Инкапсулирование биологически активных веществ с использованием обратных микроэмульсий

Ильюшенко, Екатерина Вячеславовна

Инкапсулирование биологически активных веществ с использованием обратных микроэмульсий тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.11 ВАК РФ

Ильюшенко, Екатерина Вячеславовна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.11 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Инкапсулирование биологически активных веществ с использованием обратных микроэмульсий»

Автореферат диссертации на тему "Инкапсулирование биологически активных веществ с использованием обратных микроэмульсий"

На правах рукописи

Ильюшенко Екатерина Вячеславовна

Инкапсулирование биологически активных веществ с использованием обратных микроэмульсий

(02.00.11 - Коллоидная химия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 4 МАЙ 2012

Москва-2012

005044644

Работа выполнена на кафедре технологии химико-фармацевтических и косметических средств Российского химико-технологического университета имени Д. И. Менделеева

доктор химических наук, профессор Авраменко Григорий Владимирович доктор химических наук, профессор Тихонов Анатолий Петрович, профессор кафедры композиционных материалов и технологий защиты от коррозии РХТУ им. Д. И. Менделеева

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

кандидат химических наук Богданова Юлия Геннадиевна, старший научный сотрудник кафедры коллоидной химии Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова

Ведущая организация:

ФГБОУ ВПО «Московский государственный текстильный университет имени А.Н. Косыгина»

Защита состоится 4в 2012 г. на заседании

диссертационного совета Д 212.204.11 в РХГУ им. Д. И. Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., д. 9) в а/^йл^/& СО

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ им. Д. И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.204.11

Мурашова Н. М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Микрокапсулирование — это процесс заключения мелких частиц вещества (твердого, жидкого или газообразного) в оболочку из пленкообразующего материала. Первоначально микрокапсулирование биологически активных веществ осуществлялось с целью повышения их эффективности, снижения токсичности или для стабилизации, в основном — в фармацевтической промышленности и в производстве пестицидов. В настоящее время микрокапсулирование - это хорошо известная, интенсивно разрабатываемая и широко используемая в различных отраслях промышленности технология.

Разнообразные свойства микрокапсулированных систем, такие, как контролируемый и селективный массоперенос через оболочку микрокапсул, пролонгированное действие инкапсулированных веществ, возможность контролирования их реакционной способности и т. д., позволяют говорить о микрокапсулировании как о перспективной и наукоемкой технологии, представляющей основу для разработки принципиально новых материалов и препаратов.

Различные методы микрокапсулирования позволяют получить частицы различных размеров - от долей микрона до сотен микрон. Один из методов, позволяющих получить частицы в нанометровом диапазоне - микроэмульсионное инкапсулирование. Микроэмульсия - дисперсная система, содержащая капли размером до 500 им и состоящая в общем случае из трех обязательных компонентов -масла, воды и поверхностно-активного вещества (ПАВ). В отличие от эмульсий, которые могут обладать только кинетической устойчивостью, микроэмульсия представляет собой термодинамически устойчивую систему.

Большинство биологически активных веществ (БАВ) представляют собой водорастворимые соединения, поэтому для их микроэмульсионного инкапсулирования необходима отработка методик получения обратных микроэмульсий, капли которых, содержащие БАВ, впоследствии будут заключены в полимерную оболочку.

Для получения микрокапсулированных препаратов с заданными свойствами методом микроэмульсионного инкапсулирования необходимо располагать знаниями

об основных коллоидно-химических свойствах данных микроэмульсионных систем -областях существования микроэмульсий, размере их капель, величинах межфазного натяжения, а также о том влиянии, которое оказывают строение и свойства инкапсулируемого биологически активного вещества (БАВ) на свойства микроэмульсии.

Цель работы заключалась в установлении коллоидно-химических закономерностей микроэмульсионного инкапсулирования ряда биологически активных водорастворимых веществ различной природы: гвдрохлорида № бензилморфолина (ГХБ), гидрохлорида тригексифенидила (ГТГФ), инсулина; а также исследовании возможности получения нанодисперсий металлического серебра в обратных микроэмульсиях без использования токсичных реагентов. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• отработать методики получения микроэмульсий, содержащих в дисперсной фазе БАВ различного химического строения - ГХБ, ГТГФ, инсулина и частиц металлического серебра;

• установить области существования микроэмульсий и выявить факторы, влияющие на области существования микроэмульсий - природа и концентрация БАВ, температура, природа ПАВ-стабилизаторов;

• подобрать полимер-пленкообразователь, способный формировать оболочку микрокапсул, содержащих БАВ;

• выделить микрокапсулы, содержащие БАВ, определить их размер и степень включения основного вещества;

• исследовать кинетику высвобождения БАВ из полученных микрокапсул.

