Синтез и основные коллоидно-химические характеристики микрокапсул рифампицина, полученных методом простой коацервации

Сардушкин, Макар Владимирович

Синтез и основные коллоидно-химические характеристики микрокапсул рифампицина, полученных методом простой коацервации тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.11 ВАК РФ

Сардушкин, Макар Владимирович АВТОР

кандидата технических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.11 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Синтез и основные коллоидно-химические характеристики микрокапсул рифампицина, полученных методом простой коацервации»

Автореферат диссертации на тему "Синтез и основные коллоидно-химические характеристики микрокапсул рифампицина, полученных методом простой коацервации"

На правах рукописи

Сардушкин Макар Владимирович

Синтез и основные коллоидно-химические характеристики микрокапсул рифампицина, полученных методом простой коацервации

02.00.11 - Коллоидная химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва - 2013

005545348

Работа выполнена на кафедре технологии химико-фармацевтических и косметических средств Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Авраменко Григорий Владимирович, заведующий кафедрой технологии химико-фармацевтических и косметических средств Российского химико-технологического университета имени Д.И. Менделеева

Официальные оппоненты: доктор технических наук, профессор Крупин Станислав Васильевич

профессор кафедры физической и коллоидной химии, Казанского национального исследовательского технологического университета

кандидат технических наук Марченко Ольга Николаевна ассистент отдела клинических исследований ООО «Синерджи»

Ведущая организация: Белгородский государственный

технологический университет им. В.Г. Шухова

Защита состоится 24 декабря 2013 г. в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д212.204.11 в РХТУ им. Д.И.Менделеева (125047, г. Москва, Миусская пл., д. 9) в кабинете гуманитарных знаний (ауд. 431).

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан «22» ноября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.204.11

Мурашова Н.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В фармацевтической промышленности микрокапсулирование биологически активных веществ используется с целью повышения эффективности действия и снижения токсичности лекарственных средств. Проблема снижения токсических эффектов наиболее актуальная в случае применения антибактериальных препаратов, используемых в лечении заболеваний, требующих длительного курса химиотерапии. Одним из примеров длительной терапии, достигающей года и более, является лечение инфекционных заболеваний легких, в частности туберкулеза.

Среди немногочисленных препаратов первого ряда химиотерапии туберкулеза широкое распространение получил полусинтетический антибиотик рифамицинового ряда— рифампицин. Он высокоактивен в отношении Mycobacterium tuberculosis, подавляет ДНК-зависимую РНК-полимеразу микроорганизмов. В настоящее время рифампицин применяется перорально или парентерально, но обладает выраженной гепатотоксичностью.

Снижение длительного системного воздействия и доставка антибактериального агента непосредственно в орган-мишень - легкие, могут быть достигнуты при ингаляционном методе введения микрокапсулированных форм рифампицина, обладающих рядом специфических свойств, одним из которых является контролируемый и селективный массоперенос антибиотика через оболочку капсулы, обеспечивающий его пролонгированное действие.

Цель работы— разработка метода получения микрокапсул рифампицина, пригодных для ингаляционного применения и определение их коллоидно-химических характеристик.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- подобрать эффективные стабилизаторы (ПАВ и полимер) для получения устойчивых прямых эмульсий рифампицина и пленкообразователя;

подобрать полимер-пленкообразователь, который способен обеспечить эффективное высвобождение активной субстанции;

- разработать методику капсулирования рифампицина и выделения полученных микрокапсул;

- установить основные коллоидно-химические характеристики микрокапсул рифампицина: распределение частиц по размерам, степень полидисперсности, и степень включения основного вещества;

- исследовать кинетику высвобождения рифампицина из микрокапсул;

- провести микробиологические испытания микрокапсул рифампицина.

Научная новизна. Подобран смешанный стабилизатор АОТ/ПВС, позволяющий получать устойчивые прямые эмульсии рифампицина и пленкообразователя в хлороформе. Определены реологические характеристики поверхностных слоев полимера-стабилизатора. Разработана методика микрокапсулирования рифампицина методом простой коацервации с использованием смешанного стабилизатора АОТ/ПВС, позволяющего получать микрокапсулы со степенью включения активного компонента 23 %. Установлены основные характеристики микрокапсул - распределение частиц по размерам, степень полидисперсности, величина ^-потенциала, степень включения основного вещества, а также остаточное количество легколетучего растворителя (хлороформа) в капсулах. Исследована кинетика высвобождения рифампицина из полученных микрокапсул.

Практическая значимость. Разработана методика микрокапсулирования рифампицина методом простой коацервации, позволяющая получать микрокапсулы рифампицина с размером 0,9 мкм, что соответствует требованиям, предъявляемым к препаратам для ингаляционного применения. Показано, что микрокапсулы рифампицина обеспечивают пролонгированное высвобождение активного компонента в течение 20-25 суток и проявляют более эффективную пролонгированную противотуберкулезную активность по сравнению с незакапсулированным препаратом.

Лнчный вклад автора. На всех этапах работы автор принимал непосредственное участие в планировании и выполнении экспериментов, анализе и интерпретации результатов, формулировании выводов.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на I Научно-практической конференции «Технология и анализ косметических средств и фармацевтических препаратов» (Москва, 2011), научно-практической конференции «Новые химико-фармацевтические технологии» (Москва, 2012), III Всероссийской молодежной конференции с элементами научной школы «Функциональные наноматериалы и высокочистые вещества» (Москва, 2012), Пятой Всероссийской

конференции (с международным участием) «Химия поверхности и нанотехнология (Санкт-Петербург - Хилово, 2012).

