Взаимосвязь активных центров неорганической пирофосфатазы Е. соli в реакциях с фосфатсодержащнми соединениями тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

РГ5 ОД

Химический факультет

На правах рукописи УДК 557.)5.2.3

Григорьева Ольга Васильевна

Взаимосвязь активных центров неорганической пирофосфатазы Е. coli в реакциях с фосфатсодержащими соединениями

Специальность: 02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2000

Работа выполнена в лаборатории химии белка кафедры химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

С.М. Аваева

кандидат химических наук, доцент В.А. Склянкина

Официальные оппоненты : доктор химических наук И.П. Куранова

доктор биологических наук, профессор В. И. Муронец

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии РАН

Защита состоится 14 июня 2000 г. в_часов на заседании диссертационного совета

Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан_мая 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

//

И.Г. Смирнова

о

Актуальность проблемы. Неорганические пирофосфатазы (РРазы; КФ 3.6.1.1) являются ферментами, необходимыми для нормальной жизнедеятельности любой живой клетки Они ответственны за контроль внутриклеточной концентрации пирофосфата (РР,), который образуется при синтезе большинства биополимеров.

Все известные в настоящее время растворимые пирофосфатазы - олигомерные белки. Пирофосфатаза Е. соИ (ЕРРаза) представляет собой гомогексамер, организованный как димер гримеров. РРаза является металлозависимым ферментом и каждая субъеднннца имеет четыре центра связывания ионов металла, кроме того, существует еше один центр присоединения металла, который находится в межтримерном пространстве. К настоящему времени для ЕРРазы получены мутантные формы, содержащие точечные замены функционально важных аминокислотных остатков. Решены пространственные структуры для апоЕРРазы, ее комплекса с сульфатом и ионами металлов, а также ряда мутантных ферментов; для пирофосфатазы Я сегеп.ъае (УРРаза) определена структура комплекса с четырьмя ионами марганца и двумя фосфатами (Р|) На основании существующей информации высказаны предположения о механизме ферментативной реакции.

Согласованность метаболических процессов в клетке предусматривает регуляцию ферментативной активности. Известно, что большинство РРаз являются конститутивными ферментами, что предполагает поддержание уровня РР* в клетке только за счет изменения каталитической активности фермента. Существует несколько альтернативных путей регуляции для конститутивных ферментов: во-первых, регуляция может осуществляться за счет взаимодействия фермента с компонентами клеточной среды, во-вторых, для олигомерных ферментов существенную роль могут играть процессы диссоциации-ассоциации, но одним из самых общих способов регуляции активности конститутивных олигомерных ферментов является взаимодействие центров связывания лигандов.

Несмотря на интенсивные исследования, вопрос о путях регуляции пирофосфатазной активности до сих пор остается открытым. В настоящее время известны некоторые природные агенты, которые могут изменять активность пирофосфатазы. К таким агентам, в частности, относятся моноэфиры фосфорной кислоты, представляющие собой продукты клеточного метаболизма. С помощью этих соединений было обнаружено взаимодействие активных центров между двумя тримерами, выражающееся в реакционной способности половины центров. Высказано предположение, что причиной инактивации является образование ацилфосфатной связи.

Следует подчеркнуть, что молекула ЕРРазы имеет 12 потенциальных центров связывания Pi, поскольку фермент состоит из шести субъединиц и каждый активный центр имеет две площадки связывания фосфата, образующегося из пирофосфата Поэтому выявление системы взаимодействий, происходящих при связывании лигандов, а также возможных путей передачи информации между субъединицами является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Главной задачей работы явилось расширение круга фосфатсодержащих соединений (ингибиторов и пирофосфата). позволяющих вскрыть систему взаимодействий центров связывания лигандов.

Работа включала следующие этапы: изучение взаимодействия ЕРРазы с неорганическим фосфатом; исследование влияния pH и концентрации фосфатсодержащих лигандов на инактивацию фермента; применение гидроксиламина для локализации в первичной структуре пирофосфатазы аминокислотного остатка, подвергающегося фосфорилированию; сравнительное изучение кинетических свойств тримерной и гексамерной форм неорганической пирофосфатазы E.coli. а также химерных ферментов, представляющих собой объединение нативного (активного) и мутантного (малоактивного) тримеров.

Научная новизна и практическая ценность работы Показано, что ЕРРаза реагирует с Pi с образованием двух неактивных соединений - продукта фосфорилирования группы активного центра и прочного комплекса с Р,. Выявлено взаимосогласованное функционирование центров связывания фосфатсодержащих соединений. Предложено для локализации фосфорилированной аминокислоты в белке превращение ее в гидроксамат с последующим расщеплением пептидной связи между аспарагиновой кислотой и соседним остатком. Сделан вывод, что при фосфорилировании ЕРРазы образуется ацилфосфатная связь с Asp 67. Рассмотрен возможный механизм аффинного ингибирования ЕРРазы. Показана кооперативность субъединиц в гримере при связывании субстрата. Сделан вывод о согласованном функционировании всех активных центров в процессе катализа.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены н; Международной конференции «The First International Meeting on Inorganii Pyrophosphatases» (Турку, Финляндия, 1997 г.), на Международном конгрессе п< аналитической химии (Москва, 1997) и на Международной конференции «26th Meeting о the Federation of European Biochemical Societies» (Ницца, Франция, 1999) По материала,-диссертации опубликовано 3 статьи и одна находится в печати.