концентрация БАВ, концентрация ПАВ и со-ПАВ. Определены основные характеристики полученных микрокапсул - распределение частиц по размерам, величина ¡J-потенциала и скорость высвобождения БАВ из микрокапсул. Показано, что в исследованных микроэмульсиях возможно получение устойчивых нанодисперсий металлического серебра с использованием реактива Толленса без использования токсичных реагентов.

Практическая значимость. Разработанный способ микрокапсулирования позволяет получать микрокапсулы, содержащие водорастворимые БАВ, со степенью включения основного вещества не менее 50%. Такие микрокапсулы могут быть использованы как в медицине, так и в косметологии, с последующим созданием на их основе средств пролонгированного действия.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались и обсуждались на Всероссийской научной молодежной школе-конференции "Химия под знаком СИГМА: исследования, инновации, технологии" (Омск, 2010), XIII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии» (Суздаль, 2010), а также на XXV международной конференции «Ars Separatoria» (Польша, Торунь, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 4 тезиса докладов на научно-технических конференциях.

Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, списка литературы и приложений. Работа представлена на 115 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу, 44 рисунка, библиографический список включает 138 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы основная цель работы и научная новизна.

В первой главе представлен аналитический обзор литературных данных. Рассмотрены основные методы микрокапсулирования, изложена суть метода микроэмульсионного инкапсулирования. Описаны некоторые аспекты термодинамики микроэмульсионных систем. Рассмотрены основные критерии

выбора компонентов для получения микроэмульсий. Описаны основные механизмы высвобождения БАВ из микрокапсул, изложена основа некоторых методов исследования кинетики высвобождения. Показаны преимущества микрокапсулированных препаратов по сравнению с обычными лекарственными формами.

Во второй главе приведены характеристики исходных материалов и методики определения физико-химических и коллоидно-химических свойств исследуемых систем Молекулярную массу высокомолекулярных соединений определяли методом капиллярной вискозиметрии. Межфазное натяжение на границе жидкость-жидкость определяли методом объема-веса капли. Поверхностное натяжение водных растворов БАВ определяли методом максимального давления. Спектры поглощения растворов БАВ были записаны на спектрофотометре Specord UV VIS М-40 с диапазоном длин волн 186 - 900 нм. Определение концентрации БАВ в растворах спектрофотометрическим методом осуществлялось при помощи спектрофотометра СФ-16 с диапазоном длин волн 186 - 1100 нм.

Фазовые исследования проводились методом турбидиметрического титрования. Размеры капель микроэмульсий и размеры микрокапсул, полученных микроэмульсионным инкапсулированием, измеряли методом фотон-корреляционной спектроскопии на установке ФК-22. Определение размеров частиц в системе после введения в нее полимера проводилось турбидиметрическим методом. Определение размеров микрокапсул, полученных по методу упаривания легколетучего растворителя, осуществлялось при помощи оптического микроскопа Olympus ВХ51. Измерение дзета(£)-потенциала осуществляли методом макроэлектрофореза с подвижной границей.

В третьей главе изложены основные коллоидно-химические закономерности микроэмульсионного инкапсулирования гидрохлорида N-бензилморфолина.

Процесс микроэмульсионного инкапсулирования складывается из двух стадий: получения обратной микроэмульсии, содержащей в дисперсной водной фазе инкапсулируемое БАВ, и заключения капель полученной микроэмульсии в полимерную оболочку. В качестве дисперсионной среды для всех полученных в данной работе микроэмульсионных систем был использован гексан. Для

стабилизации обратных систем, содержащих в водной фазе ГХБ, был использован ди-2-этилгексилсульфосукцинат натрия (АОТ) - поверхностно-активное вещество, растворимое как в гексане, так и в воде.

Возможность микроэмульсионного инкапсулирования определяется областью существования микроэмульсии в конкретной системе. Исследование положения фазовых границ в системе Н20/А0Т/гексан (рисунок 1) показало, что микроэмульсионная область в этой системе невелика и максимальное достигнутое содержание дисперсной фазы не превышает 23% (масс.).

