Изучение структурной и функциональной роли элементов центрального протуберанца большой субчастицы рибосомы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

КИПАРИСОВ Сергей Владиславович

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНОЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ ЭЛЕМЕНТОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО ПРОТУБЕРАНЦА БОЛЬШОЙ СУБЧАСТИЦЫ РИБОСОМЫ

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2005 г.

Работа выполнена на кафедре Химии Природных Соединений Химического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова, на факультете Клеточной Биологии и Молекулярной Генетики Университета плата Мэрилэнд, Колледж Парк, США и в Институте Молекулярной Генетики им. М. Планка, Берлин, Германия.

Защита состоится 29 ноября 2005 г. в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 28 октября 2005 г.

Научные руководители:

кандидат химических наук, доцент Сергиев Петр Владимирович; доктор химических наук, профессор Донцова Ольга Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Гарбер Мария Борисовна д октор химических наук, профессор Цетлин Виктор Ионович

Ведущая организация:

Институт Молекулярной Биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

z&tL mow

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аггуальность проблемы. Какова функциональность тех или иных элементов структуры рибосомы? Каков тонкий механизм координация биосинтеза белка? Является ли структура рибосомы "жесткой'* и ее роль - правильно располагать тРНК в пространстве и участвовать в катализе пептвдилтрансферазной реакции, а передача сигнала между пространственно разнесенными функциональными центрами осуществляется через молекулы тРНК? Или структура рибосомы "динамична", и цикл ее работы сопровождается серией аллостерических изменений, передающих конформационный сигнал по цепи связанных структурных элементов между функциональными центрами? Верхняя часть центрального протуберанца большой субьединицы подвижна при транслокации, а голова 30S субьединицы изменяет положение при декодировании. В данной работе была исследована структурная и функциональная роль консервативных элементов центрального протуберанца большой субчастицы рибосомы - SS рРНК рибосом Saccharomyces cerevisiae н спирали 38 23S рРНК рибосом Escherichia colt. Положение этих элементов в структуре рибосомы предполагает их непосредственное участие в передаче информационного, аллостерического сигнала во время биосинтеза белка. Цель работы.

1. Изучить особенности функционирования рибосом Escherichia coli, содержащих укороченную спираль 38 23S рРНК, in vitro.

2. Определить изменения структуры 70S рибосом Е. coli, вызванные укорочением спирали 38 23S рРНК.

3. Охарактеризовать фенотип клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, продуцирующих рибосомы, SS рРНК которых содержит точечные мутации.

4. Определить изменения структуры 80S рибосом Saccharomyces cerevisiae, содержащих точечные мутация в 5S рРНК.

Научная новизна и практическая значимость.

Была проверена способность мутантных SOS субчастиц рибосом Escherichia coli, содержащих укороченную спираль 38 23S рРИК, в которой был удален участок 872-905 полинуклеотидной цепи, к ассоциации с 30S субчастицами. Кроме этого, для таких рибосом была определена эффективность polyU зависимого синтеза polyPhe и измерена стимуляция СТРазной активности EF-G рибосомами и их комплексами с polyU и деацилированной тРНК14*. Укорочение спирали 38 23S рРНК замедляет рост клеток и влияет на ассоциацию субчастиц, при этом оно не летально для клеток, не вызывает изменений в принципиальных стадиях элонгационного цикла, а также не влияет на способность деацилированной тРНК,

I иос. НАЦИОНАЛЬНАЯ i

библиотека i

■'. ¿"Ум\

связанной в Р-участке, стимулировать йТРазную активность EF-G. С помощью химического пробинга выявлены структурные элементы 23 S рРНК, конформации которых взаимосвязаны, и показано, что локальные изменения могут передаваться по цепям из элементов рибосомы на большие расстояния.

Среди 246 точечных мутаций в SS рРНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae только 7 оказались нелетальными для клеток. Химический пробинг показал незначительные изменения конформаций оснований нуклеотидов D-петли SS рРНК и спирали 95 25S рРНК. Такие результаты подтверждают, что SS рРНК высокоструктурированная и консервативная молекула. Для рибосом Saccharomyces cerevisiae, содержащих точечные мутации в 5S рРНК, была измерена эффективность запрограммированного сдвига рамки считывания трансляции, полученные результаты были объяснены с точки зрения обобщенной модели запрограммированного сдвига рамки считывания.

Таким образом, в работе был применен комплекный подход, основанный на методах функционального исследования рибосом in vivo и in vitro, а также на методах химического пробинга структуры РНК. Этот подход может быть успешно использован для исследования широкого круга рибонуклепротеидных комплексов, и его разработка является важным этапом в развитии методов изучения динамики работы рибосомы при биосинтезе белка. Дпрпйят^я работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: Международном симпозиуме Держателей грантов Медицинского института Говарда Хыоза, Таллин, Эстония, 2004 г.; Международной конференции студентов и аспирантов "Ломоносов -2005", Москва, Россия, 2005 г.; Конференции Европейской Молекулярно-Биологической Организации "Синтез белка и трансляционный контроль", Гейдельберг, Германия, 2005 г.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 1страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы. Материал иллюстрирован S'O рисунками и ^ таблицами. Библиографический указатель включает ¿ЦЦ цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследования спирали 38 23S рРНК

Спираль 38 23S рРНК (или А-сайтовый палец) выступает из межсубьединичной поверхности в области центрального протуберанца большой субчастицы рибосомы в сторону малой субчастицы (Рисунок 1А). Спираль 38 23S рРНК взаимодействует с центральным доменом 5S рРНК, контактирует с тРНК, связанной в A-участке, и образует В1а

межсубъединичный мостик, взаимодействуя с белком S13. В нашей лаборатории был получен штамм Е. coli, продуцирующий только мутантные рибосомы, содержащие укороченную спираль 38 23S рРНК, в которой был удален участок 872-905 полинуклеотидной цепи (Рисунок 1В). Укорочение спирали вызывает разрушение межсубьединичного мостика В1а, поэтому такая мутация была названа ABla.

Рисунок 1. Мутация ABla. А. Структура большой субъединицы Thermus thermophilic, показана спираль 38 23S рРНК (ASF), 5S рРНК (55) и белок L5. В. Схематичное представление части 5'-концевого домена 23S рРНК E.coli. Прямоугольником выделен участок 872-905 полинуклеотидной цепи 23S рРНК, удаление которого приводит к нутации ДВ1а.

Ранее было показано, что мутация ДВ1а нелегальна для клеток, хотя и приводит к замедлению роста клеток и к незначительному увеличению частоты сдвига рамки считывания и прочтения стоп ко донов.

1.1. Влияние мутации ABla на ассоциацию рнбосомных субчастиц

Установлено, что спираль 38 23S рРНК принимает участие в ассоциации рнбосомных

субъединиц. Эксперименты по пробингу гидроксил-радикалами показали защиту нуклеотидов 884-902 23S рРНК при ассоциации большой и малой субъединиц рибосом Е. cotí. Так как укорочение А-сайтового пальца приводит к разрушению В!а межсубьединичного мостика, была проверена способность мутантных ABla 50S субчастиц к ассоциации с 30S субчастицами при различных концентрациях ионов Mg2*, результаты эксперимента приведены на рисунке 2.

Рибосомы дикого типа были ассоциированы на 30% при низкой концентрации, и практически полностью ассоциированы при высокой концентрации ионов Mg2*, и, напротив, рибосомы ABla были сильно диссоциированы при низких, ассоциированы наполовину при

средних и сохраняли способность к диссоциации при высоких концентрациях ионов М^. Таким образом, укорочение А-сайтового пальца приводит к снижению способности субчастиц к ассоциации, что может объяснять понижение скорости роста клеток, вырабатывающих мутантные рибосомы.

5>М 14 нМ 21 <М

■508*303 _

В7Ц_Ущирицииии Mflg»_

Расугок 2. Эффект удаления участка 872-905 спирали 3S 23S рРНК Е. coli на ассоциацию субчастиц при различных концентрациях ионов Mg2*. WT -рибосомы дикого тяпа, ДВ1а - рибосомы, содержащие укороченную спираль 38 23S рРНК. Светло-серым показана доля (%) 70S субчастнц, темно-серым -доля (%) SOS и 30S субчастиц.

1.2. Эффективность polyU зависимого синтеза polyPhe для рибосом, содержащих мутацию ДВ1а

Мутантные рибосомы и рибосомы дикого типа были протестированы на способность

polyU зависимого синтеза polyPhe. Мутантные рибосомы синтезировали такое же количество полифенилаланина (21±2 пмоль Phe/пмоль рибосом), как и рибосомы дикого типа. Уровень ошибочного включения лейцина для рибосом дикого типа составлял гДЫМхЮ3 Phe/Leu, столько же, сколько и для мутантных рибосом - 2,8±0,4х103 Phe/Leu. Эти результата свидетельствуют об отсутствии значительного влияния укорочения спирали 38 23S рРНК на элонгацию.

1.3. Эффективность отдельных стадий элонгационного цикла для рибосом,

содержащих мутацию ДВ1а

Мутантные рибосомы были протестированы на эффективность протекания

индивидуальных стадий элонгационного цикла с помощью пошаговой системы трансляции in vitro. Для эксперимента была использована синтетическая неприродная мРНК: MFK-mPHK, кодирующая Met-Phe-Lys (MFK) полипептид (Рисунок ЗА). Эффективность отдельных стадий элонгационного цикла была детектирована методом тупрннтинга

(от англ. toe-printing), который позволяет определять положение рибосомы на мРНК и полноту образования комплекса.

А.

MFK-mPHK

+16 +19 +22

5'-AAGGAG AUAUACC AUG UUC AAG UAC — 3"

SO

B.

