и начать исследования, касающиеся возможной роли этой субъединицы в процессах онкогенеза.

Объем работы. Диссертация содержит M страниц машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы .

» ,

II.I.Получение препаратов суммарной клеточной РНК и ■ ро].у(А+)-РНК из тканея и клеточных линий человека.

Первым этапом работы по изучении экспрессии генов множественных изоформ МаД-АТФазы было выделение препаратов суммарной РНК, а также poly(A+)-PHK из различных тканей и клеточных линий человека.

В литературе описано множество' способов выделения РКК. Выбор тех или иных методик диктуется характером предпринимаемых исследований и свойствами'используемого биологического материала. Для выделения суммарной РНК из тканей наиболее часто используются методы, основанные на применении сильного хаотропного агента - гуанидинизотиоцианата, быстро денатурирующего эндогенные рибонуклеазы. Этот наиболее универсальный метод для различных тканей был применен в данной работе. При электрофоретическом анализе выделенной клеточной РНК в формальдегидном геле были отчетливо видны полоса 28S и 18S рибосомальной РНК, что свидетельствовало об отсутствии деградации РНК во время ее выделения. 1ля проведения ряда предварительных экспериментов необходимо было выделить фракцию poly(A+)-Pffi£ из нескольких .тканей. Для этого мы проводили 2 цикла аффинной хроматографии на олиго(сГП-целлюлозе. в среднем количество выделенной poly( А+ J-PHK составляло около 1-1,5« от исходного количества клеточной РНК. наличие недеградированных 28S и 18s рибосомальных

РНК свидетельствовало об отсутствии деградации во -время хроматографии.

в результате проведенной работы была выделена суммарная клеточная РНК из 11 нормальных органов человека, а также из клеток и клеточных линий человека лиыфоидного и нейронального происхождения.

II.2 Разработка метода оценки уровня экспрессии генов а- и р-субъединиц Na,К-АТФазы в тканях и клеточных линиях человека на основе PCR.

для оценки уровня экспрессии того или иного гена ранее использовались два различных подхода. Один из них основан на получении и анализе банков кднк, другой, более распространенный и менее трудоемкий, основан на гибридизации специфических олиго-или полинуклеотидных зондов с РНК, иммобилизованной на твердом носителе (Northern-гибридизация). Недостатками упомянутых методов являются их трудоемкость, необходимость выделения poly( if )-РНК, значительная продолжительность эксперимента по времени, необходимость работы с радиоактивной меткой, а в. - 'случае Northern-блота также и недостаточная чувствительность, в связи с этим для изучения уровня экспрессии генов otl-, aZ-, «3-изоформ каталитической субъединицы и двух изоформ ß-субъединицы Na,К-АТФазы мы использовали чувствительный, быстрый и достоверный метод, основанный на полимеразной цепной реакции (PCR).экспрессию интересующих нас генов мы оценивали на уровне транскрипции, т.е., на уровне синтеза мРНК, для чего выделяли суммарную клеточную РНК. Для синтеза первой цепи кДНК мы брали фиксированное количество РНК. а в качестве затравки использовали статистический

^размер. При этом РНК-зависимая днк-полимераза равновероятно синтезировала днк-кошш со всех имеющихся в наличии мРНК. Полученный в результате двуцепочечный гибрид РНК-ДНК использовали затем во всех последующих реакциях амплификации, каждую из которых проводили с соотаетствуюшими специфическими лраймерами.

Для выбора оптимальных условия протекания реакции, а также с цель» проверки возможных межиндивидуальных отличий при амплификации РНК, выделенной из аналогичных тканей, взятых от разных доноров, был проведен ряд. предварительных экспериментов. Из- тканей почек и мозга, полученных от четырех доноров, была выделена суммарная клеточная РНК, на основе ее синтезирована первая цепь кДНК, которая затем амллифицировалась с зондами к МРНК а 1-субъединицы ИаД-АТФазы (структура зондов приведена в. табл.1). Все зонды, использованные в данной работе, были синтезированы сотрудниками ФИБХ АН СССР Черновым К.П., Маковецким А.Ф. и Ланилковичем A.B. Полученные результаты представлены на рис.2. Они показали, что интенсивность полос, представляющих собой продукты амплификации препаратов РНК от разных доноров, была практически одинаковой, что свидетельствовало об отсутствии межиндивидуальных отличий, а также о воспроизводимости результатов реакции.