Рисунок 1. Фазовая диаграмма системы Рисунок 2. Фазовая диаграмма системы

НгО/АОТ/гексан при температуре 25 °С Н20 + 0,25% (масс.) ПХБ/АОТ/гексан

при температуре 25°С

Введение в водную фазу системы ГХБ в концентрации 0,05% (масс.) уже приводит к расширению микроэмульсионной области на диаграмме и увеличению максимального содержания дисперсной фазы в системе. Дальнейшее повышение концентрации ГХБ в системе ведет к дальнейшему увеличению микроэмульсионной области и позволяет достичь концентрации дисперсной фазы порядка 44% (масс.) при концентрации ГХБ в водной фазе 0,25% (масс.) (рисунок 2). По данным ФКС, размер капель дисперсной фазы составлял для всех вышеперечисленных систем от 30 до 40 нм (радиус). Полученные микроэмульсии представляли собой прозрачные голубоватые жидкости, опалесцирующие в рассеянном свете и обратимо реагирующие на изменение температуры.

Существенное расширение микроэмульсионной области в присутствии ГХБ позволило предположить, что это соединение обладает поверхностно активными свойствами. Это предположение было подтверждено данными о поверхностном натяжении водных растворов ГХБ, а также рассчитанными на их основе изотермами Гиббсовской адсорбции (рисунок 3).

е, мН-м'/молъ 0,36

Гтах, мкмоль/м* 0,8

Т 5* ни1 2,08

? 7

8 !■ 6

0,6 1 I 5

§ % 4

■§ й

0.4 2" I ,

| | 3

5 3 2-

0,02 0,03 0,04 0,05 Конц;н1рация ГХБ, моль/л

0,0 0,06

г "в" ^

Рисунок 3. Изотермы поверхностного натяжения (1) и Гиббсовской адсорбции (2) для водного раствора ГХБ (22°С).

О 0,01 0,02 0,03

Концентрация ГХБ в водной фазе, моль/л

Рисунок 4. Изотерма межфазного натяжения Н20 + ГХБ/гексан + 0,05 М АОТ

При введении ГХБ в водную фазу системы Н20/А0Т/гексан сначала происходит небольшое снижение межфазного натяжения вода-гексан (рисунок 4). Однако при дальнейшем увеличении концентрации ГХБ (более 0,5 % масс.) межфазное натяжение резко возрастает, и микроэмульсионная область сужается, а затем полностью исчезает. Поэтому для инкапсулирования ГХБ была использована микроэмульсия с содержанием ГХБ в дисперсной фазе 0,5% масс, поскольку такая концентрация обеспечивает удовлетворительное количество БАВ в системе, не приводя при этом к резкому росту межфазного натяжения (рисунок 4).

Концентрационные и температурные границы существования микроэмульсии в системе тесно связаны друг с другом. Рисунок 5 иллюстрирует взаимосвязь температурного диапазона существования микроэмульсии в системе Н20/А0Т/гексан и количественного содержания водной фазы в системе. Соотношение ПАВ и масляной фазы сохранялось постоянным и составляло 0,0065 моль АОТ/моль гексана.

С увеличением массового соотношения вода/гексан температурный интервал существования микроэмульсии не сужается, но смещается в область более низких температур. Влияние содержания ГХБ на температурный диапазон существования

микроэмульсии в системе Н20 + ГХБ/АОТ/гексан иллюстрирует рисунок 6. Содержание водной фазы во всех системах постоянно и составляет порядка 15% (масс.). Из рисунка видно, что с ростом концентрации ГХБ температурный диапазон существования микроэмульсии сужается и смещается в область более высоких температур. По-видимому, это обусловлено тем, что в присутствии хорошо растворимого ГХБ растворимость АОТ в водной фазе уменьшается.

451

40-

35-

и 30-

25-

20-

£ 15-

10-

Михроэмульсия

—т, -о-т,

Макроэиулъсия

0.11 0,12 0,13 0,14 0,15 0,16 0,17 0,18 0,19 Массовое соотношение вода/гексан

Рисунок 5. Верхняя (Ті) и нижняя (Т2) температурные границы существования микроэмульсии в системе Н20/А0Т/гексан

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Котстрация распора ГХБ, % масс.

Рисунок 6. Верхняя (Т,) и нижняя (Т2) температурные границы существования микроэмульсии в системе Н20 + ГХБ/АОТ/гексан в зависимости от концентрации ГХБ

Результаты проведенных фазовых и температурных исследований позволили перейти к разработке второй стадии микроэмульсионного инкапсулирования — формирования полимерной оболочки. В качестве материала оболочки для инкапсулирования ГХБ была использована триацетилцелюллоза (ТАЦ). Процесс осуществляли следующим образом: к обратной микроэмульсии, стабилизированной АОТ и содержащей в дисперсной фазе ГХБ, добавляли раствор ТАЦ в метиленхлориде. Дисперсионная среда микроэмульсионной системы (гексан) не является растворителем для ТАЦ, поэтому при введении в систему раствора ТАЦ происходит ухудшение качества растворителя для полимера и начинается процесс простой коацервации, завершающийся образованием микрокапсул.