Объем н структура паботы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, экспериментальную часть, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Материал иллюстрирован 25 рисунками и 2 таблицами. Библиографический указатель включает 127 цитируемых работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Инактивация апоЕРРазы неорганическим фосфатом Необратимая инактивация ЕРРазы неорганическим фосфатом

Изучение взаимодействия ЕРРазы с фосфатом показало, что фермент эффективно инактивируется Р, (ряс. 1, кривая 1). Ионы магния при концентрации 1 мМ обладают защитным эффектом в этой реакции (кривая 2). А, %

Рисунок 1. Зависимость глубины инактивации от времени взаимодействия фермента с Р,.

Условия: [Е] 6 мкг/мл, [Р,] 50 мМ, рН 7.2. 25°С

Активность определялась в присутствии 0,05 мкМ (1), или 20 мкМ (3) Р„ та же реакция в присутствии 1 мМ магния.

20 30 40 50 время, мин.

Результатом взаимодействия фермента с фосфатом является необратимая инактивация, происходящая за счет фосфорилирования остатка дикарбоновой аминокислоты фермента, что было показано рядом независимых экспериментов. 1) разбавление инкубационной смеси до остаточной концентрации Р| 0,05 мкМ не приводит к восстановлению активности. Медленная реактивация белка наблюдается лишь при инкубации его при рН 7,2 в течение двух часов в присутствии РР;. Инактивированный фермент, тщательно освобожденный от избытка реагента, содержит связанный фосфат, количество которого коррелирует со степенью

инактивации. Так включение Р, в ЕРРазу с остаточной активностью 75% и 52% составляет 1,4 и 3,0 моль Р/моль Е, соответственно.

2) Фосфорилированный фермент после обработки гидроксиламином не изменяет своей активности, но полностью утрачивает способность к восстановлению активности в присутствии РР|.

3) фосфорилированный фермент, выдержанный в 8М мочевине и обработанный этиловым эфиром лейцина увеличивает свою массу на величину, соответствующую молекулярной массе остатка вводимого реагента, что показано методом МАХОТОК масс-спектрометрии. В контрольном опыте, где белок не подвергался фосфорилированию, после действия эфира аминокислоты, прироста молекулярной массы белка зарегистрировано не было.

3) свойства ЕРРазы, модифицированной неорганическим фосфатом в щелочной среде (рН 9,0), принципиально отличаются от свойств фермента, инактивированного при нейтральных значениях рН. Полученный неактивный белок не восстанавливает активности после гель-фильтрации и последующей длительной инкубации с РР, Ниже эти процессы будут рассмотрены подробнее.

Образование неактивного комплекса ЕРРазы с фосфатом.

На рисунке 1 (кривые 1 и 3) сопоставлены два условия определения активности фермента после выдерживания его с 50 мМ Р, - в присутствии 0,05 и 20 мкМ Р, Видно, что в последнем случае уже в начальный момент регистрируется резкое падение активности.

Свойства инактивированного белка, полученного при кратковременной инкубации с Р, (около двух минут), принципиально отличаются от свойств неактивного фосфорилированного фермента, описанных выше. В этом случае фермент, после разбавления буфером, не содержащим фосфата, проявляет полную каталитическую активность, нечувствителен к гидроксиламину или изменению рН инкубационной смеси до рН 9,0. Эти результаты явились указанием на возможность очень прочного связывания ЕРРазой неорганического фосфата в центре, отличном от центра фосфорилирования.

Действительно, было обнаружено, что неорганический фосфат, взятый в микромолярных концентрациях, уменьшает активность фермента (рис. 2) Однако зарегистрировать инактивирующее действие фосфата в этом случае, можно лишь сохраняя в среде для определения активности фермента такую же концентрацию Р,. как и в реакционной смеси. Ионы магния, добавленные в инкубационную среду, полностью

защищают РРазу от ингибировання фосфатом, субстрат (\%РР|) также оказывает защитный эффект. Поэтому необходимым условием регистрации инактивации ЕРРазы 0,5-20 мкМ фосфата является кратковременная преинкубация белка с фосфатом. Можно думать, что Р„ связываясь в активном центре ЕРРазы, вызывает изменение ее конформации, и образующийся комплекс становится устойчивым к действию металлов-активаторов и к субстрату. Сродство ЕРРазы к фосфату очень велико, максимальный ингибирующий эффект наблюдается при 1мю\1 Р, и К0.5 ингибирующего центра можно оценить как 0,5 мкМ. .