для выяснения адекватности результатов PCR поставленной задаче, т.е. полуколичественной оценке специфических РНК в препаратах суммарных РНК, мы сопоставили результаты, полученные этим методом, с результатами Nopthern-гибридизации. Для этого мы выделяли фракции poly (А+)РНК из шести тканей: почки, мозга, мышцы, сердца, легкого и эмбрионального мозга указанным выше методом, после разделения препаратов РНК в 1,5« агарозном геле в денатурирующий условиях, переносили их на нейлоновую

Таблица 1. структуры олигоиуклоотидных зондов, использованных в работе.

I. Структуры зондов, специфичных трем генам а-субъединицы Na.iC-АТФазы (al,a2 и аЗ).

специфические праймеры: al: 5'- AGO TGA AGT СТТ GTC AAA AGA GAC - 3' «2: 5'- AGA CAC GGA GAT GTT CTC CTG TCC TGC - 3' a3: 5'- GAG CAC AGG GAT GTT GTC CTG ACC ACC - 3' Универсальный праймер:

5'- AAG AAC TGC CTG GTG AAG AAC CTG GAG - 3'

II. Структура зондов, комплементарных генам gl и ß2 Ма,К-АТФазы

01: 5'- GAC TGA AAT TTC СТТ TCG ТСС TAA T - 3* Н-Концевой 5'- GGA CAT TTC GGT TAT ACT TCA TCA - 3' С-Концевой 02: 5'- СТТ TGA TGT CAT TGT CAA TGT CAG T - 3' N-Концевой 5'- TCG ATG TTG CCG TTG GCG GGG AAC - 3' С-К0НЦеВ0Й

III. структура зондов, специфичных ß-актину человека.

5'- GGC GAC GAG GCC CAG AGC AAG AGA - 3' Ы-КОНЦевОЙ 5'- GTC CAG GGC GAC GTA GCA CAG CTT - 3' С-К0НЦеВ0Й Длина ожидаемых продуктов PCR

МРНК. (п.о.)

al «2 аЗ В1 62

ß-актин

200 270 270 349 400 502

ДНК (П.О.> 250 393 344

I II III 1У

12 12 12 1 2 3

Рис.2. PCR-анажз распределения мРНК al-нзоформи а-субъединицы иа.к-АТФагн в тканях печки и мозга, полученных от 4-х здоровых доноров (I-IY). 1 - мозг, 2 - почка, 3 контроль - рис/Sau ЗА.

мембрану Hybond-м и проводили гибридизация в жестких условиях с олигонуклеоткднкм зондом, комплементарным мРНК al-изоформы каталитической субъединицы. результаты эксперимента приведены на рис.ЗА. Видно, что интенсивность сигналов гибридизации наиболее велика в почке, слабее - в мозге, легких и сердце, и значительно более слабая - в мышце и эмбриональном мозге. соотношения интенсивностей гибридизационных сигналов совпадали с результатами PCR этой панели тканей с зондами к al-изоформе (рис.ЗВ), однако, как и ожидалось, чувствительность последнего метода оказалась суаественно выше: в каждую пробу при реакции амплификации было взято 200 кг суммарной клеточной РНК, тогда как каждая дорожка на Northern-блотв содержала 10-12 дг poly(A+)PHK.

Для оценки уровня экспрессии гена необходимо выбрать стандарт, относительно которого проводятся измерения. Из литературных данных известно, что количество актиновой мРНК в различных тканях отличается незначительно, поэтому данные, полученные при анализе количества продуктов PCR для каждой из

a b

Рис.3. Результаты по изучению экспрессии МРНК al-изоформы На,к-лказы метолом Korthem-гибридизацин (а) и PCR (b). к-контроль - polytА~)-РНК, i-сердце, 2-легкое, з-ышца, 4-змбриональный мозг, 5-взрослый мозг, б-почка, т- рис/Sau.