Публикации. По теме работы опубликовано 3 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, а также 4 тезиса докладов на научно-технических конференциях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 57 рисунков и 15 таблиц. Список литературы представлен из 103 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе представлен аналитический обзор литературных данных. Описаны основные принципы антибактериальной терапии инфекционных заболеваний легких, роль рифампицина (РФП), как препарата I ряда в противотуберкулезной терапии. Рассмотрены основные методы микрокапсулирования, изложена суть метода простой коацервации. Рассмотрены основные критерии выбора компонентов (пленкообразователей и стабилизаторов) для микрокапсулирования РФП. Описаны основные механизмы высвобождения РФП из микрокапсул, изложена суть некоторых методов исследования эффективности микрокапсулирования и кинетики высвобождения инкапсулированного вещества. Показаны преимущества микрокапсулированных ингаляционных форм лекарственных веществ по сравнению с другими лекарственными формами, а также рассмотрены требования, предъявляемые к препаратам для ингаляционного применения.

Во второй главе приведены характеристики исходных веществ и материалов, а также методики определения физико-химических и коллоидно-химических свойств исследуемых систем. Молекулярную массу высокомолекулярных соединений определяли методом капиллярной вискозиметрии. Межфазное натяжение на границе жидкость-жидкость определяли методом объема-веса капли. Электрофоретическая подвижность частиц определялась методом макроэлектрофореза. Измерение реологических характеристик межфазного слоя проводили с помощью ротационного поверхностного реометра «Physica MCR-301». Определение концентрации РФП в

растворах осуществлялось спектрофотометрическим методом при помощи спектрофотометра «UNICO 1201» на аналитической длине волны 475 нм.

Размеры капель эмульсий и размеры микрокапсул измеряли методом динамического рассеяния света с использованием прибора «ANALYSETTE 22 NanoTec», а также при помощи оптической и электронной микроскопии. Оценка остаточного содержания органического растворителя в микрокапсулированных формах РФП проводилась на газовом хроматографе «JIXM-80». Изучение противотуберкулезной активности образцов микрокапсул проводилась в условиях in vitro методом абсолютных концентраций.

В третьей главе изложены основные результаты, полученные в ходе работы.

Процесс инкапсулирования РФП включает две стадии. На первой была получена прямая эмульсия с дисперсной фазой, представленной раствором инкапсулируемого РФП и пленкообразователя в хлороформе. В качестве дисперсионной среды был использован водный раствор стабилизатора. Второй стадией являлось удаление из системы под вакуумом хлороформа с последующим выделением центрифугированием микрокапсул и их сушкой на воздухе при нормальных условиях. В качестве пленкообразователя первоначально был выбран синтетический полимер - полилактидгликолид (ПЛГА) с молекулярной массой 7200 Да и соотношением мономеров 50/50. ПЛГА нетоксичен, и продукты его биоразложения являются естественными метаболитами живых систем; в качестве стабилизатора эмульсии использовался поливиниловый спирт (ПВС) с молекулярной массой 11000 Да.

Исследование зависимости эффективности микрокапсулирования РФП от концентрации ПВС при постоянном соотношении РФП/ПЛГА, равном 1/10, (рисунок 1), показало, что с повышением концентрации ПВС эффективность микрокапсулирования снижается. Стабильные результаты инкапсулирования РФП были получены в области концентраций ПВС от 0,8 до 1,4 мг/мл. В дальнейших исследованиях использовался ПВС с концентрацией 1 мг/мл. Изменение величины рН дисперсионной среды в диапазоне 3-11 существенно не влияло на эффективность капсулирования. Капсулы, полученные таким способом, имели правильную сферическую форму (рисунок 2а). Среднечисленный радиус частиц гп составил 0,78 мкм, коэффициент полидисперсности системы (П) 0,78. Средний радиус полученных микрокапсул соответствовал требованиям, предъявляемым к микрокапсулам,

предназначенным для ингаляционного применения (рисунок 3). Известно, что оптимальные размеры частиц аэрозолей должны

находиться в интервале 0,5-5 мкм, из них частицы с размером до 2 мкм способны достичь поверхности альвеол (структурная единица легких). Частицы большего размера задерживаются в ингаляторе и верхних дыхательных путях, а частицы меньше 0,5 мкм, не успевая осесть за фазу вдоха, выводятся с выдохом.

Однако, при использовании ПЛГА в качестве материала оболочки абсолютные значения эффективности микрокапсулирования низки. Повышение эффективности инкапсулирования возможно при замене сополимера ПЛГА на полилактид (ПЛА), что описано в литературе. Поэтому в дальнейших исследованиях в качестве материала оболочки мы использовали ПЛА.

Важной характеристикой, влияющей как на эффективность капсулирования, так и на высвобождение инкапсулированного вещества, является прочность оболочки микрокапсул, которая, в первую очередь, зависит от компонента, находящегося на поверхности микрокапсул. Таким компонентом является ПВС. Прочность может быть охарактеризована с помощью реологических исследований (измерения межфазной вязкости).

На рисунке 4 представлены кривые эффективной вязкости межфазного слоя на границе хлороформ/водный раствор стабилизатора (ПВС). Эти результаты позволяют сделать вывод, что формирующийся межфазный слой на границе жидкость/жидкость ведет себя, как структурированная система. Прочность межфазного слоя характеризуется пределом текучести. Зависимость изменения прочности межфазного слоя водного раствора ПВС 0,1% во времени на границе с хлороформом представлена на рисунке 5.

гг

I 50

|40

|зо

I 20 £

• сг

■ е ч

• 1

\ е

\ !