M F К

AB1a 12 3 4

¿L

Расуаок 3. Пошаговая трансляция мРНК, кодирующей MFK пегггид. А. Схематичное изображение первичной структуры MFK-mPHK, показана часть мРНК, содержащая последовательность Шайна-Дальгарно - SD, и транслируемые кодоны, которые отмечены фигурными скобками, нумерация соответствует местам остановки обратной транскриптазы. В. Радиоавтограф разделения электрофорезом в 10% полиакряламндном геле продуктов обратной транскрипции MFK-mPHK с 5'- радиоактивно меченного праймера. Линии соответствуют различным комплексам: (/) - комплекс рибосом (0,1 цМ), MFK-mPHK (0,1 цМ) н fMet-rPHKr"* (0,2 цМ); (2) - комплекс рибосом (0,1 цМ), MFK-mPHK (0,1 цМ), £Met-TPHKf"" (0,2цМ) и Phe-iPHKpke*EF-Tu*GTP (0,2 цМ); (3) - то же, что ■ в (2), но после добавления EF-G*GTP (0,1 цМ); (4) то же, что и в (5), но после добавления Lys^rPHKL>**EF-Tu*GTP (ОД цМ). Обозначены места остановки обратной транскриптазы, отсчет ведется с А инициагорного кодона AUG. WT - рибосомы дикого типа, АВ1а- рибосомы с укороченным ASF.

Связывание инициаторной fMet-TPHKfMcI в Р-участке рибосом было почти количественным как для рибосом дикого типа, так и для рибосом ABla. На геле появлялась единственная полоса в положении +16 от нуклесггида А инициаторного кодона AUG (Рисунок ЗВ, линия /), такой сигнал объясняется тем, что MFK-mPHK содержит только один AUG ко дон и рибосома хорошо позиционируется на этом кодоне за счет взаимодействия с последовательностью Шайна-Дальгарно и fMet-TPHKfMe.

Ферментативное (зависимое от EF-Tu и GTP) связывание следующей тРНК - РЬе-тРИС"* в А-участке приводило к появлению дополнительного сигнала в положении +17 (Рисунок ЗВ, пиния 2) в обоих образцах рибосом. Это связано с конформационным изменением рибосомы при связывании тРНК в А-участок. Кроме этого, при связывании двух тРНК наблюдается появление зоны, соответствующей положению UUC кодона в Р-сайте рибосомы - положения

+19, +20 (Рисунок ЗВ, линия 2). Это явление может быть объяснено прохождением спонтанной EF-G-независимой транслокации. Интенсивность полос для рибосом, несущих ДВ1а мутацию, и для рибосом дикого типа была одинаковая, что свидетельствует об одинаковой эффективности связывания тройного комплекса.

После связывания Phe-TPHKpbe и пептидилтрансферазной реакции при добавления EF-G*GTP проходила транслокация. Появление характеристических полос в положениях +19 и +20 свидетельствовало об одинаковой степени транслокации для АВ1а и рибосом дикого тяга (Рисунок ЗВ, линия 3). При последующем добавлении тройного комплекса Lys-TPHKLy**EF-Tu*GTP к реакционной смеси происходило связывание лизиновой тРНК в А-участке, аккомодация, пептидилтрансферазная реакция и последующая транслокация за счет EF-G, добавленного на предыдущих стадиях реакция. Эффективность второго раунда транслокации для рибосом дикого типа и ДВ1а была одинаковой и выражалась в остановке обратной транскриптазы на нуклеотиде в положения +22 от нуклеотида А инициаторного кодона AUG (Рисунок ЗВ, линия 4).

Несмотря на то, что консервативный элемент структуры 23S рРНК спираль 38 находится близко от "локтя" тРНК, связанной в A-участке, и образует межсубьединичный мостик В 1а, который может быть вовлечен в конформационные перестройки при транслокация и декодировании, укорочение данного элемента не вызывает изменений в эффективности прохождения отдельных стадий элонгационного цикла в пошаговой системе трансляции in vitro. Функциональные тесты не выявили различий между ДВ1а рибосомами и рибосомами дикого типа при связывании тРНК с А и Р - участками и транслокация.

1.4. Стимуляция GTPa3Hofi активности EF-G функциональными комплексами рибосом, несущих ДВ1а мутацию

Биохимические эксперименты показали, что присутствие или отсутствие полипептидной

цепи на тРНК в Р-участке может контролировать связывание трансляционных факторов IF2, EF-G и RF3. В ходе биосинтеза белка EF-G взаимодействует с рибосомой, несущей деацилнрованную тРНК в Р-участке и пептидил-тРНК в А-участке, то есть с рибосомой в претранслокационном состоянии. Из результатов экспериментов, проведенных в лаборатории Эренберга, известно, что комплекс рибосомы с деацилированой тРНК в Р-участке достаточно эффективно имитирует претранслокационное состояние и стимулирует ОТРазную активность EF-G.

Была измерена ОТРазная активность EF-G, индуцированная рибосомами дикого типа и ДВ1а мутантными рибосомами, а также их комплексами с polyU и деацилироваяной тРИк"*, которая связывается преимущественно в Р-участке. Зависимость скорости гидролиза GTP от концентрации EF-G представлена на рисунке 4А.

Мутация ДВ1а значительно не повлияла на способность деацилнрованной тРНК стимулировать СТРазную активность ЕР-й. При этом вТРазная активность ЕР-в, вызванная мутантными рибосомами как в присутствии, так и в отсутствие деацилнрованной тРНК, была снижена по сравнению с рибосомами дикого типа (Рисунок 4).

А.

I:

I-

■ WT ▼ ОТЧтРНК л дВ1а » ДВ1а + тРНК

в.

АВ1а

RV

EF-Q, мкМ

Направление движения хроматографического фронта"

Ршсунок 4. Стимуляция ОТРазной активности EF-G рибосомами дикого и ABla типов. А. Зависимость скорости гидролиза GTP от концентрации EF-G. Серые значки соответствуют рибосомам ABla, черные - рибосомам дикого типов. Квадраты соответствуют пустым рибосомам, треугольники - комплексам рибосома*ро1уи*тРНКп*. В. Радиоавтограф хромагограммы разделения продуктов гидролиза GTP EF-G, индуцированного рибосомами ABla типа. Цифры от 1 до 7 соответствуют концентрациям EF-G: 0,0; 0,1; ОД; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 мкМ. Р,*- радиоактивный неорганический фосфат. GTP" - y-[52P]-GTP.

1.5. Структурные изменения в рибосоме при мутации ДВ1а

Для определения структурных изменений, которые могут возникнуть в рибосоме при

укорочении спирали 38 23S рРНК, был использован метод химического пробинга. Мутация не повлияла на реакционую способность оснований 16S рРНК, однако было найдено несколько групп оснований 23S рРНК, реакционная способность которых изменилась в мутаншых рибосомах по сравнению с рибосомами дикого типа.

Первая группа нуклеотидов, реакционная способность которых изменялась, была сконцентрирована между местом контакта спирали 38 с 5S рРНК и пептидилтрансферазным центром рибосомы. Так, увеличилась реакционная способность нуклеотидов U2249, G22S0 и G22SS спирали 80 23S рРНК (Р-петли), которая является компонентом пептидилтрансферазного центра (Рисунок SA). Увеличилась реакционная способность G9S6 спирали 39 23S рРНК, соединяющей Р-петлю со спиралями 81,89 и SS рРНК (Рисунок SB), и U89 D-петли 5S рРНК (Рисунок 5Q.

Кроме реакционной способности оснований нуклеотидов, находящихся в регионах, близких к ASF, изменялась реакционная способность оснований, находящихся в спиралях,

отдаленных от спирали 38 23в рРНК. Так, повышалась реакционная способность оснований С2529 (Рисунок 50) и С2751 (Рисунок 5Е), находящихся на концах спиралей 91 и 97 23Э рРНК, соответственно.

А. В.

п га Г д РМбКеЙ» СМС Цп ц ц с д 1)М8Кв№СМС 11п

U2249; G2250-

G2255>-!

G956

С.

4Wt Awt Awt Awt

D.

UGCADMSKrthCMCOn U G С A

U89>-

DMS KettlCMC Un

G2529

¿Wt Awt Awt Awt DMSKeth CMC Un

AWt Awt Awt Awt

G2751>~

Awt AWt AWt AWt

Ршсунок 5. Химический пробинг структуры 70S рибосом Е. coli, несущих мутацию ABla. Показаны радиоавтографы продуктов обратной транскрипции модифицированной 5S рРНК и 23S ppräc с 5'-радиоактивно меченных праймеров, разделенных электрофорезом в 10% полиакриламидном геле. Линии соответствуют: U, G, С, А - сиквеясу; DMS - модификации диметилсульфатом; Keth - кегоксалем; CMC - карбодиимидом; Un - немодифицированной рРНК. Л и wt соответствуют мутангным ABla рибосомам и рибосомам дикого типа. Остановки обратной транскриптазы соответствуют нуклеотидам, чья реакционная способность увеличивалась в результате мутации AB 1 а.

Анализ изменений реакционной способности оснований яуклеотидов 23S рРНК позволяет сделать вывод о том, что при разрушении В 1а мостика изменяют свою структуру несколько функционально важных регионов 23S рРНК (рисунок 6).

Спираль 38 23S рРНК образует контакт с 5S рРНК и спиралью 81, которая, в свою очередь, контактирует со спиралью 39 23S рРНК. Нуклеотид G956, который находится в петле спирали 39, становится более реакционноспособным по отношению к кетоксалю при укорочении спирали 38. Спираль 81 23S рРНК образует третичный контакт с нуклеотидом G2255, который находится в спирали 80 (Р-петле) и реакционная способность которого также повышается.

Другой нуклеотид Р-петли, на который влияет мутация в А-сайтовом пальце - в2250 взаимодействует со спиралью 39 238 рРНК. Нуклеотид 1189, реакционная способность которого по отношению к кетоксалю повышается, находится в О-петле 58 рРНК, которая располагается в кармане, образованным спиралью 42, поддерживающей центр, ассоциированный с ОТРазной активностью, спиралью 39 и 89 23в рРНК (Рисунок 6В).

