Кристаллизация белков и механизм функционирования леггемоглобина и пирофосфатазы по результатам рентгеноструктурного исследования тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ БЕЛКОВ И МЕХАНИЗМ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ЛЕГГЕМОГЛОБИНА И

ПИРОФОСФАТАЗЫ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия,

Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук в форме научного доклада

Химический факультет

На правах рукописи

КУРАНОВА

ИННА ПЕТРОВНА

УДК 577.361+548.737

химия природных и физиологически активных веществ

Москва 1991

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте кристаллографии им. А.В.Щубникова АН СССР

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, член-корр. АН СССР Ю.Т.СТРУЧКОВ доктор химических наук, профессор М.Я.КАРЛЕЙСКИИ доктор биологических наук, профессор В.В.МОСОЛОВ

Ведущая организация - Институт биохимии им. А.Н.Баха АН СССР

Защита состоится "2^' ctLCLtS 1991 г. в 4é> часов на заседании Специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете имени 1/1.13Ломоносова по адресу: Москва IIS899, Ленинские горы, МГУ, лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С авторефератом можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан "//" Дллр^сЬЛ 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук,

доцент / / Г.И.лАЯРЕНОВА

, ... j ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

' - Актуальность проблемы. Исследование пространственных структур елков представляет значительный теоретический и практический инте-ес. Развитие представлений об организации белковых молекул и изу-ение корреляции меяду первичной и тротичной структурами; прогресс области направленного мутагенеза, ведущий к созданию белков с но-ыми свойствами; теоретические аспекты механизма действия ферывн-ов - перспективы развития всех этих областей зависят от знания томных структур. ' •

Сравнение пространственных структур болков одного семейства ли различных семейств слупит ваяным критерием для определения эво-i оционных связей между ними. Сравнение пространственных структур ативного белка и его стабильных комплексов с аналогами субстратов ли другими соединениями, имитирующими состояние макромолекулы на азных стадиях реакции, позволяет судить о конформационных измене-иях в ходе ферментативной реакции.

До сих пор практически единственным методом, дающим точные ко-рдинаты атомов в молекулах белков, является рентгеноструктурный нализ (РСА). Однако его удается применить лишь в тех случаях, ког-а исследуемое соединение получено в виде достаточно больших и со-ершенных монокристаллов,-дающих диффракционное поле до разрешения е менее, чем 3 I. Поэтому выращивание белковых кристаллов стало цним из актуальных направлений, от успехов которого зависит раз-лтие рада областей современной молекулярной биологии.

Объектами детального изучения пространственной структуры в злной работе били выбраны леггемоглобин люпина (ЬЬ ) и неорганичен 1Я пирофосфатаза дрожжей.

Своеобразие леггемоглобинов заключается в том, что они являют? уникальными представителями гемоглобинов (НЬ ) в растительном ipe и участвуют в процессах фиксации атмосферного азота. Процессы зреноса и. запасания кислорода исключительно ваяны, поэтому гемог-эбины интенсивно изучаются различными методами с целью выяснения пекулярных механизмов функционирования. В связи с этим представит большой интерес исследование пространственной структуры в раз-1чных функциональных состояниях и в комплексах с разными лиганда-1, что дает необходимый экспериментальный материал для изучения гханизмов регуляции сродства гемоглобина к лигандам.

Неорганическая пирофосфатаза дрожжей (КФ З.ЬЛ Л. )-металлоак-шируемый фермент, который катализирует гидролиз, а в определенных ¡ловиях п синтез нирсфоефага, принадлежит к ферментам фосфорного 5мена. Известно, что ферментативным переносом фосфатных групп

сопровождаются все реакции, связанные с превращением энергии в живых организмах. Гидролиз пирофосфата пирофосфатазой сопрягается с реакциями биосинтеза большинства биологически активных соединений и способствует их завершению. Благодаря относительной простоте, не органическая пирофосфатаза дрокаей может служить удобным объектом для изучения общих закономерностей ферментативного гидролиза и син теза пирофосфатной связи. Хотя химические свойства отдельных представителей семейства пирофосфатаз довольно хорошо изучены, до настоящей работы не было известно ни одной пространственной структуры фермента этого класса, из чего следует актуальность этого иссле до шипя.

Цели исследования. Данная работа является частью комплексного исследования пространственных структур белков, проводимого в отделе структуры биокристаллов Института кристаллографии АН СССР. Она включает биохимические эксперименты (очистка белков до кристаллографической степени чистоты, Еыращивание белковых кристаллов и приготовление изоморфных кристаллических производных), которые являются составной частью кавдого рентгеноструктурного исследования, некоторые стадии собственно структурного исследования, начиная с интерпретации синтезов электронной плотности, а также анализ струк турно-функциональных отношений с.использованием атомных координат макромолекул.

Одной из целей работы была разработка методик выращивания кри сталлов рада белков, пригодных для рентгеноструктурного исследования, и, в -связи с этил, изучение влияния некоторых факторов на раа мер и качество кристаллов.

Основной целью работы было исследование пространственных стр^ тур леггемоглобина и пирофосфатазы - как нативных белков, так и их комплексов с лигаедями, - и развитие представлений о механизмах функционирования этих белков с учетом полученных данных.

Научная новизна и практическая ценность результатов. Приготог ление крупных и высокоупородоченных кристаллов белка лежит в основе всей белковой кристаллографии. В работе описаны новые методики очистки и выращивания рада белковых кристаллов, пригодных для рент геновского исследования.

Предложенный простой способ хроматографического разделения леггемоглобина люпина на иадивидуальные компоненты дал возможном! приготовить кристаллы, устойчивые к действию рентгеновских лучей, на которых был проведен весь комплекс кристаллографических исследс ваний.

Впервые вцделена, охарактеризована и закристаллизована новая

неорганическая пирофосфатаза из термофильного штамма бактерий Т.

, исследование пространственной структуры которой представляет особый интерес, так как по устойчивости к термоинактивации она значительно превосходит большинство белков этого семейства.

Кристаллы леггемоглобина, неорганической пирофосфатази дроя-кей, термофильной пирофосфатазы, термитазы л карбоксипептидазы тер-моактиномицетов, соответствующие требованиям структурного исследования, были приготовлены впервые. Приемы и наблюдения, описанные лри выращивании белковых кристаллов, имеют общее значение и могут Зыть использованы при кристаллизации различных белков.

В главе о леггемоглобине проведен анализ пространственных стр}|к-< гур ферролеггемоглобина и его производных, включая оксилеггемогло-5ин, и суммированы результаты кристаллографического исследования »того белка при разрешении ~ £

Изучены коя$ормационные изменения, сопровождающие связывание Л двухатомных молекул и лигандов большого объема. В комплексе с штрозобензолом и другими объемистыми лигшщами зафиксирована кон-юрмация с открыты!/! входом в гемовый карман, которая имитирует со-:тояние молекулы в момент проникновения лиганда.

Обнаружено кардинальное отличие оксилеггемоглобина от кисло-одных комплексов других-гемоглобинов: смещение атома келеза гема роисходит в направлении, противоположном лиганду, а молекула 0^ , асполагаясь практически параллельно плоскости гема, связывается ак г^-лиганд. Такое расположение, соответствующее модели Гриффи-а, впервые найдено в оксигенированнон железопорфирине.

Результаты структурного исследования привлекаются для обсутзде-ия механизма функционирования гемоглобинов. Рассмотрена роль не-оторых элементов структуры (размер гемового кармана, подвижность летального гистидина, образование водородной связи с лигавдом) в згуляции сродства к лигаццу. Проведены корреляции меаду особен-остями строения гемового кармана и параметрами, характеризующими 'орость образования и диссоциации кислородного комплекса.

В последней главе рассматриваются результаты рентгенографичес-)го исследования структуры и функции неорганической пирофосфатазы южяей.

Пространственная структура фермента, относящегося к семейству [рофосфатаз, определена впервые. По атомной модели (разрешение 3 А) ¡исаны ход полипептидной цепи и вторичная структура фермента.

В растворе и в кристалле изучено взаимодействие пирофосфатазы ингибирующимк ионами тербия и уранила, обнаруненное избирательное язывание этих ионов использовано для локализации активного центра

фермента.

Для определения функционально ваяных участков молекулы приго товлены и исследованы рентгенографически кристаллические комплексы фермента с ионами металлов-активаторов, с СаРР^ - нерасщепляе-мым аналогом субстрата, с фосфатом марганца - продуктом прямой и субстратом обратной реакции (последний комплекс исследован при ра решении 2,4 2).

Установлено и описано пространственное строение активного центра, включая природу и геометрию входящих в него аминокислотны остатков, выявлены особенности его структуры, существенные для вы полняемой функции. Найдены кластеры основных и дикарбоновых амино кислот, участвующих в связывании ионов металла и фосфатных групп; Обнаружено, что при общем преобладании полярных аминокислот на дн активного центра имеется гидрофобный участок. На основании пространственной картины активного центра представлена схема каталитического действия фермента.

Результаты, полученные при анализе пространственной структур пирофосфатазы, расширяют представления о механизме функционирования ферментов, переносящих фосфатные группы, и о роли ионов метал ла в биологическом катализе.

Атомные координаты леггемоглобина и пирофосфатазы представле ны в Международный банк белковых данных.Координаты ьь могут быть использованы для компьютерного моделирования динамики этого белке Пространственная структура пирофосфатазы представляет значительнь интерес для планирования экспериментов по направленному мутагенег как данного белка, так и других белков этого семейства, поскольку как показало сравнение аминокислотных последовательностей, остатки, входящие в активный центр дрожжевой пирофосфатазы, в основноь инвариантны и в бактериальных ферментах.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на X конгрессе ФЙБО (Париж, 1975 г.), на 1У Всесоюзном биохимическом съез;: (Ленинград, 1979 г.), на У1 Международной конференции по росту к{ таллов (Москва, 19Ь0 г.), на 1У Международном симпозиуме по фиксг ции азота (Канберра, 1960 г.), на У1 объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ЩР (Таллинн, 19Ы г.),- на I Всесоюзно» биофизическом съезде (Москва, 1982 г.), на 1У Всесоюзном симдози} ме по химии белков и пептидов (Рига, 19ЬЗ г.), на УШ Всесоюзнок биохимическом съезде (Киев, 19Ьб г.), на УШ Европейском кристалле графическом конгрессе (Льеж, 19ЬЗ г.), на Х1У Международном биох! мическом конгрессе (Прага, 19Ш г.), на УН Международной кpиeтaлJ графической конференции (Милан, 1990 г.).

ВЫРАЩИВАНИИ КРИСТАЛЛОВ БШОВ.

Метод кристаллизации издавна применялся как один из этапов эчистки белков. Однако намного большое практическое применение он 1риобрбл в связи с развитием рентгеноструктурного анализа простран-¡твенного строения макромолекул.

Рентгеновское исследование предъявляет особые требования к зазмеру и качеству выращиваемых кристаллов. Для него пригодны со-¡ершенные монокристаллы с оптимальными размерами 0,5*0,5*0,5 ым, [меющие дифракционное поле не менее, чем до 3 А.

Несмотря на то, что множество белков получено в кристалличес-:ом состоянии, до сих пор имеются трудности в получении монокрис-аллов достаточной величины и высокого качества. Поскольку теорети-.еские аспекты роста белковых кристаллов развиты недостаточно, ра-отаюцим в этой области приходится полагаться на эмпирические пра-ила и экспериментальное искусство, и выращивание кристаллов оста-тся наиболее узким местом белковой кристаллографии.

Специфика кристаллизации б&тков в большой степени связана с собенностями самих объектов. Высокие молекулярные веса, ограничен-ая стабильность, сложный состав сред, используемых дляхрастворения} клонность к агрегации, способность образовывать не только кристал-^ но и аморфные осадки,- наличие нескольких минимумов растворимос-1, конформационная гибкость, способность к денатурации, доступности малых количествах, длительное время роста кристаллов - все это дцественно затрудняет поиск условий кристаллизации. Характерное ш.белковых кристаллов высокое содержание воды (от 40 до ЪОй) уве-5чивает подвижность молекул внутри кристаллической решетки и явля-'ся одной из причин полиморфизма.

Чтобы стимулировать образование кристаллов, систему, содериа-то растворенный белок, очень медленно приводят о состояние мкниму-. растворимости, создавая ограниченную степень пересыщения. Для ого вводят высаживающие реагенты, или осадители, - хорошо раство-мые в воде соли щелочных или щелочноземельных металлов, смешиваю-еся с водой органические растворители или некоторые полимеры на нове полиэтиленгликоля (ПЭГ).

При поиске лучших условий кристаллизации можно варьировать та-е факторы, как концентрацию белка, величину ионной силы и природу нов, природу буфера и значение рН, температуру, низкомолекулярные факторы, содержание органических растворителей или ПЭГ. Поэтому удивительно, что выращивание кристаллов каждого белка является са-:тоятельной задачей, требующей проведения ряда поисковых экспери-■¡тов. Используя эмпирические правила, удается сократить объем пока.

Таблица I.

Белок

Приготовление Пр.группа

Леггемоглобин люпина комп. I, №=17900 Да

Леггемоглобин люпина кош. П, 41=17600 Да ЬЬ

Никотинат-леггемоглобш ЬЬ Ыс

Акваметлеггемоглобин Иэ-НгР

Цканидлеггемоглобин 1_ЬО/

Фторидлеггемоглобин ЬЬЬ

Изохинолинлеггемоглобин 1_Ь

Дезоксилеггеноглобин 1_Ь

Оксилеггемоглобин 1_ЬОг

Карбониллеггеыоглобин 1-ЬСО Нитрозолеггемоглобин |_ЬЫО

Нитрозобензол-

леггемоглобин IЬЛ1Ь

Пирофосфатаза дрожжей

и1=64048 Да Р2

Пирофосфатаза-ПХЛВС Р2

Комплексы ПФ с ионами-

активаторами:

, М-Р , Со^ , СсГ Комплексы ПФ с ионами

Р2

•

лег ■

ть

Зь

и'О'

Пирофосфатаза-СаРР^ Пирофосфатаза- Кп

Термитаза Т.V.4=28400 Да

Карбоксипептидаза Т., Бр.122, М =38000 Да Пирофосфатаза ТЛЬ.,

,.1=119000 Да ДФ-трипсин, и1 =23800 Да

Р21

р2-,

кристаллов белков

С|=В2

Р212121 Р2 ^2|2 2

Рб322

рз2

Р212121

0,4.0,7.0 ,Ь 0,5.0,4-0,5

0,4-0,5.0,7 0,3-0,6-Од1 0,3-0,44),? О,4-0,5'и,о

0,3*0,4.0,6 0,3-и,4-0,4 О ,4-0,4.и,5

0,3-0,3-0,4

0,3-0,5-1,0

0,1-0,4-0,Ь

0,7-0,8-0,8

0,5-0,5-и,7 0,4-0,5-1,5

Оо ' лО/

Ср.размеры(мм) У^СА^/Б) 2,0.0,5.0,2 0,5.0,6.0,9 2,6

2,9

1,95

2,58 2,5

для рентгеноструктурного исследования

Условия кристаллизация

1.5-3,0% р-р 1_Ь в N а,К-фосфатном буфере (ф.б.), рН 7,0 70% сульфата аммония (с.а.), кристаллизация в пробирке

1% р-р в аммоний-ацетатном буфере (а.а.), рН 7,0, 30-35%. с.а., кристаллизация в пробирке

1,7% р-р 1_ЬАс, 70-кратный избыток никотиновой кислоты, а.а. буфер, рН 7,0, 30-35% с.а.

Настаивание кристаллов 1_ЬАс в консервирушем р-ре: ф.б., рН 7,0 и 80% а.с. - для 1.Ь.Н20; то же + 0,05 М №Ы - для 1.Ь СИ , то же + 0,5 М КР - для 1.ЬР; то же + 1»10~4м изохинолина - для

'Восстановление кристаллов 1.ЬАс в консервирующем р-ре дитионитом Оксигенирование кристаллов ЦэАс в том же р-ре примесью 0в аргоне Пропускание тока- СО или МО через тот же р-р с кристаллами 1_Ь Ас

Восстановление кристаллов 1Ь'Н.рО в том же р-ре в рентгеновском капилляре фенилгидроксиламкном

2-3 мг белка на II мл (ЛЕЗ-буфера, рН 6,0, 15-20% «!ДД, кристаллизация в ультрацентр ¡'.фуге (УЦФ), 40000 об/мин., 48 час.

Инкубация 1% р-ра белка в МЕБ-буфере, рН 6,0 с 1,5-кратным избытком 1ШБС, 16%],ИЩ, кристаллизация в УФЦ

Равновесный диализ или диффузия паров растворителя, 1,0-1,5"/ р-р

белка в МК5-буфере, рН 6,0, 20-25 % ¡ЩЦ, 5г10-10~4;,1 соли металла

Кристаллизация в УЦФ, 16-18% Д1Д, конц. солей металлов: 1-КГ5;.1 1Ь< N 03)2, 5-Ю"4,.! ,А£04 или ИдШ^

Кристаллизация в УЦЗ, 16% ьЩ, I-Ю~4.1 СаСЬ,, 1'10"5,И Иа^Ог,

Равновесный диализ или диффузия паров растворителя, 1,2% р-р белка, 5.10-^.1 ф.б., 22-23 % ЛДД, 5-Ю^М Лп504

Диффузия паров растворителя, 0,4-0,5% р-р белка в а.а. буфере,

рН 5,6, 20-25% с.а., 2 % М1Д

Диффузия паров растворителя, 1,5% р-р белка, /ЛЕ^буфер, рН 6,0 30-35 % с. а. , 3 % 1.111Д, I. Ю-3 М 7пЭ 04

Диффузия паров растворителя, 1,5% р-р белка, ТрисНС1 буфер,

рН 7,5, 48-50% с.а., 3 % иШД, 2-Ю-3 М ¡££0,

1,5% р-р белка, б о ратный буфер, рН8,5, 45% с.а., кристаллизация в пробирке

Препараты белков для кристаллизации. В таблице I суммированы условия приготовления ряда белковых кристаллов, которые использованы или используются на1.!и для изучения пространственных структур. На материале эксперимента обсувдается влияние различных факторов (чистота препарата, метод выращивания, природа буфера и осадителя, добавки органических растворителей и т.д.) на способность белков образовывать совершенные монокристаллы.