4!. 1 1 1 ----

1,5 2 2.5

Спвс,мг/мп

Рис. 1. Эффективность микрокапсулирования РФП в зависимости от концентрации ПВС

а б

Рис. 2. Дисперсность капсул РФП с ПЛГА-оболочкой, стабилизированных ПВС: а — микрофотография; б — гистограмма численного распределения

бронх вторичная бронхиола

Рис. 3. Распределение вдыхаемых частиц в легких человека в зависимости от их диаметра (Tomoda К., Makino К., 2007)

Радиус частиц, мкм

2~5мкм

Размер

оседающих

частиц

Максимальный размер

-------------- в легкие

частиц-60 мкм

первичная бронхиола

терминальная бронхиола дыхательная бронхиола

глотка гортань

первичная бронхиола

трахея

2 <5 «

I 4

t г

О 60 100 150 200 25

Напряжение сдвига, мН ч1

Рис. 4. Зависимость межфазной вязкости от напряжения сдвига на границе хлороформ/водный раствор ПВС 0,1% в зависимости от времени формирования межфазного слоя

1™

i < ё

В[)СМЛ. ÍDIH

Рис. 5. Изменение прочности межфазного слоя водного раствора ПВС 0,1% на границе с хлороформом во времени

Прочность межфазного слоя нарастает во времени и достигает максимальных значений при 100-120 мин. Временная зависимость межфазной прочности для ПВС обусловлена замедленной диффузией адсорбирующихся макромолекул и медленной ориентацией их на границе раздела фаз. На основании полученных данных время упаривания хлороформа из систем было увеличено до полутора часов.

Полученные микрокапсулы РФП с оболочкой из ПЛА представляли собой сферические частицы с достаточно высокой степенью полидисперсности, но средний радиус микрочастиц не превышал допустимых значений для ингаляционного применения (рисунок 6).

Рис. 6. Дисперсность капсул РФП с ПЛА-оболочкой, стабилизированных ПВС: а — микрофотография; б — гистограмма численного распределения

Для оценки влияния содержания пленкообразователя на характеристики микрокапсул и эффективность микрокапсулирования, кроме систем с соотношением активный компонент/пленкообразователь, равном 1/10, были исследованы системы с содержанием ПЛА в 4 раза больше (соотношение 1/40). Соответствие размеров микрокапсул, допустимых для ингаляционного введения, было подтверждено методом динамического рассеяния света (рисунок 7).

Поскольку в фармацевтической промышленности на разных технологических стадиях часто используется ультразвук, была проведена оценка устойчивости частиц к такому воздействию. Под действием ультразвукового поля линейный размер капель и частиц практически не изменялся, что свидетельствует об устойчивости системы в ультразвуковом поле.

Радиус частиц, мкм

Размер частиц, мкм

Рис. 7. Дифференциальные кривые массового распределения частиц по размерам: 1,2- системы с соотношением активный компонент/пленкообразователь 1/10; 3, 4-системы с соотношением активный компонент/пленкообразователь 1/40;

1,3 — системы до удаления хлороформа; 2,4- после упаривания хлороформа

Для оценки влияния молекулярной массы полимера на эффективность микрокапсулирования были синтезированы образцы ПЛА с молекулярными массами 5200, 9100 и 30500 Да. В таблице 1 приведены сравнительные данные эффективности микрокапсулирования РФП для ПЛА с различной молекулярной массой и с разным соотношении активный компонент/пленкообразователь. Прямым методом определялось количество РФП, завлеченного в капсулы; косвенным — количество не завлеченного РФП, оставшегося в дисперсионной среде после выделения микрокапсул центрифугированием. Полученные результаты свидетельствуют, что эффективность микрокапсулирования выше в системах с соотношением активный компонент/пленкообразователь 1/40, чем в системах с меньшим содержанием ПЛА.

При увеличении молекулярной массы полилактида эффективность микрокапсулирования также существенно возрастала. Полученные результаты можно объяснить тем, что, чем больше концентрация и чем выше молекулярная масса пленкообразователя, тем больше вязкость масляной фазы и, как следствие, меньше скорость диффузии молекул РФП из масляной фазы (раствор РФП и ПЛА в хлороформе) в дисперсионную среду. Минимальная степень включения наблюдалась в системах для ПЛА с молекулярной массой 5200 Да, поэтому данный полимер в дальнейшем не использовался.

Максимальный процент включения РФП составил всего 17% в системах для ПЛА с молекулярной массой, равной 30500 Да. Дальнейшее увеличение

молекулярной массы пленкообразователя нецелесообразно, поскольку это может привести к уменьшению скорости высвобождения инкапсулируемого вещества. Учитывая возможность влияния на степень включения не только характеристик пленкообразователя, но и природу стабилизатора, для увеличения эффективности микрокапсулирования мы заменили ПВС на анионное поверхностно-активное вещество — ди-2-этилгексилсульфосукцинат натрия (АОТ), поскольку он широко используется в качестве стабилизатора прямых эмульсий медицинского и биологического назначения.

Выбор концентрации АОТ, необходимой для стабилизации, проводили на основании измерения величин межфазного натяжения на границе

хлороформ/вода, варьируя

концентрацию ПАВ. Чем ниже эта величина, тем стабильнее эмульсия. Оказалось, что в присутствии 0,1 % масс. АОТ в водной фазе межфазное натяжение снижается до минимального значения, равного ЮмНУм, что вполне достаточно для получения устойчивой эмульсии (рисунок 8). Помимо величины межфазного натяжения, агрегативная устойчивость эмульсии, стабилизированной АОТ, обеспечивается и электростатическим фактором устойчивости, т.е. формированием двойного электрического слоя (ДЭС) на поверхности капель вследствие адсорбции ПАВ. Одной из количественных характеристик ДЭС является величина ¡¡-потенциала. Чем выше величина последнего, тем устойчивее эмульсия. На рисунке 9 показана зависимость ¡¡-потенциала частиц от концентрации АОТ. Полученные данные согласуются с результатами измерения межфазного натяжения: именно при концентрации АОТ, равной 0,1 % масс., заканчивается процесс адсорбции ПАВ, и величина ¡¡-потенциала достигает максимального значения, а значение межфазного натяжения - минимального.