CVp

h92

Рясувок б. Структурные изменения в функционально важных участках рибосомы. А. Вторичная структура 5S рРНК и части 23S рРНК E.coli. Отмечены номера спиралей, обсуждаемых в тексте. РТС - петгпадилтрансферазный центр. SRL - спираль 95 23S рРНК или с&рцин-рициновая петля. Кружками отмечены основания, реакционная способность которых возрастала при мутации AB 1а. Линии отображают третичные взаимодействия нуклеопщов рРНК. В. Расположение элементов вторичной структуры и нуклеотидов в большой субьединице рибосом Я marismortui, вид со стороны малой субъединицы. Черными ван-дер-еаальсоеыми сферами показаны иуклеогады 23S и SS рРНК Е. coli, реакционная способность которых увеличивалась при мутации ДВ1а в рибосоме.

Таким образом, пробинг структуры позволяет выявить серию взаимосвязанных элементов рибосомы, которые находятся непосредственно над пептидилтрансферазным центром и включают в себя его часть - Р-петлю. Изменения реакционной способности в данном регионе являются скорее незначительными, что свидетельствует о том, что укорочение спирали 38 23S рРНК не разрушает полностью структуру Р-петли и близлежащих элементов 23S рРНК, а, скорее всего, смещает равновесие между альтернативными третичными структурами. Такая интерпретация соответствует слабому влиянию мутации АВ1а на функции рибосомы in vitro.

Наибольший интерес вызывает влияние укорочения спирали 38 на элементы 23S рРНК, расположенные близко к центру связывания элонгационных факторов. Так, нуклеотид G2751 спирали 97 23S рРНК, который изменяет свою реакционную способность по отношению к кетоксалю, образует третичный контакт со спиралью 42 23S рРНК, поддерживающей GAC, спираль 97, в свою очередь, располагается под "локтем" спирали 42. Длинный стебель 23S рРНК, который составляют спирали 95, 96 и 97, несет структурный элемент, который взаимодействует с элонгационными факторами - сарцин-рицияовую петлю (спираль 95 23S рРНК), контактирующий с кончиком спирали 91, содержащей другой остаток, реакционная способность которого повышается при укорочении А-сайтового пальца - G2529. Дяиичй нуклеотид образует высококонсервативную неканоническую обращенную Уотсон-Криковскую пару с основанием нуклеотида С2475 спирали 89 23S рРНК, которая соединяет пептидшггрансферазный центр, спираль 39, спираль 42 23S рРНК и 5S рРНК (Рисунок 6В).

Таким образом, мы обнаружили, что укорочение спирали 38 23S рРНК замедляет рост клеток, влияет на ассоциацию субчастиц и понижает вТРазную активность EF-G, индуцированную рибосомой или ее комплексом с деацилированной тРНК. При этом оно не летально для клеток, не вызывает изменений в принципиальных стадиях элонгационного цикла, а также не влияет на способность деацилированной тРНК, связанной в Р-участке, стимулировать вТРазную активность EF-G. Пробинг структуры рибосом, содержащих мутацию в спирали 38 23S рРНК показал, что В1а мостик, образованный спиралью 38 23S рРНК, может влиять на формирование третичных контактов, соединяющих SS рРНК со структурными компонентами пептидилтрансферазного центра и элементами, взаимодействующими с элонгационными факторами.

Таким образом, локальные изменения структуры передаются по цепям элементов рибосомы на большие расстояния, при этом она, вероятно, использует множественные альтернативные пути коммуникации между функциональными центрами, и потеря одних взаимодействий может компенсироваться другими. Так, по-видимому, укорочение спирали 38 23S рРНК, разрушающее В1а мостик, приводит к тому, что его роль начинают выполнял» мостики Bib и Ble.

2. Исследования 5S рРНК

5S рРНК - основной компонент центрального протуберанца большой субъединицы рибосомы. Она не является частью каких-либо функциональных центров рибосомы, однако расположена так, что может связывать эти центры и быть промежуточным звеном в передаче аллостерического информационного сигнала. Голова 5S рРНК находится в верхней части центрального протуберанца 70S рибосомы и с его внутренней стороны контактирует с белком L5, который образует консервативный Blb/c (Bib) межсубьединичный мостик с

белком малой субъединицы 813. й-петля 58 рРНК взаимодействует с карманом, образованным спиралью 42, поддерживающей центр, ассоциированный с СГРазной активностью, спиралью 39 и 89 23в рРНК.

Исследования 55 рРНК проводились совместно с лабораторией доктора Джонатана Динмана на факультете Клеточной Биологии и Молекулярной Генетики Университета штата Мэрилэнд, Колледж Парк, США. В этой лаборатории была получена библиотека высококопийиых дрожжевых плазмид рЯ>106.Тф, содержащая 246 из 363 возможных мутантных аллелей 58 рРНК 8ассЬаготусе$ сегеуШае.

2.1. Фенотип мутаций в 5в рРНК ЗассНаготусез сегеуЫае Для исследований был выбран штамм ЫОУЮ49, в котором все хромосомные повторы 5Б рДНК удалены из генома и который содержит только одну копию всех рРНК генов -на плазмиде рЖ>У353. После серии генетических манипуляций был получен штамм Л) 1253, содержащий плазмиды рЛ)373.Ьеи и рЛЛОб.Ттр, при этом большие рибосомные РНК были закодированы на плазмиде рЛ5373.Ьеи, а 58 рРНК синтезировалась с плазмиды рЛ>106.Тгр, которая несла ген 58 рРНК, содержащий ту или иную точечную мутацию. Среди всех 246 мутаций в этом гене только 7 оказались нелетальными для клеток: А20С, С6911, А7611, А7911, 1181С, А84в и С93и.

Для полученных штаммов были определены времена удвоения и рассчитаны относительные скорости роста -величины обратные временам удвоения, нормированные на скорость роста штамма, вырабатывающего рибосомы дикого типа (Рисунок 7). Скорость роста замедлена в клетках, продуцирующих рибосомы, несущие мутации А20С и Ш1С в 5Б рРНК.

Из клеток всех штаммов были выделены рибосомы, 5Б рРНК которых была проанализирована методом обратной транскрипции. Эксперимент показал, что полученные штаммы вырабатывают мутантные рибосомы, а примесь рибосом дикого типа не превышает 4% (Рисунок 8).

Рмсувок 7. Относительные скорости роста клеток штамма ЛЭ1253- рЯ)106.Тгр. Мутантная 58 рРНК вырабатывается с плазмиды рГОЮб.Ттр. ^ -ппамм Я>125Э-рГО18<Шга.

VGCAVGCA A20C

MUT WT

VGCAVGCA

C69U

MUT WT

11GCA U G С A A76U MOT WT

MOT WT

VGCAVGCA A79U

VGCAVGCA U81C

VGCAVGCA A84G

VGCAVGCA C93U

Рисуяок 8. Анализ соотношения мутантной SS рРНК (пггамм JD1253- рЛИОб.Тгр) к SS рРНК дикого типа (JD1253-pJDl 80.Ura), выделенной из клеток соответствующих штаммов. Показаны радиоавтографы разделенных в 10% ПААГ продуктов обратной транскрипции рРНК в присутствии смеси dNTP (три из четырех) и ddNTP (четвертого). Праймеры выбирались так, что продукты их удлнннения должны различатьс« в зависимости от того, какой нуклеотид находите* в месте мутации. MUT-соответствует мутантной 5S рРНК, WT-5S рРНК дикого типа. U, G, С, А соответствуют остановке реакции обратной транскрипции напротив соответствующего нуклеотида 5S рРНК.

2.2. Эффективности программируемого сдвига рамки считывания для рибосом Saccharomyces cerevisiae, несущих точечные мутации в SS рРНК

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae это удобный объект для количественной

характеристики эффективности сдвига рамки считывания. Последовательности ПК вирусов (например, L-A или HTV-1) или Ту/, ТуЗ элементов дрожжей содержат участок запрограммированного сдвига рамки считывания. При трансляции таких последовательностей в Saccharomyces cerevisiae наблюдается сдвиг рамки считывания.

В предыдущих исследованиях было показано, что экспрессия мутантных SS рРНК аллелей с высококопийных плазмид может вызывать фенотип повышенной частоты +1 или -1 программируемого сдвига рамки считывания. Так как, в соответствии с полученными нами результатами, только 7 штаммов, которые продуцируют мутантные по SS рРНК рибосомы, жизнеспособны, в лаборатории доктора Динмана был использован дрожжевой штамм JD1111, который содержит 4 хромосомных копии гена SS рРНК - RDN5. Данный пггамм был трансформирован плазмидами рЛМОб.Тгр из исходной библиотеки. Анализ SS рРНК, выделенной из таких штаммов, показал, что соотношение рибосом, несущих мутантную SS рРНК, к рибосомам дикого типа находится в интервале от 1:10 до 1:1. Для полученных

штаммов с помощью дрожжевых векторов на основе моноцистронного репортерного гена LacZ нашими коллегами была рассчитана эффективность программируемого сдвига рамки

Г.Ч И' 11ДМЯИ

Для расчета эффективности программируемого сдвига рамки считывания трансляции в штаммах JD1253, которые продуцируют SS рРНК только с плазмиды pJD106.Tip, несущей точечные мутации в гене SS рРНК, был использован метод на основе бицистронного репортерного гена, кодирующего люциферазы Renilla reniformis и Photinus pyralis (Рисунок 9). Синтез второго репортерного белка - люциферазы Photinus pyralis в тестовой плазмиде происходит только в случае сдвига рамки считывания за счет сигнальной последовательности "+1 или -1 сдвига", клонированной с 5'- конца гена flue (Рисунок 8В).

А.

5'

О рамка считывания

3' UAG

В.

5'

О рамка считывания"

сигнал +1 или -1 программируемого сдвига рамии

+1 или -1 рамка считывания

Рисунок 9. Система для количественного анализа программируемого сдвига рамки считывания в дрожжах Saccharomyces cerevisiae на основе репортерных генов люцифераз Renilla reniformis (rluc) и Photinus pyralis (flue). AUG-cnpt кодон, UAG - стоп кодон. А. Контрольная плазмида, в которой происходит синтез люцифераз Rluc и Flue, сигнал сдвига отсутствует. В. Тестовая плазмида в которой синтез Flue происходит только в результате программируемого сдвига рамки считывания, сигнал сдвига клонирован с 5'-конца гена flue.