Для выращивания кристаллов ДФ-трипсина коммерческий препарат фермента ингибировали диизопропилфторфосфатом.

Яеггемоглобин г.елтого лшина был очищен и разделен на компоненты по разработанной нами методике. Хроматографией на DEAE -целлюлозе экстракт из клубеньков лшина, содержащий преимущественно леггемоглобины, был разделен на несколько фракций. После рехро-матографми два главных: компонента были получены в электрофоретичес ки чистом состоянии. Ультрацентрифугированием по Арчибальду были определены молекулярные веса главных компонентов, которые составили 17900 и I76C0 для первого и второго компонентов соответственно* Кристаллы были выращены из обоих белков. Для исследования простраь ственной структуры использовали второй компонент.

Для кристаллизации и рентгепоструктурного исследования нами бича ввделена и охарактеризована новая неорганическая дирофосфата-за из экстремально термофильного втаыма бактерий Thormus thermophá lúa . Электрофоретически однородный фермент имеет коэффициент экстинкции EgbO^HM " Молекулярная масса, определенная мето-

дом гель-фильтрация, сосгавлярг (115 - 2)'10^ Да, масса субьедини-цы, определенная электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, - около 19000 Да. 1сак и ранее исследованные пирофссфатазы, лирофосфагаза T.th яьлкегся металюактив;: руомым (¿пиментом. Наиболее сильным активирую;;;;'.:.! действием обладаю! ионы магния, затем марганца и цинка.

Белок отличается повышенной термостабильностью: чтобы активность снизить вдвое, требуется более I часа инкубации при 90°С.

Но субстратной специфичности фермент напоминает пирофосфата-зу Ü.coli : он не расщепляет АТР ни в присутствии цинка, ни в присутствии магния.

Кривая pH-зависимости гидролиза пирсфосфата активируемого ион; ми магния обнаруживает иирокий максимум в интервале pH между 6,3 i 9,5, что типично для щелочных неорганических инрофосфатаз.

Неорганическая пирофосфатаза дрожкей к термптаза T.v . были предоставлены д-ром В.Хёне (Берлинский Университет имени Л. Гумбольдта), внеклеточная цинк-содержащая каубсьспиеитидаза термоак-

тиномицетов - проф. В.М.Степановым (ВНИИ "Генетика"), гистидиеде-карбоксилаза - д-ром Н.А.Гончар (Институт энзимологии АШ СССР).

Значение чистоты препарата. При кристаллизации леггемоглобина было показано, что достаточные по величине кристаллы можно получить,, не разделяя белок на индивидуальные компоненты. Однако, качество таких кристаллов не позволяет использовать их для структурного исследования: недостаточно изометричные пластинчатые кристаллы оказались неустойчивыми к действию рентгеновского излучения. Только разработка методики гцделения индивидуальных компонентов ьъ в высоко-, чистом состоянии привела к получению достаточно совершенных кристалк лов, пригодных для рентгеновского исследования.

Два компонента 1Ь , которые отличаются всего 17-ю аминокислотными остатками (Ц.Егоров), кристаллизуются в разных пространст- , венных группах. Рентгеноструктурное исследование показало, что пракг гически все различающиеся остатки расположены на поверхности молекуц чы, вследствие чего изменяются межмолекулярные контакты, что отра-кается на упаковке молекул в кристалле.

Включение в одну кристаллическую решетку молекул, содержащих различные аминокислотные остатки в пространственно эквивалентных положениях , вероятно, нарушает единую систему межмолекулярных контактов и понижает стабильность кристаллов, выращенных из смеси композитов.

Таким образом, понятие кристаллографической чистоты, кроме эбычной гомогенности, подразумевает отсутствие микрогетерогенности, ?.е. замен на уровне первичной структуры, а также отсутствие денатурированных молекул и агрегатов и кон|)ормационную однородность.

Раствор белка для кристаллизации не должен содержать денатури-юванных молекул и агрегатов, так как они могут служить центрами 1уклеации и приводить к образованию большого числа мелких кристал-юв. Поэтому раствор белка перед кристаллизацией бывает полезно ¡екоторое время вццеряать в присутствии ненасыщающей концентрации >садигеля, после чего осветлить центрифугированием. При этом дена-'урированные молекулы и крупные агрегаты удаляются в осадок. Цент-)ифугирование удаляет также механические примеси, которые могут :тать центрами нуклеации и способствовать выпадению мелкокристалли-[еского осадка.

2-Метил-^,4-пентадиол (МВД) в качестве добавки. Выращивание ;рупных белковых кристаллов существенно затруднено в тех случаях, ;огда скорость нуклеации соизмерима со скоростью роста кристаллов, 'огда происходит выпадение массы мелких кристаллов, что мы наблюда-:и, например, для термитазы. Эффективным приемом, позволившим умень-

шить количество кристаллов термитазы и увеличить их размер, явилось введение в раствор строго фиксированной концентрации »ЩД (3% по объему).

Результаты рентгеновского исследования термитазы предлагают объяснение-повышенной склонности к нуклеации. Такие гидрофобные ос татки, как фенплалашн, триптофан, тирозин, обычно погруженные внутрь белковой глобулы, в молекуле термитазы выходят на поверхность. Слипание гидрофобных остатков способствует образованию агр( гатов. Добавленный в раствор амфифильный ЬЩЦ "смачивает" гидрофобные остатки, повышая растворимость белка и уменьшая степень агрег; ции. Те же самые гидрофобные взаимодействия обеспечивают плотную упаковку молекул белка в кристалле: каждая молекула имеет 10 сосе; них в своем ближайшем окружении при минимальном для белковых кристаллов содержании воды 40%.

Добавление М11Д при кристаллизации карбоксииептидазы также сп< собствует уменьшению числа кристаллов и увеличению их размера.

Что касается пирофосфатазы T. th., то при использовании в качестве осадителя сульфата аммония при рН U,0 белок образовывал аморфный осадок. Получить кристаллы удалось только при добавлении нескольких процентов МЦД. Когда эти кристаллы переносили в консервирующий раствор, не содержащий г.'Щ, они переставали давать дифракционную картину. Возможно, в данном случае 1«ЦД встраивался непосредственно в кристаллическую реаетку.

Использование кофакторов в качестве добавок. Как уже упоминалось, конфор.мационная однородность - один из факторов, облегчающих получение кристаллов достаточного размера и качества. Один из приемов, позволяющих иметь белок преимущественно в одном из возмо; ных конформационкых состояний, - добавление в раствор кофакторов : других малых молекул, избирательно связывающихся с белком.

При крисшллизации неорганической пирофосфатазы дрожжей мето дом диффузии паров растворителя введение в раствор ионов-активаторов (цп+, zn2+, Со , Cd приводило к получению крупных и изо метричных кристаллов. Кристаллы нативного апофермента, приготовле ные этим методом, редко достигали требуемой величины.

Одновременное введение в раствор ионов марганца и фосфата, я ляющегося продуктом пирофосфагазной реакции, не только увеличило мер и степень изометричности кристаллов, но и изменило пространственную группу кристаллов. Одновременно возросла степень совершено1 ва кристаллов: их дкффракционное поле простиралось до Z,'¿ й вкест 3 I для нативного фермента.

Включение малых молекул оказалось полезным и при кристаллиза

;ии леггемоглобина: наиболее крупные и изометричные кристаллы были шращены из аммонийно-ацетатного буфера и имеют 6-м лигандом при (томе железа ацетат-ион.

Кристаллы карбоксипептидазы, в которых кофактором является юн цинка, достигали максимальногоразмера при выращивании в присут-:твии этого иона. Следует отметить, что, в противоположность тер-[итазе, кристаллы которой содержат предельно низкий процент воды, одержание воды в кристаллах карбоксипептидазы достигает 80%, что лизко к верхнему известному пределу. Благодаря столь высокому со-ержанию воды, молекулы в кристалле максимально приближены к условие м в растворе. Как показало рентгеновское исследование, активные ентры не входят в зону контакта, что делает их доступными для поучения комплексов с пептидными субстратами. Несмотря на ажурную ридталлическую решетку, в которо^ присутствуют каналы диаметром О А вдоль оси 6-го порядка и 30 А вдоль осей а и Ъ , заполненный астворителем, кристаллы стабильны к рентгеновскому излучению и да-г разрешение до' 2 2.

Выбор метода кристаллизации. Качество кристаллов зависит и от этода выращивания. Как правило, экспериментатор располагает ограни-*-енным количеством препарата, поэтому предпочтение отдается микроме-" эдам (диффузия паров растворителя в варианте висячей или лежащей эпель, равновесный диализ в микроячейках). Необходимо, однако, леть в виду, что в некоторых случаях большие кристаллы удается поучить, лишь используя пробы большого объема. Это особенно актуаль-з для белков, имеющих высокую скорость нуклеации. Нуклеацию на по-грхности раздела можно уменьшить, увеличивая объем раствора, по-сольку отношение поверхность/объем пропорционально обратному радиу-г. Наиболее крупные кристаллы термитаэы были получены из растворов, >ъем которых был не менее 0,2 мл.

Если сопоставить по размеру и габитусу кристаллы алофермента ¡органической пирофосфатазы дрожжей, выращенные методом диффузии па,->в растворителя, равновесного диализа и ультрацентрифугирования, то иболее крупные и изометричные кристаллы давал последний метод 1ИС.1). Этот метод основан на том, что в процессе центрифугирования; створа в присутствии осадителя за счет центробежной силы у дна про* рки достигается пересыщение по белку (Барынин, 19Ь0). На дне про-рки образуется осадок в виде плотной друзы, где центральную часть ставляют мелкие кристаллы, а по краю расположены более крупные, щественное преимущество этого метода - относительно короткое вре-эксперимента, 2-3 дня, в то время как при традиционных методах исталлизации требуется несколько недель или даже месяцев.

Рис Л Кристаллы пирофосфатазы на дне центрифужной пробирки

Па размер и качество кристаллов белка можно влиять, изменяя природу осадителя. Например, в присутствии ПЭГ-6000 термофильная пи рофосфатаза образовывала тонкие игольчатые кристаллы, тогда как сул фат аммония с добавлением ЩИ, позболкл получать крупные кристаллы, пригодные для рентгеновского исследования.

Б ряде случаев скорость роста кристаллов, а также их качество существенно зависят от температуры, при которой проводится эксперимент. Например, кристаллы ДФ-тркпсина достигали наибольшего размера 'при 25°, кроме того, время роста сокращалось в 2 раза.

Характерный для большинства белков отрицательный коэффициент растворимости в присутствии сульфата аммония был использован для ¡уменьшения числа зародышей при выращивании кристаллов леггемоглоби-,на. Пересыщение сульфатом аммония при комнатной температуре способствовало быстрому образованию большого числа зародышей. Последующее ¡выдерживание проб при температуре 4°С приводило к растворению части зародышей и относительно быстрому росту ограниченного числа крупных кристаллов.

Направленное использование описанных выше приемов позволило со кратить время поиска условий и приготовить для структурного исследо вання кристаллы белков и их комплексов с низкомолекулярныкл соедиче ниями, перечисленные в таблице I. Некоторые из выращенных кристалла Показаны на рис.2.

-13! '

!

Рис.2. Кристаллы некоторых белков. I - кристаллы неорганической нирофосфатазы дрожжей, выращенные: а - методом равновесного диализа, б - в ультрацентрифугё, в - в ультрацентрифуге после доращивания, г - кристаллы марганцево-фосфатного комплекса, д - кристаллы кадмиевого комплекса; 2 - кристаллы: а - карбокси-пептвдазы Т, б - терлитазы Т.1/. , в - термофильной пирофо&Татазы ТЛИ.

ЛЕГГЕМОГЛОШН

Одним из направлений, которое в течение ряда лет развивалось в Институте кристаллографии, было исследование пространственной структуры растительного мономерного гемоглобина - леггемоглобина и его комплексов с лигандами.

Белки, относящиеся к классу гемоглобинов, выполняют в природе функцию запасания и транспорта кислорода. Эту задачу они осуществляют при помощи простетической группы - гема. Ьо всех гемоглобинах она одинаковая - протопорфирин IX. Находящийся в центре порфирина атом железа имеет максимальное координационное число б и удерниЕает кроме 4 экваториальных, два аксиальных лиганда. Одним из этих лпгак дов является имидазольное кольцо проксимального гистидина, с помощью которого гемогруппа присоединяется к белку. При выполнении его функции in vivo вторым аксиальным лигандсм является молекула кислорода .

Несмотря на то, что все нъ имеют один и тот же гек, гомологичные аминокислотные последовательности и одинаковую схему укладки полипептидной цепи, по сродству к кислороду_отдельные представителе этого семейства различаются более, чем в 10° раз, что соответствует изменению в энергии связывания 0£ на 7 ккал/моль (pcrutz , I97ó).

В связи с исключительной важностью процессов аэробного дыхания гемоглобины интенсивно исследуются различными методами, в частности, методом рентгеноструктурного анализа. Пространственная струг тура миоглобина ( ць ) была первой белковой структурой, которую уда лось решить этим методом ( ¡londrew , I960). К настоящему времени с высоким разрешением изучены пространственные структуры ¡Ли, и и.ъСО (S.E.V.Phillips el. О.1., 1980; J.Kurian et al., I9bü). ¿'станевленг пространственная структура эритрокруорина (i£) - мономерного гемоглобина личинок комара ( К. Víeber st al.. , I.)Vl), гемоглобина Aplyaia limacina (M.Bolosaosi, et al., 1990).

Своеобразие леггемоглобинов состоит ь тем, что сии функционируют в высших растениях, фиксирующих атмосферный азот, г мсг>т был рассмотрены'как отдельная эволюционная ветвь !1Ъ . Содержащиеся и" клубеньках бобовых растений, инокулированных бактериях lihizobiuin , эти мономерные НЬ обеспечивают диффузию 0^ к азотофиксирующим бактероидам ( Kubo , 1939; Appleby , 1974). Обладая высоким сродством к кислороду, леггемоглобины поддерживают тот уровень которь Достаточно высок для протекания реакций окислительного фосфорплиро-|вания в бактероидах и достаточно низок, чтобы не вызвать инактивацию нитрогеназного комплекса, работающего в анаэробных условиях, bi !сокое сродство Lb к кислороду определяете*; шеемш значением коне

танты скорости образования кислородного комплекса и умеренным значе» нием скорости его диссоциации (Лрр1еЪу , 1972). В данной работе особенности пространственного строения ьь ■ и его комплексов, установленные при рентгенографическом исследовании с высоким разрешением, рассматриваются в связи-с молекулярным механизмом функционирования этого белка.

Приготовление кристаллов ьь и его комплексов, получение изоморфных кристаллических производных. Условия кристаллизации приведены в таблице I. Наилучшие кристаллы были получены при выращивании высокоочищенного компонента II из аммонийно-ацетатного буфера при использовании в качестве осадителя сульфата аммония. Для рассчета фаз структурных амплитуд настаиванием кристаллов ьъ в растворах, содержащих достаточную концентрацию осадителя и соответствующее сое-ь цинение, были приготовлены изоморфные производные си н 03)2, [^(АсО).,, Н2<124« 3-хлормеркурпиридином. Как показало рентгеновское исследование, при выбранных условиях кристаллизации шестым лигандом трехвалентного железа тема является ион ацетата ( ьъ Ас).

Кристаллы дезоксилеггемоглобина ( ьъ11 ) получали, восстанавливая дитионитом кристаллический аквпметлеггемоглобин ( ЬЬ^^оО)

в

токе аргона, освобожденного от примеси кислорода. Пропускание аргона без предварительного удаления следов кислорода приводило к получению ЬЬОр. Низкое давление кислорода, а также пониженная температура (- 13 С) при сборе диффрактометрических данных предотвращали экисление комплекса. ЬЬ Си и ШЮ были получены при пропускании соответствующих газов через раствор; 21.1 К, На-фосфатного буфера, в котором находились кристаллы ЬЬ 0^. Впервые полученный комплекс с нитробензолом '( Ш1Ъ ) приготовлен с применением фенилгидроксила-/ина: железо гема, выступая как окислитель, переводит производное гидроксиламина в комплексно связанное нитрозосоединение. Полнота об-эазования каждого комплекса контролировалась спектрофотометрически юсле растворения кристаллов.

Определение пространственных структур ЬЬ и его производных. 1ри помощи метода изоморфных замещений была решена пространственная структура ацетатного комплекса ьь Ас при разрешении 2,сЗ 8. При построении атомной модели была использована последовательность амнно-шслот, установленная в ИБОХ АН СССР (Ц.Егоров, 1976). Методом Джак-(а-Левита модель была уточнена при разрешении 2,0 Я, К = 27,3Для шределения пространственных структур последующих комплексов ферри-1 ферро-ьь исходивши служили фазы структурных амплитуд ььдс.

Структуры дезоксилеггемоглобина ( ЬЪ1"'" ) и ЬЪИЪ при разреше-ши 2,0 Я были уточнены тем же методом, н = 20,2 и 1-3,1% соответ-

ственно. Структуры ьь СО и ьъно при разрешении 1,Ь й,й = и ьъ 0£ при разрешении 1,7 Я, й= 15%, уточнены по методу Хеедр! сона-Коннерта.

Некоторые особенности пространственного строения леггемоглоб> на, существенные для его функционального поведения,.были обнарук« ны при анализе структуры 1Ъ Ас. Миоглобиновый тип свертки (рис. полипептидной цепи согласуется с предположением о происхождении растительных 1ГЬ от общего с другими гемоглобинами белка-предшесч

Рис.3

Ход полипепт^ц ной цепи в мо; куле леггемог/ бина. Овалы сс ответствуют пс лостям, а зате ненные - главь гидрофобным кластерам.