Для того, чтобы оценить время, необходимое для формирования оболочки, была исследована динамика изменения размеров частиц дисперсной фазы в процессе коацервации (Таблица 1). Возникающие коацерваты локализованы вблизи границы

раздела фаз «масло-вода», по-видимому, именно этим обусловлен резкий рост размеров частиц системы через 1 час после добавления полимера. В течение последующих 72 часов размер частиц системы продолжает уменьшаться, что, по-видимому, соответствует уплотнению оболочки. По прошествии 72 часов с момента введения полимера размеры частиц практически не изменялись.

Таблица 1.

Средний радиус частиц системы Н20 + 0,5% (масс.) ГХБ/АОТ/гексан/ТАЦ в зависимости от времени, прошедшего с момента введения в систему раствора ТАЦ

Концентрация активного вещества в системе, % масс. Концентрация полимера в системе, % масс. Время, прошедшее после введения полимера Средний радиус частиц системы

0,130 0 - 33,5 нм

0,023 1 час 231,0 нм

24 часа 172,5 нм

72 часа 166,4 нм

Распределение полученных частиц по размерам представлено на рисунке 7. Наивероятнейший радиус частиц составлял 165 нм, что предполагает широкий спектр

Радиус частиц, нм Время, дни

Рисунок 7. Гистограмма распределения Рисунок 8. Кинетика высвобождения ГХБ микрокапсул по размерам из микрокапсул (рН = 1,2)

Кинетика высвобождения ГХБ из микрокапсул с оболочкой из ТАЦ была исследована в водной среде с рН = 1,2 (рисунок 8). Выбранное значение рН соответствует условиям высвобождения при пероральном введении. В течение 18 дней во внешнюю среду высвобождается около 50% от общего количества ГХБ.

Из рисунка 8 видно, что начальный (в пределах первых суток) всплеск при высвобождении отсутствует, следовательно, сколько-нибудь существенной адсорбции ГХБ на поверхности микрокапсул с оболочкой из ТАЦ не происходит.

В четвертой главе описаны некоторые коллоидно-химические принципы микроэмульсионного инкапсулирования гидрохлорида тригексифенидила (ГТГФ) -холинолитического препарата, применяемого при болезни Паркинсона, болезни Литтля, спастических параличах. Обратные микроэмульсии, содержащие в водной фазе ГТГФ, получали аналогично микроэмульсиям, содержащим ГХБ. В качестве масляной фазы был использован гексан, а в качестве ПАВ для стабилизации системы было выбрано неионогенное ПАВ под торговым названием СгосЫоя Т5А -оксиэтилированный тридецилмонофосфат (степень оксиэтилирования п = 5). Выбор ПАВ в данном случае был обусловлен невозможностью использования АОТ в системах, содержащих ГТГФ, поскольку при химическом взаимодействии ГТГФ и АОТ образуется нерастворимое соединение.

Первоначально, как и в предыдущем случае, была предпринята попытка получения трехкомпонентной микроэмульсии НгО/СпхЗайк Т5А7гексан. Однако без введения вспомогательных компонентов получить микроэмульсию при температуре 25°С не удалось. При введении в дисперсную фазу системы ГТГФ в концентрации 0,5% (масс.) в системе существует достаточно протяженная микроэмульсионная область (рисунок 9, серая заливка). Максимальное достигнутое содержание водной

о,

фазы в исследуемой системе составило порядка 50% (масс.). Средний радиус капель микроэмульсии составил 37 нм.

100,

Рисунок 9. Фазовая диаграмма системы Н20 + 0,5% ГТГФ/Сгос1ай)5Т5А/гексан при температуре 25°С

Гексан

100

Фазовое поведение систем, содержащих ГТГФ, имело некоторые особенности по сравнению с другими исследованными системами. При титровании водным раствором ГТГФ (0,5% масс.) растворов Сгос^ов Т5А в гексане с исходной концентрацией ПАВ от 0,1 до 0,25 моль/л наблюдалась заметная опалесценция,

сопровождавшаяся резким ростом вязкости системы. Вязкость всех остальных полученных в данной работе обратных микроэмульсионных систем практически не отличалась от вязкости дисперсионной среды. Область аномально высокой вязкости обозначена на диаграмме (рисунок 9) штриховкой. Электропроводность таких систем составляла порядка 2+3 мкСм/см, что соответствует низкому содержанию воды в системе и не позволяет предположить наличие в системе бинепрерывной структуры.