Исходные штаммы трансформировали плазмидами, в которых клонированы сигналы сдвига -1 вируса L-A - pYDL-LA и сдвига +1 Ту J элемента дрожжей pYDL-TYl, регистрировали соотношение активностей люминисценции люцифераз Renilla reniformis и Photinus pyralis - Fa/Ra и рассчитывали эффективности программируемого сдвига рамки считывания по формуле Эффеиявностъ=[(Л1та/^^/(^аюи^/ЛаИВ1^)]. Результата представлены в таблице 1.

Таблица 1. Эффективность -1 и +1 программируемого сдвига рамки считывания для штаммов ГО 1253- рГОЮб.Тгр, рассчитанная с помощью метода двух репортерных генов люцифераз. ИТ-штамм ДР1253-рДР18(Щга._

Мутация Эффективность +1 программируемого сдвига рамки считывания ± ошибка расчета, % Эффективность -1 программируемого сдвига рамки считывания ± ошибка расчета, %

WT 11,05±0,14 1 ОДОЮ, 14

А20С 12,10±0,70 15,13±0,15

C69U 12,50±0,12 15,90±0,20

A76U 9,82±0,31 11,10±0,26

A79U 14,13±0,24 16,50*0,28

U81C 13,10±0,77 17,30±0,54

A84G 14Д0±0,44 16,80±0,35

C93U 14,22±0,43 16,60±0,34

Изменение эффективности программируемого сдвига рамки считывания в случае мутаций в SS рРНК может быть объяснено со структурной точки зрения. Для этого необходимо рассмотреть расположение SS рРНК в рибосоме и локализацию в пространстве нуклеотидов, изменение которых приводило к тем или иным феиотипическим проявлениям. К сожалению на ддишл« момент не описано ни одной детальной трехмерной модели SS рРНК в составе 80S рибосомы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Сравнение крио-электронной модели 80S рибосомы дрожжей Saccharomyces cerevisiae с моделью структуры большой субчастицы Haharcula marismortui не выявило значительных различий в структуре и положении SS рРНК и основных элементов большой рРНК, поэтому представляется целесообразным рассмотрение пространственного расположения тех или иных нуклеотидов 2SS и SS рРНК 80S рибосом Saccharomyces cerevisiae на модели структуры большой субчастицы Haloarcula marismortui.

Согласно обобщенной модели сдвига рамки считывания трансляции события -1 и +1 сдвига рамки происходят на разных стадиях элонгационного цикла. Так, предположено, что -1 сдвиг рамки считывания происходит во время или сразу после аккомодации, но перед транслокацией, а +1 сдвиг рамки считывания происходит в посттранслокационном состояния, то есть на стадии, когда А участок рибосомы свободен.

Анализ данных по эффективности программируемого сдвига рамки считывания, рассчитанной для штаммов, продуцирующих как только мутантные по 5S рРНК рибосомы, так и мутантные рибосомы в смеси с рибосомами дикого типа, позволяет сделать вывод о том, что мутации в "голове" SS рРНК понижают эффективность -1 программируемого сдвига рамки считывания (Рисунок 10А, нуклеотиды выделены белым) и, одновременно, повышают эффективность +1 программируемого сдвига (Рисунок 10В, нуклеотиды выделены черным). Согласно обобщенной модели такой эффект может быть объяснен стабилизацией

посттраяслокационного состояния, что должно понижать эффективность -1 и повышать эффективность +1 программируемого сдвига. Белок 115 (уЫ 1) взаимодействует с "головой" 5Б рРНК и с тРНК, связанной в Р-участке. Мутации в "голове" 5в рРНК могут разрушать консервативную сеть водородных связей между атомами белка и 5Э рРНК, приводя к нарушению контактов между 5Э рРНК и Ь5. Это может негативно влиять на прохождение структурных перестроек в рибосоме, происходящих при связывании ЕР-Ти и необходимых для дальнейшей трансляции. При этом поспранслокационное состояние будет стабилизировано.

Ршсунок 10. Расположение нуклеотидов рибосом H. marismortui, соответствующих нуклеотидам 5S рРНК Soccharomyces cerevisiae, мутации в которых влияют на сдвиг рамки считывания. А. -1 программируемый сдвиг рамки считывания В. +1 программируемый сдвиг рамки считывания. Черными ван-дер-ваальсовыми сферами показаны нукпеотилы, мутации в которых увеличивают, белыми - уменьшают эффективность программируемого сдвига рамки считывания по сравнению с рибосомами дикого типа. Отмечены результаты экспериментов по расчету эффективности для штаммов, продуцирующих только мутантные по 5S рРНК рибосомы (Таблица 1), и мутантные рибосомы в смеси с рибосомами дикого типа.

Эффекты мутаций в нижней части 5S рРНК прямо противоположны эффектам в "голове" 5S рРНК. Мутации в нижней части 5S рРНК повышают эффективность -1 (Рисунок 10А, нуклеотиды выделены черными), и понижают эффективность +1 программируемого сдвига рамки считывания (Рисунок 10В, нуклеотиды выделены белыми). D-петля 5S рРНК связана с GAC и SRL через спирали 25S рРНК. Мутации в нижней части 5S рРНК, вероятно, могут влиять на относительное положение этих элементов. Тогда, согласно обобщенной модели сдвига рамки считывания, наблюдаемое изменение эффективностей программируемого сдвига рамки считывания может быть объяснено понижением способности связывания eEF-2 (EF-G) и повышением эффективности связывания eEF-1 (EF-Tu) с рибосомой.

А

5S

2.3. Структурные изменения в рибосомах Лгссйвгояусе« сегеуШае при

мутациях в 5в рРНК

Единственным источником 5в рРНК в штамме Л)1253 является плазмида рЛМОб.Тгр,

которая содержит мутантный ген 58 рРНК. № таких штаммов были выделены рибосомы. Структурные изменения в рибосомной 258 рРНК и 5Э рРНК ЭассЬаготусез сегетзгае определялись методом химического пробинга. Были найдены изменения ках в 58, так и в 258 рРНК.

Нелетальные мутации располагаются равномерно по всей молекуле 5Б рРНК, при этом все 7 из них вызывают уменьшение реакционной способности того или иного из нуклеотидов 085, 091 и (392, которые располагаются в нижнем домене 5Э рРНК (Рисунок 11В; Рисунок 12). Наибольший эффект был получен для мутаций А20С и 1181С (Рисунок 12). Замена пары оснований А-17 на С-11 при мутации А20С должна дестабилизировать спираль П и, напротив, замещение в-и пары на более стабильную в-С пару стабилизировать спираль IV 5в рРНК (Рисунок 11В). Вероятно, даже такие незначительные изменения могут передаваться на отдаленный в пространстве регион спираль IV и Е>-петто 5в рРНК. Этот регион взаимодействует со спиралями 39, 89 и 42 258 рРНК, которые являются частью системы третичных контактов, связывающих 5в рРНК, А-сайтовый палец и структурные элементы пептидилтраясферазного центра и центра связывания элонгашонных факторов.

Мутации А20С и и81С вызывают изменения в спирали 95 258 рРНК: сарцин-рициновой петле (Рисунок 12). Так, уменьшается реакционная способность 03027, соответствующего нуклеотиду 02661 у Е.соН, основание которого защищается от химической модификации при связывании как СТ-С, так и ЕР-Ти. Кроме того, незначительно уменьшается реакционная способность основания нуклеогадного остатка 03013, который лежит в основании спирали 95 25Э рРНК и находится близко к месту контакта 5ЯЬ и белка 1.3. Интересно, что штаммы, продуцирующие рибосомы с мутациями А20С и 481С, имели пониженную скорость роста, что может объясняться дефектами в структуре рибосомы, «ниччтшдд данными мутациями.

Сарцин-рициновая петля всегда занимает одну и ту же позицию как на крио-электронных реконструкциях, так и на всех доступных атомных структурах большой рибосомной субьеднницы из различных организмов. Изменение реакционной способности оснований нуклеотидов в3027 и 03013 сарцин-рициновой петли, вероятно, может быть связано с движением спирали 91, которая через консервативную пару оснований С2843-02897 (С2475-С2529 у Е. соЩ взаимодействует со спиралью 89 25в рРНК.

DHS KM CMC Un

M wt И wt H wt H M#t II Л С A

DM8 KM CMC Un

Mwt Mini Mwt Mwt U С С A

DM8 KM CMC Un

Mwt Mwt Mwt in и О С A

U81C

63027 A20C

I

10

\

II

1111

£ in f

CAUA T AA С/

5' (p) ppGGUUGCGGC UC UACC@G AGCA С GUU

111111111 A 11 111111 В 1111 i 111

UCUAACGUCG4 ,AG AUGGUC UUGAGCAA

CCf

I

120

G U С

\ G A 60 A

-UII

► Ull cllll

-01

uu

I

50

cuagcs

5S pPHK

40

SRL

4

uus

и

7

А чзозо

\ 3100

25S pPHK

Рясунок 11. Химический пробинг структуры 80S рибосом Saccharomyces cerevisiae. несущих точечные мутации в SS рРНК. А. Радиоавтографы продуктов обратной транскрипции модифицированной SS рРНК и 2SS рРНК с 5'-радиоактивно меченных праймеров, разделенных электрофорезом в 10% полиакриламидном геле. Линии соответствуют: U, G, С, А- сиквенсу; DMS -модификации диметилсульфагом; Keth - кетоксалем; CMC - карбодиимидом; Un - немодифицированной рРНК. AÍ и wt соответствуют мутангным рибосомам и рибосомам дикого типа. Остановки обратной транскрипгазы соответствуют нуклеотидам, чья реакционная способность увеличивалась в результате мутации соответствующих нуклеотвдов в SS рРНК. В. Вторичная структура 5S рРНК (отмечены номера спиралей и доменов) и спирали 95 2SS рРНК (SRL) Saccharomyces cerevisiae. Окружностями показаны мутации в SS рРНК (стрелка и соответствующая мутация), которые были исследованы в данной работе. Цветными прямоугольниками напротив показано, какие из мутантов вызывают увеличение реакционной способности нуклеотидов SS или 2SS рРНК, которые отмечены кружочками соответствующего цвета.

