Пространственная структура неорганической пирофосфатазы Escherichia coli при разрешении 2,2 А тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.18 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ ПАУК ■■.О ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

ИНСТИТУТ КРИСТАЛЛОГРАФИИ им. А. В. ШУБНИКОВА

^ На правах рукописи

ОГАНЕСЯН Ваге Юнович

УДК 548.737

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ПИРОФОСФАТАЗЫ lischericia coli ПРИ РАЗРЕШЕНИИ 2.2Ä.

Специальность 01.04.18 — Кристаллография,

физика кристаллов

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физики — математических наук

Москва 1995

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте Кристаллографии им. А.В.Шубиикова РАН

Научный, руководитель: доктор химических наук, профессор

Э.Г.Аругюнян

Официальные оппонентьгдоктор физико- "математических наук,

профессор В.И.ИваиоБ (ИМБ РАН), доктор химических наук, профессор Л.А.Асланов (МГУ). Ведущая организация: Институт теоретической и

экспериментальной Биофизики РАН. Защита диссертации состоится " 24 " мая 1995г. в "1СЙ9'1 на заседании Специализированного совета Д.002.58.01 при Институте Кристаллографии им. А.В.Шубпикова РАН по адресу 117333 Москва, Ленинский проспект, 59.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Кристаллографии им. A.B. Шубникова РАН

Автореферат разослан " 20 " апреля 1995г.

"Ученый секретарь специализированного совета кандидат физик.» — математических наук

В.М.Каневский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Неорганическая пирофосфатаза с участием ионов металла катализирует обратимую реакцию гидролиза—синтеза неорганического пирофосфата, обеспечивая строгое соответствие количества пирофосфата и фосфата в клетке. Неорганические пирофосфатазы выделены более чем из тридцати разных источников, для десяти из них известна аминокислотная последовательность. Несмотря на низкую гомологию, для всех нирофосфатаз характерно наличие консервативных аминокислотных остатков. Большинство этих остатков расположено и активном центре, что свидетельствует об общности механизма их действия. До недавнего времени структурно — функциональные исследования; нирофосфатаз сдерживались отсутствием данных о пространственной структуре этих ферментов при высоком разрешении. Единственным ферментом этого класса, для которого была установлена пространственная структура нативкого состояния при разрешении ЗА и комплекса с металлом — активатором и фосфатом при разрешении 2.35А, являлась неорганическая пирофосфатаза Saccharomyces cerevisiae.

Пирофосфатазы подразделяются на две группы: с гексамерной и димерной четвертичными структурами. Первая характерна для прокариот, вторая для эукариот. Неорганическая пирофосфатаза Escherichia coli один из наиболее полно исследованных белков этого класса. Для этого белка установлен механизм действия с участием четырех конов металла. Выполнен комплекс генноинженерных исследований с заменой аминокислотных остатков, предположительно входящих в состав активного центра. Таким образом, исследование этого белка методом рентгеноструктуртют анализа, имея обеспеченную биохимическую базу, способно дать ответ на ряд важных вопросов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ заключалась в определении пространственной структуры пирофосфатазы E.coli методом рентгеноструктурного анализа.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ состоит в установлении нространственной структуры нативного фермента неорганической пврофосфатазы из прокяриотичсского организма Escherichia coli с разрешением 2.2А. Проведен анализ вторичной, третичной и четвертичной структур молекулы и их сравнение с другими известными неорганическими гшрофосфатазами.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ работы заключается в том, что установленная атомная структура неорганической пирофосфатазы является основой для изучения механизма действия фермента путем изучения структур его комплексов с металлами — активаторами, металлами —ингибиторами, аналогами субстрата, а также комплексов полностью или частично неактивных мутантов фермента с субстратом.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликованы три научные работы. Список публикаций приведен в конце автореферата.

ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и заключения. Она изложена на страницах с рисунками,

таблицами и списком цитируемой литературы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Промежуточные результаты докладывались на научной конференции сотрудников ИК РАН (1988), полностью работа представлена на четвертом Европейском совещании по кристаллографии биологических макромолекул (Комо, ИталияД995).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ. Во введении обоснована актуальность темы, содержится постановка задачи и сформулирована основная цель работы.

ГЛАВА-! посвящена обзору имеющихся в литературе данных о физике — химических свойствах пирофосфатазы Escherichia coli (E.coli).