100»-

Рисунок 2. Влияние низких концентраций фосфата на активность ЕРРазы. Условия: [Е] 6 мкг/мл, рН 7,2, 40 мин., 25°С Активность определялась в присутствии %т!азанных концентраций Р,

15 20 25 [фосфат], мкМ

Из рис. 2 следует еще один важный вывод. Колоколообразный характер этой зависимости, указывает на существование в гексамерной молекуле нескольких центров связывания фосфата с очень высоким сродством, заполнение которых вызывает противоположный эффект, что свидетельствует о взаимном влиянии центров, расположенных в разных субъединицах

Центры связывания фосфата в апоЕРРазе и их взаимосвязь

Для ЕРРазы отсутствуют данные о пространственной структуре комплексов, содержащих субстрат или продукт реакции. Однако, принимая во внимание сходство в строении активных центров в апоформах УРРазы и ЕРРазы, для обсуждения вопроса о местах присоединения Р, к ЕРРазе можно использовать результаты рентгеноструктурного анализа комплекса УРРазы с ионами марганца и Р; (Harutyunyan Е. et al, 1996). Согласно этим данным в активном центре существуют два места присоединения фосфата PI и Р2, сильно различающиеся по основности формирующих их аминокислот. В Р1 находятся Arg 43, Туг 141 и Lys 142. Из сравнения структур комплексов УРРазы с фосфатом и ЕРРазы с сульфатом очевидно, что сульфат

связывается в Р1. Поэтому можно думать, что образование неактивного комплекса с Р,

происходит также в центре Р1

Это предположение было полностью подтверждено при изучении влияния фосфата, мегилфосфата и сульфата на модификацию Аг£ 43, расположенного в центре Р1, диацетилом. Все эти реагенты оказывают на реакцию защитное действие Зависимость защитного эффекта от концентрации Р, дает картину, аналогичную изменению активности ЕРРазы при действии фосфата, показанную на рисунке 2. Максимальное наблюдаемое падение скорости модификации (в 15 раз) обнаруживается в присутствии 1,5 мкМ фосфата. Отсюда можно сделать вывод, что ингибирование ЕРРазы фосфатом в микромолярных концентрациях обусловлено присоединением к центру Р1. Зависимость наблюдаемой константы скорости инактивации ЕРРазы диацетилом от концентрации мегилфосфата представлена на рисунке 3. Соответствующую константу связывания в ингибиторном центре можно оценить как 7 мкМ. Сульфат ион также сильно снижает скорость модификации остатка аргинина и максимальный инактивирующий эффект достигается при концентрации сульфата, равной 2 мкМ, при этом скорость инактивации падает в 7 раз.

8

Рисунок 3. Влияние метилфосфата на инактивацию ЕРРазы диацетилом Условия [Е] 6 мкг/мл. концентрация диацетила 13 мМ (1); 15 мМ (2). рН 7,2. 25°С

На врезке представлены экспериментальные данные в координатах Диксона.

40 60 80 [метилфосфат], мкМ

Следует заметить, что в отличие от Р„ после инкубации ЕРРазы с 0,5-20 мкМ метилфосфатом и определения ферментативной активности в среде, содержащей реагент, не наблюдается изменения активности. По-видимому, образующийся комплекс, в отличие от комплекса с фосфатом, является более лабильным и разрушается при определении активности фермента, что не позволяет регистрировать его, как это описано выше для фосфата. Колоколообразный характер зависимости наблюдаемой константы скорости инактивации ЕРРазы диацетилом от концентрации метилфосфата

свидетельствует о различном сродстве этого ингибитора к центрам Р1, расположенным в разных тримерах и еше раз демонстрирует взаимное влияние этих центров.

Таким образом, защитный эффект очень низких концентраций фосфата, метилфосфата и сульфата при модификации остатков аргинина свидетельствует о связывании этих лигандов в участке Р1 активного центра.

Вопрос о расположении в молекуле фермента центра, способного взаимодействовать с фосфатом с образованием ацилфосфатной связи является более сложным. Можно было бы предположить превращение комплекса с фосфатом в центре Р1 в устойчивое ковалентное производное. Казалось бы, что в пользу такого предположения свидетельствует факт уменьшения во времени количества комплекса по мере протекания химической модификации высокими концентрациями фосфата. Так зависимость 3 на рисунке 1 отражает суммарный эффект инактивации за счет протекания двух процессов - образования неактивного комплекса и образования ацилфосфатной связи, а кривая 1 - только второй процесс. Разница между двумя кривыми указывает на вклад в инактивацию комплекса. Однако это предположение полностью опровергается тем фактом, что выдерживание комплекса без дополнительного увеличения концентрации Р; не приводит к образованию ковалентного соединения, независимо от времени инкубации с фосфатом.

Особый интерес представляют результаты опытов по ковалентной модификации ЕРРазы метилфосфатом в присутствии сульфата и фосфата, связанных в центре Р1. Заполнение Р1 приводит к резкому снижению скорости модификации (рис.4) и при концентрации Р| равной 1 мкМ и 7 мкМ сульфата наблюдается полная защита фермента от инактивации.

Обратное влияние второго центра на Р1 демонстрирует уменьшение вклада неактивного комплекса в общую степень инактивации фермента по мере хода фосфорилирования белка, что говорит о резком уменьшении устойчивости комплекса в Р1 при фосфорилировании второго центра.

Наиболее вероятно, что фосфорилирование ЕРРазы фосфатом и метилфосфатом происходит в одном центре. Это следует из уменьшения глубины инактивации метилфосфатом при добавлении в реакционную смесь фосфата (рис. 5).

Вопрос о расположении второго центра в молекуле фермента удалось решить только после идентификации аминокислотного остатка, подвергающегося фосфорилированию.

а)

0,00

0,0 0,4 0,8 1,2 1,6

[фосфат], мкМ

б)

0,18 0,160 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00

©

40 I-30 20 10

-2

О

о"

/

б

0 2 4 6

¡суль}-шт], иг*.