Гомолога первичных стр} тур ЬЪ и МЪ изучена с учетом результате

структурного исследования. При сравнении последовательностей амиь кислот учитывалась их принадлежность к соответствующим элементам вторичной структуры; положение делеций и вставок определялось те.ч чтобы максимальное число пространственно эквивалентных остатков с ответствовали друг другу. Элементы вторичной структуры обозначали по номенклатуре Кендрью ( кеп&гест , 1901): спирали - большими бук вами латинского алфавита, начиная с и - конца цепи, а межепира ные переходы - буквами обеих примыкающих к участку спиралей. Результаты сравнения представлены в таблице 2.

^з 1ЬЗ остатков в полипептидной цепи каждого белка, инвариант ными оказались только 2о. Тринадцать из них, наиболее существенны для поддержания структуры или для функции, пространственно эквива лентны в обоих белках ( в таблице 2 они отмечены звездочками). Ср ди этих остатков - дистальный (¿7) и проксимальный ( Ь в Ыъ и ?II в ЬЬ ) гиотидини, И1С , плоскость ароматического кольца

Таблица 2.

А • 40

V IlJ S Jil G Е W Q JTvj L Н V ГЙ| А К V Е [XIО V A G [н] G Q О I L fí¡ R L F К S Н fp] Е Т I A [J Т [е{ S Q A A [¡J К S S [uj Е Е F N |а| N I Р К ¡Hj Т Н R F F ¡ij L V L E I A [pj А А К

NAH I--A-1 ABI-8-1 I-С-

* • 60 * * *

Kpj D R F [к] H t К - - T E A E M K A S E D [П К КрП G V T[y1 L T A I G А I L К - -

L l_fj S F L [jc| GTSEVPQN-- - - NPE [LJ O A J_HJ G К [ij FKLVYEAAIQL ■i !-CO-1 I-D-1 I-E-

80 * • 100

- - К КГ( н н Е А Е - - L К PL А Q S Л А 7 - - кнк I Р I К Y 1. Г F I S Е А I

0 100

ч т - -[с J» V V S 0 А Т L К HL G S »L jjv S К G V А - - - D А Н F Р V V к Е А I

—If-EF-f 1-F-1 I-FG—I I-G-

120 • * 140

HVLHSR-H PWD f S A D A Q C|Ä|N N K[¡]L E L F R К D[Í1A А К V К E L G r

120 140 153

KT I К E VV - G ¡Aj К U S EE L N S|A]W T I [Aj* DELAIV[IjKKEMDDAA-

-1 I-GH-1 I-H-1 I-

53

В --- (№)

■ -- (Lbir

■i

Сравлепне аминокислотных последовательностей миоглобппа (Mb) кашалота еггемоглобина II желтого люпипа (Lb) м соотпетсттш с данными рентгепострук-мого анализа. В рамках покапаны инпариаптимс остатки. Звездочками отмечены нокпелоты, вынолпиющне одинаковую роль Ii обоих белках. Ii пунктпрпых i;ax показаны инвариантные аминокислоты, которые и срашпшаемых белках стиуют и различной системе коитактои. Л — Ala, D — Asp, К — Olli, F — Phc, -Cly II — Hin, I—Не, К — Ьуз, L —Lou, M —Met, N — Asn, P —Pro, Q —Gin, К — Arn, S — Ser, 'Г — Tlir, V — Vu!, W — Tip, V — Туг

которого параллельна плоскости гема; Pro С2, обеспечивающий резкий поворот цепи при переходе от спирали В к спирали С, Leu и A3 фиксирующий N -концевой участок полипептидной цепи у поверхност! глобулы; Va'l Ab, Leu Е4, Val Ell, ILc G II, Leu F 7, ILe НИ, входящие в состав гидрофобных кластеров вблизи гема; Тгр AI2, расположенный в щели между спиралями А и Е, Ala Н7, конта] тирующий со спиралью А.

Пространственная роль остальных 13-ти остатков менее очевидна Три из них несколько смещены в двух структурах: остаток hís В5 в ьъ сближен со спиралью G , a не с участком GH , как в нъ ; боковая цепь Lys cd 5 в ib направлена в растворитель в то вре! как в мь она образует солевую связь с Aap CD 2 и стабилизирует конформацию полипептидной цепи на участке Cd ; остаток ILe BII в Lb контактирует с участком cd , а не со спиралью d .

Несмотря на малое число инвариантных остатков миоглсбиновый pi сунок полипептидной цепи четко выдерживается в Lb . Известно, что для поддержания структуры белковой глобулы особенно важны гидрофо! ные контакты. При анализе структуры пяти глобинов (Козицын, Птицы! I9öl) было показано, что в каждом из них сохраняется 15 из 30 гид рофобных контактов. Из этих 15 пар 10 существуют и в молекуле Lb

Один из контактов между спиралями G и H е Ш> осуществляется посредством водородной связи t/ежду Glu Со и Arg HIb, а в Lb на расстояние ван-цер-ваальсовых радиусов сближены Pro G 5 и бокова; цепь Lys Н20. В итоге взаимодействие боковых цепей на данном участке сохраняется, несмотря на изменение полярности одного из них. В рассматриваемой паре белков можно наблюдать пример сохране ния взаимодействия пары остатков при одновременной смене знака их заряда. Конфигурация полипелтидной цепи миоглобина на участке G ! поддерживается водородной связью между остатками лир G Н4 и Lyo AI4, причем эта связь имеется во всех изученных миоглобинах и гем глобинах животного происхождения. В полипептидной цепи леггемогло-бина полярные остатки поменялись местами: контактируют Lys G НЗ и Glu AI4.

Согласно Такано ( Tako.no, 1377) гидрофобное ядро молекулы ми> глобина составлено из трех кластеров, среди которых размещается г могруппа (рис.3, табл. 3 и 4).

Кластер I дистального гистидина включает гидрофобные остатки мевду Hiß pli, спиралью В и участком Cd . Кластер II отражает ок ружение проксимального гистидика, а кластер III -остатки, ограни чивающие наиболее удаленную от гема часть полости гемового карман; При сравнении состава этих кластеров в Mb и Lb оказывается, ч1

Таблица 3.

Аминокислотные остатки в вшоглобнне и леггемоглобпне II, входящие в кластер дпстальиого (El) п проксимального (-FS) гистидинов

Кластер I гистидина El Кластер II гистидина F8

Миоглобии Леггемоглобии II Многлобин Леггемоглобии II

Val £11 His El Ile 59 Leu 510 Leu 513 Phc CD 1 Leu £4 PheC54 Phe 514 Val £11 His El Phe £12 Phe Л15 His 55 Phe 59 Phe 510 Val 513 Phe CDi Leu £4 Phe CDZ His £8 Ile Я19 Phe Я15 Leu G5 Ile £G4 Leu £4 Ala £9 Ilo £18 His £11 (£8) Ile Я19 Leu Я15 Phe G4 Met Я23 Ala £G2 Leu £7 Val £11

Таблица 4.

\Е11шокнслотныс остатки в гшоглобине п леггемоглобпне II, входящие в кластер III

Миоглобии Леггемоглобии II Миоглобии Леггемоглобии II

Leu £12 Pho £12 Val Л15 Ala Я11

Ile 59 Phe 59 Ilo 511 Phe 510

Ile G12 Ilo Gll Iiis 55 Phe Л15

Mot //« Tip //8 Val Л8 Val Л8

Low E15 Vai £15 Leu £19 Ala £19

Leu II VI Туг //12 Phe G//5 Pho G//4

Ala//11

аминокислоты, входящие в каждый из них, в молекулах обоих белков занимают близкое или одинаковое положение, а замены происходят с сохранением полярности остатков. Исключение составляет замена Зез F 7 в Мъ на гидрофобный Val FIO в ъъ в позиции, предшествующе проксимальному гистидину.

Сохранению рисунка полипептидной цепи способствует высокое сс держание спиралей. Для одинаковой упаковки спиралей наиболее важным является сохранение порядка чередования полярных и неполярных остатков. В Нь они, как правило, распределяются на противоположных сторонах спирали. Поскольку взаимодействие гидрофобных поверх ноетей спиралей является определяющим при свертывании в глобулу определенного рисунка, индивидуальная природа остатка оказывается менее важной. Данному условию могут удовлетворять разные наборы п следовательностей, что способствует сильной вырожденности структу гемоглобинов.

Как можно видеть из таблицы 2, спирали Ей у в ьъ удлинены соответственно на 5 и4 остатка, спираль d отсутствует, а участок CD удлинен, что придает ему дополнительную конформационную подвижность.

Полость гемового кармана. Расположенная между спиралями Е и i гемогруппа разделяет полость гемового кармана на дистальную часть где размещается лиганд, и проксимальную, где гем непосредственно связан с глобулой через остаток щз ГII. С дисгальной стороны полость гемового кармана ограничена спиралями В, С и участком CD на проксимальной находятся спирали с, , H и участки , í'G G H.

По сравнению с Mb и Ее, гемогруппа в ъъ на 3 S сдвинута в направления G и H спиралей и удалена от дистальных участков пол пептидной цепи. В результате в ЪЪ заметно увеличен объем дисталь-ной полости, чему способствует и удлинение спиралей Е и f , а т ке большее расстояние между спиралями Б и il: на участке их максим ного сближения в ¡>ib находятся остатки глицина Вб и tíb, в то вре мя как в ЬЪ они заменены остатками большего объема ( ïiir Б6 и A3 fib).

Ь дистальной плоскости расположены несколько остатков, которы непосредственно взаимодействуя с лигандом, ответственны за стери-ческие препятствия, возникающие при его размещении. Эти остатки, инвариантные в большинстве Hb , - His ¿V, Val ь!1, Plie cul Lys ¿10 (в ¡4b - Thr iilO). Из-за изменения объема гемового карм на вLb и Mb расположение дистальных остатков относительно гема заметно отличается (рис.4). Дистальный гистидпн з ыЬ находится

Рис. 4. Проекция на илоскость тема некоторых дистальных остатков в леггемоглобине и миоглобина

ЬЬ

мь

\/А1 Е11

Блияайпие к гему амшокислотные остатки.

внутри полости гемового кармана над центром тема: в ьь он смеще! в направлении к экваториальным заместителям гема, ближе к входу i гемовый карман. Val Ell в Lb находится рядом с пиррольным колы I, тогда как в Mb он нависает над плоскостью этого кольца. Остаток phe CD I, один из наиболее консервативных в семействе гемогда бинов, заметно удален от гема и проектируется на его плоскость 3i пределами порфиринового цикла.

Полость гемового кармана выстлана преимущественно гидрофобными остатками. В ьь , как и в других растительных Нь , в гемовой i лости увеличено число остатков фенилакина, причем 5 из них наход; ся на дистальной стороне гема (в i¿b таких остатков только 3). Шесть остатков phe в ьъ , сконцентрированные на небольшом учас ке, взаимодействуя с другими аминокислотными остатками, связываю1 в единый узел С-конец спирали Айн -концы спиралей В и Ü. Нахо дящиеся на границе кластеров I и Ы остатки Phe В9 и Plie £12 рас секают дистальную полость гемового кармана на две части, в больш из которых связывается лигавд.

В связывание гема с глобулой значительный вклад вносят нева-лентше взаимодействия экваториальных заместителей порфириновой системы с ближайшими аминокислотными остатками. В радиусе около ■ от атомов гема расположено, включая дистальный и проксимальный г стидины, 17 гидрофобных остатков (рис.Ь). Ь ьъ среди них имеете ïyr HI2, который вносит в полость полярную гидроксильную группу Расположенные над плоскостью гема полярные остатки серина и ллзи образуют -водородный связи с атомами кислорода остатков пропионов кислот гема. Б ряде комплексов ЬЪ гндиоксил Jer СР2 вместе с £ аминогруппой р14 образует Н-связь с пропионаюм Ш. Карбоксил про пионата П либо свободен, либо образует Н-связь с Lys ¿10. Б !.;ь ь связывании карбоксилов прошюнатов с iMioóyjioíi участвуют лги Cl) и Hic FG2.

Связывание лигандов леггемоглобинсм

Леггемоглобин - весьма удобный объект для изучения изменений структуре, сопровождающих связывание лигандов: круг возможных ли гавдов для него шире, чем для большинства исследованных гемоглоо нов. Как упоминалось выше, кроме традиционных (U^МО, Си для ьъ и р~ , Н2С, Си" для ЬЪ ) леггемоглобин может присоединять ь 6-й лиганд никотиновую кислоту, изохпнолин, чнтрна'ензел. ьо всех гемоглобинах лигандом железа является ¡;г,"-'.дазол проксимального гп тидина - сильный донор электронов. Он способствует несимметрично распределению а -орбиталей железа v облегчает присоединение 7i акцептора (C/g, WO, СО и др.) в ';paHC-iiCvi;.-:-.:eH;;e за счет уволиче

шя электронной плотности а -орбиталей, направленных к шестому шгаццу'(транс-эффект). Изменение электронной плотности на атоме ?еталла происходит также в результате передачи влияния вдоль плоскими кольца через экваториальные лиганды - пиррольные атомы азота [цис-эффект). При помещении гема внутрь белковой глобулы ограничи-зается свободное перемещение самого гема и проксимального гистиди-)а из-за несвязанных взаимодействий с атомами белкового окружения, соторые вносят вклад как в цис-, так и в транс-эффект.

Следующие характеристики гемоглобинов являются наиболее важны-«и при рассмотрении процессов связывания лигандов.

■ Превде всего, это размер гемового кармана, который должен быть ^статочным, чтобы аккомодировать лиганд в оптимальной конформации.

Как показано в этой работе, больший, чем обычно, размер гемово-"о кармана - характерная особенность леггемоглобина.

Второе важное свойство - степень открытости гемового кармана и (етали его геометрии, способствующие или, наоборот,, затрудняющие )бразование дополнительных связей между лигандом и окружающими грул-1ами.

Наконец, специфику связывания определяет геометрия самого ок-"аэдрического комплекса железа гема, которую можно охарактеризовать 'акими параметрами, как длины связей между атомом железа и эквато-жальными и аксиальными лигандами, степень искажения плоской струк-'уры порфирина (гофрирование или образование куполообразного гема) : одновременным выходом железа из плоскости гема. Существенны так-;е плоский угол ъ1-ь2-?о ; двугранный угол между плоскостью пор-шрина и плоскостью имидазольного кольца проксимального гистидина; )риентация плоскости этого имидазола огносительно связей атома же-1еза с пиррольными атомами азота; сдвиг гема как целого относитель-ю глобулы, который может сопровождаться некоторым смещением спира-[ей.

Открытость гемового кармана

В совместной работе с С.Маричичем (Загреб, Югославия) степень >ткрытости гемового кармана ЬЪ в растворе была нами изучена мето-,ом стереохимичесного ШР титрования, ^егод основан на измерении :корости релаксации протонов молекул растворителя, находящихся в :оле действия парамагнитного иона железа гема. Сравнивались скорос-'йелаксации протонов поды и необменивеющихся протонов спиртов, ис-ользовавшихся в качестве добавки к растворителю - БоО. Измерение коростей релаксации иронодили в диапазоне температур - 10 4- +40 С ри частоте 24 Мгц. Непосредственное сравнение температурной зави-имости молярной парамагнитной скорости релаксации Г/Т^П для одно-

го и того не объекта в Н50 и D показывает, что для Lb« овыше

сО 2

+5 происходит возрастание скорости релаксации, что свидетельствует о прямом обмене этиленгликоля с окрестностью атома железа. Этот не наблюдается в случае глицерина, имеющего больший размер (рис.6, а,б). Следовательно, гемовый карман в ьъ достаточно открыт для того, чтобы допустить проникновение этиленгликоля, но не глицерина Наличие температурного порога указывает на кон^ормационную подвижность соответствующего участка полипелтидной цепи макромолекулы.

В Нъ позвоночных доступность гема, согласно данным того же метода, значительно меньше: для Нъ человека (Царичич, 1974) прямо обмен между ближайшей окрестностью гема был обнаружен только для минимального по размеру спирта - метанола.

Геометрия лигацдов и изменения в дистальной полости гемового кармана. В таблице 5 приведены геометрические параметры гема в изученных комплексах Lb по сравнению с аналогичными величинами в соответствующих комплексах Mb и Ис и в модельных келезопорфиринах Из литературных данных по структурам комплексов железопорфиринов, моделирующих пространственные препятствия в окрестностях лигацц-связывазсщего центра известно, что карбонильная и нитрозильная груп пы, а также молекула кислорода присоединяются как монодентатные •у] -лигавды, причем для первой осуществляется линейная геометрия Fe-C-O, а для двух других - угловая с углом около 130-140° ( Jameson , 1978).

Представления о природе связи и геометрии комплексов железопор< фиринов с молекулой кислорода восходят к двум классическим работам Полинг ( Pauling , 1964) считал, что связь образуется за счет не-поделенной электронной пары кислорода и включает ОТ - компоненту вследствие поляризации двойной свяли б молекуле Og. Тип связи и ге> ометрия триады близки к оуцяствующим в молекуле озона, а идеальный угол У e-iij-Og раиэд 120°. Расчеты по методу Хоффмана дали вероятный диапазон угла для такого типа связывания 120-160° (Hoffman , 1977).

Согласно Гриффиту ( Griffith , 1956), связывание осуществляете за счет JT" -электронов двойной связи и кислород выступает как би-дентатный >"] *"-лигацд. Оба атома кислорода в этой модели эквивалент ныи связь 0-0 параллельна плоскости гема. Теория Гриффита соответствует модели Дьюара-Чатта-Дункансона (Dev.ar-Chatt-Duncanson , 1953) для ЗГ -олефиновых комплексов металлов, в которых имеются два вклада в связывание: перенос электронной плотности с высшей занятой ЯГ -орбитали олефина на свободную d '\sp° орбиталь металла и т.наз. "back-donation " - перенос электронной плотности в обратном

Рис.6 (а)

Температурная зависимость продольной скорости магнитной релаксации протонов при 24 Мгг в растворах леггемоглобина

о. л - водные расз«1

воры;

а, л - дейтериро-ванные растворы; содеряа-щие 35% этиленгликоля -

В2:С2Н4(0 с}2:

а,о - фтормет-лег*

гемоглобин;

А, л -акваыет-лег-

гемоглобин.