Неорганическая пирофосфатаза (пирофосфат фосфогидролаза, КФ 3.6.1.1) E.coli это узкоспециализированный к еталлозависимый фермент, катализирующий превращение неорганического пирофосфата РР, в

фосфат Р, [1]. Молекула фермента имеет массу 120 кДа и состоит из шести химически идентичных субъединиц [2]. Для каталитического действия пирофосфатазе необходимо присутствие в каждой из субъединиц двух двухвалентных ионов металла—активатора. В клетке эту роль выполняют ионы Мд2 + , однако в присутствии Мн2+, Т.п2 +, и Со2+ фермент также проявляет активность [1]. Ионы Са2+ ингибируют фермент. Истинным субстратом является не ион ггирофосфата, а его комплекс с ионом магния [3]. Известно также, что связывание субстрата облегчает присоединение четвертого иона металла [4]. Механизм функционирования фермента может быть представлен следующей схемой [4]: ЕМд2 + Мд2РР1 о ЕМд4РР} «1 ЕМд2(МдР1)2 «> ЕМд2МдР1

Мд0кт2 1 Мд0Кя3 " Мд

4 Мд0Кт5 ' *

ЕМд ЕМдзРР| ЕМд(МдР1)2 ЕМд(МдР{)2

Е <=> ЕМд2 + МдР4 ,

Кт, = [Е||Мд|/[ЕМд|; Кт2 = [ЕМд;[Мд)/[ЕМд2]; КшЛ=[ЕМдзРЯ1][Мд1/[ЕМд4РР1];

Ки4=[ЕМд(МдР£2]|ГМд1/[ЕМд2(МдР1)2]; К^« [ЕМд(МдР1)|ГМд]/[ЕМЧ2МдР1]; К, = Кз = К7~ку'*в-

Аминокислотная последовательность пирофосфатазы £.соП полностью была выведена из нуклеотидной последовательности гена [5]. Субъединица состоит из 175 аминокислотных остатков.

Первичная структура дад другого хорошо изученного фермента пирофосфатазы БассЬаготусев сегем'.ыае (З.сегепвхае) была установлена еще в 1978 году [6] и уточнена по нухлеотидной последовательности гена [7]. Для пирофосфатазы из этого источника определена пространственная структура нативного белка с разрешением З.ОА [8] и комплексов с Ь'02г, ТЬ3+, Мд2+, СаРР(, Мп ~ Р, ¡9]. Установлены элементы вторичной структуры и аминокисчотные остатки активного центра. Данные о первичней структуре пирофосфатаз из других источников показали, что несмотря на большое различие в дллне полхшеатидной цепи,

функциональные группы, обращенные в полость активного центра пирофосфатазы Асегеияае, проявляют ярко выраженную консервативность во всех пирофосфатазах. На рис.1 приведены выравненные аминокислотные последовательности трех наиболее изученных пирофосфатаз. Гомология по всем известным аминокислотным последовательностям составляет около 24%. В работе [23] показано, что при их разделении и а две группы степень гомологии возрастает до 50 — 60%. Одну группу составляют прокариотические ферменты, другую — о у кар и отческие.

10 20 30 40 30 60 70

5-ТУТТЙО1САКЫТ1,ЕУКУУ1ЕК0СКРУЗАЯНО1РЬУАОКЕЫЫ1РЫМУУ£1Р'а\УТЫАЛЬ£1ТКЕЕТЬМР1 Ю/ Т— Ат^^С'ОКАРЕУЛШМИ£У.РКаЗС1Ч.КУ£¥ОРОЬ- *СА1Ки

Е- БШ-Л'РАС'КОЬРЕ Б I УУ МгПРАР.'ЛЕ^А'У/ЛОК 'САЬЕУ

10 20 30 40

80 90 100 110 120 130 140

8- ЖЕДРУКМСЕРШ 1'С И11Г\' КЙЛРТОГЛЕОРГ4У8НРЕГКАУСда#Я^.ШСРТ!Л\Т«Э 1КС)УКА1а\

Т---* ЯУРРСА' ' * ОРУРСОУбР! Р5 УЬ ЛЕ.........* • */Х^Л.»а.£УЕЗТУРШ><Л'УУ ЕУЯУУО.!