Возникновение микроэмульсионной области в системе H20/Crodafos Т5А/гексан при введении в водную фазу 1 11 Ф позволило предположить, что это соединение обладает поверхностно активными свойствами. Это предположение было подтверждено данными о поверхностном натяжении водных растворов ГТГФ и рассчитанной на их основе изотермой Гиббсовской адсорбции (рисунок 10).

Микроэмульсионное инкапсулирование ГТГФ было осуществлено согласно той же схеме, что и микрокапсулирование ГХБ. В качестве материала оболочки был использован поли(лактид-гликолид) с соотношением молочной и гликолевой кислот 75:25 (PLGA 75:25). Этот полимер, в отличие от ранее использованной ТАЦ, является биодеградируемым. В качестве растворителя для полимера был использован метиленхлорид. Размер полученных микросфер составил порядка 150 нм (радиус).

Кинетика высвобождения ГТГФ из микрокапсул с оболочкой из PLGA 75:25 была исследована в водной среде с рН = 7,4 (рисунок 11). В течение 18 дней во внешнюю среду высвобождается более 50% от общего количества ГТГФ. Поскольку степень включения ГТГФ в микросферы в ходе настоящей работы не определялась, за 100% принято суммарное количество БАВ, введенное в систему при инкапсулировании. Кроме того, из графика видно, что начальный (в пределах первых суток) всплеск при высвобождении отсутствует, следовательно, сколько-нибудь

\ 2ч /

мН*и /моль 4,97

Плат, мкмоль/м2 14,0

S„, нм1 1,19

/ 1

-1

12 о

10 Ё

8 ё

6 i

4 к

2 £ S

0 Z

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 Концентрация I 11 Ф, моль/л

Рисунок 10. Изотермы поверхностного натяжения (1) и Гиббсовской адсорбции (2) для водного раствора ГТГФ (22°С).

существенной адсорбции ГТГФ на поверхности микрокапсул с оболочкой из РЬОЛ 75:25 не происходит.

Важнейшей характеристикой любой дисперсной системы является величина ¿¡-потенциала частиц дисперсной фазы. Чем выше значение ¿¡-потенциала, тем более агрегативно устойчива система. Эти знания могут быть полезны при прогнозировании устойчивости суспензии микрокапсул, приготавливаемой непосредственно перед использованием. Согласно Государственной Фармакопее РФ, суспензия, предназначенная для парентерального применения, не должна расслаиваться в течение 5 минут. В таблице 2 приведены величины ¿¡-потенциала водных суспензий микрокапсул при различных величинах рН дисперсионной среды. Исследованный интервал рН соответствует физиологическим значениям.

60-,

в 40. Ё

я 30 х

Г0'

П 10-

о-

Таблица 2.

Влияние рН дисперсионной среды на ¿¡-потенциал микрокапсул

8 10 12 14 16 18 Время(Они)

рН ¿¡-потенциал, мВ

6,5 45

7,0 43

7,5 41

8,0 25-30

Рисунок 11. Кинетика высвобождения ГТГФ из микрокапсул (рН = 7,4)

Сравнительно высокие значения ¿¡-потенциала позволяют получать устойчивые дисперсии микрокапсул в интервале рН от 6,5 до 7,5, что и требуется для их использования в составе лекарственных препаратов. Резкое падение ¿¡-потенциала при переходе в щелочную область приводит к расслоению суспензии.

В пятой главе описано применение методов микроэмульсионного инкапсулирования и упаривания легколетучего растворителя для получения микросфер, содержащих инсулин.

Предварительные фазовые исследования показали, что при введении инсулина в концентрации 0,5% (масс.) в водную фазу системы НгО/АОТ/гексан и без

того небольшая микроэмульсионная область сужается еще сильнее (рисунок 12), и повышение температуры до 30°С не позволяет ее расширить (рисунок 13).

Максимальное достигнутое содержание дисперсной фазы в этой микроэмульсии составляло 24% (масс.), что соответствует содержанию инсулина в системе порядка 0,12% (масс.). Микроэмульсионное инкапсулирование инсулина в оболочку из РЬОА 75:25 было осуществлено согласно описанной ранее схеме.