Таблица 1. Расчетные значения эффективности микрокапсулирования, полученные прямым и косвенным методами

Полимер Эффективность микрокапсулирования, %

Прямой метод Косвенный метод

РФП/ПЛА 1/10 РФП/ПЛА 1/40 РФП/ПЛА 1/10 РФП/ПЛА 1/40

ПЛА 30500 Да 6,0 17,0 6,5 17,3

ПЛА 9100 Да 2,7 9,8 2,9 10,1

ПЛА 5200 Да 0,9 6,9 - 7,5

а 20

ЕЕ

<3 15

-С, мВ

0.04 0,05 О.О [ЛОТ]. % масс

Рис. 8. Изотерма межфазного натяжения на границе хлороформ-вода в присутствии ЛОТ

0,2 0,4 0.6 0.8

[ЛОТ]. % масс

Рис. 9. Зависимость величины ^-потенциала микрокапсул от концентрации АОТ: 1 — ПЛА с молекулярной массой 30500 Да; 2 — ПЛА с молекулярной массой 9100 Да

При использовании ПЛА с молекулярной массой 9100 Да максимальная величина ^-потенциала составляет -(60-62) мВ и снижается до - 40 мВ для полимера с молекулярной массой 30500 Да. Несмотря на то, что размеры полученных микрокапсул позволяли использовать их для ингаляционного введения, эффективность микрокапсулирования в системах, стабилизированных АОТ, составляла не более 6% (для систем с ПЛА с молекулярной массой 30500 Да). Такая низкая эффективность не может считаться удовлетворительной, поэтому для ее повышения мы использовали смесь стабилизаторов, АОТ/ПВС, поскольку известно, что подобные смеси обладают синергетическим эффектом. Необходимое соотношение АОТ/ПВС выбирали, измеряя межфазное натяжение в системе хлороформ/вода, и параллельно контролируя степень включения РФП в капсулы. Ни большой избыток АОТ, ни большой избыток ПВС не приводил к удовлетворительным результатам. Однако, при соотношении АОТ/ПВС, равном 1/1 [0,05% (масс.) АОТ/0,05% (масс.) ПВС], эффективность капсулирования составила 23%, т.е. практически в 4 раза выше ранее установленной величины для чистого АОТ. Значение межфазного натяжения лежало в пределах 4-5 мН/м (рисунок 10), что обеспечивало высокую агрегативную устойчивость эмульсии.

На рисунке 11 представлены микрофотография микрокапсул и 2

гистограмма распределения частиц по г

размерам в присутствии смешанного Ц стабилизатора. В случае применения | системы АОТ/ПВС возрастает не о

только эффективность капсули- -в

о5

рования, но и снижается поли- 2 дисперсность капсул (рисунок 116), что более удобно для их практического применения в качестве ингаляционных форм.

\ [111 С]=Соп »г

--------

О 0,01 0,02 0.03 0,04 0,05 0,06 0,07 [ДОТ]. % масс

Рис. 10. Изотерма межфазного натяжения на границе хлороформ/вода в присутствии АОТ при постоянной концентрации ИБС (0,05% масс.)

0,45 0,75 1,05 1,35 1,65 2,15 ■аишшщвшвшш л и наин^^в^а: Радиус частиц, мкм

а б

Рис. 11. Морфология капсул рифампицина, стабилизированных системой АОТ/ПВС

(1/1): а — микрофотография; б — гистограмма численного распределения, полученная

по данным рисунка 11 а

Далее были исследованы кинетика высвобождения активного компонента из микрокапсул с оболочками из ПЛА с разной молекулярной массой, а также влияние рН среды на этот процесс.

В качестве среды высвобождения использовался физиологический раствор с рН 6,7 (рисунок 12).

Объективно, кинетика высвобождения РФП из микрокапсул с оболочкой из ПЛА с молекулярной массой 30500 Да характеризуется значительно меньшими количествами высвобожденного РФП по сравнению с микрокапсулами из ПЛА с молекулярной массой 9100 Да. На основании полученных данных для дальнейшего исследования были выбраны микрокапсулы с оболочкой из ПЛА с молекулярной массой равной 9100 Да.

Далее, варьируя значения рН, мы моделировали различные среды организма,

приближая условия

эксперимента к реальным физиологическим. Моделирование альвеолярной среды легких достигалось использованием буферных растворов, имитирующих вариант гидролиза фагоцетированной макрофагом микрочастицы: фосфатного буферного раствора с величиной рН 7,4 и цитратного с рН 4,0, что соответствует рН среды фагосомы и фаголизосомы, соответственно. Для моделирования гидролиза микрокапсулы на поверхности альвеолы (не фагоцетированной) использовался физиологический раствор. По данным, представленным на рисунке 13, видно, что значение рН раствора влияет на количество РФП, высвобождающегося из микрочастиц, что можно объяснить особенностями гидролиза ПЛА и различной растворимостью РФП в средах с различными значениями рН. Существенное снижение высвободившегося активного компонента в цитратный буферный раствор связано с понижением растворимости РФП в кислых средах.