изучаемых изоформ'в отдельной ткани, сравнивали с количеством продуктов амплификации той же РНК с праймер'ами, специфичными к актиновой РНК. Постоянство интенсивности полосы, полученной в результате амплификации актиновой мРНК, свидетельствовало о практически одинаковом количестве РНК в пробах. Оценку относительного содержания мРНК каждой, из изучаемых изоформ в тканях или клетках проводили, сканируя негативы результатов PCR на лазерном денситометре Apple.

Из литературы известно, что выход продуктов реакции • PCR пропорционален первоначальному количеству образца только в таких условиях, при которых их накопление происходит экспоненциальное постоянной эффективностью. Кроме того, известно, что при большом количестве циклов накопление продуктов амплификации генов с высоким уровнем экспрессии выходит на плато, в то время как для генов с невысоким уровнем экспрессии продукты. амплификации продолжают накапливаться экспоненциально, для того, чтобы подобрать необходимое количество циклов, мы проводили кинетический анализ амплификации образцов кднк мозга с зондами к

МРНК е2-субъедннииы На.к-АТ'Газы. Результаты эксперимента представлены на рис.4. Видно, что количество продуктов реакции увеличивалось на каждой последующей стадии, достигая максимального значения при 40 циклах, и не изменялось при 45, т.е., на стадии 40 циклоз накопление'продуктов реакции выходит на плато. Аналогичный кинетический анализ проводился для мРНК «1-изоформы. Исходя кз полученных результатов, оптимальным количеством циклов для о- и з-кзсформ КаД-АТФазы было выбрано 36.

Рис.4. Результаты кинетического анализа PCR мРНК мозга с зондами, гомологичными 02-субъ-единице На,К-АТФазы. 1-20 циклов, 2-25, 3 - 30, 4- 35, 5 - 40, б - 45, Г - pUC/Sau3a..

Необходимо было также убедиться в том, что продукты реакции, соотвегствуюшие по длине ожидаемым, совпадают с ниш по первичной структуре. Для определения первичной структуры фрагментов, полученных при амплификации, ш использовали модифицированный метод Сенгера с меченным праймером. Для получения одноцепочечной матрицы, необходимой для сиквенирования этим методом, мы проводили реакцию амплификации суммарной РНК из препаратов мышцы и сердца с зондами, гомологичными мркк а2-изоформы ка,к-АТФазы. продукты реакции клонировали в вектор M13mpl8 и определяли первичную структуру ДНК, выделенной из рекомбикантных клонов.

Анализ полученных результатов показал полное соответствие структуры амплифицированных'фрагментов структуре соответствующего участка мРНК «2-изоформы На.К-ЛТФазм (см.рис.5).

AAGAACTGCCTGGTGAAGAACCTGGAGGCGGTGGAGACGCrGGGCTCCACGTCCACCA TCTGCTCGGACAAGACGGGCACCCTCACCCAGAACCGCATGACCGTCGCCCACATGTGGTTCGA CAACCAAATCCATGAGGCTGACACCACCGAAGATCAGTCTGGGGCCACTTTTGACAAA.CGATCC CCTACGTGGACGGCCCTCTCTCGAATTGCTGGTCTCTGCAACCGCGCCGTCTTCAAGGCAGGA CAGGAGAACATCTCCGTGTCT

Рис.5. Нуклеотидная последовательность фрагмента а2-м?НК НаД-АТФазы человека. Представлена область 1053-1322, содержаЕая часть 9 и 10 экзонов. Подчеркнута структура праймеров, с которых шла амплификация. Стрелкой указана граница между экзонами.

Таким образом, были подобраны оптимальные условия для оценки содержания мРНК методом PCR, что позволило быстро, эффективно, без применения радиоактивной метки оценить содержание мРНК 3-х изоформ а-субъединицы и 2-х изоформ ß-субъединицы Na.K-АТФазы в различных органах и клеточных линиях человека.

II.3 Тканеспецифическая экспрессия генов а- и е-субъединиц йа.К-АТФазы в нормальных тканях человека.