1000/ т. к"

Рис.6 (б)

Температурная зависимость продольной скорости магнитной релаксации протона, 24 Ыгг, в растворах леггемоглобина

%з, & - водные раствор ры, содержащие 20% глицерина - с3н5(он)3

- дейтерирован-ные растворы, содержащие 20$ глицерина-1)^: 03^(00)3;

_ фтпрмет-лег-гемоглобин;

- аквамет-лог-гемоглобин.

I

vO

Основные стереохим кческие пара: '.етры активного цент pinje и легге;,- pa в моде зглобпне лъных соед:-: íc:I Yac q. jior.'ioO;:; le, орптро; РУ

Комплекс :Сдвиг атома яелеза Расстояния. $ Углы, град. __.

!из плоскости reMaJ" '1

i ' а ь Fe-Np^r Fe-N¿2 Fe-Ц ц- u .^ЦЦг i| ¡

Fe(TpivPP)(2MeIm) 0,399 - 2,072 2,095 _ _ _ I

Pe02(TpivPP)(2MeXm) ¡0,086 - 1,996 2,107 1,898 I ,22 ' 129 2

FeO~(TPP)(IMelm) Lb" ¡0,03 _ 1,98 2,07 1,75 I ,16 131 2

¡0,09 0,06 2,07 2,27 - - - -55

Lb HO 0,03 2,02 2,20 1,79 т ДЗ 154 -77 -60

Lb NB 0,03 2,05 2,30 2,22 - - -60

Lb CO 1 1 0,02 2,02 2,27 1,95 I ,15 151 -65 -60

Lb 0, Ec11 ¡0,26 0,30 2,02 2,21 2,00 I ,21 61 -16 16

' 0,23 0,17 2,02 2,20 - - - !3

Ec CO '.0,II 0,01 2,01 2,1 2,4 I CiJ 161 4

Ec 0o Mb11 :0,38 0,30 2,04 2,10 i,e I ,25 170 3

'0,42 0,-16 2,03 2,22 - - - 5

Mb CO ¡0 0 2,20 1,92 I 2 140 6

Mb 02 ¡0,18 0,22 1,95 2,06 , 1,83 т 22 115 7

„}ТР1тРЕмезо-тетра/о-пивалшл1дофеши/порфпринат, 2-MeIn

**' V^TlftTiufSuuо гт тттт/->/-»тг/-1/-»т1. neun rm on с

I-Mein 2-

1-:.:етплпмидаз ол

Усредненная плоскость тема проведена через (а) четыре атома азота; (б) через 24 атома тема. G.Jameson et al. Inorg. Chen., (1978) Г7> 850 6. J.G.Hanson, B.P.3choenborn, J.

G.Jameson et al. J. Am.Chen. Soc., (1973) 222.6769 Kol. Biol. (1981) J_53, 117

3. E.Weber et al. J. Mol. Biol. (1978) 1_20, 327 7. 3.2.V.Philippa, J.Mol. Biol.

4. S.Weber et al. J. Mol. Biol. (1979) 12£, 309 (1980), U2, 531 T.Takano. J. Mol. Biol. (1977), JJO, 569

1. 2.

направлении, с заполненной орбитали металла на низшую вакантную ОТ -орбиталь олефина (соответственно, кислорода).

Как можно видеть из таблицы 5, в гемоглобинах значения угла Fe - ь j- L g варьируют довольно значительно как для различных лигаццов в одном белке, так и для одного лиганда в разных белках.

Угол наклона нитроэогруппы в комплексе Lblio равен 154°, что близко к таковому в HbNO (145°). В Lbco значение угла Ре -СО 151°. Обращает внимание, что ни в одном из карбонильных комплексов НЬ не найдено линейной геометрии лигацца: угол Fs -С-0 изменяется от 140 до 160°. Как известно (Makinen , 1979) нелинейное расположение СО имеет функциональное значение: напряжение, вызываемое неблагоприятной геометрией, уменьшает сродство к карбонилу по сравнению с кислородом и in vivo защищает гемогруплу от отравления окисью углерода, которая образуется при биодеградации иорфиринов.

В то время как в производных Lb с к 0 и СО сохраняется моно-дентатный тип связывания, в окси-комллексе положение лиганда существенно изменено. Молекула кислорода связана с атомом железа лег-гемоглобина бидентатным способом, причем оба атома кислорода находятся почти на одинаковом расстоянии от атома металла: Ре - 01 2,00 8, Fe - 02 2,17 Я.

Такое расположение, соответствующее модели Гриффита, никогда ранее не наблюдалось для кислородных комплексов гемоглобинов, но известно для более простых комплексов 0^ с переходными металлами, начиная с иридия (I) в комплексе Васки (vaska , 1963). Молекула 0^ в Lb02 обладает довольно высокой подвижностью, что следует из достаточно высокого значения температурного фактора В, который характеризует колебательные движения атома. Сравнительные величины Ь-факторов некоторых атомов приведены в таблице 6.

Оо

Таблица 6; Значения температурного В-фактора (А ) для атомов лиганда в некоторых комплексах леггемоглобина, миоглобина, эритрокруорина

J атом 1.ГЪ02 Ес02 Lb02 LbCO LblíO

1 ! 0(1) 19 15 42 - -

0(2.) ■¿0 25 .39 14,5 16

С - - - 11,5 -

i; ! - - - 9,5 ¡ ____i________________i

Кроме угла Ре-Ь^^ , ориентацию лигавда относительно

плоскости гема удобно охарактеризовать величинами двугранных углов Ь2-Ь1-Ре-н1 и с£1 -Н£2'-1,е-Ы1 . , которые приведены в

таблице 5. На рис.7 эти двугранные углы представлены в проекции на плоскость гема. Линия связи Ре-^-^ в и 0 и СО - леггемо-

глобине направлена между пиррольными атомами азота м I и и 4, блиае к линии Ре- н 4, в то время как в комплексе с кислородом она близка к линии Ре - и I, как и в других нъ . ВрХске-Ь-гепс! порфиринах, где отсутствуют стерические препятствия, накладываемые глобулой, молекула 0^ располагается в "шахматной" конформации относительно линий, соединяющих противолежащие атомы пиррольного азота и с равной вероятностью находится в одном из четырех квадрантов. Та кое биссектральное положение минимизирует ван-дер-ваальсовы контакты с атома!,ш азота порфиринового цикла.

Расположение лигавда в гемовом кармане в первую очередь диктуется необходимостью избекать невыгодных контактов с близкими к тему дистальнкми остатками.

Расстояния между атомами лигавда и ближайшими атомами дисталь-ных остатков приведены в таблице 7 (Я).

Таблица 7.

лмганд Е7 Уа1 Е11

К£2- Ъ сгГ ь

ко 3.29 4.13 3.77 'I

со 3.47 4.07 3.93 |

0. (01) 2 •ос 4.84 3.59

Ос; (02) 3.84 4.13 3.31

Другим фактором, влияющим на геометрию лиганда, является возможное образования водородной связи с окружающими остатками. В II ь потенциальным партнером для образования такой связи является дисталышй гистидин. Хотя в комплексах ьъ с НО и СО расстояния до II£ £ дистального гистидина достаточно малы, неблагоприятная геометрия делает водородную связь маловероятной, однако, она вполне возможна в ЬЪ

Смещение дистального гистидина к периферии гема, а также выгод ность образования водородной связи кезду ним и лигандом могут быть причиной отклонения от стандартной геометрии.

Адаптация лиганда в гемовом кармане вызывает смещение самих ди

Рис.7 Проекции на плоскость гема двухгранных угле-; : ы.лчюдд и-• ческом комплексе железа для ьъ ^ и нскол., его нроизЕодных:

.Углы Производные

,. 1.1 .и и аю

г? --- -л-/л- - -а-а- -о-о-

¡1 -г - пипрольные атомы азота С ,, - атомы остатка проксимального гистлдипп

стальных остатков: в фвррокомплекиях К, с двултоункуи лиганааии оно достигает I Я.

Таким образом взаимодействия лиганда с дистплынеш остатками влияют на характер и геометрию связи железо-лиганд. 13 свою очередь раг'полсксние дистальппх остатков, уникальное в каждом белке, является одним из факторов, определяющих сродство гемоглобинов к лиган-дям.

Изменение ориентации тема. Расположение проксимального гисти-дина и атома кедеза относительно плоскости тема. Возмущение электронной системы тема, происходящее вследствие присоединения шестого лиганда, через цпс- и транс-эффект передается на ближайшие участки белковой глобулы и может быть одной из причин, приводящих к смещению тема относительно глобулы. Двпауа;ей силой, вызывающей изменение ориентации тема, может быть и необходимость минимизировать контакт лиганда с дястальными остатками и компенсировать его смещение относительно оси -гема.

Величина и направление смещения гема при образовании комплекса [_Ь зависит от природы лиганда. В 1_ЬМО и 1_ЬСО гем поворачивается вокруг прямой, параллельной спирали В и лежащей в его плоскости, в (-Ь02 гем поворачивается на Ь° вокруг линии, параллельной его плоскости и лежащей на высоте 1,7 5 над ним.

В большинстве НЬ железо в пентакоординационном состоянии (дез-окси-форма) заметно смещено по направлению к проксимальному гисти-дину. Наибольшей величины, ~0,6 Я, этот сдвиг достигает в тетра-мерных Н Ь .

Присоединение шестого лиганда в модельных соединениях, МЬ и тетрамерных НЬ обычно сопровождается движением железа по направлению к этому лиганду, иногда с выходом на дистальную сторону. Интересно, что в <х и /3 субъединицах тетрамерных НЬ велич:ша перемещения аелэза различна, что иллюстрирует влияние белковой глобулы на значение этого параметра, движение атома железа относительно плоскости гс-ма легло э осаог; гипотезы Ппрутца, обьяашщек природу кооперативного эффекта з '.етра-ле.'лчх гемоглобина* (Ре г и! г , 1572).

Что касается ЬЬ , то сдвиг ячлеза в ттю^спмал^нуо стог,о;;у в дезокси-форке относительно нал (тобл. о), л коылексах .^гхчмо-глобина с СО, N0 к нитрозобенчолом телезо т.рактстоска пагопится в плоскости гема, как и в случае других НЬ.

Однако, при оксигенпрованил 1_Ь наблюдается исключение из общего правила: в !_Ь02 атом железа смещается в сторожу проксималь- ■ ного гистидша относительно своего положения в дезокси-форме на 0,24 й. пиление атома железа при окекгенировании в направлений, противоположном лиганду, ранее наблюдалось только для эритрокруо-рина, но абсолютное значение этого сдвига, 0,13 8, значительно меньше. Правда, в дезоксиэритрокруорине атом железа уже смещен к ' Н'15 58.

Пленарная структура гема в Lb искадена: пиррольные кольца повернуты на некоторый угол вокруг линий, соединяющих противополок-с ные атомы азота, т.паз. гофрированный гем. Поворот пиррольных колец относительно средней плоскости гема на 6° соответствует смещению из плоскости метиновых атомов углерода на О,ЗА. .Степень гофрирования гема в Lb увеличивается в ряду: Lb ^(0,14 S),LbPhNO (О,lb 8),LbliO (0,20 Я), Lb 0rj(0,25 Я),Lb CO (0,27 Я). Чем более гофрирован гем, тем меньше среднее расстояние между железом и пир-рольньм азотсм, что может способствовать переносу электронной плотч ности от периферии к центральному атому и лиганду (цис-эффект).

Длина связи Fe"^ - H^-HiaFll Е леггемоглобине несколько больше, чем в других Нъ и в "pickat-fenoe" комплексах. В случае 2-MeImFe она удлинена по сравнению с I-MelnFe (табл.5), т.к. метильная группа в положении 2 препятствует максимальному сближению с гемом, причем одновременно понижается и сродство к кислороду. Этот пример иллюстрирует один из способов регуляции сродства к кислороду. На длину этой связи в Lb11 влияет специфика взаимодействий проксимального гистидина с кластером окружающих гидрофобных остатков, ограничивающих его перемещения относительно гема.

В отличие от модельных соединений, где имидазольная группа может свободно вращаться, в ьь , как и в других дезоксигемоглсби-нах, ее положение достаточно жестко фиксировано. Плоскость His F II в Lb перпендикулярна плоскости гема. Боковая цепь ¡lis F II находится на расстоянии ван-дерваальсовых взаимодействий с боковыми группами Lou р 7 и VaL FG I. Кроме того, в дезоксиформе атом кислорода основной цепи lqu f 7 образует водородную связь с л ^ I Н1з Р II. Водородная связь в этом фрагменте структуры инвариантна в больыинстве Нь . Таким образом, в Lb , как и вообще в гемо-вых белках, проксимальный гистидин тесно окружен аминокислотными остатками глобулы, так что движение гистидина должно вызывать смещение окружающих групп и наоборот.

По-видимому, плотная упаковка боковых цепей вокруг проксимального гистидина позволяет ему воспринимать коврормационные изменения и гема и белкоЕой глобулы и участвовать в трансляции этих изменений между примыкающими фрагментами структуры.

изменения в ориентации гема и его бликайаего окружения при связывании никоторых лпгандов леггемоглобином представлены на рис.Ь.

На рис.7 представлены углы между проекцией на плоскость гема линии, связывающей атомы и Cg_i проксимального гистидина,

г. направлением уе - И I порфирина (эти углы эквивалентны двугранным углам с^ 1 - IJ^ 2 -ре_н1 , значения которых приведены в табли-

Рис.В. Конформационные изменения гема и его ближайшего окруженщ при связывании лиговдов леггемоглобином

---LbTI,---ЪЪ02, —- ШЮ, -Л-д-ЬЪСО, -----ЬЪИЪ

це 5).

Присоединение j;o и СО групп вызывает поворот проксимального гистидина вокруг с^-сьязи, так что угол между линиями Ре -

«г I и iig-y - с^л ' в соответствующих комплексах изменяется на 5°. Ослабляется водородная связь мсдду Lou F 7 и il^j Hi.;; FI1 (рис. 8).

Изменение ориентации проксимального гистидина может быть вызвано перераспределением электронной плотности в гемовой системе из-за присоединения лигацда. Перемещение проксимального гистидина отражается на степени перекрывания d -орбиталей железа с & - и р-орби-талями атома азота и, следовательно, на энергии связи желе-

зо-гистидин.

Наиболее драматические изменения в стереохимии октаэдрического комплекса железа наблюдаются при оксигенировании ьъ . Остаток проксимального гистидина поворачивается на 60° относительно его положения в Lb При этом Hia Р11 пересекает линиюш-Ре-из , где имеет место наиболее сильное вацдерваальиовское взаимодействие этого остатка с атомами пиррола порфиринового цикла. Движение ги-

стидина сочетается с изменением ориентации всего гема. Характер поворота гема иной, чем при образовании N0 и СО-комплексов. Угол наклона плоскости Hia PII к плоскости гема становится равным 70° вместо 90°. Происходит разрыв водородной связи между кислородом Leu р7 м N I HisFII. Линия связи становится почти пара-

ллельной плоскости гема: з то время как атом приближается к плоскости, атом C^g удаляется от нее, напоминая движение маятника.

Наклон имидазольного кольца Hia Fil под углом 70° к плоскости гема с одновремешгым удалением от нее атома Nj^ будет ослаблять связь и-астично этот эффект компенсируется за счет выхода

атома железа из плоскости гема в направлении проксимального ща .Такое движение ранее было отмечено для эритрокруорина (iv'eber, 1978), но величина сдвига зпмэтно меньше (табл.5). Расположение атома железа на проксимальной стороне гема наблюдается для большинства оксиге-нированных НЬ, однако атом келеза в них ближе к плоскости гема, чем ц LbOp. В дозоксиформе 1Ь, напротив, железо помещается в плоскости гема, а не сдвинуто к пятому лигавду, как обычно. В общем стереохимия келеза отражает суммарное воздействие на гем стерических ограничений, накладываемых глобулой, и перераспределения электронной плотности под влиянием лигандов.

Путь лиганда в гемовый карман и роль дистального гистидина. Особенности строения комплекса леггемоглобина с нитрозобензолом.Если, сравнивая пространственные структуры описанных выЩе форм Lb , попытаться найти путь лиганда к атому железа, оказывается, что вход в гсморкй карман довольно плотно закрыт. Такая же картина обнаружена и в других НЬ. По оценке Карплуса (Surplus , ГЗЫ) в L!b гем внутри белковой глобулы настолько экранирован, что вероятность проникновения кислорода к желозу в этой жесткой.структуре такова, что для ее осуществления потребовалось бы время, значительно превышающее время жизни организма. Тем не менее реальные НЬ обменивают молекулу Og довольно быстро, поскольку в процессе теплового движения происходят конформационные изменения, открывающие канал, по которому молекула кислорода может проникнуть к железу гема.

Для анализа возникающих промежуточных конформаций используется ■/етод молекулярно-динамического моделирования, а при рентгенографическом исследовании для этих целей применяют субстраты, способные [■иксировать белок в информации, соответствующей одной из стадий изучаемого процесса.