Расуюк 12. Изменение реакционной способности оснований 5S и 25S рРНК, вызванные мутациями в SS рРНК, отмеченные на детальной атомной структуре SOS субчастицы Н. marismortui. Черными ван-дер-ваальсовыми сферами выделены нуклеотиды, основания которых изменяют реакционную способность при мутациях в SS рРНК, белыми выделены нуклеотиды А20 и U81, серыми выделены остальные нуклеотиды 5S рРНК, мутации оснований которых оказались нелетальными для клеток.

Для SS рРНК в литературе были предложены различные функции. Полагают, что она увеличивает сродство аминоацил-тРНК к рибосоме, помогает в формировании правильной геометрии пептидилтрансферазного центра, или увеличивает пептвдшпрансферазную активность. Еше до получения структуры SOS субчастицы с высоким разрешением возникла гипотеза о том, что 5S рРНК может связывать функциональные центры рибосомы и передавать между ними конформационный сигнал и, в частности, соединять пептидилтрансферазный центр и центр, ассоциированный с вТРазной активностью.

Структурные изменения в рибосомах Saccharomyces cerevisiae, которые вызывают мутации в SS рРНК, скорее можно отнести к категории слабых. Однако, вместе с результатами о летальности большинства (239 из 246) мутаций в SS рРНК для клетки, они четко свидетельствуют о том, что 5S рРНК является высокоструктурированной и консервативной молекулой. Даже незначительные изменения в ее доменах могут передаваться в район D-петли, который взаимодействует с карманом, образованным спиралью 42, поддерживающей центр, ассоциированный с СТРазной активностью и спиралями 39 и 89 2SS рРНК. Если идея об аллостерической связи структурных элементов рибосомы верна, то "голова" SS рРНК может влиять на конформацию "нижней" части молекулы. Таким образом, структурные изменения в области центрального протуберанца большой субъединицы, например, во время относительного поворота субчастиц при транслокации или при переходе малой субъединицы из "открытого" состояния в "закрытое" при декодировании, могут передаваться с "головы" SS рРНК на D-петлю молекулы, а через нее на другие структурные элементы рибосомы, что подтверждается полученными в этой работе данными о том, что мутации в SS рРНК могут потенциально влиять на третичные контакты между спиралями 25S рРНК в 80S рибосоме Saccharomyces cerevisiae, связывающими структурные элементы пептидюггрансферазного центра и центра связывания элонгационных факторов.

ВЫВОДЫ

1. Укорочение спирали 38 23S рРНК, приводящее к разрушению В1а межсубъединичного мостика, замедляет рост клеток, влияет на ассоциацию субчастиц и понижает ОТРазную активность EF-G, индуцированную рибосомой или ее комплексом с деацилированной тРНК, при этом оно не летально для клеток и не вызывает изменений в принципиальных стадиях элоигационного цикла.

2. Пробинг структуры рибосом, содержащих мутацию в спирали 38 23S рРНК, показал, что В1а мостик, образованный спиралью 38 23S рРНК, может влиять на формирование третичных контактов, соединяющих SS рРНК со структурными компонентами пептидилтрансферазного центра и элементами, взаимодействующими с элонгацнонными факторами. Таким образом, локальные изменения структуры могут передаваться по цепям элементов рибосомы на большие расстояния.

3. Среди 246 точечных мутаций в 5S рРНК Saccharomyces cerevisiae только 7 оказались нелетальными для клеток: А20С, C69U, A76U, A79U, U81C, A84G и C93U.

4. Структурные изменения в различных доменах 5S рРНК могут передаваться в район D-петли SS рРНК и на центр связывания элонгационых факторов в 80S рибосомах Saccharomyces cerevisiae.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Sergiev PV, Lesnyak DV, Burakovsky DE, Kiparisov SV, Leonov AA, Bogdanov AA, Brimacombe R, Dontsova OA. (2005) Alteration in Location of a Conserved GTPase-associated Center of the Ribosome Induced by Mutagenesis Influences the Structure of Peptidyltransferase Center and Activity of Elongation Factor G. J Biol Chem. 280, 3188231889.

2. Sergiev PV, Kiparisov SV, Burakovsky DE, Lesnyak DV, Leonov AA, Bogdanov AA, Dontsova OA. (2005) The Conserved A-site Finger of the 23S rRNA: Just One of the Intersubunit Bridges or a Part of the Allosteric Communication Pathway? J Mol. Biol. 353, 116-123.

3. Kiparisov S, Petrov A, Meskauskas A, Sergiev PV, Dontsova OA, Dinman JD. (2005) Structural and functional analysis of 5S rRNA in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Genet. Genomics. 274,235-247.

4. Sergiev P. V., Kiparisov S. V., Leonov A.A., Bogdanov A. A., Brimacombe R., Dontsova O. A. Mutations in ribosomal RNA that affect different stages of translation. 2004. Meeting of HHMI International Research scholars, Abstract book, p.79.

5. Кипарисов C.B., Лесняк Д.В., Бураховский Д.Е., Леонов А.А., Сергиев П.В. Изучение взаимодействий между функциональными центрами рибосомы. 2005. Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005». С. 80.

6. Dontsova О., Sergiev P., Kiparisov S., Lesnyak D., Burakovsky D., Bogdanov A. Communication between the elongation factor binding site and peptidyl-transferase centers of the ribosome. 2005. EMBO Conference on Protein Synthesis and Translational Control. Abstract book, p. 48.

РНБ Русский фонд

2006-4 23071

Подписано в печать 26 октября 2005 г. Заказ 508. Формат 60 х 90/16. Тираж 100 экз. Отпечатано в салоне оперативной печати ПКФ. Москва, Садовая-Черногрязская, ЗБ.

Содержание.

Список сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Морфология рибосомы.

1.2. Особенности строения функциональных центров и структурных элементов рибосомы.

1.2Л. Элонгационный цикл рибосомы.

1.2.2. Пептидилтрансферазный центр.

1.2.3. Центр связывания элонгационных факторов.

1.2.4. Декодирующий центр.

1.2.5. А-сайтовый палец.

1.2.6. 5S рРНК.

1.2.7. Спирали 89 и 91.

1.3J Передача сигнала в рибосоме.

1.3:1. Декодирование, конформационные изменения при связывании EF-Tu.

1.3.2. Транслокация, конформационные изменения при связывании EF-G.

1.3.3. Передача сигнала.

Синтез белка— сложный процесс, центральную роль в нем играет рибосома -молекулярная машина, задача которой декодировать матричную РНК (мРНК) в соответствующую последовательность аминокислот с помощью аминоацил-тРНК.

Рибосома состоит из рибосомной РНК (рРНК) и белков. В научном мире долго велись споры о функции рРНК, были выдвинуты гипотезы о том, что она; может являться матрицей, определяющей последовательность синтезируемого белка,, или г образует каркас, на который крепятся каталитически активные белковые компоненты. Накопление большого количества биохимических данных, свидетельствующих о том, что рРНК вовлечена в работу рибосомы, открытие каталитической активности-РНК в 80-х годах [1], и наконец, разрешение структуры рибосомы на атомарном уровне позволили установить, что главным компонентом, ответственным за функцию макромолекулярного комплекса является рРНК, а белки выполняют роль скорее структурных, чем функциональных составляющих.

Успехи в определении структуры различных функциональных комплексов рибосомы в сочетании с биохимическими методами, такими, как; сайт-направленный мутагенез рРНК, химический пробинг, футпринтинг и фотоаффинная, химическая модификация открывают широкие возможности для установления механизма трансляции и динамики работы рибосомы на молекулярном уровне.

Данные полученные в результате рентгеноструктурного анализа позволили различить отдельные структурные компоненты рибосомы, которые вовлечены во взаимодействия как между собой, так и с основными участниками трансляции -трансляционными факторами и тРНК. Большой конформационной подвижностью в процессе биосинтеза обладают области контакта центрального протуберанца большой и головы малой субъединицы. Именно в этом регионе рибосомы располагаются высоко-консервативные структурные элементы - А-сайтовый палец и 5S рРНК, функциональному исследованию которых и посвящена данная работа.

1. Обзор литературы.

4. Выводы.

1. Укорочение спирали 38 23 S рРНК, приводящее к разрушению В1а " межсубъединичного мостика, замедляет рост клеток, влияет на ассоциацию субчастиц и понижает ОТРазную активность EF-G, индуцированную рибосомой или ее комплексом с деацилированной тРНК, при этом оно не летально для клеток и не вызывает изменений в принципиальных стадиях элонгационного цикла.

2. Пробинг структуры рибосом, содержащих мутацию в спирали 38 23S рРНК, показал, что В1а мостик, образованный спиралью 38 23 S рРНК, может влиять на формирование третичных контактов, соединяющих 5S рРНК со структурными компонентами пептидилтрансферазного центра и элементами, взаимодействующими с элонгационными факторами. Таким образом, локальные изменения структуры могут передаваться по цепям элементов рибосомы на 4 большие расстояния.

3. Среди 246 точечных мутаций в 5S рРНК Saccharomyces cerevisiae только 7 оказались нелетальными для клеток: А20С, C69U, A76U, A79U, U81C, A84G и C93U.