Мы исследовали экспрессию указанных .генов в наборе из 11 нормальных тканей взрослого человека, а также в эмбриональных тканях мозга и почки. Для этого из тканей выделяли суммарную

- и -

клеточную РНК, синтезировали первую цепь клнк. как описано выше, и использовали эту клнк для всех последующих амплификация, на первом этапе мы проводили амплификацию полученных матриц с зондами, гомологичными актиновой РНК. Результаты PCR приведены на рис.Т. они свидетельствуют о том, что все 13 образцов содержали практически равные количества РНК, а также указывают на стандартные условия проведения реакции.

Для исследования распределения мРНК изоформ а-субъединицы (а1,а2 и аЗ> Ка.К-АТФазы была выбрана область, включающая большую часть 9-го и ю-го экзонов. область 10 зкзона соответствует вариабельному участку белков, поэтому праймеры, специфические к каждой изоформе, были выбраны из этой области, праймер для синтеза второй цепи соответствовал наиболее консервативному участку в 9 экзоне и был общим для всех трех изоформ. Результаты амплификации приведены на рис.6. Длина ожидаемых фрагментов составляла ~ 200 п.о, из рисунка видно, что ген al-субъединицы экспрессировался во всех проанализированных тканях, этот результат согласуется с литературными данными о повсеместной экспрессии этого гена, обладающего многими свойствами touseKeeping-reHOB, в различных' тканях и клеточных линиях крысы CEnsnuel, 1987, Lingrei, 1990].

В наибольшем количестве он экспрессировался в почках, в меньшей степени - в мозге, сердце, легких, щитовидной хелезе, матке, в тканях аорты, наименьшие количества наблюдались в тканях толстой кишки и печенк. В дорожках 4, б, 7, 8 и 9 (рис.ба) видны слабыз полосы, размер', которых значительно превышает длину ожидаемого фрагмента. Наличие этих дополнительных полос связано с присутствием небольших примесей ДКК в выделенных препаратах РНК, которая также амплифкцировалась в незначительной степени.

Для генов изоформ а2 и «3 экспрессия ..цела ярко выраженный тканеспецифический характер и наблюдалась в '-.граниченном наборе тканей. Так, транскриптц «2-изоформы в наибольшем количестве- были обнаружены в мышце и мезге, в меньших - в эмбриональном мозге, сердце, в тканях аорты медиа и интима, а также в матке. Транскрипты аЗ-изоФормы были найдены только в эмбриональном и взрослом мозге, а также в сердце. Наличие полосы в ткани легкого, (рис.бЪ!, отличающейся по размеру от ожидаемой, а так же полос в дорожках 3, 4, 7, 8, и, 12 и 13 (рис.6с! связано с наличием примесей ДНК в препаратах РНК. этот вывод следует из факта, что полосы по размеру соответствуют длине амплифицируемого фрагмента с интроном (см. таблицу 1).

Наши результаты отличаются от данных Лингрела и Эмануэля [Ыпвге1, 1990, Етапие1, 19873. изучавших содержание 3-х изоформ а-суйъединицы и р-субъединипы На,К-ЛТФазы в тканях и клеточных линиях крысы методом (кичьегп-гибридизаиии. Так, получив сходные с ними результаты по экспрессии <х2-субъединишд преимущественно в нейрональных и мышечных тканях, мы не обнаружили присутствия мРНК этой изоформы в почках и легких. Так же мы не наблюдали присутствия мрнк оЗ-изоформы каталитической субъединицы фермента в легких и в скелетных мышцах. Расхождения в наших результатах могут, вероятно, объясняться специфической локализацией мРНК этих субъединиц в определенных типах клеток, которых могло не оказаться в имеющемся у нам материале, следует отметить, что уровень экспрессии мрнк субъединиц а1 и а2 увеличивался во взрослом мозге по сравнению с эмбриональным, и аналогично увеличивалось количество ы1-мрнк во взрослой почке, что полностью согласуется с

л

данными по тканям крысы. [Огютеку, 1938]. Экспрессия мрнк схЗ-субъединицы в эмбриональном и взрослом мозге сохранялась приблизительно на постоянном уровне.