Кон^ормационная изменчивость Lb нами была изучена на пространственных структурах комплексов с лигацдами большого объема (никотиновая кислота, изохинолин для ферр;;-[_Ь, нитрозоЗензол - тля ферро-Lbl

Во всех случаях происходили сходные кон|>ормационные изменения, кот< рые рассмотрены ниже на примере Lbliu

Молекула нитрозобензола (Nb), которую можно рассматривать как замещенную N0 группу, связывается с железом тема через атом азота (рис.8 ). Присоединение Nb сопровождается поворотом и смещением гена по направлению к спирали F. Связи N-0 и M-CgH^ располагаются симметрично относительно оси reMahJ-Fe . Расстояние L-Fe несколько больше, чем в ъъко . Располагаясь вблизи остатков iJhe сЩи 1'леС D3, фенильная группа лигавда выталкивает из гемового кармана боковую цоль дистального гистидина. Поворачиваясь вокруг связи Cß - Cß- ,он выходит на поверхность молекулы и лигавд препятствует его возвращению в гемовый карман (рис. 8 ). Остаток пропионата в пиррольном koj це 1У разворачивается из дистальной в проксимальную сторону, приче! разрывается водородная связь между пропионатом и Lyn ЕЮ, а образуется новая - с Ьув FI4. В результате вход в гемовый карман оказывается открытым для лигацда.

Найденную в нитрозобензольном комплексе конформацию гемового кармана можно рассматривать как промежуточную, имитирующую состояш макромолекулы, когда кислород диффундирует в полость гемового карм! на.

0 том, что подобные изменения осуществляются и при тепловом движении атомов, свидетельствуют рассчеты, проведенные Карплусом для ыиоглобина. Было показано, что энергетические барьеры, препятствующие продвижению молекулы внутри жесткой молекулы белка, сш жаются благодаря локальным перестройкам структуры, причем главный вклад вносят флуктуации боковых групп Hie Е7, Val Ell, fhr ЕЮ ( в Lb-LysEIO). Смещение дистальных остатков отмечоно и при связывании лигацдов леггемоглобином.

Некоторые корреляции мегду структурой и функциональными особенностями леггемоглобина. Установленные в работе особенности строенш ЬЪ могут быть привлечены для объяснения его поведения при связывании кислорода, а также других лигандов. Благодаря описанным выше mi жественным контактам (ff-связь, водородные связи, невалент'ные взаимодействия) гем и глобула действуют как единая система с эффективной обратной связью, регулируя сродство к лигачдам.

Ограниченная конформационная подвижность проксимального His l'i; в сочетании с его жесткой ориентацией относительно гема, различной для пяти- и шестикоординационного состояния, является одним из инструментов, изменяющих электронную систему гема. В большинстве комплексов Lb проекция связи Cgj приближается к одному из направлений железо-азот пиррола, несмотря на стерическое отталкивание. С<

гласно расчету (Scheidt ,Chipmm, 1986), такая заслоненная конЬорма-ция стабилизируется перекрыванием d^ и рт орбиталей железа с р^-орби-талями имидазола, что дает выигрыш в энергии. Водородная связь ?П с F-спиралью обеспечивает передачу на глобулу конформационных изменений, связанных с изменением в лигандней сфере железа, вследствие чего происходит перераспределение контактов экваториальных за-угстителой с глобулой, смещение ге:ла и спиралей. Согласно окспери-..!с-!су, среднеквадратичное отклонение в координатах Cot -атомов для спиралей Е и Г достигают я Lbö? 0,32 и 0,35 S соответственно.

Подпилность атома железа относительно плоскости гема - еще один {зктор, который влияет на распределение электронной плотности dxzи d-jZ -орбиталей. Диапазон смещения делеза в производных Lb достигает D.35 'R: от 0,05 2 в длетальную сторону в LbCW до 0,30 л в проксимальную a LbOo. Расположение атома пелеза вблизи плоскости порфиыь

Т Г С '

-га в Lb j увеличивая электронную плотность на дистальной стороне рема, облегчает присоединение лигандов.

Ваяно з значение имеет искажение плоской структуры порфирина из-за одновременного воздействия на него лиганда и глобулы..Если лигянц :спытнвает пространственные ограничения при включении в дистальнук юлость, то возникающее напряжение может компенсироваться искаженн-?м порфнрнна, равно как и смещением дистальных остатков. Степень 'офрировки порфирина, оцениваемая смещением метиновых атсмов углерода, достигает наибольшей величины, 0,27 Я,в Lb СО.

При связывании лкгавдов заметные информационные сдвиги проиехс-;;:т на участке CD, длина которого в Lb увеличена в связи с отсутствием спирали D. Подвижность этого участка уменьшает напряжение в ■лобуле, возникающее при размещении лиганда. Начавшиеся ъ области ■емсвого кармана изменения передаются и к более удаленны; участкам юлекулы, d результате изменяется число водородных связей на Ы-кон-,езсм .участке молекулы и вблизи С-конца спирали Н. Б отличие от тет-■ймерных гемоглобинов, оо'щее число водородных связей увеличивается ри переходе от Lb^ к 6-координированным комплексам.

Как известно, функция растительных клубеньковых гемоглсбимов -скорение транспорта кислорода для дьхания бактероидовЫ'.^Ьэлвт. при остаточнс низкой концентрации растворенного 0^ СI—10 мМ), не инак-ивирующей азото[)иксирующие ферменты, неустойчивые к кислороду :-vrzorvor, Иоэгот.'у высокое гроцстго к Og при высокой икерее-

и связывания и умеренней скорости диссоциации Lb fv - общее сбойстро сех растительных гемоглобиноэ. Сравнительные вечнчнны констант ско-ости связывания Og и СО некоторыми монскернши гемоглсбинлми привесны в таблице б.

Таблица 6.

Кинетические константы и константы равновесия для реакции некоторых мономерных гемоглобинов с и СО.

Белок СО М Источник

к' к К к' к К Ксо/Хоа

l b (соя) 120 5,6 21 13 0,0078 1612 78 ■i

Lb (люпин) 320 25 13 52 0.015 3570 280

Mb (Hiü E7)I4 12 1,2 0,51 0.019 27 23 у

lib (GLo' E7)I40 1600 0,09 5,8 0.038 150 1700

Ее 300 218 1.38 27 0.095 310 224 3

к1 - константа скорости ассоциации, иМ~х«Сек-^

' -I

к - константа скорости диссоциации, сек К = к' /к, jtM"1

1 Q. II. (lib son et ul. J .Biol .Cliem., 264, №1, 100 (1989)

2 В.¿.Springer et ul. J.Biol.Chem., 264, K°6, 3057 (1989)

3 G..«meconi ct ul. liur. J.iiochem., 31, №1, 52 (1972)

Замечательно, что величина константы ассоциации 0^ для растительны НЬ имеет тот же порядок, что и рассчитанная для модели, где она ли ыитирована только диффузией в гемовый карман (Сабо, 1978), т.е. близка к максимально возможной для белков миоглобинового типа. Выс кая скорость присоединения к Lb хорошо объясняется такими особе ностями строения, как увеличенный и более открытый гемовый карман, подвижный остаток дистального гистидина. Для одной из мутантных форм Mb, где благодаря единственной замене His Е7 - Gly гемовый ка ыан более открыт, наблюдается увеличение скорости ассоциации в 10 раз по сравнению с нативной формой (табл.6). Большой гемовый ка ман найден и в никотинатном комплоксе леггемоглобина сои, структур которого была установлена при разрешении 3 8 ( l.oilis et ui.,I9ti3 и, по-видимому, является общим свойством растительных НЬ.

Гемовый карман в гемоглобинах выкроен таким образом, что благ приятствует связыванию , имеющему угловую геометрию связи Fe-О, 0^, в то время как линейный фрагмент Fe -С-0 испытывает стерические затруднения даже в относительно большой дистальной полости Lb. Дис криминация СО предотвращает ингибирование белка окисью углерода, к торая образуется in vivo при распаде порфирина. Дополнительная ста билизация LbO^ по сравнению с LbCO достигается благодаря образованию водородной связи между молекулой 0^ и ;iis Е7, Такая связь обна ружена и в МЬО^ (/nillipe,^choenborn , I9bl), однако, она отсутств ет в комплексах с СО. По-видимому, благодаря стабилизации через во дородную связь константа диссоциации Lb02 увеличивается незначигел

но, несмотря на открытый гемовый карман, что такие способствует увоч-пичению сродства. В то же время в эритрокруорине, где Н1вЕ7 смещен эт входа в дистальную полость и его место занимает остаток лейцина, и особенно в мутантном МЪ с заменой Н1вЕ7 С1у наблюдается резкое возрастание константы диссоциации и понияение сродства. Как об-зуждалось выше, расположение Н1а Е? относительно плоскости тема раз» нично в разных Нъ. Поэтому, образуя Н-связь с молекулой 0^, Н1а Е7 влияет на паршлетры октаэдрического комплекса нелеза, определяя ве-тичину угла Ре-О^-^, которая различна в разных белках (табл.5).

В заключение следует подчеркнуть, что механизмы, посредством которых осуществляется изменение реакционной способности гема, эак-иэченного в белковую глобулу, весьма чувствительны как к единичным заменам единичных аминокислотных остатков, расположенных в окрест-■юсти активного центра, так и к сдвигам в их пространственной распо-+ юнении. Неудивительно поэтому, что, несмотря на одну и ту на прос-гетическую группу и общий рисунок полипептидной цепи белки ссмойст-эа гемоглобинов Сильно отличаются по способности связывать кислорода Зпектры кругового дихроизма ферри- и ферро-комплексов леггсмоглобина. Электронные переходы лелезопорфирина в асимметрическом окружении боА-(овой глобулы становятся оптически активными. На характере спектров Ср, отражается изменение как природы шестого, аксиального лигацда, :ак и стерических контактов мегду хромофорной группой и белком.

В работе изучены спектры КД в диапазона 350-600 нм для ряда гроизводных леггемоглобина, ферро: , ЬЫ10 , ЫСО, ЬЪ Оо, ьыгь и фор- • )и:ЬЬ Н20,ЬЪР ,ЬВДс,ььси , Ш1с , ьы^ . В общем споктры КД в ферри-)ЯДУ значительно слабее зависят от природы лигавда. В низкоспиновых юмплоксах наличие объемного лигацда (изохинолин, никотинат) отрада-;тся в появлении слабого (+) ЗК при 440 нм, в ЬЬСН - при 465 нм. В 1ысокоспиновых комплексах (Н^О, ацетат, фторид) различия наблюдаются I полосах переноса заряда 450-470 и 630-680 нм (рис.9,10).

КД спёктры в ферро-ряду значительно более характеристичны. По-,обно 1.Ь сои и в отличие от МЬ, большинство ЭК в полосе Соре имеют ¡нак (-). Исключение составляют !_ЬСО и 1-ЬМЬ (рис.II, 12), где в результате расщепления поляризованных в плоскости гема электронных подходов на Х- и У-компоненты, появляются один или два (+) ЭК в об-асти полосы Соре. Еще большие различия наблюдаются в видимой облас-и, где полоса С}0 расщепляется на две во всех комплексах, причем аименьшую амплитуду (-) ЭК имеет в Слабо разрешенный (+) экс-

ремум имеется в |_ЬС0 и 1_ЬМЬ комплексах, в последнем он отличается ыеокой интенсивностью. В нитрозобензольном и дезоксикомплексах по-юсе <3« соответствует (+)ЭК с малой амплитудой. Переход ьъ11- 1Лз02со-

провожается значительными изменениями в области 450-650 нм: резко увеличивается амплитуда (-) ЭК при 580 нм, участок кривой в интерва ле 460-550 нм перемещается в отрицательную область, где возникает широкий экстрёмум, при 465 нм появляется новый (+) ЭК. В результате кривая эллиптичности LbOg заметно отличается от других феррокомплек сов, но весьма сходна с соответствующей кривой LbO^ сои.

Согласно Хсу и Вуди (Heu.Woody, 1971), во вращательную силу JT-hp ¡7С*переходов гема основной вклад вносят спаренные осциллятор-иые взаимодействия ыезду переходами гема'и разрешенными ST-?lt

переходами в ароматических остатках, находящихся в ближайших боковы цепях на расстоянии <15 Ä от центра гема. Такие остатки в Lb люпин и сои, а также Mb перечислены в таблице 7.

Таблица 7.

Остатки ароматических аминокислот, расположенные в радиусе ^ 15 S от центра гема, в миоглобине и леггемоглобинах сои и люпина

Phe: A15 B9 В10- В14 CD1 GD3* E12 G4*¥ G7 1115

Mb - - - + + ü - + + +

Lb сои + + + - -t- + + - -

Lb люпина + + +■ - + + + + - -

Iii ss С1 Е7 F8***FG2 G3 ffiyr: E16 1112 1123 HC 2 t TyxA12

Mb + + + + - - - + + l

Lb сои - + + + - - + - - I +

Lb люпина - + + J- + ■h - - i +

* в миоглобине - CD4, *"ь миоглобине - туг, Lb люпина -Iiis ?1

Знак и величина ЗК эаилсят от ориентации моментов перехода в плоско ти порфирина. Если эти моменты переориентируются в результате связь вания лиганда, то изменение знака и формы кривой может произойти да же в отсутствие конформационных изменений.

Отличие спектра КДнитрозобензольного комплекса 1-Ь от остальнь по длине волны, знаку и амплитуде ЭК может быть связано с наибольшу нарушением симметрии гема, так как над его плоскостью располагаются две группы N-0 и^-РЬ; причем последняя взаимодействует с ароматичес кими остатками СС участка. Существенно и вхождение в непосредствен^ окружение гема еще одной ароматической группы, а также конформациоь ные изменения, включающие значительное смещение дистального гпстид!: на (рие.В). Однако сходные конформационные изменения, происходящие в комплексах изохинолина и никотината с РеШ), не приводят к столь резкому изменению в КД спектре.

pue. 9. Спектры поглощения и КД ш»сокоспыюбцх производных ферри-леггемоглобина

производных ферри-леггеыоглобина

Рис. II. Спектры поглощения и КД производных ферролеггемоглобина

Рис. 12. Спектры поглощения и КД

нитрозобензоллеггемоглобина

Рис.13.

Спектры КДдезокси-и оксилеггемоглоби'-на по сравнению с соответствующими спектрами миоглоби-на.

Сравнение ферро- и феррикошлексов показало, что природа лигаадов оказывает значительно меньшее влияние на КД спектры последних. Наиболее заметно природа лиганда отражается ¡а характере КДспектра при присоединении лигацдов, способных к зт -связыванию с с/-орбиталями железа. Отличный от остальных характер КД (ислородного комплекса, вероятно, отражает особую.геометрию лиганд-!0Й сферы, обнаруженную рентгеноструктурным исследованием. Сравнение •пектров КД миоглсбина (зи^^а , ГЭбЬ) и леггемоглобина люпина приедено на рис. '3 , Спектры КД люпина и эволюционно близкого 1.Ь :ои (Эллфольк, Сивере, 1975) весьма похожи, но существенно отличают-'.я, з частности, по знаку ЭК, от спектров !ДЬ и НЬ животных. Как внд-ю из таблицы 7, в леггемоглобмнах, в отличие от миоглобнна, большее 1исло ароматических остатков вблизи тема позиционно эквивалентны. Та-:им образом, спектры КД, зависящие от строения ближайшего к тему 'частка белковой глобулы, могут служить тестом на степень аволюцион-[ого родства белков семейства гемоглобинов.

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА НЕОРГАНИЧЕСКОЙ ПИРОФОСФАТАЗЫ ДРОЖНЩЙ.

Неорганические пирофосфатазы (К5 3.6.1.1), относящиеся к фермен-ш.1 'фосфорного обмена, участвуют з процессах переноса фосфатных групп, опровождающих биологическое превращение энергии в живых организмах, ерменты этого класса разделяются на два больших семейства, заметно азличагщихся по свойствам: растворимые цитоплазматичеекпе пирофсофа-азк и мембранные ферменты, которые содержатся а мембранах митохонд-ий или в хромофорах фотобактерий.

Для каталитической активности пирофосфатаз (ГШ абсолютно необходимо присутствие ионов некоторых двухвалентных металлов, являю-

лизируемая растворимыми ПФ, - гидролиз макроэргической фосфоангидри; ной связи неорганического пирофосфата (РР^), который является промежуточным продуктом клеточного метаболизма. Энергия, выделяющаяся при ферментативном гидролизе РР{ .способствует завершению биосинтетических реакций в клетке. Более сложно организованные мембранные ПФ, наряду с гидролизом, катализируют энергозависимый синтез РР^ , используемого далее как донор энергии в фосфорилирующих электрон-транспортных системах, и таким образом непосредственно участвуют в молекулярном преобразовании энергии.

Растворимая неорганическая пирофосфатаза пекарских дрожжей имеет молекулярную массу 64064 Да, состоит из двух идентичных субъединиц с известной аминокислотной последовательностью роЬеп , 1976). Кроме гидролиза РР^, она катализирует реакцию кислородного обмена Р^— Н20, обмена фосфата Р^ - РР^. (сойп, 1956), а в определенных условиях, в частности, при избытке фосфата в среде - синтез эквимолекулярного количества РР^; образующийся в отсутствии внешнего источника энергии, PP¿ остается связанным в активном центре (Аваева,1981) Благодаря этим особенностям, дрожжевая ПФ может служить удобной моделью для изучения'общих закономерностей ферментативного гидролиза и синтеза пирофосфатной связи - реакции, играющей ключевую роль в энер гетическом метаболизме. В то время как свойства пирофосфатаз в растворе интенсивно изучаются, до сих пор не была известна кристаллическая структура какого-либо из белков 'этого семейства.

Некоторые этапы исследования пространственной структуры неорганической пирофосфатазы дрожжей, а также атомная модель .молекулы и строение ее активного центра описаны в данной работе.

Выращивание кристаллов нативной пирофосфатазы и ее комплексов с металлами - ингибиторами; приготовление изоморфных производных.

Для кристаллизации использовали препарат пирофосфатазы с активностью 350-450 ед. Все кристаллы фермента были выращены при 4°С из растворов белка в МЕ$ -буфере, рН - 6.0 с использованием в качестве осадителя МЩ. Для кристаллизации были использованы три метода: (а) диффузия паров растворителя через газообразное состояние, (б) равно весный диализ, (в) ультрацентрифугирование в присутствии осадителя. Кристаллы, выращенные различными методами, представлены на рис.1 и 2. Условия опытов приведены в таблице I.