10 15 20 25

[сульфат], мюМ

30

Рисунок 4. Влияние фосфата (а) и сульфата (б) на модификацию ЕРРазы метилфосфатом Условия: [Е] бмкг/мл, концентрация метилфосфата 7,2 мМ рН 7.2, 25°С На врезке представлены экспериментальные данные в координатах Диксона.

Рисунок 5. Изменение активности ЕРРазы под действием мстилфосфата и фосфата (I) и метилфосфата (2). Условия: [Б] бмкг/мл, концентрация метилфосфата 5 мМ. фосфата 10 м.М. рН 7,2, 25°С

20 25 30 время, мин.

Исследование рН-зависимости взаимодействия ЕРРазы с метилфосфатом

Исследование рН-зависимости в широком диапазоне концентраций ингибитора является необходимым этапом для выяснения механизма фосфорилирования

Реакция ЕРРазы с метилфосфатом была исследована в диапазоне рН 6.0-9,5 (рис. 6). При всех используемых условиях происходит инактивация фермента Однако вместо традиционных гиперболических зависимостей скорости инактивации от концентрации ингибитора практически при всех значениях рН наблюдаются колоколообразные зависимости.

рН 6,0

рн 7,2

0,20 г

0,16

I 0,12

ь

с ЧЭ 0,08

0,04

0,00

0

0,24

0,20

'I 0,16

5

с 0,12

X 0,08

0,04

0,00

0

0,20

0,16

I

0,12

с

Я X 0,08

0,04

0,00 С

0,20

0,15

'х

Е 0,10

с О

0,05

0,00

0

•

••

9 9 - « % • 9 О

9 | 1 1 1 1 1 1

1,0 0,8

1 0,6

1 0,4 0,2 0,0

5 10 15 20 25 30 35 40

[метилфосфат], мМ

17.67

5 10 15 20 25 30 [метилфосфат], мМ

рН 8,0

20 40 60 80 100

[метилфосфат], мМ

рН 8,5

5 10 15 20 25 30 35 [метилфосфат], мМ рН 9,01

« 9

©

0,20 ее о

тх 0,16 -

5-. 0,12 -

С чэ в 9

^ 0,08 в

0,04 О О 9

0,00 1 1 1 I

20 40 60 80 100 120

[метилфосфат], мМ

рН 9,5

О 10

20 30 40

[метилфосфат], мМ

Рисунок 6. Зависимости наблюдаемой константы скорости инактивации ЕРРазы мстилфосфатом от концентрации ингибитора при разных рН, Условия: [Е] б мкг/мл, 25°С

[метилфосфат], мМ

0

I _I

Для определения рК групп, принимающих участие во взаимодействии фермента с ингибитором, была построена зависимость начальных скоростей инактивации ЕРРазы от рН (рис. 7). Характер этой зависимости определяется ионизацией групп свободного фермента и свободного ингибитора. Из рисунка видно, что во всем изученном интервале рН в инактивации ЕРРазы моноэфирами фосфорной кислоты принимают участие, по крайней мере, три ионизованные группы фермента и ингибитора, рК которых составляют 7,5+0,2, 8,0±0,3, 8,3±0,2. Очевидно, что в области кислых и нейтральных значений рН процессом инактивации управляет группа, рК которой составляет 7,5. При ее депротонировании происходит резкое снижение эффективности процесса. Скорее всего, эта группа принадлежит ингибитору; ее рК, по литературным данным, составляет 6,6. Расхождение в значениях рК для ионизованной группы ингибитора не вызывает удивления с учетом повышенной гидрофобное™ активного центра.

Igk

0,0001 ....................... I I . ... I .... ...........

5,6 6 6,5 7 7,5 S 8,5 9 9,5 10

РН

Рисунок 7. Зависимость начальной скорости инактивации ЕРРазы метилфосфатом от рИ

Эти результаты дают основание предположить, что химическая реакция протекает между ионизованной карбоксильной группой белка и протонированной формой ингибитора. По-видимому, связывание метилфосфата в активном центре, предшествующее фосфорилированию, реализуется за счет взаимодействий с Lys 29, что увеличивает электрофильность атома фосфора ингибитора.

Удивительным представляется факт резкого увеличения скорости реакции при переходе в щелочную область (рис. 7). Было установлено, что белок, модифицированный как фосфатом, так и метилфосфатом, по своим свойствам принципиально отличается от белка, полученного при нейтральных значениях рН. Белок, модифицированный при рН 7,2, содержит стехиометрические количества ингибитора, тогда как фермент, инактивированный при щелочных значениях рН не содержит реагента. Кроме того, в последнем случае модифицированный белок не

способен к реактивации даже при длительной инкубации в присутствии РР|. Следует подчеркнуть, что ЕРРаза, модифицированная при нейтральных значениях рН, а затем перенесенная в щелочную среду, обладает свойствами белка, фосфорилированного при щелочных значениях рН. Эти результаты позволили предположить, что при взаимодействии моноэфира фосфорной кислоты с РРазой в щелочной области рН также образуется ацилфосфатная связь, которая далее подвергается нуклеофильной атаке расположенной вблизи функциональной группой Lys или Туг и в ферменте образуется внутримолекулярная сшивка. Подтверждение этой гипотезы было получено при исследовании инактивации некоторых мутантных форм фермента метилфосфатом при рН 9,5. Оказалось, что способность к реактивации утрачивается всеми мутантными формами, кроме Tyr55Phe. Не исключено, что инактивация РРазы при щелочных рН обусловлена образованием сложноэфирной связи между остатком фосфорилированной дикарбоновой аминокислоты активного центра и Туг55.