Е~ • • '№М8ТА- * * МЯ 1ГЛЧ,\Н 7Ь ЙЬ ' * * ' * *......ДПОЛ'ОТ.ЛУРТРУРРОРГг И 1гС1*Р\'ГДЛ

50 60 70 80 90

150 160 170 1Ё0 190 200 210

5-ДГСЕПМ'ЛУГАIОГ NО' *Р1АРКЕН/ДЕг7УЕКУРРСЬЬКАТКЕ\У/«11МРО* * 'СЖЕКОРАЯЧСЕАК ?ч1КК ХЮ^СС/>АКУТСУУАЕО''ОНЬ0Н[0ЯС/ДФ*"ЕСУКОЕ1ОНН/ЕТгаАЕЕАККСМУУК\г"**'ТСШК0КК, £-ВСДСЕДАМ.\'АУРН5КЕ8КЕУГЗН1К/Л'МИЛ'-"ЕЦ.КЛ01АНР/ЕН ИГОЕЕ' ' КГГЯ\ЛЛ/КУ"''ЕСУ/ЕМАЕ 100 110 120 130 140 150

220 230 240 250 260 270 280

A'-DI[KETHDSWЛQL!AGKSSDSKG1DLTNVTLPDTPTYSKAASD.A1PPASPKADAP1DKSIDKWFFISGSV Г-ЕЕУРАС1АГ(УКС /T-AhIVASFF.RA.KNK 170

Рис.1. Приведенные в соответствие первичные структуры аирофосфатйЗ .9— 5.С(уеи.«зе, Г- ТЬеппиа 1ЬеппорЬИи5 и Е- КсоИ. Жирными буквами выделены в-оисерватипные аминокислотные остатки, символ * означает отсутствие аминокислотного, остатка;

верхняя нумерация мя пирофосфатазы Ь'.сегеушае, кижняя — Е.со11

Существенный прогресс в изучении пространственной структуры пирофосфатаз был достигнут в 1994 году, когда одновременно были опубликованы три работы, посвященные рентгеноструктурному анализу этих ферментов, в том числе результаты настоящего исследования. Знание деталей пространственной структуры является важнейшим этапом на пути познания механизма действия и функционирования штрофосфатаз.

ГЛАВА 2. Экспериментальная часть.

Неорганическая пирофосфатаза Е.соИ выделялась из штамма 1М109 с рекомбинантной плазмидой р11С19 в Московском государсгвенном университете. Кристаллы апоформы были получены в 1985 году [11]. Они относятся к пространственной группе К.3'2 с параметрами ячейки а~ 110.4А, с— 154.7А. Независимая часть элементарной ячейки содержит две субъединицы. Позже были получены кристаллы с вдвое меньшим параметром с. Они содержат одну субъединнцу в независимой части ячейки. Эта кристаллическая форма явилась предметом диссертационного

исследования. Кристаллизация проводилась при температуре 25~30°С методом висячей капли из раствора белка ( 4тд/ш1 ) и хлорида аммония ( 4 М ) в 0.1М трис —НС1 буфере ( рН 7.5). Максимальный размер кристаллов достигал 0.6 х 0.6 х 0.5 мм. Пространственная группа кристаллов Я32, параметры элементарной ячейки а~ 110.4Л, с~76.ВЛ.

В решении пространственной структуры использовался метод полиизоморфных замещений. При настаивании кристаллов для получения тяжелоатомных производных применялись специфические добавки. Для модификации остатка цистеина, один из которых доступен для молекул растворителя [11], использовался парахлормеркурбензоат. Второе тяжелоатомное производное получено на основании аналогии с иирофосфатазой Б. сегаъ^я/ае, где были использованы солп лантаноидов [8]. Условия получения производных и параметры элементарных ячеек их кристаллов приведены в таблице 1. Диффракционнме данные для нативных кристаллов и для кристаллов тяжелоатомных производных были

Таблица 1. Условия получения и кристаллографические данные для тяжелоатомных производных.

Производное "8 Ей

Добавка рСМВ Еи(Ы03)3

Концентрация,М ю-4 ю-4

Время настаивания.часы 48 24+30

Параметр а,А 110.6 110.9

Параметр с,А 77.0 77.1

собраны на автоматическом диффрактометре КАРД—6 [12] с двумерным детектором в Институте Кристаллографии АН.Поповым.

Характеристики наборов данных приведены в таблице 2. Обработка наборов данных, а также последующая расшифровка производных, расчет

Таблица 2. Характеристики наборов данных.