4. Структурные изменения в различных доменах 5S рРНК могут передаваться в район D-петли 5S рРНК и на центр связывания элонгационных факторов в 80S рибосомах Saccharomyces cerevisiae. т

2.3. Заключение.,

Удаление участка 872-905 консервативного структурного элемента рибосомы -спирали 38 23S рРНК нарушает В1а мостик. . Результаты тестов мутантных ДВ1а рибосом /и vivo и in viro позволяют сделать выводы о роли этого межсубъединичного мостика в рибосоме. Мутация замедляет рост клеток, влияет на ассоциацию субчастиц и понижает СТРазную активность EF-G, индуцированную рибосомой или ее; комплексом с деацилированной тРНК. При этом она не детальна для клеток, не вызывает изменений в принципиальных стадиях элонгационного цикла, а также не влияет на способность деацилированной тРНК, связанной в Р-участке, стимулировать ОТРазную активность EF-G. Похожие случаи были описаны в литературе. Так, замещение консервативного G2655 на А не приводило к функциональным дефектам [91, 93]. Замещение консервативного С2475 на G [238] и мутация C2254U [239] не имели фенотипа, несмотря на то, что С2475 образует консервативную неканоническую обращенную Уотсон-Криковскую пару с основанием нуклеотида G2529 спирали 91 23S рРНК [26], а нуклеотид С2254 защищается тРНК, связанной в А участке [97].

Пробинг структуры рибосом, содержащих мутацию в спирали 38 23S рРНК подтверждает связь структурных элементов 23S рРНК и то, что локальные изменения; структуры могут передаваться по цепям элементов рибосомы на большие расстояния. Мутация ДВ1а, так же как и другие, описанные в литературе мутации [140, 216], скорее сдвигают равновесие между конформерами в рибосоме, а не полностью разрушают ее структурные элементы. Такой переход может осуществляться, например, при движении спирали 89 23S рРНК, расположенной- между пептидилтрансферазным центром, и центром связывания элонгационных факторов.

Вероятно, рибосома может использовать множественные, альтернативные пути коммуникации' между функциональными центрами и потеря, одних взаимодействий компенсируется другими. Так, по-видимому, укорочение спирали; 38 23S рРНК, разрушающее В1 а мостик, приводит к тому, что его роль начинают выполнять мостики Bib и В 1с. Интересно, что недавние эксперименты по изучению способности субъединиц- рибосомы к ассоциации показали, что среди 12 межсубъединичных мостиков, которые были классифицированы Юсуповым и коллегами [28], только В2а и В4 абсолютно необходимы для ассоциации субчастиц [240]. Все мостики В 1а группы включают в себя структурные элементы большой субъсдиницы, связанные с 5S рРНК, а именно спираль 38 23S рРНК (В1а мостик), и белок L5 (Bib, Blc мостики), который взаимодействует с S13 [28, 36]. Для того, чтобы нарушить нормальное функционирование рибосомы, по-видимому, необходимо мутировать одновременно спираль 38 вместе с L5 или 5S рРНК.

Для ЗБ рРНК в литературе были предложены различные функции; Так полагают, что она увеличивает сродство аминоацил-тРНК к рибосоме [141, 142], помогает в формировании, правильной геометрии пептидилтрансферазного центра [144], или увеличивает пептидилтраисферазную активность [137, 141, 143]. Еще до получения структуры 50S субчастицы с высоким разрешением [26], возникла гипотеза о том, что 5S рРНК может связывать функциональные центры рибосомы и передавать между ними конформационный сигнал [145] и, в частности, соединять пептидилтрансферазный центр и центр, ассоциированный: с ОТРазной активностью. Методом мутагенеза и химического пробинга структуры рибосом, содержащих точечную мутацию в спирали 39 в 23S рРНК, показано, что нуклеотиды D-петли 5S рРНК вовлечены в образование третичных контактов, связывающих эти функциональные центры [140].

Структурные изменения в 80S рибосоме Saccharomyces cerevisiae, которые вызывают мутации в 5S pPHK скорее можно отнести к категории слабых. Однако, вместе с результатами о летальности большинства (239 из 246) мутаций в 5S рРНК для; клетки, они четко свидетельствуют о том, что 5S рРНК является высококонсервативной и высокоструктурированной!молекулой. При этом, даже незначительные структурные изменения ; в ее доменах могут передаваться в район D-петли 5S; рРНК, который взаимодействует с карманом, образованным спиралью 42 25S рРНК, поддерживающей центр, ассоциированный с ОТРазной активностью, спиралью 39 и 89 25S рРНК. Если идея об аллостерической связи структурных элементов рибосомы верна, то "голова" 5 S рРНК может влиять на конформацию "нижней" части молекулы. Таким образом, структурные изменения в области центрального протуберанца большой субъединицы, например, во время относительного поворота субчастиц при транслокации [135, 184] или; при переходе малой субъединицы из "открытого" состояния в "закрытое" при декодировании [112. 136], могут передаваться с "головы" 5S рРНК на D-петлю молекулы, а через нее на другие структурные элементы» рибосомы. Такое предположение подтверждается данными, полученными в этой работе, что мутации в различных доменах 5S рРНК могут потенциально влиять на третичные контакты между спиралями 25S рРНК в 80S рибосоме Saccharomyces cerevisiae, которые связывают структурные элементы пептидилтрансферазного центра и центра связывания элонгационных факторов.

3. Материалы и методы.

3.1. Исследование спирали 38 23S рРНК E.coli. 3.1.1. Выделение 70S рибосом E.coli несущих мутацию ДВ1а.

Выделение ДВ 1а мутантных рибосом проводили из штамма AVS69009 E.coli, в котором все семь рибосомных оперонов (ггп\) удалены из хромосомы, а гены 16S, 23S, и 5S рРНК представлены в опероне ггпС на плазмиде pHK-rrnC+ [241]. После замещения, [140] данной плазмиды на плазмиду plkl 192U, несущей мутацию в спирали 38, был получен штамм, продуцирующий только мугантные рибосомы.

Рибосомы выделялись с использованием: модифицированной методики: реассоциации: субчастиц [242]. 500 мл среды LB инокулировали свежей ночной культурой клеток и инкубировали при 37°С и перемешивании 160-170 грт до Л600 ~ 0,4-0,5. Клетки охлаждали на льду в течение 30 минут (все дальнейшие манипуляции• проводили при +4°С) и собирали центрифугированием при 7000 об/мин: 10 минут: при* 4°G в роторе: GSA. Осадок ресуспендировали в охлажденном буфере для диссоциации H20M1N200S4 (20мМ Hepes-KOH рН 7,5; 1 мМ MgOAc2; 200 мМ NH4C1;.4 мМ Р-меркаптоэтанол), снова осаждали, буфер декантировали и осадок хранили при; необходимости при -20°С.

Полученные осадки дальше ресуспендировали в 3-4 мл буфере для диссоциации H20M1N200S4 и разрушали клетки ультразвуком5 8-10 раз по 15 сек во льду, интенсивность около 5-6, с промежутками по 45 секунд во льду, контролировали лизат по вязкости, прозрачности и температуре.

От клеточного дебриса избавлялись центрифугированием в роторе SS34 при ? 15000 об/мин на. протяжении 30 мин в препаративной центрифуге Sorvall. Из полученного супернатанта отбирали объем, в котором содержалось 180 ОЕгбОпш и наносили на градиент сахарозы 10-40%. Центрифугирование в сахарозном; градиенте проводили на: ультрацентрифуге Beckman L7-55 в роторе SW28! в течение 18 ч при 22000 ■ об/мин. Субъединицы собирали в одну общую фракцию, не разделяя по субчастицам, доводили до нужного объема буфером для диссоциации, доводили концентрацию ионов магния до 15-17 мМ и осаждали центрифугированием; при 43000 об/мин? в роторе Ti-60 в течение 22 часов.

После осаждения растворяли субъединицы в 700; мкл буфера для ассоциации H2oM2oN3oS4= (20мМ Hepes-KOH рН 7.5; 20 мМ MgOAc2; 30 мМ NH4C1; 4 мМ [)-меркаптоэтанол) и центрифугировали в настольной центрифуге в 1,5 мл пробирках Eppendorf при 7000 об/мин 10 минут. После чего проводили реассоциацию рибосомных субъедишш, проинкубировав субъсдиницы 15 мин при 42°С. 70S частицы отделяли от 30S и 50S субъединиц путем центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы 10-40% в роторе SW28 в течение 18 ч при 22000 об/мин. Из сахарозы рибосомы осаждали центрифугированием при 43000 об/мин в роторе Ti-60 в течение 22 часов. Осадки растворяли в буфере для ассоциации H20M20N30S4. Концентрацию полученных рибосом оценивали спектрофотометрически:ТО.Е.260=24 пмоль 70S Е. coli/sm [243].

3.1.2. Определение зависимости степени ассоциации рибосомных субчастиц; от, концентрации Mg2+.

Степень ассоциации рибосомных субчастиц рассчитывали по результатам центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы 10-40% (vv/v) в буфере H20M4N30S4 (20мМ Hcpes-KOH рН 7,5; х мМ MgOAc2; 30 мМ NH4C1; 4 мМ р-меркаптоэтанол), с различной концентрацией Mg2+ (5, 14, 21 мМ).

100 мкл 0.4 мкМ раствора рибосом в буфере H20MXN30S4 инкубировали в течение 10 мин при: 37°С и наносили на градиент концентрации сахарозы 10-40%, который предварительно охлаждали до 4°С. Центрифугирование проводили в течение 18 часов; при 22000 об/мин и 4°С в роторе SW28 (Beckman).

3.1.3. Эффективность polyU зависимого синтеза polyPhe.

Эффективность polyU зависимого синтеза polyPhe проводили согласно методике, описанной в [210].

Трансляцию проводили в два этапа. На первом этапе проводили связывание N-ацетил-фенилаланил-тРНКРЬе. Для чего 5 пмоль рибосом, 7,5 пмоль N-ацетил-фенилаланил-тРНКРЬе, 50 мкг полиуридиловой кислоты (polyU) в буфере, содержащем 10 мМ Hepes-KOH, рН 7,6; 6 мМ Mg(CH3COO):;150 mM NH4C1; 0,6 мМ спермина; 0,4 мМ спермидина; 4 мМ Р-меркаптоэтанола инкубировали 10 мин. при 37°С после чего увеличивали объем:реакционной смеси с 25 мкл до 50 мкл, оставив: концентрации; ионов неизменными, и инкубировали 25 мин. при 37°С.