Следующим этапом работы был анализ экспрессии генов £1- и 62- изоформ е-субъединицы. Зонды, как и в случае а-субъединмц.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рис.б. РСК-анализ транскрипции генов а1,а2 и аЗ йа.К-АТФазы в различных тканях человека. 1 - взрослый мозг, 2 - эмбриональный шзг, 3 - взрослая почка, 4 - эмбриональная почка, 5 - мышца, ь - сердце, 7 - легкое, 8 - матка, 9 - яорта медиа, 10 - аорта интима, И - щитовидная железа, 12 - толстая кишка, 13 - печень, 14 - контроль рис/ЗаиЗа.

выбирались из области наименьшей гомологии. Результаты амплификации приведены на рис.7. видно, что экспрессия гена 61-субъединицы осуществлялась во всех проанализированных тканях, причем в наибольшем количестве она наблюдалась в тканях почки, мышцы, сердца, легкого, матки, в меньшем - в тканях аорты и мозга, в наименьшем количестве транскрипты были обнаружены в тканях толе-

той кишки и печени. При сравнении наших результатов с данными предыдущей работы СЕвапие1, 19873. мы не нашли корреляции в количественных оценках, однако, нам удалось обнаружить наличие МРНК в1-субъединицы а тканях эмбрионального мозга и печени, где авторами этой работы отмечалось их отсутствие. Определение малых количеств упомянутых мРНК, видимо находилось за пределами чувствительности' метода Лог №ег п-гибридизации. мРНК &2-субъединицы была обнаружена во всех проанализированных тканях, за исключением толстой кишки и печени, следовые количества мРНК этой изоформы присутствовали в мьшце. В наибольшем количестве она содержалась в эмбриональном мозге и'матке, в меньших - во всех остальных. Присутствие полос, значительно превышавших ожидаемую длину Фрагмента, могло быть, как и в предыдущих случаях, связано с амплификацией примесей ДНК, однако, из-за отсутствия данных о структуре геномного гена 02-субъединицы, мы не располагали сведениями о длине интронов. Из литературных данных известно, что В2-субъединица млекопитающих экспрессируется преимущественно в центральной нервной системе. Так при использовании иммунохимичес-кого подхода констатировалось отсутствие этой изоформы в тканях почки, сердца, печени и легких 1Б11уЗап, 19893. однако, наши- результаты показывают, что, по-крайней мере, на уровне мРНК экспрес сия данного гена осуществляется в более иироком спектре тканей.

' 11.4. Изучение экспрессии изоформ иа.К-АТФазы - в человеческих клеточных линиях.

Во многих работах по изучению. распределения мРНК генов Ка,к-АТФазы методом КогШегг-гибридизации использовались препараты РНК, выделенной из целых тканей, либо из их сегментов.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Рис.7. Р(Ж-анализ транскрипции генов 61- а ¡52- изоформ В-субъединицы Ка.К-АТФазы в различных тканях человека. 1 - взрослый мозг,2 - эмбриональный мозг, 3 - взрослая почка, 4 - эмбриональная почка, 5 - мышца, б - сердце, 7 -легкое, 3 - матка, 9 - аорта медиа, 10 - аорта интима, и -щитовидная железа, 12 - толстая кишка, 13 - печень, 14 - контроль - рис/ЗаиЗА.

Результаты этих исследований представляют большой интерес, хотя выводч о возможной Функциональной роли индивидуальных изоформ в этом случае сделать затруднительно из-за наличия множества типов клеток в одной ткани. Также необходимо учитывать действие гормонов, поступающих в организм экзогенно. Они, как_известно, оказывают влияние на функционирование АТФазы, и это влияние трудно вычленить. Поэтому альтернативным подходом при изучении экспрессии индивидуальных изоформ является использование культур клеток, большой интерес представляют различные типы опухолевых

линий. Функционирование в которых ка.к-АТФазн, вероятно, может отличаться от ее работы в нормальных клетках. Таким образом, можно изучать взаимосвязь функций фермента с состоянием клетки, и возможно, более детально роль отдельных изоформ.