Обращает на себя внимание колоколообразный вид большинства зависимостей k„,6„ от концентрации ингибитора, полученных при различных рН (рис. 6). Этот факт свидетельствует о существовании нескольких центров связывания, причем связывание ингибитора вторым тримером не только ухудшает его сродство к первому тримеру, но и сопровождается падением скорости инактивации белка, что свидетельствует о проявлении кооперативное™. Несколько иной характер зависимости kBaen от концентрации ингибитора наблюдается при рН 7,2 (рис. 6). В этом случае связывание ингибитора одним тримером облегчает образование ковалентной связи в другом и, как следствие, наблюдаемая константа скорости увеличивается в 1,5 раза. Не исключено, что связывание метилфосфата в одном тримере таким образом влияет на конформацию второго, что он также становится способным связывать ингибитор и, в свою очередь, изменять конформацию первого тримера так, что скорость инактивации растет, хотя сродство к метилфосфату ухудшается. При этом модификация может идти только в одном ("первом") тримере.

Локализация остатка фосфорилированной дикарбоновой аминокислоты

Известно, что фосфорилирование белков является эффективным путем регуляции их функционирования. При идентификации природы фосфорилированной аминокислоты особые трудности возникают в случае дикарбоновых аминокислот, в первую очередь из-за лабильности ацилфосфата. Еще более сложной проблемой является локализация фосфорилированной дикарбоновой аминокислоты в первичной структуре белка.

В настоящей работе исследована возможность использования описанной способности нмзкомолекулярных пептидов, содержащих гидроксамат аспарагиновой кислоты, расщепляться по С-концу, с образованием новой 1^-концевой последовательности'

-ЫНСНСО-ШЯ

-МН СО

СНгСОМНОН

Ж

"СН О

| | + му*

сн, МН —кн со

—МН СО

^ сн \

NR

со' "сн- \ СИ2-со

ион +

сн2^ / со

Реакцию проводят при 60°С в течение 5-30 часов; выход продуктов расщепления зависит от природы радикала Я.

Первый шаг на пути локализации аспартилфосфата в белке состоял в превращении ацилфосфата в гидроксамат. Однако известно, что выдерживание нативной ЕРРазы с гидроксиламином приводит к ее инактивации Поэтому в первую очередь необходимо было исследовать взаимодействие нативной ЕРРазы с гидроксиламином.

Взаимодействие неорганической пирофосфатазы Е. соИ с гидроксиламином

Установлено, что ЕРРаза, так же как и УРРаза, ингибируется гидроксиламином. Если при этом образуется гидроксамат, то пептидную связь, образованную карбоксильной группой, можно было пытаться расщепить, используя описанные выше химические превращения. Условия получения гидроксаматов и их превращения суммированы в таблице 1. Массы получившихся фрагментов определяли с помощью МА1ЛЭ1-ТОР масс-спектрометрии и определяли места разрывов в соответствии с первичной структурой.

Из опыта 1 видно, что при действии гидроксиламина происходит модификация большого числа остатков аспарагиновой кислоты. Удаление из реакционной среды избытка гидроксиламина до нагревания (опыт 2) практически не сказывается на числе полученных пептидов. Обращает на себя внимание тот факт, что подавляющее число разрывов происходит по остаткам аспарагиновой кислоты, входящих в центры связывания ионов металла.

Таблица 1. Взаимодействие неорганической пирофосфатазы из Е. coli с 0,1 М

Гцдроксиламином при 25°С н pH 7,2.

Л® опытов j 1 I 2 3 4

\ Условия | инактивашш ) '1 Иккубашм 1.5 часа Инкубация 1.5 часа Инкубация 18 часов, после прединкубации с 33 мМ Мв* Инкубация 3 часа в 5М гуанидил хлориде

Остаточная | яктгтнпсть 35% 35% 75% --------

1 Условия | растепления 45°С, 5 часов, в присутствии гидроксиламина 60"С. 5 часов. Перед нагреванием фермент был освобожден от избытка гидроксиламина 60' 'С. 5 часов. Перед нагреванием фермент был освобожден от избытка гидроксиламина 60"С, 5 часов в присутствии гкдроксиламина

Расщепляемая связь Asrr'-Ala2' Asp^-Gl)66 Asp61-Pro68 Asp'^-Ala10' Asp"-Lvs51 Asp'3- Leu'26 Агп'^-АЬ25 А5р65-СН-№ А5р6,-Р гоа А5р97-С1и9® А5р,и-А1а,и АБп'-УаГ, А5Р"-ЬУ55\ А5П"-Туг5\ А5Р,с,-УаГ' А5п2"-А1а:'\ А5р65-ау66

По-видимому, гидроксиламин в условиях проведения реакции, являясь цвиттер-ионом, заполняет эти центры связывания ионов металла, что в свою очередь активирует карбоксильные группы, являющиеся потенциальными лигандами металла, обеспечивая протекание реакции с кислородным атомом гидроксиламина. Защитный эффект ионов магния на инактивацию ЕРРазы гидроксиламином подтверждает это предположение. Действительно, даже после 15 часовой инкубации с гидроксиламином в присутствии магния глубина инактивации не превышает 25%, (опыт 3) и расщепление по связям, образуемым большинством белковых лигандов металла, исчезают. Однако использование еще одного приема для минимизации собственного взаимодействия гидроксиламина с белком, заключающегося в предварительной денатурации фосфорилированного белка (опыт 4), привело к лучшим результатам. В этом случае, несмотря на увеличение температуры с 45°С до 60°С, число разрывов, затрагивающих дикарбоновые кислоты, сокращается в два раза.