Набор Нативиый »8 Ей

Ь/2зте,А 2,19 2.30 2.50

N 26800 22100 18400

^¡па 9116 7253 С169

1>о.% 87 81 92

6.3 8.3 8.0

5.0 10.0 7.0

Полнота, % 97 89 97

N — полное, число измеренных отражений; N¡„1 -■ число независимых отражений; о — средне—квадратичная ошибка измерения иотенсивпостей; 1<1>~! | / X <1>;

изоморфных фаз и их уточнение проводились с использованием комплекса программ "BLANC" А.А.Вагипа [13] на персональном компьютере PC —386. Полнота набора для нативных кристаллов составила в среднем 97.9%.

Определение положения тяжелых атомов проведено но разностным синтезам Патгерсона и перекрестным разностным синтезам Фурье. Оба производных имели по одному месту присоединения тяжелого атома. Разностные синтезы Фурье по объединенному набору фаз не выявили дополнительных мест связывания атомов тяжелых металлов. Фазы, рассчитанные после уточнения параметров тяжелых атомов, характеризовались фактором достоверности <т> = 0.51. Соответствующий синтез электронной плотности при разрешении 2.5Â позволил установить лишь границы гексамерной молекулы. Данные по размерам молекулы были использованы для последующего улучшения качества фаз по методу Ванга, учитывающего вклад молекул растворителя [14]. Эти фазы

-180 -135 -90 -45 0 45 90 Phi(degrees)

Рис.2. Карта Рамачапдраиа для модели пирофосфатазы.

135 130

комбинировались с фазами, полученными методом полиизоморфных замещений. Четыре цикла такой итеративной процедуры привели к повышению фактора достоверности фаз <т> до 0.77, одновременно

уменьшилось значение фактора расходимости ЩИ^Е^о^ — Р(;Д1С)/2РоЬч) с 0.49 до 0.32 и повысилась величина корреляционного фактора

C(C==X{Fobs-<FobS>)(Pcalc-<FCalc>)/(E(Fobs-<Fobs>)2 С

0.71 до 0.88, где Fobs и Fcalc соответственно наблюдаемые и вычисленные структурные факторы.

Синтез электронной плотности, рассчитанный по комбинированным фазам, позволил практически однозначно установить ход полипептидной цепи. При проведении полипептидной цепи и последующих ручных правках модели использовалась программа "О' [15,16] на графической станции Evans & Sutherland PS 330. На начальном этапе определения структуры в синтезе электронной плотности были локализованы две длинные а —спирали и семицепочечяый слой, расположение которых оказалось таким же как в известной структуре нирофосфатазы S.cerevisiac. Полипептидная цепь в этом ферменте иа 111 аминокислотных остатков длиннее, чем в пирофосфатазе £.coIi, однако сравнение

Получение и уточнение модели.

Е-factor

0.4

0.3

г. х

0.03 O.OS 0.14 0.23

Рис.3. Оценка точности в положениях атомов по методу Луазати.

первичных структур этих пирофосфатаз позволило выделить те участки в структуре S.cerevisiae, которые могут быть идентичными в обоих белках. Эти участки следующие: 27 N —концевых, 61 С —концевых остатков и участки 72—77 и 202 — 213. Они были удалены из модели S.cerevisiae. Оставшаяся часть была совмещена со скелетной моделью пирофосфатазы E.coii, полученной с помощью программы "BONES". Остатки, для которых не было электронной плотности в области боковой цепи, были заменены остатками аланина. Полученная таким образом частотно полиаланиновая модель явилась исходной для установления полной структуры пирофосфатазы E.coii. Фактор расходимости R на этом этапе составил 48% при разрешении 2.5Â. Последующее определение структуры сводилось к последовательному включению в модель отсутствующих боковых групп по мере их выявления по синтезам электронной плотности в результате уточнения, постепенному расширению разрешения до 2.2Â и исправлению хода нолипептидной цепи преимущественно на нерегулярных участках. Эти ручные правки модели на графической станции чередовались с уточнением со стереохимическими ограничениями В. Хендриксона и Дж. Коннерта [17], совмещенного с алгоритмом быстрого преобразования Фурье Агарвала [18], реализованного и развитого Э. Додсон в программе "PROLSQ" комплекса программ ССР4 [19]. В уточнении использовались все