Хотя кадцый из использованных методов давал некоторое количеств кристаллов, пригодных для рентгеновского исследования, наиболее

щихся активаторами

Основная реакция, ката-

крупные и изометричные кристаллы были получены методом ультрадент-рифугированип. Этот метод оказался наиболее удачным и при выращивании кристаллов изоморфных производных П'З техникой сокрист.аллизации (табл.1).

Все кристаллы нативного белка, независимо от метода выращивания, принадлежали к пространственной, группе P2j и имели следующие параметры элементарной ячейки: а = 52,2 Я,Ь= 70,3 Я, с = 95,5 Я. В независимой части ячейки содержалась одна молекула белка.

Более 30 тяжелоатомных соединений было использовано при поиске изоморфных производных для расчета фаз структурных амплитуд. Поскольку Ш> принадлежит к металлозависимым ферментам и ее взаимодействие с солями металлов может сопровождаться кокформационными изменениями, настаивание с тяжелоатомными соединениями часто приводило к разрушению кристаллов. После укрепления кристаллов глутаровым альдегидом, методом настаивания удалось приготовить изоморфные производные с KgHgl^, РЬОУОз^К^РШО^)^, KglJOgFg. Однако дифракционное поле кристаллов после обработки глутаровым альдегидом уменьшалось до 4-5 Я. Кристаллы с тяжелоатомными добавками, дающие более широкое диффракционное поле, были приготовлены сокристаллизацией в ультрацентрифуге, модификация единственной в полипептидной цепи S Н -группы Cys Ь2 ПХМВС с последующим центрифугированием позволила получить кристаллы с двумя главными местами связывания тяжелых атомов; тот же метод был использован для приготовления платиновой производной с K^P-KNO.^, которая содержала только два атома платины на молекулу фермента.

Чтобы приготовить третью производную, была использована способность П5 избирательно взаимодействовать с ионами уранила. Как было показано методом флуорометрического титрования, связывание единственно^ на субъединицу кона уранила в активном центре фермента (КСБ = = 10^ ¡.Г1) полностью егс инактивирует (Bimwald > 197Ь). Это давало возможность использовать урановую производную fifi только для вычисления фаз, но и для локализации активного центра. Однако первые попытки ввести ионы уранила (в виде K^L'OgFg) в кристаллы ПФ оказались ^удачными: кристаллы, даже укрепленные глутаровым альдегидом, быст-ю разрушались при концентрации 1Ю2 1*10 ' Ы. В то же время устойчивость кристаллов резко возрастала, когда концентрация уранила была увеличена до 5•10 М. Возросшая устойчивость кристаллов наталкива-;а на мысль, что в ферменте, кроме так называемого "флуорометричес-;ого" центра, существуют дополнительные центры связывания с меньшим ¡родством к ионам уранила. По-видимому, присоединение U0£+ именно в гих центрах делает молекулу более стабильной. Это заключение было

подтверждено изучением влияния ионов уранила на термоинактивации ПФ в растворе (рис.14 а,б).

Растворы пирофосфатазы с различной концентрацией ионов уранила инкубировали при рН 6.0 и 50° и оценивали падение активности фермен та. Защитный эффект ионов уранила почти отсутствовал при концентрации 1*10~® Ы, когда занят только "флуорометрический" центр. Однако, при концентрации 5*10"^ Ы защитное действие ионов уранила сравнимо с таковым для ионов магния, являющегося наилучшим активатором. Константа связывания уранила в стабилизирующих центрах оказалась на по редок ниве, чем в центре наибольшего сродства (Ксв = 0,9"10^ М-*). Скорость термоинактивации комплекса ПФ с ио|+ была в 26 раз меньше, чей для нативного фермента. Таким образом, бьшо показано, что не менее двух уранильных ионов-ингибиторов связывается с ферментом в растворе и по крайней мере один из этих ионов оказывает стабилизиру сщее действие.

Учитывая полученные результаты, для приготовления изоморфных производных с 1)02 кристаллы фермента, укрепленные глутаровым альдегидом, на короткое время (около часа) помещали в раствор с высокс ОЗ'Ю"3 Ы) концентрацией иО^4, при этом часть кристаллов оставалась неповрежденной. Полученные таким способом кристаллы уранильно-го комплекса ПФ были использованы для сбора дифрактометрических даь ных и расчета фаз при разрешении 5 а также для локализации акти: ного центра.

Чтобы получить уранильную производную, диффрагирующую до более высокого разрешения, был использован следующий прием. Сокристаллиз! цией в ультрацентрифуге вырастили кристаллы ПФ с активирующими ион£ ми магния,с концентрацией 5*10"^ М. Оказалось, что присутствие связанных ионов магния защищает кристаллы от разрушения при последующем добавлении ионов уранила в нивких концентрациях.

Далее при поиске тяжелоатомных производных мы исследовали дойо вие на ПФ ионов тербия, которые часто связываются с белками в тех же центрах, что и ионы Са^+. Ион Са^+ является природным ингибиторе фермента, а пирофосфат кальция (СаРР{) - нерасщепляемым аналогом субстрата. Был использован метод флуоромегрического титрования, пае кольку известно, что при связывании с белком собственная флуоресце1 ция ТЬ^*" сильно возрастает. Обнаружено, что с каждой^ субъединицей связываются два иона ТЬ^ (рис.15). Добавляя соли или Са^+, удается вытеснить ТЬ^1" из одного центра, а при одновременном добавлении Са^+ и РР^ тербий вытесняется и из второго центра. По-видимо; му, только один из двух тербиевых центров связывает ионы и Са' второй либо вообще их не связывает, либо связывает с меньшим cpo^

Рис. 14а. Влияние К^О^ на скорость тепловой инактивации пирофосфатазы при 50°С. Концентрация пф 0,03

МЕЗ-буфер рН 6, 0. I - без 2-6 - с добавкой КоУОрГц:

2 - 1.ЮГ6М, 3-2, 5.10~%, 4 - 5.10"%, 5-1, 25'КГ 5Ы, 6 - 5-Г0~5М; 7 - с добавкой 4-КГ3М М^04, рН 7,2

Бис. 146. Определение константы связывания комплекса пиро-фосфатаза-уранил: £0 и^г(мин~^) - константы скорости тер-мошактивации свободного фермента и комплекса фермент-ура-нпл соответственно, ^(иин" ) - константы скорости термо-кнактивации, определённые при различных концентрациях ионов уранила.

Рис. 15. Флуорометрическое титрование ЛФ нитратом тербия». Частичное тушение флуоресценции ТЬ3*" при [ТЬ3*]® 25уцЫ: о ионами Мд^ □ ионами Са2^ * СаРР^ при [ Са*+] = 540М.

ством. Была определена константа ингибирования тербием ферментативного гидролиза пирофосфата магния. Ее значение (1,8*10 М) свидетельствует о высокой избирательности связывания. Исходя из характера спектра возбуждения, повышение флуоресценции вызвано переносом энергии от близко расположенного остатка триптофана. Как следует из пространственной структуры, им может быть Try 152.

Кристаллы комплекса пирофосфатазы с

тЬз+

были выращены сокри-стеллизацией в ультрацентрифуге и, наряду с ионами уранила, использованы для локализации металлсвязывающих участков.

Тем же методом были приготовлены кристаллы ПФ с .CaPf^ , который маркирует субстх7атсвязывающий участок активного центра.

Кристаллизация комплексов пирофосфатазы с ионами-активаторами и фосфатом. Скорость катализируемой пирофосфатазой реакции существенно зависит от природы металла-активатора. По способности активировать, фермент ионы двухвалентных металлов можно расположить в ряд: Mg^+>Zn^+> Со^+> Mn > Cd^+ (Cooperman, 19Ы2). Известно, что комплексы ПФ с ионами металлов, а также с фосфатом образуются на последовательных стадиях ферментативной реакции, поэтому изучение их

структуры представляет особый интерес. Приготовить соответствующие кристаллические комплексы ГГ1> настаиванием кристаллов апофермента с солями металлов-активаторов не удается, так как после настаивания кристаллы перестают давать диффракционную картину. Поэтому кристаллические комплексы ПФ с металлами-активаторами (Мп^+,2п , Со Сс1^+) были приготовлены методами диффузии паров или равновесного диализа (табл.1). Магниевый комплекс, как упоминалось выпе, был приготовлен ультрацентрифугированием.

Кристаллы, Еыращенные в присутствии металлов-активаторов, превосходили по величине кристаллы апофермента, выращенные тем ие методом, и были более изометричны. Изоморфные нативному ферменту, все они имели диффракционное поле до 3 й. По сравнению с апоферментом, они отличались большей устойчивостью к рентгеновскому излучению.

В ряде работ (Сосрегтап , 1963) было показано, что в присутствии ионов марганца ПЗ связывает в активном центре два остатка фосфата. Учитывая, что фосфат марганца СМпР{) является продуктом прямой и субстратом обратной реакции, мы проЕели ряд экспериментов по кристаллизации маргпнцевофосфатного комплекса П2>. Полученные кристаллы превосходили по размеру кристаллы остальных комплексов ' (табл.I) и отличались от них по огранке (рис.2 ). В отличие от остальных, они пригадлежали к ортогональной пространственной группе и име-

ли следующие параметры элементарной ячейки: а = 116,5,Ь= 106,3, с = 56,2 8. Так как кристаллы,выращенные в присутствии только ионов марганца, изоморфны нативному ферменту, естественно предположить, что именно при связывании фосфата происходит изменение в упаковке молекул в кристаллической решетке, возможно, связанные с конформа-ционным изменением фермента. Переход к новой пространственной группе сопровождался расширением дифракционного поля кристаллов до 2,3 8, что дало возможность провести структурное исследование при более высоком разрешении.

Определение пространственной структуры пирофосфатазы и ее комплексов. Структура ПЗ при разрешении 5 8 решена методом множественных изоморфных замещений с использованием четырех производных. По рэзностньгл синтезам Паттерсона локализованы места присоединения тяжелых атомов в производных с К^РКМО^)^ и (по два место на молекулу). Координаты тяжелых атомов в производных с ГОС!ВС и КдОО^Р^ определены по разностным синтезам ^урье, с использованием фаз, рассчитанным по первый двум производным. Средний показатель достоверности фаз т= 0,9. По рассчитанному синтезу Фурье была Екделена молекула и построена модель фермента (рис.16), которая состоит из двух похожих субъединиц. Форму субъединицы можно аппроксимировать

шаром диаметром 50 8, а форму диыера - эллипсоидом, оси которого приблизительно равны 96 х 48 х 50 8. На рис.16 можно видеть располо' жение тяжелых атомов. Основные места связывания ртути в производных с ПХМБС и К2Н314 совпали: оба они расположены около единственного в полипептидной цепи остатка Суь 82, как было установлено при разрешении 3 Я. Атом платины в каждой из субъединиц связан с Met 42.

По полученным фазам при разрешении 5 Я рассчитан разностный синтез для комплекса пирофосфатазы с СаРР{.

Пространственная структура ПФ при разрешении 3 8 получена с использованием трех описанных выше производных: К^Р^С^О^)^; ПХМБС, ^З^^^б* Дифрактометрические наборы для кристаллов апофермента, производных и комплексов с ионами металлов получены на автоматичес ких дифрактометрах 5УЫТЕХ Р2^ и КАРД-4. Поскольку.молекула пирофосг фатазы обладает некристаллографической симметрией, качество фаз улучшено методом молекулярного замещения. Уточненные путем усреднения электронной плотности молекулы фазы комбинированы с изоморфными фазами. После уточнения фактор достоверностит= 0,82. Синтез электронной плотности по уточненным фазам был рассчитан в молекулярной системе координат в виде сечений, перпендикулярных некристаллографической оси симметрии, с шагом 0,76 Я. По этим картам прослежен ход полипептидной цепи (масштаб I см - 2,4 Я). Атомная модель одной из субъединиц построена с помощью компаратора Ричардса по картам электронной плотности большего размера (2 см - I 8), с использованием последовательности аминокислотных остатков, установленной Коэ-ноы. Установлено положение 2В1 аминокислотного остатка из 265. Для четырех последних остатков на С-концевом участке электронная плотность отсутствовала. Измеренные на модели координаты атомов ПФ, модифицированные по методу Даймовда, представле.ны в Мевдународный банк белковых данных.

Структура марганцево-фосфатного комплекса при разрешении 2,7 8 была определена методом молекулярного замещения. Стартовой моделью служила молекула апофермента при разрешении 3 8. Число присоединившихся ионов марганца и их положение было локализовано независимо с использованием данных по аномальному рассеянию в интервале 30 - 5 8. Полная атомная модель комплекса, за исключением 4 конечных остатков, была уточнена до кристаллографического К-фактора 0,25 в интервале 6-2,7 8 со среднеквадратичным отклонением от идеальной геометрии 0,02 8 и 2,9° для длин связей и углов соответственно. Атомные координаты апофермента и марганцево-фосфатного комплекса отличались друг от друга незначительно за исключением некоторых сдвигов в районе активного центра.

о

Рис. 16. Модель молекулы пирофосфатазн при разрешении 5 А. А и Б - субъединицы молекулы, показано положение атомов Р4

Рис. 17. Ход полипептидной цепи в субъединице пирофосфатазы.

V-

Расположение ионов металлов и локализация активного центра. В уранильном комплексе ПФ в каждой из субъединиц обнаружено по три иона уранила. Расположенные в полости вблизи поверхности молекулы, они образуют треугольник со сторонами от 6,7 до 9 8. На основании изложенных выше соображений полость, где расположены эти ионы, была идентифицирована как активный центр молекулы. Каждая из трех пар ионов с разной степенью точности подчиняется действию молекулярной оси, два места (I и 10 связаны наиболее строго. Чтобы различить центры по величине сродства к ионам уранила, кристаллы магниевого комплекса инкубировали в растворах с низкой концентрацией ио|+ и через определенные интервалы времени собирали набор диффрактометри-ческих данных при разрешении 5 X. По разностным синтезам электронной плотности определяли последовательность заполнения центров. Оказалось, что пара ионов, наиболее строго подчиняющаяся действию молекулщжой оси, присоединяется в первую очередь и соответствует ионам,- обнаруживаемым при флуорометрическом титровании.

В той же полости, что и ионы уранила, находится электронная плотность, соответствующая молекуле СаРР^(разрешение 5 &). По одному иону тербия и одному иону магния на субъединицу найдено в соответствующих комплексах ПФ. При разрешении 3 8 координаты этих ионов совпадают. Оба иона располагаются между уранильными центрами I и 3.

Укладка полипептидной цепи в субъединице пирофосфатазы. Ход полипептидной цепи в субъединице пирофосфатазы, проведенный по С^ -атомам, представлен на рисунке

Распределение элементов вторичной структуры по аминокислотной последовательности приведено в таблице 8.

Около половины аминокислотных остатков полипептцдной цепи представляют собой развернутые /3 -цепи, часть из которых объединена в систему антипараллельных /3 -слоев. Наиболее значительный слой, включающий антипараллельные /3-цепи 1,2,5 и 6 имеется на А/-конце-вом участке молекулы (до 70-го аминокислотного остатка включительно К этому слою примыкает структура типа баррела, образованная пятью р -цепями 4,9,11,13 и 16; две соседние цепи в нем (II и 16) оказыва ются параллельными, т.к. общее число цепей нечетное. Баррел заканчивается вблизи 160-го аминокислотного остатка, р -слой и одна из стенок баррела образуют интерьер глобулы. Полипептидные цепи баррела ориентированы таким образом, что внутри его сосредоточены преимущественно гидрофобные остатки, в то время как полярные находятся на поверхности.

В молекуле имеется четыре сХ-спиральных фрагмента, включающие более 50 аминокислотных остатков (18%). Самая длинная спираль (<*з )

Таблица 10. Элементы вторичной структуры в субъединице ПФ

Тип структуры

Элемент

Первый остаток

Последний остаток

Количество остатков

/3 -Цепи

1 Туг 2 8 7

2 Ьеи 13 Азр 22 10

3 СХу 23 Рго 25 3

4 Авп 41 Не 49 9

5 Асп 54 Пе 59 6

6 Ьеи 65 01п 70 6

7 Лг2 77 Рго 84 8

8 Й1у 87 Не 89 3

9 Н1а 90 Рго 96 7

10 01п 97 Дер 101 5

11 Аеп 115 01и 125 11

12 Не 127 Тйг 130 4

13 Ил 152 Ьеи 139 8

14 01у 140 (51и 147 8

15 йХу 148 Ьуз 153 г о

16 Уа1 154 Абр 158 5

17 С1и 199 д1а 203 5

18 А1а 208 Аеп 210 3

19 Авр 276 11е 2В1 6

11 Азр 169 Р1ге 177 9

2 179 11е 193 15

3 Азп 210 А1а 230 21

4 Зег 253 11е 260 8

Участки реверсивных поворотов: 28-31,33-36,36-39,51-53, 53-55,65-68,83-86,129-132,146-149,158-161,163-167,193-196, 204-207,230-233,234-237,243-246,246-249,249-252,272-275

Табл.11. Остатки аминокислот, ближайшие к связанным ионам

Ион металла Аминокислотные остатки

1оП I, и 2 01и 58

ип 2, и I АБР 119

Пп 3 Азр 114, ДЕР 151

тъ , Азр 119, Аср 151

и 3 нар 146, а\уг 191, Аср 200

состоящая из 21 аминокислотного остатка, прикрывает вход в баррел. Все сХ-спирали расположены на поверхности субъединицы. Однако, при объединении в димер спираль U j каздой из субъединиц входит в зону контакта. По классификации Левита и Чотиа, пирофосфатаза относится к белкам oi +fi типа. В полипептидной цепи заметно высокое содержание у?-складчатой структуры, особенно вблизи N-концевого участка. Цепь из 285 остатков имеет более 25 изгибов и поворотов, в том числе 20 реверсивных. Учитывая, что более 50 остатков включены в а-спирали, и что вблизи С-концевого участка, начиная с 260-го остатка, полипептидная цепь плавно огибает субъединицу, один реверсивный поворот приходится в среднем на каждые 10 остатков. В поворотные шпильки включено около половины остатков пролина и 4<Ж остатков глицина полипептидной цепи.