Для оценки динамики высвобождения РФП в зависимости от времени были построены кривые суточного высвобождения РФП (рисунки 14, 15).

/ /

/ г

/ У

—1 1 —1 »

О 2 4 б 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Время, сут

Рис. 12. Кинетика высвобождения РФП (РФП/ПЛА 1/40): 1 — молекулярная масса ПЛА 9100 Да; 2 — молекулярная масса ПЛА 30500 Да

, ¡¡НЕЙЙ_...............,......................................,....................

5 10 15

Время, сут

Рис. 13. Кинетика высвобождения РФП (РФП/ПЛА

1/10, ПЛА с молекулярной массой 9100 Да): 1 — физиологический раствор (рН 6,7); 2 — фосфатный буферный раствор (рН 7,4); 3 — цитратный буферный раствор (рН 4,0)

Динамика высвобождения РФП из микрокапсул с оболочкой из ПЛА с молекулярной массой 30500 Да отличается от таковой в системах с полимером, молекулярная масса которого составляет 9100 Да. В случае ПЛА с большей молекулярной массой за 1-ые сутки наблюдается максимальное количество высвободившегося активного компонента, что связано, по-видимому, с его адсорбцией на внешней поверхности микрокапсул. Таким образом, в качестве материала оболочки микрокапсул предпочтительнее использовать ПЛА с молекулярной массой 9100 Да. В этом случае обеспечивается пролонгированное высвобождение РФП в течение 20-25 суток,

причем максимум высвобождения приходится на период 7-14 суток как в физиологический, так и в фосфатный буферный растворы. Для микрокапсул с оболочкой из ПЛА с молекулярной массой 30500 Да профиль кривых высвобождения аналогичен, но характеризуется меньшим количеством высвобождаемого РФП.

Так как в процессе синтеза микрокапсул использовался органический растворитель - хлороформ, необходимо было определить его остаточное содержание в конечном продукте. Согласно ГФ XII, хлороформ относится ко второму классу токсичности, и его допустимое предельное содержание составляет 60 ррт.

Время, сут

Рис. 14. Суточное высвобождение РФП из микрокапсул ПЛА с молекулярной массой 9100 Да: 1 — физиологический раствор (рН 6,7); 2 — фосфатный буферный раствор (рН 7,4); 3 — цитратный буферный раствор (рН 4,0)

10 15

Время, сут

Рис. 15. Суточное высвобождение РФП из микрокапсул ПЛА с молекулярной массой 30500 Да: 1 — физиологический раствор (рН 6,7); 2 — фосфатный буферный раствор (рН 7,4); 3 — нитратный буферный раствор (рН 4,0)

Определение содержания хлороформа в микрокапсулах проводилось методом газовой хроматографии.

Микрокапсулы подвергались термическому разложению в специальной ячейке и образовавшиеся газы направлялись на хроматогра-фическую колонку. В качестве стандарта использовался

раствор хлороформа в четыреххлористом углероде. Было установлено, что содержание хлороформа в микрокапсулах с оболочкой из ПЛА с молекулярной массой 9100 Да не превышает 46 ± 2 ррт, что ниже допустимого значения.

В заключительной части работы были проведены микробиологические испытания микрокапсулированной формы РФП в сравнении с субстанцией активного компонента . Изучение эффективности образцов микрокапсул проводилось в условиях in vitro методом абсолютных концентраций. В качестве микробиологического материала использовался штамм Mycobacterium tuberculosis. В результате исследования (таблица 2) наибольшую эффективность показали микрокапсулированные формы РФП по сравнению с незакапсулированной

Таблица 2. Зависимость величины КОЕ М. tuberculosis штамм H37RV от концентрации препаратов

Образец Аликвоты растворов препаратов до конечных концентраций

250 мкг/мл 50 мкг/мл 10 мкг/мл

Незакапсулиро-ванная субстанция РФП 1,6(+/-0,2)х10 9,0(+/-0,1)х102 0,7 (+/-0,1 )х 10s

Микрокапсулы РФП с ПЛА 9100 Да 1,0(+/-0,3)х10 3,3(+/-0,2)х102 0,1(+/-0,2)х105

Микрокапсулы РФП с ПЛА 30500 Да 2,0(+/-0,1)х10 5,7 (+/-0,2)х102 9,3(4-/-0,2)х104

Контроль 1,1(+/-0,2)х105 1,1(+/-0,2)х105 1,1(4-/-0,2)х105

* Испытания проводились на базе ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Оболенск

субстанцией, что связано с пролонгированным высвобождением РФП из микрокапсул в течение всего времени проведения эксперимента. Лучший результат показали микрокапсулированные формы РФП с оболочкой из ПЛА с молекулярной массой полимера 9100 Да, что подтверждает ранее установленные особенности высвобождения РФП в зависимости от молекулярной массы пленкообразователя.

Выводы

1. Разработана методика микрокапсулирования рифампицина методом простой коацервации, позволяющая получать микрокапсулы рифампицина с размером 0,9 мкм, что соответствует требованиям, предъявляемым к препаратам для ингаляционного применения.

2. Подобран стабилизатор прямых эмульсий РФП и пленкообразующего материала, представляющий собой смесь АОТ/ПВС в соотношении 1/1, который позволяет получать микрокапсулы со степенью включения РФП 23 %.

3. Установлено, что при использовании ПВС на поверхности капсул рифампицина формируются адсорбционные слои полимера, максимальная прочность которых достигается в течение 120 мин, что позволяет определить продолжительность процесса инкапсулирования.