Локализация остатка дикарбоновой аминокислоты, образующего ацнлфосфатиую связь

Для локализации остатка дикарбоновой аминокислоты, подвергающейся фосфорилированию, ЕРРазу инкубировали с 50 мМ фосфатом 15 часов при рН 7,2 (остаточная активность фермента составила 40%). Фосфорилированный фермент лиофилизовали, растворяли в 5 М гуанидил хлориде рН 7,4 и инкубировали 3 часа при 37°С. К денатурированному ферменту добавляли гидроксиламин до концентрации 0,1 М

и инкубировали 30 минут при 25°С, затем повышали температуру до 60°С и выдерживали 18 часов. Контрольным являлся эксперимент, в котором белок подвергался тем же самым обработкам, кроме фосфорилирования Препараты хроматографировали с помощью ОФ-ВЭЖХ на колонке Ыис1еоз11 Сд в градиенте ацетонитрил/ 0,5% ТФУ (рН 3,0) с детекцией элюции материала при 215 нм. Выходящий с колонки материал собирали в виде трех фракций и далее анализировали, с помощью ступенчатой деградации по Эдману, фракцию, элюируемую с колонки первой, наиболее обогащенную пептидным материалом (таблица 2).

Таблица 2. Результаты трех циклов анализа по Эдману опытного и контрольного образцов.

аминокислоты Опыт количество, пикомоль Контроль Количество, пикомоль

Asp 4,5 4,3

Ser .20 24,1

Gly 7,1 9,3 6,7

Gin 1,4

Ala 4,1 0,8

Pro Ш42Ш 10 9 :/ пкг : •; 11,8 10

Val , лг:--:. • 8 0,8 111,3

He 10 6

Lys 10 9

Leu 4 '..56 . 55 0,7 41 20

Как видно из данных, приведенных в таблице 2, в опытном образце идентифицированы следующие N-концевые последовательности. Ser-Leu-Leu, соответствующая N-концевой последовательности фермента, и последовательность Рго-Val-Asp, являющаяся уникальной, и соответствующая пептиду, образующемуся при расщеплении по остатку Asp 67. Возможно идентифицировать и еще некоторые последовательности, соответствующие пептидам, однако их содержание в анализируемой смеси незначительно и, по-видимому, отражает реакцию взаимодействия гидроксиламина с белком. В контрольном опыте, не смотря на то, что количество белка в 1,5 раза превышает количество, взятое в опыт, кроме N-концевой последовательности, определяется лишь незначительное количества пептида, начинающегося с Pro 68 Это расщепление, по-видимому, связано с тем, что ЕРРаза является термостабильным

белком и обладает очень прочным кором, поэтому провести полную денатурацию фермента для абсолютного устранения его способности к взаимодействию с гидроксиламином невозможно, так как определенные ограничения на время инкубации с денатурирующим агентом накладывает лабильность ацилфосфатной связи.

Для того чтобы снизить количество неспецифических расщеплений были проведены специальные эксперименты: увеличивали в два раза количество белка, и уменьшали время инкубации при 60°С до 10 часов. В этом случае, после хроматографирования в описанных выше условиях, в отличие от вышеописанного опыта, с помощью ступенчатой деградации по Эдману были проанализированы все три фракции выходящие с колонки. В соответствующем контрольном образце также были проанализированы все собранные фракции. Полученные результаты и в опытном и в контрольном образцах принципиально не отличались от описанных выше, однако выход пептидов снизился, что может быть обусловлено двумя причинами. Во-первых, это может являться результатом уменьшения времени инкубации при 60°С, во-вторых анализ последовательности искомого пептида проводили на фоне очень больших количеств белка.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что инактивация ЕРРазы фосфатсодержащими ингибиторами является следствием фосфорилирования остатка асларагиновой аминокислоты - Asp 67, расположенной в активном центре ЕРРазы. Эти результаты коррелируют с данными рентгеноструктурного анализа, согласно которым остаток Asp 117 в УРРазе (Asp 67 в ЕРРазе) располагается вблизи центра Р2.

После локализации остатка, образующего ацилфосфатную связь, второй центр взаимодействующий с Р, и метилфосфатом следует отождествить с Р2 сайтом активного центра.

В заключение надо отметить, что метод, предложенный для расщепления гидроксаматов ди- и трипептидов, удалось успешно использовать в случае белка. Несомненно, что этот метод значительно проще и удобнее описанных ранее в литературе. Главное осложнение при локализации аспартилфосфата в РРазе возникает из-за собственной реакции гидроксиламина с белком. Это потребовало введения дополнительной стадии - денатурации белка, что однако может приводить к частичной потере фосфатной группы. Чувствительность к гидроксиламину не позволяет также увеличивать его концентрацию, что необходимо для увеличения выхода продуктов расщепления. Не исключено, что состав продуктов контрольного опыта может свидетельствовать о небольшом дополнительном неспецифическом гидролизе пептидных связей.