На втором этапе к исходной смеси для связывания добавляли 150 мкл смеси, включавшей 25000 пмоль фенилаланина (Phe) с удельной активностью [I4C]Phe 50 cpm/пмоль. 3 мкг пируваткиназы, 30 мкл S100 экстракта, а также 30 мкл буфера. содержащего 40 мМ Hepes-KOH, рН 7,6; 750 мМ NH4CI: 16 мМ Р-меркаптоэтанола; 3 мМ спермина; 2 мМ спермидина; 10 мМ АТР; Т мМ GTP; 50 мМ фосфоенолпирувата.

Для определения уровня ошибочного включения' лейцина в реакционную смесь добавляли также 250 пмоль лейцина (Leu) с удельной активностью [3H]Leu 10000 cpm/пмоль и стрептомицин до конечной концентрации 5 мкМ, Конечная концентрация: солей на втором этапе трансляции была та же, что и при связывании, только количество

76 ионов Mg2f было уменьшено до 3 мМ. Синтез проводили при 37°С на протяжении 5 мин, после чего реакцию останавливали добавлением 1 мл раствора, содержащего 10% ТХУ и по 0,5% (w/v) фенилаланина и лейцина. Смеси инкубировали 10 мин при 100°С, после чего фильтровали на стеклянных фильтрах (Schleicher-Schull), промывали десятикратным объемом раствора ТХУ/аминокислоты и десятикратным объемом изопропанола. Отрицательные контроли, без polyU или без рибосом, обрабатывали аналогично.

Подсушенные на воздухе в течение часа фильтры интенсивно встряхивали в сцинтилляторе OCS (Amersham) и радиоактивность обсчитывали на счетчике.

З.Г.4: Тестирование способности* мутантных рибосом ДВ1а осуществлять базовые стадии процесса трансляции in vitro:

3.1.4.1. Получение MFK-mPHK.

Для? получения MFK-mPHK был использован ПЦР-продукт, полученный при амплификации участка плазмиды рЕТЗЗВ+, несущей последовательность MFK-mPHK с клонированным с З'-конца гена промотором РНК-полимеразы бактериофага Т7.

Реакцию транскрипции проводили в течение ночи при 37°С в объеме 300 мкл.

Реакционная смесь содержала 40 мМ Tris-HCl, рН 8,0; 6 мМ MgCb; 10 мМ ДТТ; 2 мМ спермидина, по 1 мМ каждого из рибонуклеозидтрифосфатов, 3 мМ ДТТ, 0,1 мг/мл

BSA (New England Biolabs), 0,01 ед./мкл пирофосфатазы, от 1 до 5 мкг ПЦР-продукта,

0,5 ед./мкл ингибитора РНКаз RNasin (Promega) и 1,7 ед./мкл Т7-РНК-полимеразы (New

England Biolabs).

Продукт транскрипции очищали электрофорезом в 8% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в присутствии 7М" мочевины, проводили фенол-хлороформную экстракцию смесью фенол:хлороформ:изоамиловый спирт 125:24:1 рН. 4,5 (Ambion) и дважды осаждали этанолом. Концентрацию конечного препарата оценивали спектрофотометрически, измеряя поглощение аликвоты при 260 нм.

На 5'-коиец ДНК праймера, комплементарного З'-концевой области MFK-mPHK вводили радиоактивный фосфат Р при помощи реакции кинирования. Реакцию^ проводили в буфере , содержащем 50 мМ Tris-HCl рН 8,2; 10 мМ MgCb; 0,1 мМ EDTA; 5 мМ DTT, 0,1 мМ спермидина, 500 пмоль праймера, 20 ед. Т4-полинуклеотидкиназы (Roche, 10 ед./мкл) и 56 пмоль [у- Р]АТР (Amersham Biosciences Part of GE Healthcare удельная активность 220 ТБк/ммоль или 6000 Ки/ммоль). Кинирование проводили при 37°С в течение 30 мин. после чего киназу инактивировали. нагреванием в течение 15 минут при 65 °С.

Далее производили отжиг полученного радиоактивного праймера на З'-конец MFK-mPHK для чего нагревали эквимолярные количества праймера и MFK-mPHK в буфере H;oM6Ni?oS4Spo.o5Spm2 (20мМ Hepes-KOH рН 7,5; 6 мМ MgOAc2; 150 мМ NH4CI; 4 мМ р-меркаптоэтанол; 0,05 мМ спермин; 2 мМ спермидин ) до 75°С с последующим охлаждением до 37°С. Полученную MFK-mPHK с отожженным праймером использовали в последующих экспериментах.

3.1.4.2. Формирование комплексов.

Все реакции проводили в буфере H2oM6Ni5oS4Spo,o5Spm2. На первой стадии, формировали инициаторный комплекс, содержащий fMet-TPHKfMet в Р-участке. Реакцию проводили в 10 мкл. Концентрация 70S рибосом была 0, Г мкМ, MFK-mPHK -0,1 мкМ, fMet-TPHKfMct - 0,1 мкМ, IF-2 - 0,3 мкМ, IF-3 0,3 мкМ и GTP с общей концентрацией 0,2 мМ инкубировали 10 мин при 37°С.

На втором этапе к исходной смеси прибавляли 5 мкл раствора? до конечных концентрации EF-Tu 0,2 мкМ, EF-Ts - 0,2 мкМ, Phe-TPHKphe 0,2 мкМ, и GTP с общей концентрацией 0,5 мМ. Добавляемую смесь предварительно инкубировали при 37°С в течение 1 мин. Полученный раствор инкубировали 10 мин при 37°С.

На третьем этапе в ту же смесь прибавляли 2 мкл смеси, до конечных концентраций EF-G - 0,1 мкМ и GTP общей концентрацией; 0,5 мМ, инкубировали в течение 10 мин при Ю мин при 37°С.

На четвертом этапе следующем этапе в систему прибавляли 5 мкл раствора, до конечных концентраций EF-Tu - 0.2 мкМ^ EF-Ts - 0.2 мкМ; Lys-TPHKLy5 - 0,2 мкМ и до концентрации 0,5 мМ. Полученный раствор инкубировали; 10 мин при 37°С.

3:1.4.3. Анализ комплексов:.

Эффективность отдельных стадий, элонгационного цикла бьша детектирована методом тупринтинга (от англ. toe-printing), который позволяет определять положение: рибосомы на мРНК и полноту образования комплекса [211]. Проводили 4 независимых одинаковых эксперимента каждый из которых останавливался на одном из этапов. Для; этого в систему прибавлялись все четыре дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфата до концентрации 0,4 мМ а также 0,5 мкл (10 ед.) AMV обратной транскриптазы (Roche). Обратную транскрипцию проводили; в течение 15 мин при 37°С. Затем смесь подвергали фенол-хлороформной экстракции и осаждали спиртом. Высушенные после осаждения образцы растворяли в краске, содержащей 10 мМ; EDTA, 95% [v/v] деионизованного формамида, 0,3% [w/v] бромфенолового синего, 0,3% [w/v] ксиленцианола. Анализ продуктов обратной транскрипции проводили электрофорезом в 10% полиакриламидном голе, содержащем 7М мочевину. Протекание отдельных стадий трансляции идентифицировали методом радиоавтографии.

З.П5. Тестирование ОТРазной активности EF-G, индуцированной различными рибосомными комплексами.

Для реакции использовали 0,04 мкМ рибосом, polyU и тРНКр1к. Реакцию проводили в буфере 60 мМ Hepes-KOH (рН 7,6); 6 мМ MgCl2; 80 мМ NH4C1; 8 мМ р--меркаптоэтанол при 37°С. Рибосомы, тРНК и мРНК инкубировали 10 мин при 37°С, после чего добавляли EF-G до концентраций 0,0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 мкМ и 5-10 мкКи у-32Р-гуанозинтрифосфата до конечной концентрации 0,5 мМ. Реакцию останавливали через 20 минут добавлением равного объема 20% муравьиной кислоты. ОТРазную активность оценивали, исходя из данных тонкослойной хроматографии, которую проводили как: описано в [244]. Пластины с PEl-целлюлозным покрытием промывали буфером 50 мМ КН2РО4 рН 3.5, после высыхания наносили аликвоту образца, после высыхания нижний край пластины помещали в 50 мМ КН2РО4 рН 3.5 в хроматографической ванночке. После достижения фронтом уровня 1 см выше линии нанесения-образцов подвижную фазу заменяли на 500 мМ КЫ2РО4 рН 3.5. После окончания хроматографии пластины высушивали, распределение радиоактивности детектировали с помощью Phosphorlmager (Typhoon 8600, Molecular Dynamics), интенсивности рассчитывали на программе ImageQuant 5.2 (Molecular Dynamics).

3.1.6. Химический пробинг рибосомных структуры рибосом E.coli;несущих мутацию в спирали 38 23S рРНК.

В работе использовалась классическая5 методика пробинга- рибонуклеопротеидов; реагентами, специфичными для азотистых оснований - диметилсульфатом, кетоксалем: (3-этоксибутанон-2-аль-1) и водорастворимым карбодиимидом (1-Циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимидлге?то-/7-толуолсульфонат или СМСТ) [215].

3.1.6.1. Буферы и растворы.

Для приготовления буферов деионизованную воду (сопротивление^ 18 QOm,

Millipore) инкубировали 12 часов при; постоянном перемешивании с 1/1000 объема диэтилпирокарбоната (DEPC,. Sigma), - после чего автоклавировали 1 час на жидком цикле Весь пластик для? эксперимента был или одноразовый стерильный; или: автоклавированный.

Растворы и буферы, необходимые для пробинга структуры рибосомы приведены в таблице 3.1. Для обратной транскрипции с рРНК использовали набор олигодезокенрибонуклеотидных праймеров (Таблица 3.2). Конечная концентрация раствора котированного праймера была 0.19 - 0.20 пмоль/.мкл.