отражения без срезки по <т. Всего было выполнено около 500 циклов уточнения с исправлениями на графической станции через каждые 20 циклов. На первых стадиях определения структуры на переходных участках между элементами вторичной структуры наблюдались разрывы в электронной плотности, а некоторые ее участки были трудно интерпретируемыми. Участки 98—101 и 147 — 150 удалось локализовать лишь на заключительных стадиях уточнения. 11о достижении фактора расходимости R = 22% в модель структуры добавлялись молекулы растворителя. Для этого использовались разностные синтезы электронной плотности с коэффициентами (2Fob, — Fra]c) и (Fobs~Fcaic)- Сначала включались те молекулы еоды, для которых расстояние до атомов

молекулы белка не превышало 3.2Ä. На заключительных стадиях это ограничение было снято, однако молекулы воды, для которых температурный фактор при уточнении превышал 60Ä2, исключались из рассмотрения. Конечная модель пирофосфатазы E.coli содержит 1380 неводородных атомов белка одной субъединицы молекулы белка и 115 кристаллографически независимых молекул растворителя. Фактор расходимости R составил 16% в интервале разрешения 10.0h-2.2A. Координаты атомов представлены в белковый банк данных PDB [20J. ГЛАВА 4. Описание и анализ модели.

Статистические характеристики уточненной модели приведены в таблице 3. Карта Рамачандрана для торсионных (р и у углов основной цепи всех аминокислотных остатков приведена на рис. 2. Модель соответствует всем стереохимическим требованиям, предъявляемым к структурам высокого разрешения [21]. На рис. 3 приведена интегральная оценка точности в положениях атомов по методу Луззати [22]. Она составляет 0.25Ä. Максимальное отклонение длин связей от идеальных составляет

0.061Ä (С —N Lys29), а максимальное отклонение валентных углов — 13.3° (N-CA-C Phe44).

На рис. 4 приведена схема четвертичной структуры молекулы гексамера. Шесть субъединиц молекулы пирофосфатазы расположены в вершинах

Рис.4. Схема четвертичной структуры 1екс.амсрной молекулы.

тригональной антицризмы с точечной симметрией Из=32. Молекулярная симметрия совпадает с кристаллографической. Центр молекулы расположен в специальном положении в элементарной ячейке в точке пересечения осей второго и третьего порядков с координатами (0, 0, 1/2). Таким образом, все шесть субъединиц и химически и кристаллографически эквивалентны. Полипептидная цепь мономера пирофосфатазы Е.соИ свернута в глобулу размерами 30х42х43А (рис.5). В таблице 4 представлено распределение аминокислотных остатков но

элементам вторичной и сверхвторичной структур (рис.6). Выделение р — цепей проводилось по значениям конформационных утлов <р и V основной цепи. В состав а—спиралей включались все остатки, которые участвуют в формировании внутрисниралышх водородных связей и по ф и \|/ углам основной цепи. Установлено шесть а— спиралей (30% аминокислотных остатков) и тринадцать р —цепей (51%). Структура субъединицы относится к классу а/р.

Рис.6. Стереоизображение хода полипситидной цепи и субъидшгице пирофосфатазы ЯсоП

Основу сверхвторичной структуры составляет семицепочечный изогнутый р—слой. Он проходит через весь мономер и составлен цепями Р10, р2, Рб, (58, р11, р10, р13, причем за исключением пары р8 и (111 слой

является антипараллельным (рис.7). Наиболее длинная цепь рю участвует в этом слое дважды.

Участки 14-19 цепи Р2, 54-59 цепи [36, 69 - 75 цепи Р8, 83-90 р10 и 103 — 109 цепи Р11, участвуя в образовании семицепочечного Р —слоя,

одновременно образуют пятицепочечный р — баррель (рис.8).

Особняком в структуре расположена двухцепочечная антипараллельная лента, составленная цепями рЗ и р4.

Элементы вторичной структуры аЗ, а5, аб, семицепочечный р — слой, р — баррель и лента, по—видимому, весьма консервативны, поскольку обнаружены во всех структурно исследованных пирофосфатазах [23,24].

В гексамере тримеры развернуты друг относительно друга на 60°, создавая ряд контактов для каждой субъединицы.

л?

ВУПП-ПП-Г^

Рис.6. Топологическая схема субъодитшци молекулы иирофосфатазы Е.соН.