4. Установлено, что скорость высвобождения и количество высвобождаемого РФП зависит от величины рН среды и молекулярной массы полимера оболочки. Микрокапсулы ПЛА обеспечивают пролонгированное высвобождение РФП в физиологический и в фосфатный буферный растворы в течение 20-25 суток, причем максимум высвобождения приходится на период 7-14 суток. В качестве материала оболочки микрокапсул предпочтительнее использовать ПЛА с молекулярной массой 9100 Да.

5. Установлено, что разработанная методика позволяет получать микрокапсулы РФП с остаточном содержанием хлороформа на уровне 46 ± 2 ррт, что соответствует требованиям Государственной фармакопее.

6. Установлено, что микрокапсулированные формы РФП обладают более высокой пролонгированной микробиологической активностью в отношении М. tuberculosis по сравнению с субстанцией активного компонента. Лучший результат показали микрокапсулированные формы РФП с оболочкой из ПЛА с молекулярной массой полимера 9100 Да (акт испытаний микробиологической активности прилагается).

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Сардушкин М.В., Ходькова Ю.В., Киенская К.И., Авраменко Г.В. Изучение эффективности микрокапсулирования и кинетики высвобождения рифампицина из микрокапсул с полилактидгликолидной оболочкой//Химическая технология. 2010. № 4. С. 233-238.

2. Сардушкин М.В., Киенская К.И., Авраменкто Г.В. Подбор стабилизатора и отработка основных стадий капсулирования рифампицина//Бутлеровские сообщения. 2012. Т. 32. № 11. С. 64-68.

3. Сардушкин М.В., Киенская К.И., Ильюшенко Е.В., Авраменко Г.В. Получение микрокапсул рифампицина с полилактидной оболочкой // Журнал прикладной химии. 2013. Т. 86. №5. С. 835-839.

4. Сардушкин М.В., Киенская К.И., Авраменко Г.В. Получение и свойства микрочастиц рифампицина с полилактидной оболочкой //1 Научно-практическая конференция «Технология и анализ косметических средств и фармацевтических препаратов». Москва, 2011. — С. 37.

5. Сардушкин М.В., УсковаС.А., Киенская К.И., Авраменко Г.В. Влияние стабилизатора на эффективность микрокапсулирования рифампицина // Научно-практическая конференция «Новые химико-фармацевтические технологии». Москва, 2012, —С. 225.

6. Сардушкин М.В., Киенская К.И., Авраменко Г.В. Получение микрокапсу-лированных форм рифампицина // Пятая Всероссийская конференция (с международным участием) «Химия поверхности и нанотехнология». Санкт-Петербург -Хилово, 2012, —С. 263.

7. Сардушкин М.В., Киенская К.И., Авраменко Г.В., Инкапсулирование рифампицина при помощи аэрозоля ОТ (АОТ) и поливинилового спирта//III Всероссийской молодёжной конференции с элементами научной школы «Функциональные наноматериалы и высокочистые вещества». Москва, 2012. — С. 513.

Подписано в печать:

22.11.2013

Заказ № 9196 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата технических наук, Сардушкин, Макар Владимирович, Москва

Российский химико-технологический университет имени Д.И. Менделеева

На правах рукописи

0420145231?

Сардушкин Макар Владимирович

02.00.11 - Коллоидная химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Г.В. Авраменко

Москва - 2013

Содержание

Введение...........................................................................4

1. Литературный обзор..............................................................8

1.1. Антибактериальная терапия туберкулеза....................................8

1.2. Роль рифампицина в химиотерапии туберкулеза. Ингаляционный путь введения препаратов...................................9

1.3. Микрокапсулирование биологически активных веществ................13

1.3.1. Методы микрокапсулирования.................................................13

1.3.2. Полимеры, используемые для микрокапсулирования БАВ..............17

1.4. Стабилизация макроэмульсий. Факторы стабилизации.....................22

1.5. Микрокапсулирование рифампицина..........................................27

1.5.1. Получение микрокапсул, содержащих рифампицин.

Морфология и дисперсность....................................................27

1.5.2. Эффективность микрокапсулирования и кинетика высвобождения рифампицина...................................................30

2. Объекты и методы исследования................................................34

2.1. Объекты исследования............................................................34

2.2. Методы исследования............................................................36

2.2.1. Методика синтеза полилактида................................................36

2.2.2. Методика определения молекулярной массы полимеров..................36

2.2.3. Методика капсулирования рифампицина.....................................37

2.2.4. Методика проведения спекрофотометрических исследований..........38

2.2.5. Методика определения эффективности капсулирования рифампицина........................................................................39

2.2.6. Методика изучения кинетики высвобождения

рифампицина из микрокапсул...................................................42

2.2.7. Методика измерения межфазного натяжения................................43

2.2.8. Методика определения размеров частиц......................................44

2.2.9. Методика проведения электрофоретических исследований...............45

2.2.10. Методика определения остаточного содержания органического

растворителя методом газовой хроматографии.............................46

2.2.1 ¡.Методика проведения 2Б-реологических исследований..................49

2.2.12,Методика изучения противотуберкулезной активности

микрокапсул рифампицина с полилактидной оболочкой................50

3. Результаты эксперимента и обсуждение......................................52

3.1. Получение микрокапсул рифампицина

с полилактидгликолидной (ПЛГА) оболочкой..............................53

3.2. Получение микрокапсул рифампицина

с полилактидной (ПЛА) оболочкой............................................59

3.2.1 Реологические исследования вязкости межфазного слоя

на границе хлороформ/водный раствор ПВС.................................59

3.2.2. Зависимость размеров капсул РФП от содержания ПЛА..................64

3.2.2.1. Определение размеров частиц

методом динамического светорассеяния...............................64

3.2.2.2. Определение размеров частиц с помощью

метода оптической микроскопии........................................68

3.2.3. Зависимость эффективности капсулирования рифампицина

от содержания и молекулярной массы полилактида........................72

3.2.4. Получение микрокапсул рифампицина,

стабилизированных ПАВ.........................................................74

3.2.5. Зависимость кинетики высвобождения рифампицина

от молекулярной массы, содержания полимера и рН-среды..............80

3.2.6. Определение следовых концентраций

органического растворителя в микрокапсулах..............................88

3.2.7. Изучение противотуберкулезной активности

микрокапсул рифампицина......................................................89

4. Выводы...............................................................................91