1. Cech, T.R., Zaug, A.J., and Grabowski, P.J. (1981) In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor ofTetrahymena: involvement of a guanosine nucleotide in the excision of the intervening sequence. Cell 27: 487-496.

2. Hall, C.A. and Slayter, H.S. (1959) Electron microscopy of ribonucleoprotein particles from; E.coli. J.Mol. Biol. 1: 329-332.

3. Huxley, H.E. and Zubay, G. (1960) Electron microscope observations on the structure of microsomal particles from Escherichia coli. J.Mol. Biol. 2: 10-18.

4. Vasiliev, V.D. (1971) Electron microscopy study of 70S ribosomes of Escherichia coli. FEBS Lett. 14: 203-205.

5. Nonomura, Y., Blobel, G., and Sabatini, D. (1971) Structure of liver ribosomes studied by negative staining. J. Mol. Biol. 60: 303-323:

6. Vasiliev, V.D. (1974) Morphology of the ribosomal 30S subparticle according to electron: microscopy data. Л с/а 5/o/. Med. Germ. 33:119-192.

7. Lake, J. A. (1976) Ribosome structure determined by electron microscopy of Escherichia coli small subunits, large subunits and monomeric ribosomes. J. MoL Biol. 105: 131-159.

8. Vasiliev, V.D., Selivanova, O.M., and Ryazantsev, S.N. (1983) Structure of the Escherichia coli 50S ribosomal subunit J.Mol. Biol. 171: 561-569.

9. Unwin, P.N.T. (1977) Three-dimensional model of membrane bound ribosomes obtained by electron microscopy. Nature 269: 118-122.

10. Frank, J. (1989) Image analysis of single macromolecules. Electron Microsc. Rev. 2: 53-74.

11. Stark, H „ Mueller, F., Orlova, E.V., Schatz, M., Dube, P., Erdemir, Т., Zemlin, F., Brimacombe, R., and van Heel, M. (1995) The 70S Escherichia coli ribosome at 23 A resolution: fitting the ribosomal RNA. Structure 3: 815-821.

12. Berman, H.M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Bhat, T.N., Weissig, H., Shindyalov, I.N., and Bourne, H.R. (2000) The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research 28: 235-242.

13. Yonath, A.E., Mussig, J., Tesche, В., Lorenz, S., Erdmann, V.A., and Wittmann, H.G. (1980) Crystallization of the large ribosomal subunits from Bacillus stearothermophilus. Biochem. Int. 1: 428-435.

14. Trakhanov, S., Yusupov, M.M., Agalarov, S.C., Garber, M., Ryazantsev, S.N., Tischenko, S.V., and Shirokov, V.A. (1987) Crystallization of 70Sribosomes and 30Sribosomal subunits from Thermus thermophilus. FEBS Lett. 220: 319-322.

15. Юсупов, M.M., Траханов, С. Д., Барынин, В.В., Боровягин, В Л., Гарбер, М.Б., Седельникова, О.М., и др. (1987) Кристаллизация 30S рибосомных субчастиц из Т. thermophilus. Докл. Акад. Наук СССР 292: 1271 -1274.

16. Yusupov, M.M., Tischenko, S.V., Trakhanov, S.D., Ryazantsev, S.N., and Garber, M.B. (1988) A new crystalline form of 30 S ribosomal subunits from Thermus thermophilic. FEBS Letters 238: 113-115.

17. Yonath, A. and Wittmann, H.G. (1988) Approaching the molecular structure of ribosome. Biophys. Chem. 29: 17-29.

18. Garber, М/, Gongadze, G., Meshcheryakov, V., Nikonov, O., Nikulin, A., Perederina, A., Piendl, W., Serganov, A., and Tishchenko, S. (2002) Crystallization of RNA/protein complexes. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 58: 1664-1669.

19. Trakhanov, S., Yusupov, M., Shirokov, V., Garber, M., Mitschler, A., Ruff, M., Thierry, J.C., and Moras, D. (1989) Preliminary X-ray investigation of 70 S ribosome crystals from Thermus thermophilus. J. Mol. Biol. 209: 327-328.

20. Yusupov, M., Garber, M.B., Vasiliev, V.D., and Spirin, A.S. (1991) Thermus thermophilus ribosomes for crystallographic studies. Biochimie. 73: 887-897.

21. Yusupova, G., Yusupov, M., Spirin, A., Ebel, J.P., Moras, D:, Ehresmann, C., and Ehresmann, B. (1991) Formation and crystallization of Thermus thermophilus 70S ribosome/tRNA complexes. FEBS Lett. 290: 69-72.

22. Wimberly, В.Т., Brodersen, D.E., Clemons, W.M., Jr., Morgan-Warren, R.J., Carter, A.P., Vonrhein, C., Hartsch, Т., and Ramakrishnan, V. (2000) Structure of the 30S ribosomal subunit. Nature 407: 327-339.

23. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2000) The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 289: 905-920.

24. Harms, J., Schluenzen, F., Zarivach, R., Bashan, A., Gat, S., Agmon, I., Bartels, H., Franceschi, F., and Yonath, A. (2001) High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell 107: 679-688.

25. Yusupov, M.M., Yusupova, G.Z., Baucom, A., Lieberman, K., Earnest, T.N., Cate, J.H., and Noller, H.F. (2001) Crystal Structure of the Ribosome at 5.5 A Resolution. Science 292: 883896.

26. Ramakrishnan, V. and Moore, P.B. (2001) Atomic structures at last: the ribosome in 2000. Curr. Opin. Struct. Biol. 11: 144-154.

27. Ban, N., Freeborn, В., Nissen, P., Penczek, P., Grassucci, R:A., Sweet, R., Frank, J., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (1998) A 9 A resolution X-ray crystallographic map of the large ribosomal subunit Cell 93: 1105-1115.

28. Gabashvili, I.S., Agrawal, R.K., Spahn, C.M., Grassucci, R:A., Svergun, D.I., Frank, J., and Penczek, P. (2000) Solution structure ofthe E. coli 70S ribosome at 11.5 A resolution. Cell 100: 537-549.

29. Lata, K.R., Agrawal, R.K., Penczek, P., Grassucci, R:, Zhu, J., and Frank, J. (1996) Three-dimensional reconstruction of the Escherichia coli 30 S ribosomal subunit in ice. J. Mol. Biol. 262:43-52.

30. Cate, J.H., Yusupov, M.M., Yusupova, G.Z., Earnest, T.N., and Noller, H.F. (1999) X-ray crystal structures of 70S ribosome functional complexes. Science 285: 2095-2104.

31. Svergun, D.I., Koch, M.H., Pedersen, J.S., and Serdyuk, l.N. (1994) Structural model of the 50 S subunit of Escherichia coli ribosomes from solution scattering. II. Neutron scattering study. J. Mol. Biol. 240: 78-86.

32. Nakagawa, A., Nakashima, Т., Taniguchi, M., Hosaka, H., Kimura, M., and Tanaka, I. (1999) The three-dimensional structure of the RNA-binding domain of ribosomal protein L2; a protein at the peptidyl transferase center of the ribosome. 18: 1459-1467.

33. Worbs, M;, Huber, R., and Wahl, M.C. (2000) Crystal structure of ribosomal protein L4 shows RNA-binding sites for ribosome incorporation and feedback control of the S10 operon. EMBOJ. 19:807-818.

34. Spillmann, S., Dohme, F., and Nierhaus, K.H. (1977) Assembly in vitro of the 50 S subunit from Escherichia coli ribosomes: proteins essential for the first heat-dependent conformational changq. J. Mol. Biol. 115: 513-523.

35. Bourne, H.R., Sanders, D.A., and McCormick, F. (1990) The GTPase superfamily: a conserved switch for diverse cell functions. Nature 348: 125-132.

36. Stark, H., Rodnina, M.V., Rinke-Appel, J., Brimacombe, R., Wintermeyer, W., and van Heel, M. (1997) Visualization of elongation factor Tu on the Escherichia coli ribosome. Nature 389: 403-406.

37. Moazed, D. and Noller, H.F. (1989) Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature 342: 142-148:

38. Rodnina, M.V., Pape, Т., Fricke, R., Kuhn, L., and Wintermeyer, W. (1996) Initial binding of the elongation factor Tu.GTP.aminoacyl-tRNA complex preceding codon recognition on the ribosome. J.Biol.Chem. 271: 646-652.

39. Valle, M., Sengupta, J., Swami, N.K., Grassucci, R.A., Burkhardt, N., Nierhaus, K.H., Agrawal, R.K., and Frank, J. (2002) Cryo-EM reveals an active role for aminoacyl-tRNA in the accommodation process. EMBO J. 21: 3557-3567.

40. Ramakrishnan, V, (2002) Ribosome structure and the mechanism of translation. Cell 108: 557-572.

41. Pape, Т., Wintermeyer, W., and Rodnina, M.V. (1998) Complete kinetic mechanism of elongation factor Tu-dependent binding of aminoacyl-tRNA to the A site of the E. coli ribosome. EMBO J. 17: 7490-7497.

42. Rodnina, M.V., Fricke, R., Kuhn, L., and Wintermeyer, W. (1995) Codon-dependent conformational change of elongation factor Tu preceding GTP hydrolysis on the ribosome. EMBO J. 14: 2613-2619.

43. Rodnina, M.V;, Pape, Т., Fricke, R., and Wintermeyer, W, (1995) Elongation factor Tu, a GTPase triggered by codon recognition on the ribosome: mechanism and GTP consumption. Biochem.CellBiol. 73: 1221-1227.

44. Savelsbergh, A., Katunin, V., Mohr, D., Peske, F., Rodnina, M., and Wintermeyer, W. (2003) An elongation factor G-induced ribosome rearrangement precedes tRNA-mRNA translocation. Mol. Cell 11: 1517-1523.55,56,57.58,59,60.63,64.