Поиск экспериментальной модели, в которой бы экспрессирова-лись либо отдельные изсфррмы Na..K-АТФазы, либо наблюдалось бы переключение- с экспрессии одной^ изоформы на другую, мы начали с клеток HL-бО. это миелоидная линия клеток лейкемии человека, способная дифференцироваться под действием ряда факторов в зрелые нейтрофилы, моноциты, макрофаги или зозинофилы. Так, при обработке клеток - HL-60 диметилсульфоксидом (DMSO) они из промиелоцитов дифференцируются в нейтрофилы. Наличие недифференцированных и дифференцированных линий клеток НЬ-60 позволило нам изучать возможные изменения в экспрессии отдельных изоформ Ka.K-АТФазы в процессе дифференцировки лимфоидных клеток. Для изучения экспрессии интересующих нас генов мы выделяли суммарную РНК из клеток нормальных лимфоцитов, линии НЬ-60 и из клеток этой же линии, обработанных DMSO. Все последующие этапы работы были аналогичны описанным выше для нормальных тканей, мы анализировали экспрессию генов 3-х изоформ а-субъединшш и 2-х изоформ ß-субъединицы КаД-АТФазн с помощью PCR и выяснили, что во всех трех случаях экспрессируются только cd- и ßl-изоформы (рис.8),то есть функционирует лишь одна изоформа ИаД-АТФазы.

На следующем этапе работы мы исследовали экспрессию изоформ Кад-АТФазы в клетках, происходящих из центральной нервной сис-' темы. Первичные культуры астрошггов и нейронов головного мозга человека были использованы как модели нейрокальных элементов человека. Нами также были взяты трансформированные линии этих . клеток - иммортализованные астроциты и 2 линии нейробластомы IMR

- 17 -12 3 4

Рис.8. PCR-анализ транскрипции генов аз- и gi-субъединиц Na,К-АТФазы в лимфоидных клетках человека. 1 - нормальные лимфоциты человека, 2 - клетки HI-60, 3 - клетки HL-60, индуцированные DMSO, 4 - контроль pUC/Sau3a.

32: клетки N-типа, растущие в культуре и несупше нейрональные маркеры, и S-типа (substrate-adherent),со свойствами меланоцитов. Известно, что прикрепление этих клеток к подложке связано с процессами дедифференцировки, поэтому они представляли для нас интерес с точки зрения возможных различий в экспрессии генов На.К-АТФазн. В качестве нормальных контролен были использованы первичные астроциты и нейроны. Все эти клетки имели-общее происхождение и представляли собой отдельные последовательные стадии дифферен-цировки и злокачественного перерождения нервных клеток.

Из пяти перечисленных выше типов клеток мы выделяли

тотальную клеточную ?НК и проводили серию последовательных амплификация с зондами к мРНК' р-актина, а также к мРНК трех изоформ а-субъединицы и двух изофоры 0-субъединицы Иа.К-АТФазы.

Результаты амплификации с зондами к 3-м изоформам а-субъединицы приведены на рис.9а и 10а. Экспрессия гена а!-изоформы наблюдалась во всех исследованных клетках, однако, здесь имели место значительные количественные отличия. Так, в клетках первичных астроцитов, нейронов и в обеих линиях нейробластомы транскрипты а1~изоформы присутствовали в незначительных количествах, тогда как в иммортализованных астроцитах уровень экспрессии изучаемого гена был значительно выше. В первичных астроцитах были обнаружены незначительные количества мРНК о2-изоформы, которая приблизительно в таком же количестве присутствовала и в нейронах. мРКК аЗ-изоформы была обнаружена в нейронах и в клетках обеих линий Iж 32, причем уровень экспрессии мРНК во всех трех случаях оказался примерно одинаковым. При анализе результатов амплификации на присутствие мРНК 61- и р2-изоформ мы обнаружили, что экспрессия гена 61-субъединицы осуществлялась во всех клетках, такяе с существенными количественными отличиями (рис.9в я юв). так, в иммортализованных астроцитах количество мРКК этой изоформы- было существенно ниже по сравнению с остальными клетками данной панели. в случае £2-субгединицы нам не удалось обнаружить присутствия мРНК этой изоформы в иммортализованных астроцитах, и лишь в следовых количествах ее транскрипты наблюдались в двух разновидностях нейробластомы. Транскрипты 02-нзоформы присутствовали в значительных количествах как в первичных астроцитах, так и в нейронах, однако, при иммортализации экспрессия соответствующего гена, по-видимому, уменьшалась, либо прекращалась полностью.