В дальнейшем представляется интересным апробировать метод на других фосфорилированных белках, в первую очередь- на лишенных специфической чувствительности к гидроксиламину.

Сравнительное изучение кинетических свойств тримерной и гексамерной форм ЕРРазы

Выше была расмотрена сложная система взаимодействий активных центров в гексамерной молекуле при реакции с фосфатсодержащими ингибиторами Принципиальным является вопрос о возможном взаимодействии активных центров в реакции с субстратом. Ответ на этот вопрос был получен при сравнительном исследовании кинетики гидролиза пирофосфата магния тримерной и гексамерной формами ЕРРазы, а также химерными белками.

Тримерную форму ЕРРазы получали, используя свойство фермента диссоциировать на тримеры в слабокислых условиях. После получения тримеров концентрацию фермента сильно снижали для предупреждения их ассоциации в гексамер

Начальные скорости гидролиза пирофосфата тримерной формой ЕРРазы были определены при следующих концентрациях: 1-2000 мкМ Гу^РР, и 0,1-8 мМ Результаты, полученные при изучении кинетики гидролиза субстрата тримерной и гексамерной формами ЕРРазы, оказались принципиально различными (рис. 8)

Для тримера, в отличие от гексамера, каталитическая реакция носит двухстадийный характер и не описывается в рамках кинетики Михаэлиса-Ментен. Первая стадия наблюдается при концентрациях субстрата менее 200 мкМ и при любой концентрации магния, вторая стадия достигается при значительно более высоких концентрациях субстрата. Такое поведение не связано с наличием примеси гексамера в реакционной смеси, так как накопление продукта во времени было линейным, и при увеличении рабочей концентрации белка в 10 раз линейность сохранялась

700 650600550500450 400350300 250200150 100

50 Н 0

500 1000 1500

МдРР, мкМ

2000

700-

650-

600-

550-

500-

450 -1

400-

-i 350-

■J 300 н

— -

е 250 -j

а < 200-

150 J

100-

50-

0 J

20

40 60

MgPPj, мкМ

—i— 80

100

Рисунок 8 Зависимость активности тримерной (а) и гексамерной (б) ЕРРазы от концентрации субстрата и свободного магния. Концентрация магния указана у соответствующих кривых.

Кинетика гидролиза субстрата тримерной формой хорошо описывается схемой, которая предполагает наличие, по крайней мере, двух центров связывания субстрата, сильно различающихся по сродству (схема 1).

K's

Ks&

EM -«-

EMS ^ i

EM Sq

А

К ГП2

K'rri2 К"тг|

; K's* *

em2s -—em2s

где E - фермент; M - ион Mg2+; S - MgPPi

Схема 1. Схема катализа тримерной формой РРазы Е coli

Расчет кинетических параметров проводился с использованием уравнения (1) Для упрощения расчетов были введены следующие допущения Ks2=K's2. K's=K"s; K^K'n^K"^, а a=k3/k2

Константы связывания субстрата в разных центрах составляют 3.6 и 985 мкМ М£РР; Эти данные указывают на взаимодействие активных центров тримера, которое проявляется в их отрицательной кооперативности при связывании субстрата.

Можно было предположить, что уменьшение эффективности катализа тримером по сравнению с гексамером, связано с разрушением межтримерных контактов, которое вызывает значительные конформационные изменения субъединиц в тримере. Однако это не так. На первой стадии превращения субстрата под действием тримера свойства части субъединиц в тримере незначительно отличаются от свойств субъединиц в гексамере (К™ 3,6 мкМ и 0,7 мкМ соответственно). Этот факт является очень важным, так как если бы происходили структурные изменения, то они были бы идентичны для всех субъединиц в тримере. Кроме того, при концентрации субстрата более 1 мМ активность тримера становится неотличима от активности гексамера. Уместно вспомнить существенную разницу в свойствах изолированного тримера и мутантных Рраз, с щадящими заменами групп активного центра. В обоих случаях эффективность катализа низкая при условиях, когда \УТ ЕРРаза полностью активна, но, несмотря на то, что пространственная структура мутантных белков не претерпевает сколько-нибудь заметных изменений, активность их не может быть повышена увеличением концентрации субстрата или металла, тогда как при увеличении концентрации субстрата активность тримера возрастает и достигает активности гексамера

v/[£„] =

¿,[A/][S0](l + g[.S-0]/A„)

(П

Доказательство согласованного функционирования активных центров ЕРРазы в катализе

Вопрос о том, как тример функционирует в составе гексамерной молекулы и по какой причине в катализе гексамером не наблюдается кооперативность субъединиц, были получены химеры, то есть гексамеры, в которых активный тример был объединен с «неактивным» (мутантным) тримером. «Неактивный» тример был получен диссоциацией мутантной формы ЕРРазы (А$р70А5п, Азр97Азп или Ьу51СМС1п), которая обладает очень низкой каталитической активностью, но сохраняет способность связывать субстрат и магний.