В непосредственной близости от оси третьего порядка на поверхности гексамера расположены N — конец и нерегулярный участок 35 — 37 всех трех субьединиц. 14—концевые серины образуют попарно водородные связи с соседней субъединицей (рис.9). Те же 14 — концевые серины образуют еще одну водородную связь с карбонилом серина 36 той же соседней субъединицы. Тем самым возникает одно из взаимодействий межд,у субъединицами, которые обуславливают более прочную связь субъединиц в тримере по сравнению со связью между тримерами. Вблизи оси третьего порядка других контактов между субъединицами нет. Здесь формируется канал диаметром 8н-9А, постепенно расширяющийся к центру гексамера. Он содержит молекулы воды, которые образуют водородные связи как между собой, так и с атомами белка.

Наиболее интенсивная зона контактов при объединении субъединиц в тример достигается за счет их парных взаимодействий. Ее формируют в

основном гидрофобные остатки, к (34 одной субъединицы и (310 и ог.2 другой. Установлено также несколько водородных связей.

Взаимодействию тримеров, связанных осью второго порядка, отвечают две зоны контактов. Одна из них выражена очень слабо. Здесь расстояния

Рпс.7. Стереоизображение ссмицепочечкого изогнутого р--слоя.

между атомами соседних субъединиц превышают 4А. Вторая зона выражена более ярко. В этой области попарно сближены спирали ос5,

нерегулярные участки 145—147, 24 — 27, петли 47 — 48, и цепи р5. Вероятно, аспартато —гистидиновый кластер, формирующийся за счет пар Н1з136, ВДзМО, Айр 143 спиралей сх5 (рис. 10), функционально важен, поскольку противоположные стороны этих спиралей обращены в полость активного центра. Здесь локализовано множество водородных связей.

1 —-П|--

Рис.8. Стереоизображение ¡3 — барреля.

В структуре обнаружено 115 молекул растворителя, что составляет около 8% от общего количества белковых атомов в субъединице. Они участвуют как во внутри молекулярных взаимодействиях, так и в контакте между соседними молекулами в кристалле.

Активный центр субъедипицы сформирован следующими участками

полипептидной цепи: 19 —23 |32, (33, 42 — 46 04, нерегулярным участком 47 — 48, р5, Р6, петлей 64-68, 69-72 08, 93-97 ¡310, 101-104 011, 131-141 «5, 148- 152 (313.

Рис.10. Аспартато — гистидииовый кластер.

Таблица 3. Показатели уточненной модели неорганической пирофосфатазы Е.соН

Характеристика Стандартное отклонение а

Валентные связи,А

Расстояния 1-2 0.012 0.020

Расстояния 1-3 0.028 0.030

Расстояния 1 - Л 0.045 0.050

Плоские группы ,к 0.015 0.020

Хиралыше объемы,А3 0.222 0.300

Невалентнъге контакты,А

Близкие 0.194 0.300

Дальние 0.237 0.300

Двуграшшю углы, град.

1 (ептидные 2.710 5.000

Алифатические 17.900 20.000

Ароматические 24.310 30.000

Тепловые факторы,А2

1-2 главной цепи 3.700 4.000

1 - 3 главной цени 5.100 6.000

1-2 боковой цепи 7.300 8.000

1-3 боковой цепи 9.900 10.000

Рис. 11. Стереоизображение активного центра

Боковые группы аминокислотных остатков (Аяр42, АэрбЗ, А5р67, Азр70, А5Р97, Лэрюг, аи20, аи31, аи98, С1и145, Ьуэ142, 1^146, 1.ув148, Ахд43, Туг51, Туг55 и Туг141) направлены в полость активного центра (рис.11).

Таблица 4. Список элементов вторичной структуры пирофосфатазы Е.соИ.

Элемент Начало Конец Сверхструктура

а1 1 4 -

5 7 -

р2 14 19 7цспоч.слой, (3-бар

(зз 28 34 лента

(34 38 46 лента

(35 49 52 -

(56 54 59 7депоч.слой, (3-бар

(37 61 63 -

(38 69 75 7цепоч.слой, (З-бар

39 77 80 -

(310 83 97 7цепоч.слой, (3-бар

ри 101 109 7цепоч.елой, (3-бар

ос2 110 114 -

аЗ 115 121 -

а4 122 125 -

(312 126 128 -

а5 129 144 -

(513 148 157 /цепочечный слой

аб 158 174 -

Ион Еи3+, использованный как тяжелоатомная добавка, локализован в глубине активного центра. Он связан с пятью остатками аспарагиновой кислоты: Аяр65, /\sp67, АБр70, А.чр97 и Азр102.