12 3 12 3

Рис.9. РСЯ-анализ распределения мРНК а- и е-изоформ Иад-АТФазк в астроцитах человека. I - рис/БаиЗа, 2 -первичные астроциты, 3 - иммортализованные астроциты.

При сравнении относительного содержания а- и 0-субъединиц На,к-АТФазы в клетках нейронального происхождения в норме и в трансформированном состоянии очевидно полное отсутствие количественной корелляции в их экспрессии. Так, несмотря на значительное увеличение экспрессии мРНК а1-изоформы в случае иммортализованных астроцитов, количество мРНК 01-субъединицы не только не увеличивается, а существенно уменьшается, экспрессия же рг-изоформы, по-видимому, прекращается полностью. Аналогичная картина наблюдалась нами и случае клеток нейробластомы, где при неизменном уровне экспрессии мРНК а1- ■ и аЗ-изоформ экспрессия мрнк 62-субъединицы резко уменьшалась, очевидно, как это отмечалось и в предыдущих работах [Ыпеге!, 19903, корреляция в

12 3 4

12 3 4

270

л) АКТИН

502

270

Рис.Ю. РСЯ-анализ распределения мРНК а- и е-изоформ ма,к-АТФазы в нейронах человека и в клетках нейро-бластомных линий 1Ш 32. I - нейроны, 2 - в® 32 (5). недифференцированные, 3 - 1МВ. 32СЫ),дифференцированные. 4 - маркер - рис/5аиЗа.

экспрессии а- и в-субъединиц на уровне транскрипции отсутствует. Если исходить из предположения о Функционировании фермента в виде протомера и&, или олигомера то следует ожидать

восстановления эквимолярных соотношений на трансляционном или посттрансляционном уровне. Однако, отсутствие стехиометрического соотношения в общем количестве мРНК а- и в-субъединиц может быть также связано с существованием других, неидентифицироэанных пока белковых изоформ этих субъединиц, например, вз-субъеданицы. Наиболее интересным для нас представляется высказанное недавно предположение о дополнительных функциях р-субъединицы в качестве

фактора адгезии нервных клеток, так как было показано, что &2-субгедйница НаД-АТФазы мыши является молекулой адгезии глиальных клеток (AMOG) [Gloor, 19901. Известно, что иммортализация приводит к существенному изменению многих функций клеток, в том числе, к утрате их способности к контактному торможению. С этой точки зрения уменьшение уровня экспрессии гена

ч

, , Ь2-субъединицы в опухолевых клетках по сравнению с нормальными заслуживает особого внимания, так как показано, что молекулы адгезии могут играть важную роль в процессах злокачественного перерождения.

Результаты нашего исследования дают основание полагать, что это уменьшение экспрессии £2-субъединицы может иметь непосредственное отношение к формированию опухоли. Однако, нельзя исключить вероятности, что наблюдаемый эффект является сопутствующим.

в ряде работ отмечалось сходство аминокислотных последовательностей гликопротеинов клеточной поверхности, которые, как полагают, вовлекаются в неопластическую трансформацию. Поэтому мы проанализировали банк белковых последовательностей с целью обнаружить белки, имеющие гомологию с е-субъединицей ИаД-АТФазы. Результаты анализа (рис.И) показали, что ограниченную гомологию с е-субъединицей имеют в основном белки, относящиеся к суперсемейству иммуноглобулинов. Было выявлено несколько коротких участков с гомологией, превышающей 502. первый участок соответствует трансмембранному сегменту молекулы э-субъединицы и включает Фрагмент с 33 по 45 аминокислоту. Этот район имеет существенную гомологию с мембранно-связанными участками молекул -предшественников' константных областей д- и с- тяжелых цепей иммуноглобулинов мыши, и, кроме того, с участками молекул -предшественников вариабельных областей тяжелых цепей.