Начальные скорости гидролиза РР| химерами были определены в широком диапазоне концентраций субстрата и магния. Для всех химерных белков зависимости скорости гидролиза от концентрации субстрата имеют тот же вид, что и для ШТ гексамера (рис. 86), поэтому для описания кинетики катализа химерами использовалась кинетическая схема 2, которая предусматривает последовательное присоединение к ферменту двух ионов металла и два пути превращения субстрата в продукт.

Кгги Кт2

Е -->- ЕМ --ЕМ 2

А А А

КБ

ЕБ

К'гги

К'5

ЕМ Э к1

К'тг

К"з| т

ем2 к2

Где Е-фермент; М - ион Б - MgPPi

Схема 2. Кинетическая схема катализа гидролиза РР, гексамерной формой ЕРРазы.

Таким образом было установлено, что свойства активного тримера в составе таких гибридов практически неотличимы от свойств тримера в составе нативного гексамера и максимальная активность достигается при низких концентрация субстрата (менее 100 мкМ). Следовательно, включение тримера в гексамер, даже в случае, когда в качестве второй половины молекулы используется практически неактивный тример мутантной формы белка, приводит к его активации. Эти данные позволяют сделать принципиальный вывод о согласованном функционировании активных центров в олигомерной структуре ЕРРазы.

Превращение неэквивалентных активных центров тримера в идентичные при объединении тримеров в гексамер могло бы происходить на стадии связывания субстрата или металла, а также при уходе продуктов реакцини. Выравнивание свойств активных центров в гексамерной молекуле обусловлено взаимодействием с субстратом, поскольку мугантный тример способен только связывать субстрат, не превращая его в продукты реакции.

Таким образом, отрицательная кооперативность активных центров в тримере и ее исчезновение в гексамере, подтверждают, что решающую роль в «выравнивании» субъединиц играют не возникающие в гексамере контакты, а изменения конформации субъединиц одного тримера, при связывании субстрата в другом. Такой факт вскрывает неизвестные ранее черты функционирования РРазыЕ. сок

Сложный отклик РРазы на связывание пирофосфата и фосфатсодержащих ингибиторов указывает на существование путей передачи информации между активными центрами соседних тримеров, обеспечивая совершенную организацию и согласованное функционирование активных центров гексамера в катализе. Этот процесс может включать некоторые перестройки нековалентных взаимодействий в олигомерной молекуле. Следует подчеркнуть, что эти пути передачи информации не могут быть отождествлены с межтримерными контактами, которым принадлежит решающая роль в поддержании четвертичной структуры.

Заключение

Изучение взаимодействий ЕРРазы с фосфатсодержащими ингибиторами выявило два центра их связывания в активном центре фермента. На основании использованных подходов показано, что центры Р1 и Р2 связаны между собой сложной системой взаимодействий в олигомерной структуре фермента. Заполнение центра Р1 в одной субъединице влияет на сродство Р]-центра в другой субъединице, аналогично, один центр Р2 влияет на другой Р2, Р1 на Р2 и Р2 на Р1. Не исключено, что взаимодействие центров связывания фосфата вовлечено в уход продуктов гидролиза субстрата из активного центра.

Взаимодействие активных центров в каталитическом гидролизе субстрата выявлено при изучении тримерной и химерной форм.

21

Выводы

1 Установлено, что неорганический фосфат взаимодействует с апоЕРРазой с образованием двух неактивных соединений - фосфорилированного фермента и прочного комплекса.

2. Выявлено взаимосогласованное функционирование центров связывания фосфатсодержащих ингибиторов.

3. Показана принципиальная возможность использования гидроксиламина для локализации аспартилфосфата в белках.

4. Показано, что фосфорилированию подвергается остаток Asp 67, входящей в активный центр фермента.

5. Рассмотрен возможный механизм аффинного ингибирования ЕРРазы.

6. Обнаружена кооперативное™ субъединиц в тримере при связывании субстрата. Сделан вывод о согласованном функционировании всех активных центров в процессе катализа.

Список публикаций по теме диссертации

1. Григорьева О.В., Склянкина В.А., Аваева С.М. Особенности реакции РРазы Е. coli с моноэфирами фосфорной кислоты в нейтральной и щелочной средах. // Вестник Московского Университета Серия 2. Химия. 1996. т. 37. № 6.

2. Avaeva S., Kurilova S., Nazarova Т., Rodina E., Vorobyeva N.. Sklyankina V., Grigoijeva O., Harutyunyan E., Oganessyan V., Wilson K„ Dauter Z., Huber R. Crystal structure of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase complexed with S042' Iigand-induced conformational changes. U FEBS Lett. 1997. 410. P. 502-508.

3. Avaeva S., Grigorieva O., Mitkevich V., Sklyankina V., Varfolomeyev S. Interaction of active sites in trimeric and hexameric forms of E. coli inorganic pyrophosphatase in catalysis. // FEBS Lett. 1999. 464. P. 169-173.

4. Аваева C.M., Григорьева O.B., Митькевич В.А., Склянкина В.А. Ингибирование неорганической пирофосфатазы Е. coli неорганическим фосфатом. // Биоорганическая химия, в печати.

5. Avaeva S., Kurilova S., Nazarova Т., Rodina E., Vorobyeva N.. Sklyankina V., Grigorjeva O., Harutyunyan E., Oganessyan V. Ligand-induced conformational changes of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase II The first International Meeting on Inorganic Pyrophosphatases. Abstract book, p. 26. Turku (Finland), 1997.