Проведено сравнение структуры субъединицы пирофосфатазы £.соП со структурой субъединицы фермента 5.сегеи'5/ае. Установлено, что структура пирофосфатазы Е.соИ вписывается в структуру пирофосфатазы 5.сегекгяае, составляя ее ядро. Несмотря на отличие в длинах полипептидных цепей (175 и 286 аминокислотных остатков соответственно) и количестве субъединиц в составе олигомера (6 и 2), "лишние" участки цепи в пирофосфатазе ¿'.сегеияае в большинстве своем нерегулярные, расположены на поверхности молекулы, экранируя ее ядро от контакта с растворителем. В прокариотических пирофосфатазах эту роль, по-видимому, выполняют соседние субъединицы олигомерной молекулы. В 1994 году, параллельно с настоящим исследованием, определены пространственные структуры двух прокариотических пирофосфатаз— "Пгеппив ¡ЬеШорЬИиз с разрешением 2.0А [23] и Е.со11 с разрешением 2.7А [24], причем вторая, в отличие от данной работы установлена для другой кристаллической формы: с двумя субъединицами в независимой части элементарной ячейки. Сравнение пространственных структур подтвердило вывод, сделанный при сопоставлении аминокислотных последовательностей, об их вероятном сходстве.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1.Методом полиизоморфных замещений решена структура неорганической пирофосфатазы Е.со11 и уточнена ее модель до И —фактора 16% в интервале разрешений 10 4-2.2 А.

2.Пропеден анализ элементов вторичной и третичной структур пирофосфатазы Е.соН. Описаны контакты субъединиц при образовании четвертичной структуры.

3.Локализован активный центр фермента и выделены все потенциальные белковые лиганды металлов —активаторов, металлов —ингибиторов и субстрата.

4. Проведено сравнение пространственной структуры пирофосфатазы Rcoli со структурами других неорганических пкрофосфатаз. Материалы диссертации представлены в следующих работах:

1.Мороз О.В., Строкопытов Б.В., Оганесян В.Ю., Айрумян Л.Г., Некрасов Ю.В., Назарова Т.Н., Курилова С.А., Воробьева H.H., Терзян С.С., Аваева С.М., Арутюнян Э.Г. Исследование неорганической пирофосфатазы лз E.coli с разрешением 5А. 1991 Кристаллография, 36:454 — 458.

2. V.Yu.Oganessyan, S.AKurilova, N.N.Vorobyeva, T.I.Nazarova, A.N.Popov, A.A.Lebedev, S.M.Avaeva, E.H.Harutyunyan. X—Ray crystallographic studies of recombinant inorganic pyrophosphatase from Rcoli. FEBS Letters 348,(1994), pp. 301-304.

3. Оганесян В.Ю.,Курилова C.A., Воробьева H.H., Назарова Т.И.,Оганесян

H.H., Терзян С.С., Аваева С.М., Арутюнян Э.Г. Пространственная структура неорганической пирофосфатазы E.coli при разрешении 2.2А. Кристаллография, в печати.

Цитированная литература.

I. Josse, J. (1966) Constitutive Inorganic Pyrophosphatase of Escherichia coli. I. Purification and catalytic properties. J. Biol. Chem., v.241, 9, 1938— 1947.

2. Wong, S.C.K., Hall,D.C., Josse, J. (1970) Constitutive Inorganic Pyrophosphatase of Escherichia coli. III. Molecular Weght and physical properties of the Enzyme and its subunits. J.Biol. Chem.,v.245, 17, 4335 — 4345.

3. Josse, J. (1966) Constitutive Inorganic Pyrophosphatase of Escherichia coli. II. Nature and Binding of Active Substrate and the Role of Magnesium. J. Biol. Chem. v.241, 9, 1948-1957.

4. Baykov, A.A., Shestakov, AS., Kasho, V.N., Vener, A.V., Ivanov, A.H. (1990) Kinetics and thermodynamics cf catalysis by the inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli in both directions. Eur. J. Biochem., v. 194, 12, 879 — 887.

5. Lahti, R., Pitkaranta, T„ Valve, E., Uta, I., Kukko-Kalske, E.,Heinonen, J., (1990) Cloning and characterisation of the gene encoding inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli К-12. J. Bacteriol. v. 170, 12, 5901-5907.

6. Cohen, S.A., Sterner, R., Keim, P.S., Heinrikson, R.L. (1978) Covalent

Structural Analysis of Yeast Inorganic Pyrophosphatase. J. Biol. Chem., v.253, 3, 889-897.