которые соответствуют сигнальным последовательностям этих белков, отметим преобладание гидрофобных аминокислот, что является отличительным признаком меыбранно-связанных иди пересекающих клеточную мембрану фрагментов белковых молекул. Наибольший процент гомологии (702) наблюдался в случае белков предшественников тяжелых д-цепей мыши, когда совпадающими были 9 кз 13 аминокислот, во всех остальных случаях гомология составляла от 53« до 60*. что, превышает уровень случайных совпадений. Второй участок гомологии соответствовал фрагменту а-субъедкницы с 249 по 266 аминокислоту, экспонированному во внеклеточное пространство. Этот район имел ограниченную гомологию с фрагментами вариабельных районов легкой х-цепи мыли и человека. Гомология в этой области не превышала 50%, однако, интересной особенностью указанного ' фрагмента является консервативное положение редких аминокислот - треонина, пролина, цистеина, а также положительно заряженных аргинина и лизина, что повышает вероятность неслучайного совпадения структуры этих пептидов.

Проведенный анализ не позволяет сделать однозначного вывода о функциональном сходстве р-субъединицы На,К-АТФазы и перечисленных белков на основании ограниченной гомологии между ними, однако, нельзя исключить возможности, что в-субъединица и ряд рецепторных белков суперсемейства 18 имеют общее .'•'происхождение, но разошлись на ранних этапах эволюции.

\

« t)

rajA иг k|! Г V p|T и -1* F У oj

k aus fit fijr kltttttr * - h г т ol

Ivnttfil |w) AiPU "t t Fit t -h f У p|

NMtS S t |F 1 V L Fl 1 i «ii f >!»

WS itvivtni t ttf v Yls

Bit« с ljl!t Fjl L * V s\l ol

EttJI Wie * II 1 l f • L - V l t«

AtUS В-.-..figjTr V - V •¿1

UU1 i*i»rirrm- t « V « t «

AJ7<f Ш»»i; г, v n- t - 1 • -U

»vier PI«TB'i l - V « t«

trrnsa fü.irnrm l s v i «а

05» t iO*E3i l »Ii

Рис.11. Гомология между мембранно-связанным сегментом ß-субъединицы Ка.К-АТФазы и а предшественниками а) тяжелых цепей иммуноглобулинов.

г so 2 (о

1 F t к » 7 Ь |а v В 1 г v е е е yjf

rat fi\ q ? t |l 1 т 1 d t Е 1 г i ECK * У

Ьгаил fA ч P ir 2 Т ■ dt Е i г il Е С t * 7

nt fii К V т г X У sh 1 У Е|С * t!«j

koua fii t L Я V т i а v eJ» я V SC Е tbd

C2KUP l [Цр ТП «ер* * sjC R t я

T Ч- V Г г г «i *{v • sie К - »

CVMS7 ■ p« Ti V т С « « *|c * s s

С2МЯ 1 У ff t« р » • I .et * *

ВЗШ p * И* V т г 1« т « n)ct »Ei

ши p» tu * 7 Г К в «1* »je * • 1

в)

в >х-цепями иммуноглобулинов

ВЫВОДЫ

1.Разработан основанный на PCR метод оценки содержания индивидуальных мРНК различных изоформ НаД-АТФазы в тканях и клеточных линиях человека.

2.Показана тканеспецифическая экспрессия мрнк 3-х изоформ а-субъе.диницы и 2-х изоформ ß-субъединицы Na,К-ЛТСазы в тканях человека. Установлено, что экспрессия генов ai- и ßl-изоформ осуществляется повсеместно, тогда как экспрессия генов а2- и аЗ-изоформ наблюдается только в электровозбудимых тканях.

3.Проанализировано распределение мРНК изоформ Na,К-АТФазы в лимфоидных и нейропальных клеточных линиях человека. ■

4.Показано достоверное , уменьшение количества мРНК £2-изоформы фермента в малигнизированных клетках. Высказано предположение о возможном участии Р2-субъединииы на.к-АТФазы в

процессе онкогенной трансформации.

основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях.

1. U.S. Akopyanz, N.E. Broude, Е.Р. веКшап, Е.о. Marzen and E.D. SYerdlov. Tissue-specific expression of Na,K-ATPase p-subunit. Does 32 expression correlate with tumorigenesis? - i'EBS Lett., 1991, V.289, П 1, p. 8-10.

2. Марцен Е.О., Бекман Е.П., Акопьянц Н.С. Дифференциальная экспрессия генов, субъединиц Na.iC-АТФазы в различных тканях человека. - Всесоюзный симпозиум "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд, 1991, стр.124.