5. Список литературы................................................................92

6. Приложения........................................................................103

Введение

Актуальность работы. В фармацевтической промышленности микрокапсулирование биологически активных веществ используется с целью повышения эффективности, снижения токсичности препаратов. Проблема снижения токсических эффектов наиболее актуальна в случае применения антибактериальных препаратов, используемых в лечении заболеваний, требующих длительных курсов химиотерапии. Одним из примеров длительной терапии, достигающей года и более, является лечение инфекционных заболеваний легких, в том числе туберкулеза.

Туберкулёз (от лат. tuberculum «бугорок») — широко распространённое в мире инфекционное заболевание человека и животных, вызываемое различными видами микобактерий, как правило, Mycobacterium tuberculosis. Долгое время туберкулез считался болезнью третьего мира, однако статистика последних десятилетий отражает распространение заболевания и в благополучных странах. В соответствии с информацией ВОЗ, инфицировано около 2 миллиардов человек, треть общего населения Земли. В настоящее время туберкулезом ежегодно заболевает 9 миллионов человек во всём мире, из них 3 миллиона умирают от его осложнений. Инфекция поражает лёгкие, реже затрагивая другие органы и системы.

Среди немногочисленных препаратов первого ряда химиотерапии туберкулеза широкое распространение получил полусинтетический антибиотик рифамицинового ряда— рифампицин. Он высокоактивен в отношении Mycobacterium tuberculosis, подавляя ДНК-зависимую РНК-полимеразу микроорганизмов. В настоящее время применяется перорально или парентерально и обладает выраженной гепатотоксичностью.

Снижение длительного системного воздействия и доставика

антибактериального агента непосредственно в орган-мишень - легкие, могут

быть достигнуты при ингаляционном методе введения

микрокапсулированных форм рифампицина, обладающих рядом

специфических свойств, одним из которых является контролируемый и селективный массоперенос антибиотика через оболочку капсулы, обеспечивающий его пролонгированное действие.

Цель работы — разработка метода получения микрокапсул рифампицина, пригодных для ингаляционного применения и определение их коллоидно-химических характеристик.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- подобрать полимер-пленкообразователь, который способен обеспечить эффективное высвобождение активной субстанции;

- разработать методику капсулирования рифампицина и выделения полученных микрокапсул;

установить основные коллоидно-химические характеристики микрокапсул рифампицина: распределение частиц по размерам, степень полидисперсности, и степень включения основного вещества;

- исследовать кинетику высвобождения рифампицина из микрокапсул;

- провести микробиологические испытания микрокапсул рифампицина.

включения основного вещества, а также остаточное количество легколетучего растворителя (хлороформа) в капсулах. Исследована кинетика высвобождения рифампицина из полученных микрокапсул.

Практическая_значимость. Разработана методика

микрокапсулирования рифампицина методом простой коацервации, позволяющая получать микрокапсулы рифампицина с размером 0,9 мкм, что соответствует требованиям, предъявляемым к препаратам для ингаляционного применения. Показано, что микрокапсулы рифампицина обеспечивают пролонгированное высвобождение активного компонента в течение 20-25 суток и проявляют более эффективную пролонгированную противотуберкулезную активность по сравнению с незакапсулированным препаратом.

Личный вклад автора. На всех этапах работы автор принимал непосредственное участие в планировании и выполнении экспериментов, анализе и интерпретации результатов, формулировании выводов.

1. Литературный обзор 1.1. Антибактериальная терапия туберкулеза

Туберкулез, как заболевание, известен еще с древних времен, но и сегодня он ежегодно уносит множество человеческих жизней. Поэтому проблема лечения туберкулеза отнюдь не утратила своей актуальности. До открытия противотуберкулезных препаратов лечение больных инфекционными заболеваниями легких заключалось прежде всего в попытках повысить сопротивляемость организма пациента болезни (путем предупреждения чрезмерного физического и умственного напряжения, длительного пребывания в постели, богатой калориями и витаминами диеты). Однако эти времена позади и в настоящее время считается, что решающее значение имеет действие лекарственных препаратов на туберкулезные микобактерии. Другими словами, лечение больных туберкулезом стало исключительно антибактериальным.

Основная задача антибактериальной химиотерапии заключается в избирательном подавлении микроорганизмов без вреда для организма человека в целом. Микрокапсулированные производные антибиотиков позволяют более эффективно подойти к решению этой задачи, так как отличаются от стандартных препаратов механизмом проникновения в бактериальную клетку, могут создавать высокие локальные концентрации в результате сорбции на клетке и позволяют обеспечить пролонгированное действие препарата.

За последние годы была исследована возможность использования широкого круга синтетических полимерных материалов в качестве биодеградируемой основы для микросфер. Диапазон подобных полимеров довольно широк, но наибольший интерес вызывают алифатические полиэфиры - полилактид (PLA), полигликолид (PGA), а также сополимеры лактида и гликолида (PLGA) с различным соотношением мономеров. Эти материалы являются полностью биосовместимыми, не вызывают

воспалительных процессов в организме, и продукты их разложения выводятся с помощью регулярного обмена веществ.