Начиная от- N -концевого треонина и примерно до 100-го остатка, полипептидная цепь, поворачивая через каждые 10 остатков, остается в одной части глобулы. На участке 100-137 цепь переходит в другую часть глобулы, где она свертывается относительно независимо. При этом С-концевой участок цепи входит в зону контакта между субъединицами. Обращает внимание относительная рыхлость полипептидного ске лета глобулы. Ряд петель, например на участке I0I-II4, слабо связан с основным ядром глобулы. В определенном ракурсе можно увидеть канал, который проходит через субъединицу. При заполнении боковыми радикалами этот канал оказывается разделенным на две полости. В одной из них размещается активный центр молекулы, другая при формировании димера заполняется аминокислотными остатками второй субъединицы.

Зона контакта субъединиц. На рис.18 представлен фрагмент зоны контакта субъединиц. Около 60 остатков каждой из субъединиц, расположенных на участках полипептидной цепи, сближены друг с другом (50-54, 81-92, 123-128, 159-182, 270-281). Среди них 30 неполярных, 24 полярных и 4 остатка глицина.

Большой гидрофобный кластер в зоне контакта включает Phe 280 Try 278, Phe 63 одной субъединицы, соседствующие с Рhe* 177 и'Leo 180* другой.

Участки полипептидной цепи 85-87 и 51-54 особенно His 86, Тук-52, кгд 51 наиболее близки к оси 2-го порядка, связывающей' субъединицы. Расстояние между His 86 и Try 52* кратчайшее между двумя субъединицами, ~ 2,5 R. Чуть больше, около 3 Я, расстояние между Try 52* и Тг^ 278, расположенным на С-концевом участке. His 86

Знаком * обозначена принадлежность к соседней субъединице.

Рис. 18

Фрагмент зоны контакта мезду субъединицами.

лишь одним остатком WLy67) отделен от Туг 88, который находится в полости активного центра.

Расположенные рядом с молекулярной осью 2-го порядка остатки His 85, His86, Arg 51, Try 52 потенциально способны участвовать в трансляции кон-формационных изменений между активными центрами функционирующего фермента. Благодаря близости Try 52 и Try 27В, С- концевой участок молекулы также может быть вовлечен в эти изменения.

Активный центр пирофосфатазы.

Полость активного центра (АЦ) имеет форму полусферы, ее диа-иетр по расстоянию между С^-атомами полипептидного хребта 25 Я. Наибольшее расстояние между неводородными атомами боковых остатков -16 8, глубина полости ~42$. На поверхности молекулы АЦ ограничен зпиралью et j, с примыкающим участком полипептидной цепи IJ6-I99, штлей 146-150 и так называемой "аргининовой" петлей, содержащей функционально важный остаток Arß 77 (участок 70-79). Изнутри по-юсть ограничена фрагментами р> -слоя (участки fi1 j4> fi 25» Z3 j?» ß и фрагментами цепей баррела ( fi /^jj), рис.Ib. Ь формировании активного центра существенную роль играют повороты /3 -(епей.

Наиболее характерные черты строения А±л пирофосфатазы следующие, .минокислотные остатки пешшептиднкх цепей /3-слоя и баррела, отвинчивающие полость АД, распределены таким образом, что полярные статкп направлены преимущественно в сторону активного центра, в о время как гидрофобные находятся внутри баррела или на иротивопо-очнор стороне ¡1 -слоя. Ь результате в активном центре оказывают-я преимущественно полярные остатки с заметным преобладанием дикар-оновых аминокислот - около четверти их общего числа в полипептид-ой цопи.

Боковые цепи дикарбоновых кислот образуют два кластера (рис. 19). В один из них входят (j-Ly 48, б-Lu 58, Asp 114, Asp 119, Asp 151, в другой - Asp 146, (rlu 147, 61ц 149. Столь большое скопление отрицательно заряженных аминокислот в полости активного центра объясняет тот факт, что свободный анион гшрофосфата слабее связывг ется с алоферментом, чем его соли.

В полости АД имеется кластер основных аминокислотных остатков (рис.20). Кроме Arg 77, функциональная роль которого известна (Со-operman, 1973) здесь присутствуют Lys 56, Lys 153, Lys 192 и Lys 19' Эти остатки, как показано далее, участвуют в связывании субстрата-MgPPj_. Некоторые из остатков лизина сближены с карбоксильными rpyi пами аспарагиновой и глутаминовой кислот на расстояние водородной связи, например Lys 153 - Asp 151,Lys 56 - d-Lu 5b, Lys 192 - Asp 146.

Харакгерной особенностью полости активного центра является npi сутствие трех остатков тирозина (Туг 88, 92, 191). Два из них (ЬБ и 92) расположены на дне полости, где к ним примыкают еще две гид] фобные группы Try Ib7 и Phe Ib8. Таким образом, в то время как у поверхности АД преобладают полярные остатки, дно его довольно гид] фобно (рис.21).

Металлосвязывающие центры пирофоефатазы. На рис.22 приведен 01 щий вид АД в марганцевочфосфатном (МпР{) комплексе ffi? с тремя ион; ми марганца. Ионы уранила, магния и тербия в АЦ можно видеть на рис.23. Цифрой I обозначено положение уранила (U) в центре наибо. шего сродства. Расстояния UI - 02 -03 соответственно 7,6 5; 9 Ион являющийся наилучшим активатором, и ингибирующий

ион ТЬ3*" занимают одно и то же место между U I и (J 3. Три иона ма; ганца в каждой из субъединиц образуют треугольник со. сторонами 3,' 5,7; 6,0 Я. центр, общий для и ТЬ"+, отстоит на расстояни; 3,5 й от ближайшего иона уранила и на расстоянии 2 & от одного из ионов марганца (МпЗ). Аминокислотные остатки, расположенные в рад усе $ 2,5 ft от ионов марганца, магния (тербия) и на расстоянии 4 $ от ионов уранила, приведены в таблице II.

За исключением U 3,все ионы металлов имеют в своей лигандной сфере аминокислотные остатки, относящиеся к первому кластеру дика боновкх кислот (рис.ДЭ). Остатки второго кластера, сконцентрирова ные на петле, внедренной в полость АЦ, не участвуют в связывании i таллов-активаторов, однако, здесь находится один из ионов уранила Mnl расположен ближе всего к поверхности фермента, ¡.¡п2 глубже все смещен внутрь полости АЦ. Мп2 и МпЗ, находящиеся в центре первого кластера, связаны с ферментом более прочно, чем Mnl. Рядом с иона;

\_«02 116

"й> 14

Рис. 19. Кластеры дикарбоновнх аминокислот в активном центре пирофосфатазы ( стереоизо5ражение).

кг и» ь

\ Гг--^

V—/ -Г® 01 151

Ч? I 9 7 153

N42 7 7

,-( М2 5»

( 4 Й^ЧуВС!

ми2 77

Рис. 20. Основные аминокислоты в активном центре и близко расположенные дпкарбсновке аминокислоты (стереоизображение).

Рис. 21. Гидрофобные аминокислоты на дне активного центра пирофосфатазы (стереоизображение1.

lin I и Ып2 расположены пары остатков лизин-дикарбоновая кислота, свя занные водородной связью (Lys56 -Glu 58, Lys 153 - Asp 151). Водородная связь между ними стабилизирует конформацию фермента в отсутствие ионов металла. Когда металл вовлекает группы СООН в свою коор динационную сферу, основные остатки могут принять участие в связыва нии пирофосфата. На последних стадиях реакции восстановление первоначальных расстояний между заряженными группами будет способствоват освобождению продуктов. Рассматривая богатую лигандами область акти ного центра ПФ, легко представить, что ионы различной природы, зани мая несколько разные позиции, будут в разной степени ускорять реакцию гидролиза.

Пространственная структура активного центра и функционирование пирофосфатазы. При интерпретации результатов рентгеновского экспери мента привлекаются данные, полученные при исследовании ПФ в ряде лабораторий. Следующая обшая схема гидролиза пирофосфата, катализируемого пирофосфатазой, была предложена Спрингсом и Куперманом'(1981 на основании исследования кинетики реакции:

kf к3 ks- *>

МРР, + ЛоШРР; Й1Е(МР,- ЖЛР, + ¡VIP,-^=: МоЕ + Р.-

1 d Кг 1 кч L * *6 L L к8 L

где Е - фермент, л - ион металла-активатора, к - константы скоросте Согласно этой схеме, в катализе Щ> участвуют три иона металла, причем два связаны с ферментом, а третий поступает с субстратом. Истин ньм субстратом, по-видкмому, является пирофосфат магния (j.igPPj ) в хелатной форме knight, 1981). Ферментативное растепление фосфоангид-ридной связи протекает по $ы2 механизму при атаке нуклеофилом (в да ном случае Нг,и) электрофильного атома фосфора, через пентакоордина-ционное переходное состояние без образования фосфорилирофанного ин-термедиата (Gonzalez, 1986) . Два остатка фосфата связываются в активном центре с разной величиной сродства, причем фосфат в центре высокого сродства взаимодействует с Axg 77 и является уходяшей груп пой. Второй фосфат, связанный в 75 раз слабее, является центром ну клеофильной атаки (Соорегпап, 1986) . Избирательная модификация Glu 149, а также Lys 56 инактивирует фермент (Gonzalez, 1986, КОмк саров 1987). В катализе участвуют группы с рКа 5,7 и 7,6(Knight, 1981^Представление о субстрат-связываюдем участке активного центра ПФ дает рис. 24, где показана электронная плотность, соответствуют молекуле СаРР{. Она простирается через всю полость активного центра перекрывая места связывания ионов металлов, и располагается непосре ственно над гидрофобным дном активного центра, вблизи кластеров основных и дикарбоновых аминокислот.

Возможные положения фосфатных групп в АЦ фермента исследовали при помоши молекулярной графики, используя координаты атомной модел

. Дт5>

Рис. 22. Общий вид активного центра пирофосфатазы (стереоизображение). Точками обозначены ионы марганца.

^ТгсоС'

23 Стереоскопическое изображение участка активпого цептра одной пз субъеди-[ ппрофосфатазы. Кубиками обозначены связаппые попы металла,. 1 -первый кептр

№

Рис________ -

еяц ппрофосфатазы. Кубпг

цоптр, далее нумерация возрастает по часовой стрелке

нетг.тнугт молекуле СпРР,

комплекса ПФ-МпР* и координаты ионов марганца, уточненные при разр< шении 2,7$. Оказалось, что в пространство активного центра с миниш льными стерическими препятствиями можно вписать три остатка фосфатг при расстояниях между атомами Р от 2,В до 3,6$. Реально на картах электронной плотности (разрешение 2,358) оказываются занятыми два центра PI и Р2 с расстоянием между ними 2,7ÍÍ. Небольшая

электронная плотность в третьем центре Р2' по интенсивности скорее соответствует кислороду молекулы воды, чем фосфату. Поскольку нево; можно предположить, что на расстоянии < 3$ могут находиться две ке-ьависимые фисфатные группы, мы полагаем, что электронная плотность центрах PI и Р2 соответствует молекуле пирофосфата.

Рассмотрим ближайшее окружение фосфатных групп в центрах PI и I и гипотетической фосфатной группы (или молекулы воды) в центре Р2' (рис. 25). В.радиусе <4Й от Р2' находятся три иона Iln , GluJ58, Asi 119, а также Ly's 56. Фосфат в центре PI находится на расстоянии водородной связи от гуанидиновой группы Arg 77. На расстоянии < 3,5$ от кислородов фосфата расположены Lys56, Lysi92 , Тут191 , а также Glu58 и llu I. На основании опытов по кинетике и модификации приш то.'считать, что соседний с Arg 77 фосфат (центр PI) связан более щ чно и служит уходяшей группой. Тогда основные аминокислоты и ион м? талла вблизи него будут способствовать гидролизу, понижая рК сопряженной кислоты и стабилизируя переходное состояние. Донорами протоков для уходяшей группы могут быть Туг 191 или Туг 92. Из всех ионе Марганца 1Лп I наиболее близок к молекуле PP¿ и, вероятно, являем тем ионом металла, который приходит в составе субстрата.

Фосфат, в центре 2 должен быть центром нуклеофильной атаки. Он тесно сближен с СООН группами аминокислотных остатков 2-го кластере Авр151, Aspl46,Glui47 (^ 2,5.8), немного дальше находится Lys 153. Водородная связь с несколькими карбоксилами может активировать атоь фосфора для атаки нуклеофилом. После растепления пирофосфатной свя: Вта фосфатная группа из-за электростатического отталкивания будет fierK¿ удаляться от фермента. Оба иона марганца в центрах 2 и 3 ско] Dceijo координируются с фосфатами через молекулу воды (расстояния 1Щ} - Р2, Кп 3 - Р2/>'|й), однако, не исключено,' что в переходном состоянии ион металла может прямо взаимодействовать с фосфатом.

Кристаллы комплекса Ibfe-MnP¿. (табл. I) были приготовлены из pací ворфв, содержащих ионы фосфата, однако, на картах электронной плотг bTiy виден комплекс фермента с пирофосфатом. Таким образом, обнаруже? наЯ в активном центре молекула пирофосфата. синтезирована непосредственно на ферменте.

Ранее был сделан вывод, что ПФ способна к синтезу пирофосфатно{ Связи в активном центре, константа равновесия PP¿^2P¿ для PP¿, ,

Диапазон расстояний

Як ^

I ^ - /

М(1,2,3) - PI 3,5 - 7 8 M (1,2,3) - Р2 4 + 5 S Ы(1,2,3) - РЗ 3,5 Я

PI - Р2 2,7 3

PI - ь,5 Я

Р2 - Р2' 3,5 8

Рис. 25. Схема расположения мест связывания ионов марганца M

вязанного с ферментом, равна 4,b ( Springs et ai,1981); через син-ез РР^ осуществляются реакции обмена HgO, РР^ - Р^ (Соhn, 1958).

В наших условиях, когда количества фермента и Р{ соизмеримы, ¡ермент удерживает синтезированный РР(. Этому благоприятствуют сле-ую.дие факторы. Известно, что в гидрофобном окружении, а также при рбавлении органических растворителей, понижающих диэлектрическую остоянную воды, равновесие сдвигается в сторону синтеза (бе Mois, 9ЪУ). Пирофосфат в АД расположен над гидрофобным кластером на дне ктивного центра, а в растворе с кристаллами содержится 30%. ЩД. роме того, в присутствии ¡¡ШД возрастает рКа карбоксильных групп, то упрочивает их водородные связи с фосфатами.

Обнаружение в АД трех позиций, способных вместить фосфат, хоро-о коррелирует со способностью ПФ расщеплять трифосфаты, а также ТФ. Эта реакция наиболее эффективно катализируется ионами цинка, есьма вероятно, что эти субстраты связываются в трех центрах, так то занятым оказывается и центр Р2'. Возможность присоединения тре-ьего фосфата к ПФ отмечалась в ряде работ (Аваева, 1977; Eakuleva Vbl). Учитывая эту особенность ПФ, можно представить такую схему ействия фермента. Пирофосфат, занимающий только два центра, может ыть связан двумя способами: в центрах PI-P2 или PI-P2'. Комбинация I-P2 является оптимальной для связывания пирофосфата, который там к бнаруживается, з то время как каталитические процессы осулрствляют-

и фосфатов Р

ся в центрах Р1-Р2'. Возможна и другая версия: сочетание Р1-Р2 является продуктивным для образования пирофосфата, а Р1-Р2' - для ег гидролиза. Таким образом продуктивный и непродуктивный комплексы • меняются местами для гидролиза и синтеза РР{, имея один обидой цент Р1 с наибольшим сродством.к фосфату.

Как уже отмечалось, истинным субстратом фермента является МдР? в хелатной форме. Связывание МРР^ может происходить через дальнейшее хелатирование его одним из ионов металла-активатора (МЗ) с обр зованием бис-хелатного интермедиата, имеющего топологию бицикло-[3.3.1] нонана: Нейтрализация еще двух зарядов в интермедиате и близкое расположение третьего иона ¡Л приводят к увеличению частичного (+ )заряда на атомах фосфора, делая их более чувствительными к нуклеофильной атаке. Эта структура ма'.ет быть промежуточной в процессе перелигандирования - передачи пирсфосфата от иона.магния в растворе к иону-активатору, связанному в активном центре. Дополнительная координация фосфорильного кислорода с треть; ионом'металла (¡12), связанным на поверхности фермента, определяет фосфорильный центр с наименьшей электронной плотностью, по котором; и происходит атака молекулой воды, приводящей к разрыву пирофосфаТ' ной связи. После гидролиза металл, прежде связанный только с субст' ратом (¿13),' присоединяется к ферменту через карбоксильную группу, что облегчает удаление остатка из центра 2'.

Таким образом в результате проведенного исследования установле] и описана пространственная структура неорганической пирофосфатазы дрожжей, ее активного центра, изучено расположение в нем ионов металла и фосфатных групп. Показано, что из двух остатков фосфата в активном центре образуется пирофосфат.

ВЫВОДЫ

I. Для изучения пространственных структур методом рентгеностру] турного анализа проведен цикл работ по очистке, кристаллизации и п] готовлению тяжелоатомных производных ряда белков.

Разработаны условия хроматографического разделения леггемоглоб] 1на из клубеньков люпина на индивидуальные компоненты, пригодные дун приготовления совершенных кристаллов, стабильных к действию рентгеновского излучения.

Ьыделена и охарактеризована.новая_неорганическая пирофосфатаза

| термофильного штамма бактерий т.-И1 . Показано, что по молекуляр-!й массе, субстратной специфичности, субъединичному составу и рН 1висим0сти катализируемой реакции она близка к пирофосфатазе Е.со1{| | превосходит последнюю по устойчивости к тепловой денатурации.