7. Kolakowski, L.F., Sloesser, M., Cooperman, B.S. (1988) Cloning, molecular characterisation and chromosome localisation of the inorganic pyrophosphatase (ppa) gene from Saccharomyces cerevisiae. NAR, v.16, 22, 10441 — 10452.

8. Терзян C.C., Воронова A.A., Смирнова E.A, Куранова И.П., Некрасов Ю.В., Арутюнян Э.Г., Вайнштейн Б.К., Хене В., Хансен Г. (1984) Пространственная структура неорганической пирофосфатазы дрожжей при разрешении З.ОА.. Биоорг. химия, 10, 1469 — 1482.

9. Чиргадзе Н.Ю., Куранова И.П., Невская Н.А., Тепляков АВ„ Вильсон К.С., Строкопытов Б.В., Арутюнян Э.Г., Хене В.Е. (1991) Кристаллическая структура MnPj комплекса неорганической пирофосфатазы дрожжей при разрешении 2.35Л. Кристаллография, 36, 128—132.

10. Vihinen, М., Lundin, М., Baltscheffsky, Н., (1992) Computer modeling of two inorganic pyrophosphatases. BBRC, v. 186, 1, 122 — 128.

И. Айрумян Л.Г., Назарова Т.И., Курилова С.А, Аваева С.М. (1990) Рентгеноструктурное исследование неорганической пирофосфатазы из Е. coli. 1. Выращивание кристаллов, получение тяжелоатомных производных. Вестник МГУ. сер 2, т.32, 1, 98- 100.

12. Попов, АН., Андрианова М.Е., Буренков, Т.П., Хейкер, Д.М. (1994) Метод съемки макромолекулярных монокристаллов в рентгеновском дифрактометре КАРД—6 с двумерным многопроволочным детектором. Кристаллография, том 39, вып.З, 415 — 421.

13. Вагин А.А. (1983) Использование некристаллографической симметрии в структурной кристаллографии белков Кандидатская диссертация, Институт Кристаллографии РАН, Москва.

14. Wang, B.C. (1985) Methods in enzymology, 15,90- 112.

15. Jones, T.A., Zou, S.-Y., Cowan, S.W. and Kjeldgaard, M. (1991) Acta Cryst., A47, 110-119.

16. Jones, T.A, Kjeldgaard, M. (1991) О - the Manual, 1-166, Uppsala, Sweden.

17. Hendrickson, W.A. & Kormert, J.I I. (1980). Incorporation of stereochemical information into cryslallographic refinement. In Computing in Crystallography (Diamond, R, Raroaseshan, S. &Venkatesan, K., etc.), Indian Academy of Sciences, Bangalore, 1301 -1323.

18. Agarwal, R.C.,(1980) New result on fast Fourier least — square refinement technique. In.Refinpment of protein structure., (Machin, PA., Campell, J.W., Elder, M„ etc.),SERC Daresbury Laboratory, UK.

19. CCP4 (1979) The SliRC (UK) collaborative project No.4, a suite of programs for protein crystallography. Daresbury Laboratory, Warrington, W\4 -IAD, UK.

20. Bernstein, r.C., Koetzie, T.F., Williams, G.J.B , Meyer, K F. Jr., Brice, M.D., Rogers, J.R., KeDTiard, O., Shinianouchi. T„ Tasumi, M (1977) The Protein Data Bank: A computer-based archival file for macromolecular structures. J.Mol. Biol. 122:535-542.

21. Morris, A.N., Mac Arthur, M.W., Hutchinson, B.C. & Thornton, J.M. (1992) Stereochemical quality of protein structure coordinates. Proteins: structure, function and genetics. 12, 346 — 364.

'22. Luzzati, V. (1952). Trateinent statistique des erreurs dans la determination ties sbuctures crista Uines. Acta Cryst., 5, 302—810.

23. Teplyakov, A., Obmolova, G.,Wilson, K.S.. Ishii, K., Kajj, Ii.,Samejima, T., Kuranova, I. (1994) Crystal structure of inorganic pyrophosphatase from Ihonaus Iherniopbilus. Protein Science,3, 1098- 1107,

24. Kankare, J., Neal, G.S., Salminen, T., Glumhofi, T., Coopennan, B.S., Lahti, R., and Goldman, A. (199-1) The structure of E.rnii soluble inorganic pyrophosphatase at 2.7 k resolution. Proiein Eitqineeriug, vol.7, 823 — 830.