Интерес к исследованию процесса микрокапсулирования туберкулостатика рифампицина, а также кинетики его высвобождения из биорезорбируемых полимерных микросфер вызван не только недостаточным количеством литературных данных по данной теме, но и обилием фармакокинетических исследований в последнее время. Знание основных принципов фармакокинетики, умение ими пользоваться на практике приобретают особое значение в случаях, когда неясны причины неэффективности лечения или плохой переносимости больным лекарственного препарата.

1.2. Роль рифампицина в химиотерапии туберкулеза.

Ингаляционный путь введения препаратов

По данным Всемирной Организации Здравоохранения, туберкулез -одно из наиболее плохо поддающихся лечению инфекционных заболеваний. Порядка трети населения планеты (то есть примерно 2 миллиарда человек) болеют туберкулезом и около 2 миллионов человек ежегодно умирают от этого заболевания. Возбудитель туберкулеза, Mycobacterium tuberculosis (МТ) проникает в легкие вместе с вдыхаемым воздухом и фагоцетируется альвеолярными макрофагами [1]. Однако, в отличие от большинства микроорганизмов, поглощенная макрофагом МТ не погибает и способна к пролиферации внутри макрофага [2]. Таким образом, фагоцитоз МТ альвеолярными макрофагами приводит к увеличению численности микобактерий. А поскольку достичь клинически эффективной концентрации противотуберкулезного агента внутри макрофагов посредством инъекционного или перорального введения лекарственных препаратов чрезвычайно сложно, лечение туберкулеза остается сложнейшей задачей, требующей длительных курсов химиотрепии.

Все противотуберкулезные препараты согласно наиболее распространенной классификации делятся на 2 группы [3]: а) препараты 1ряда (основные антибактериальные); б) препараты II ряда (резервные). Противотуберкулезные препараты I ряда (изониазид и его производные, рифампицин) высокоэффективны, являются основными при лечении туберкулеза, но при их применении довольно быстро развивается устойчивость микобактерий туберкулеза. Препараты II ряда менее активны по действию на микобактерии туберкулеза, чем изониазид и рифампицин; их основная особенность заключается в том, что они действуют на микобактерии, ставшие устойчивыми к препаратам I ряда.

Рифампицин (рисунок 1.1) является одним из наиболее эффективных антибиотиков для лечения инфекционных заболеваний легких. Это полусинтетический антибиотик, впервые синтезированный в 1965 году и обладающий высокой активностью в отношении микобактерий туберкулеза. Помимо этого, рифампицин имеет высокий коэффициент проникновения внутрь клетки, хорошо сочетается с другими противотуберкулезными препаратами, однако обладает гепатотоксичностью.

Рисунок 1.1. Структурная формула рифампицина

Основу современной химиотерапии туберкулеза составляет краткосрочная схема лечения. Рифампицин (РФП) представляет собой

ключевой компонент этой схемы. Только с появлением РФП возникла возможность завершить химиотерапию туберкулеза за 6-9 месяцев и снизить частоту неудач и рецидивов до 5%. До появления РФП противотуберкулезную химиотерапию приходилось продолжать не менее 12 месяцев, чтобы добиться таких же результатов [4]. Среди различных штаммов туберкулезных микобактерий частота выявления мутантов, резистентных к РФП, составляет 1:108. Это хороший показатель [5].

Однако до настоящего времени лечение туберкулеза ограничено методами доставки препаратов к очагу поражения. Биодоступность рифампицина при приеме внутрь составляет 90-95% [6]. Увеличение доз существенно повышает риск, поскольку антитуберкулезные препараты, как правило, применяются в дозах, близких к максимально переносимым. В последнее время, как альтернатива пероральному, рассматривается ингаляционный путь введения препарата. В случае легочного туберкулеза доставка активного компонента непосредственно в зону инфекции в виде ингаляционного аэрозоля может позволить обойти первичный метаболизм и достичь эффективных концентраций препарата в области поражения, значительно повышая таким образом эффективность лечения и уменьшая побочные эффекты [7-9]. Для того, чтобы уменьшить степень токсичности и оптимизировать режим приема препарата, представляется целесообразным создание системы в форме аэрозоля микрочастиц с контролируемым высвобождением рифампицина.

Доставка лекарственных средств непосредственно в легкие имеет

значительные преимущества перед другими методами введения. Легкие

обладают высокой проницаемостью для растворов, обширной площадью

поверхности для поглощения. Для эффективной доставки лекарственных

веществ крайне важны размеры частиц. Оптимальные размеры частиц

аэрозолей, предназначенных для взрослых и детей старшего возраста,

должны находиться в интервале 0,5-5 мкм [10, 11]. Частицы большего

размера задерживаются в ингаляторе и верхних дыхательных путях, а

частицы меньше 0,5 мкм, не успевая осесть за фазу вдоха, выводятся с выдохом [11]. Кроме того, микросферы, содержащие антитуберкулезные агенты, также могут подвергаться фагоцитозу, что позволяет достичь клинически эффективной концентрации препарата внутри макрофагов [12]. Максимально эффективно захватываются макрофагами микросферы диаметром 1-3 мкм (рисунок 1.2) [13].

Рисунок 1.2. Распределение вдыхаемых частиц в легких человека в зависимости от их диаметра

Нужно отметить и «человеческий фактор» в лечении туберкулеза. Противотуберкулезные препараты, в том числ