Разработаны условия кристаллизации и вырашгны для рентгеновского ¡следования кристаллы следующих белков: ДФ-трипсина, леггемоглоби-! люпина, термктазы и цинк-содержаией карбоксипептидазы термоакти-мицетов, неорганической пирофосфатазы дрожжей, термофильной пиро-|сфатазы '1'. 1:1-1 . Приготовлены изоморфные кристаллические производ-1е, позволившие установить пространственные структуры леггемогло-!на (¿5), пирофосфатазы дрожжей (ЗЙ), термитазы (1,45), карбокси-■птидазк (3)?). Изучено влияние чистоты препарата, метода кристаллицин, органических добавок и кофакторов на размер и качество кри-аллов на примере кристаллизации перечисленных белков.

2. для исследования пространственной структуры леггемоГлобина различных функциональных состояниях приготовлены кристаллы белка

следуюшими лигандами: ферри-ЬЬ с Н^О, СНдСОО", Р~, изохинолином, ;котиновой кислотой и ферро-ЬЬс 0^, CO.NO, нитрозобензолом.

3. С использованием уточненных атомных координат исследованы из-нения геометрических параметров октаэдрического комплекса железа ма и конформацнонные изменения в белковой глобуле, сопровождающие язывание лигандов (0?, СО, нитрозобензол) дезоксиформой ЬЬ.

|И этом наблюдается смешение ближайших к лиганду дистальных остат-в, поворот проксимального гистидина и гема, изменение его парамет-в. Наибольшие изменения среди двухатомных лигандов наблюдаются в Ь0<>: только в этом комплексе железо гема сдвигается в противопо-;.>;ном лиганду направлении, поворот проксимального гистидина сопро-ждается разрывом связи со спиралью Р, молекула 0^ образует водо-дную связь с дистальным гнстидином. Расположение лиганда 0^, почти раллельное плоскости порфирина, соответствует модели, предложенной иффитом и впервые найдено в комплексах железопорфиринов.

4. В нитрозобензольном комплексе ЬЬ обнаружена открытая конфор-ния гемового кармана, которая достигается благодаря повороту и вы-ду на поверхность остатка дисталыюго гистидина и развороту одного

прописнатов в проксимальную сторону. Предполагается, что. эта кон-рация отражает состояние глобулы, когда лигацо, диффундирует в ге-вый карман.

о. Показано, что структурные особенности ЬЬ (большой размер гемо-го кармана, его открытость, подвижность дистальных остатков) обьяст ют высокую скорость образования кислородного комплекс!*ЬЬ0>. Водород--я связь с дистальным гистидином, по-видимому, ответственна за уме-" иное значи.;ие скорости диссоциации.

о. Исследованы спектры кругового дихроизма производных леггемо-глобина и особенности кривых эллиптичности рассмотрены с привлечен] емчанных о пространственной структуре. Обнаружено, что спектры и ЬЬО-э наиболее отличаются от остальных. Особый характер спектра ] первом случае можно связать с появлением в окружении гема дополнительной ароматической группы и нарушением симметрии порфирина. Во втором случае на характер кривой влияет уникальная для гемоглобино] геометрия связывания 0- как бидентатного г^-лиганда.

7. Пространственная структура неорганической пирофосфатазы дро? жей, установленная при разрешении 38, проанализирована и описана п< атомной модели одной из субъединиц с использованием соответствуют^ координат. Установлено распределение аминокислотных остатков по эле ментам вторичной структуры. Согласно классификации Левита и Чотия, фермент принадлежит к белкам типа.

Ь. Показано, что в растворе ионы уранила и тербия ингибируют каталитическую активность пирофосфатазы, избирательно связываясь в активном центре. Приготовлены кристаллические комплексы ПФ с ионам! ингибиторами и СаРР^ и установлена их пространственная структура П] разрешении 38 (ио^и ть3+)и 58 для ПФ-СаРР^. К субьединице присоед! няются 3 иона ио^ , ион а'Ъ3+ , молекула СаРР{_ ; по их расположению локализован активный центр фермента.

9. Выращены кристаллы пирофосфатазы с ионами-активаторами ^^ , Ип^ Сс12+ , изоморфные апоферменту (простр. группа

Р2^) и имеющие дифракционное поле до ЗЙ. Выращены кристаллы компле! са ПФ- МпР£, принадлежащие к простр. группе с более широки

дифракционным полем, которые были использованы для установления прс странственной структуры комплекса фермента при разрешении 2,3)8. Методом аномального рассеяния локализовано по 3 иона марганца в каждс субьединице.

10. По атомным координатам охарактеризованы размеры активного це тра, природа, геометрия, расположение в полипептидной цепи входящих в него аминокислотных остатков. Показано, что в полости АЦ преобла/ ют полярные аминокислоты, которые образуют кластер из основных амш-кислот и два кластера из дикарбоновых кислот. На дне АЦ найден гид^ фобный участок из трех остатков тирозина, одного фенилаланина и одь Го триптофана.

11. Рассмотрена возможная роль аминокислот АД в каталитическом ь Канизме. Показано, что остатки одного из кластеров дикарбоновых ам!' нокислот вовлечены преимущественно в связывание ионов металлов, в т время как аминокислоты второго кластера, наряду с аргинином и зщзш. могут участвовать в связывании фосфатных групп.

12. С помопью молекулярной графики изучена топография активного ентра пирофосфатазы. Обнаружено, что в пространстве АД можно одно-ременно разместить три остатка фосфата. Найдено, что в кристаллах Ф, вырашэнных сокристаллизацией с фосфатом марганца, две из этих озицкй заняты пирофосфатом, синтезированным в активном центре ермента. На основании результатов структурного исследования и итературных данных обсуждена схема каталитического действия ирофосфатазы.

Основные результаты опубликованы в следующих работах:

. Вайнштейн Б.К., Арутюнян Э.Г., Зайцев В.Н., Куранова И.П., Гре-енко К.А., Конарева Н.В. Рентгеноструктурное исследование произ-одных ДФ-трипсина. Кристаллография, 1970, 15, К1 I, 167-168. . Арутюнян Э.Г., Зайцев В.Н., Куранова К.П., Гребенко А.И. Опреде-ение координат тяжелых атомов в производной ДФ-трипсина. Кристал-ография, 1972, 17, 4, 861-862.

. Вайнатейн Б.К., Арутюнян Э.Г., Куранова И.П., Борисов В.В., Сос-енов НЛи, Павловский А.Г., Гребенко А.И., Конарева Н.В. Рентгено-труктурнсе исследование леггемоглобина. I. Кристаллизация, получе-ие производим. Кристаллография, 1974, 19, Р 5, 964-970. . Куранова И.11., Гребенко A.b., Конарева Н.В., Сыромятникова И.Ф., арынкн В.В. Разделение на компоненты леггемоглобина из клубеньков юпина. Биохимия, 1976, 41_, № 9, I603-IÜ08.

. Vu;:-. ..vlovic ti, , :;«i:co Г,., ¡..„ricic ö. , I,u.mjn<.r С., Kuranovu I.P4 -ii::. It I. in .im. j-'liG Iicwo-ucccssibiliy in lcchemoßlobin iron Lupinua itcu0 tts observed by proton saafjKotic relaxation. Intern. J.Peptide L-otein i-.jc., 1375, 0, -127-434.

. Арутюнян Э.Г., Куранова К.П., Вайнштейн Б.К., Штайгеманн В. ентгенсструктурное исследование леггемоглобина. Структура ацетат-эррилеггемоглобина при разрешении 2,uS. Кристаллография, 1980, 5, № I, 81-103.

. Арутюнян Э.Г., Куранова И.П., Гребзнко А.К., Воронова A.A. Рент-еноструктурное исследование леггемоглобина. Кристаллографические энные по структуре 1-го компонента. Кристаллография, 1977, 22, 3, '¿3-1-636.

. Арутюнян З.Г., Куранова И.П., Товбпс А.Б. , Гребенко А.К., Вороно-i-а A.A., Некрасов 1С.Б., ВзйнлтеГш Б.К. Рентгеноструктурное исследо-".нке леггемоглобина. Определение структуры комплекса феррилег: емо-с :-;|ксу|.и хвелитоя п;л у уурз: e:;;.v. ¿¡Ui. лрксталлогра^-л, j ¿и, о^с—53ч.

,9. Арутюнян Э.Г., Дайзенхофер il., Тепляков A.B., Куранова И.П., 0( молова Г.В., Вайнатейн Б.К. Структурные параметры связывания лига} дов леггемоглобином лшина при разрешении 2Ä. ДАН СССР, 1963, 270-, 732-736.

10. Куранова И.П., Тепляков A.B., Обмолова Г.В., Воронова A.A., Пс пов А.Н., ХейкерД.М., Арутюнян Э.Г. Рентгеноструктурное исследовг ние леггемоглобина в комплексах с нитрозобензолом, никотиновой кис лотой и ионами ацетата, фторида и цианида. Биоорган, химия, 1982, 8," № 12, 1625-1636.

11. Обмолова Г.В., Сафонова Т.Н., Тепляков A.B., Попов À.H., Кураь ва И.П., Арутюнян Э.Г., Вайнштейн Б.К. Структура комплексов ферро-леггемоглобина желтого люпина с СО и No при разрешении I,8Ä. Биоорган. химия, 1968, 14, №11, I509-1519.

12. Арутюнян Э.Г., Сафонова Т.Н., Обмолова Г.В., Тепляков A.B., По пов А.Н., русаков A.A., Рыбинский C.B., Куранова И.П., Вайнштейн Е Кристаллическая структура оксилеггеыоглобина при разрешении 1,7Й. Биоорган, химия, 1990, 16, № 3, 293-301.

13. Тепляков A.B., Куранова И.П., Арутюнян Э.Г., Фроммель К., Хене Кристаллическая структура терлитазы и стабильность субтилизинов. Б орган, химия, 1990, 16, № 4, 437-447.

14. Куранова И.П., Обмолова Г.В. Изучение спектров кругового дихро изма леггемоглобина желтого люпина и его производных в связи с их пространственной структурой. Биофизика, 1991.

15. Смирнова Е.А., Махалдиани В.В., Воронова A.A., Куранова И.П., Арутюнян Э.Г., Вайнштейн Б.К., Хайтманн П., Хене В. Рентгеноструктурное исследование неорганической пирофосфатазы дрожжей. I. Выраш вание кристаллов, получение производных и определение положения в : тяжелых атомов. Кристаллография, I960, 25, № I, 104-110.

16. Махалдиани В.В., Смирнова Е.А., Воронова A.A., Товбис А.Б., Ку ранова И.П., Арутюнян Э.Г., Вайнштейн Б.К., Бинвальд Б., Хансен Г. Хене В. II. Расчет фаз и модель структуры пирофосфатазы при разрешении 68. Кристаллография, I960, 25,№ 2, 280-286.

17. E.Harutyunyun, I.Kuranova, E.Smirnova, A.Tovbis, G.Tcrziun, B.Vainshtein, W.Hohne, G.Hansen. X-Ruy Structure of Inorganic pyre phosphatase from baker's yeust. Utudia Eioph.ys., licrlin, 1980, 79, 151-152.

18.. G.Hansen, ft. Hohne, I.Kuranova, b.IIarutyunyan. Binding of to Inorganic i'yropliosphutiise from baker's yeast. Ibid., 19!>0,149-1 19. I.Ï.Kuranova, K.A.bmirnova. Crystal Growth of Inorganic i'yro-phosphatase. 6th Intern Conf. on Crystal Growth, v.4, p.06, I.loscov, USSR, 19-16 September, 1980.

3. Куранова Й.П., Смирнова Ъ.А., Махалдиани В.В., Воронова A.A., рутюнян Э.Г., Хене В., Хансен Г. Рентгенографическое исследование ^органической пирофосфатазы дрожжей. Локализация субстрат-связыва-лих центров в молекуле. ДАН СССР, 1981, 258, № 5, 1245-1250. I. Арутюнян Э.Г., Терзян С.С., Воронова A.A., Куранова И.П., Смир-эва A.A., Вайнштейн Б.К., Хене В., Хансен Г. Рентгеноструктурное ¿следование неорганической пирофосфатазы из пекарских дрожжей с «решением ЗЙ. ДАН СССР, 1981, 258, № 6, I48I-I485. Î-. Куранова И.П., Терзян С.С., Смирнова Е.А., Воронова A.A., Арутю-1н Э.Г. Пространственная структура неорганической пирофосфатазы. ззисы I Всесоюзного биофизического съезда, 1982, с. 15.

G.Hansen, w.Höhne, I.Kurunova. Wechselwirkung von Tb^+ mit tm-irgunischer Pyrophosphatase aus Bäckerhefe: Charakterisierung der iindungsorte. Acta biol. med. germ., 1982, 4J., 23-30. L. Куранова И.П., Терзян С.С., Воронова A.A., Смирнова Е.А., Вайн-?ейн Б.К., Хене В., Хансен Г. Строение активного центра неоргани-¡ской пирофосфатазы дрожжей на основании результатов рентгенострук-фного исследования. Биоорган, химия, Itb3, 9, № 12, I6II-I6I9. к Терзян С.С., Воронова A.A., Смирнова Е.А., Куранова И.П., Некра-)в Ю.В., Арутюнян Э.Г., Вайнштейн Б.К., Хене В., Хансен Г. Прострац-■венная структура неорганической пирофосфатазы дрожжей при разреше-ш 38. Биоорган, химия, 1984, 10, № II, 1469-1482. ). Куранова И.П. Пространственная структура неорганической пирофос-1тазы дрожжей. Тезисы Всесоюзного биохимического съезда, т. 2, :-I5, 1986, Киев.

'. Куранова И.П., Соколов В.И. Конформационная гипотеза перелиган-[рования металлов, активируюших пирофосфатазу и родственные фермен-I. Ьиоорган. химия, 1986, 12, I? 6, 749-754.

. Куранова И.П., Обмолова Г.В., Конарева Н.В. Неорганическая пиро-сфатаза из экстремально термофильной бактерии Vuermus themophilus H СССР, 1987 , 295, 4, IUI3-I0I6.

. Куранова И.11. Пространственная структура неорганической пирофос-тазы дрожжей и ее активного центра. Биохимия, 1988, 53, I82I-I827. Э. '.¿.Чолпс, U.wessner, I.Kuranovu, G.Otraolova. ilinetical characte-i.r.ution of a thermostable inorßunic pyrophosphatase from 'i'liernus lo^'r.ojiailus. jlioiaed. Piochera. Gern., 1988, 47, 12-22. 1. i.-.ururiova, K.ühircadze, L.ümiixova, .llönnc, Б. .Iurutyunyan. irce-i i::ier cionul structure of inorganic pyrophosphatase from buker's ;ust und its active site. 14tli Intern. Congress of Biochemistry, jstruct с, р. Ъ4, July 10-15, Irugue, 19CG.

32. Чиргадзе Н.Ю., Куранова И.П., Строкопытов Б.В., Арутюнян Э.Г. Хене В. Определение кристаллической структуры марганцево-фосфатно комплекса неорганической пирофосфатазы из пепарских дрожжей метод молекулярного замещения. Кристаллография, 1969, 34, JJ6, 1446-1450 33- lî.Konareva, I.Kuranova, A.Mikhailov. A preliminary X-ray stuc of Yeast tranoketolase. Biochemistry Int., 1983, 6, 799-803.

34. Тищенко Г.H., Куранова И.П., Конарева Н.В., Гончар H.A., Вотр: И.И., Вайнштейн Б.К. Кристаллизация и предварительное рентгеновою исследование декарбоксилазы из Micrococcus sp. п. Кристаллографи: 1963, 28, № 2, 306-309.

35. Прозоровский В.Н., Романцев Ф.Е., Гребеншикова О.Г., Куранова И.П., Конарева Н.В., Тищенко Г.Н., Михайлов к.¡А. Физико-химически, характеристики каталаз. Биохимия, 1Уь4, 4У, £- 2, 20У-214.

36. Тепляков A.B., Строкопытов Б.В., Куранова И.П., Попов л.h., ¿ц тюнян Э.Г., Вайнштейн Б.К., ¿роммель К., Хене В. Рентгеноструктур! исследование термитазы при разрешении 2,öS. Кристаллография, 1986, 31, № 5', 931-935.

37. Куранова И.П., Обмолова Г.В. Способ получения кристаллов карбс ксипептидазы Т. Авторская заявка № 49350098/31-13 (0661500) от

24 апреля 1967 г.

36. Обмолова Г.В., Куранова И.П., Поляков K.M., Мосолова О.В., Ру-денскв;я Г.Н., Степанов В.ii. Карбоксипептидаза Т - кристаллизация у предварительное рентгеноструктурное исследование. Кристаллография, 1986, 33, № 2, 517-516.

39. A.Teplyakov, I.Kuranova, L.Harutyunyan, C.ï'ronmieli Vi.Holme. Crystal structure of thermitase ir.om ïhermoactinomycee vulgaris a 2,2& resolution. ÏEBS Lettrrs, 1988, 2A±, 208-272.

40. Поляков K.M., Обмолова Г.В., Куранова И.П., Отрокопытов Б.В., Вайнштейн Б.К., Йосолова О.В., Степанов В.М., Руденская Г.Н. Рентг йоструктурное исследование карбоксипептидазы термоактиномицетов с 'разрешением 38. Мол. биология, 1969, 23, № I, 266-272.

,41. A.l'eplyakov, I.Kuranova, E.Harutyunyan, B.V&tnßlytein, C.l'romiac W.Hohne, К. Vi ilson. J.Mol.Biol., 1990, 21^, 261-279.

42. Куранова И.II., Смирнова Е.А., Чиргадзе Н.Ю. Выращивание криста. $юв неорганической пирофосфатазы дрожжей с ионами металлов и фосфа Ком. Кристаллография, 1990, 35, № 6, 1562-1564.