50 Гексан

Рисунок 12. Фазовая диаграмма системы НгО + 0,5% (масс.) инсулина/АОТ/гексан при температуре 25°С

Рисунок 13. Фазовая диаграмма системы НгО + 0,5% (масс.) инсулина/АОТ/гексан при температуре 30°С

Поскольку метод микроэмульсионного инкапсулирования не позволили

достичь значимого содержания

Рисунок 14. Микрокапсулы инсулина, полученные методом упаривания легколетучего растворителя

инсулина, в качестве второго метода инкапсулирования был реализован один из самых распространенных в настоящее время методов получения инкапсулированных пептидов и белков - метод упаривания легколетучего растворителя. На первой стадии получали первичную эмульсию вода/масло, причем в качестве дисперсной фазы использовали водный раствор инсулина, а в качестве дисперсионной среды - раствор полимера в метиленхлориде.

Полученную первичную эмульсию вводили в водный раствор поливинилового спирта и полученную вторичную (двойную) эмульсию перемешивали в течение необходимого времени для упрочнения оболочки и полного удаления метиленхлорида из системы. Таким образом, были получены микрокапсулы из РЬвА 75:25, содержащие инсулин, средний радиус которых составил 80 мкм (рисунок 14).

В шестой главе описано применение обратных микроэмульсионных систем Н20/А0Т/гексан для синтеза наночастиц металлического серебра без использования токсичных реагентов. Для этого использовали реакцию «серебряного зеркала», в которой восстановителем для ионов Ад+ служит глюкоза. Применение данной реакции для получения дисперсий металлического серебра описано в литературе, однако данные о ее проведении именно в микроэмульсиях отсутствуют.

Оптимальный состав исходных микроэмульсий был подобран на основе результатов фазовых исследований, так как возможность восстановления металлического серебра в обратных мицеллах определяется областями существования исходных микроэмульсий. В каплях первой микроэмульсии содержался реактив Толленса (аммиачный комплекс серебра) с концентрацией 3% (масс.), в каплях второй - водный раствор глюкозы с концентрацией 1% (масс.). Для стабилизации всех систем был использован АОТ. Выбор концентраций реагентов был обусловлен необходимостью соблюдения стехиометрического соотношения в реакции «серебряного зеркала».

101

О 25 50 75 100 0

Гексан

25 50 75 100

Гексан

100

Рисунок 15. Фазовая диаграмма системы Н20 + 3%(масс.) ^(ЫН3)2]ОН/АОТ/гексан

Рисунок 16. Фазовая диаграмма системы Н20 + 1% (масс.) глюкозы/АОТ/гексан

при температуре 25°С

Выход за пределы обозначенных микроэмульсионных областей (рисунки 15 и 16) приводит либо к фазовому расслоению, либо к образованию вязкой бинепрерывной структуры. Замена гексана на парафиновое масло позволила использовать полученные дисперсии серебра в составе косметических композиций.

О том, что в каплях микроэмульсии действительно произошло восстановление ионов серебра до металла, свидетельствует спектр, представленный на рисунке 17. Максимум спектра, обусловленного поверхностным плазмонным резонансом, соответствует 433 нм, что хорошо согласуется с литературными данными.

3,5-

.....■ ■■ ■■'•', Ъ:

500 600

Длина волны, нм Рисунок 17. Спектр поглощения микроэмульсии, содержащей наночастицы серебра -100

ЧШШт

20 пш

Рисунок 18. Фотография наночастиц серебра, синтезированных в обратной микроэмульсии

заключении

50 75 100

Гексан

Рисунок 19. Сводная фазовая диаграмма для систем, содержащих в водной фазе соответственно: 1 - ГХБ, 2 - ГТГФ, 3 - инсулин, 4 - глюкозу, 5 - [Аё(ЫН3)2]ОН

приведена объединенная фазовая диаграмма (рисунок 19), на которую нанесены области существования

микроэмульсий во всех

исследованных системах. Как видно из рисунка, области существования микроэмульсий во всех системах достаточно близки, что позволит использовать полученные данные для инкапсулирования различных БАВ.

Выводы

1. Разработан способ микроэмульсионного микрокапсулирования водорастворимых биологически активных веществ различного химического строения - гидрохлорида Ы-бензилморфолина, гидрохлорида тригексифенидила, инсулина.

2. Определены области существования микроэмульсий, содержащих данные БАВ. Показано, что при температуре 25°С во всех системах содержание водной фазы в микроэмульсиях составляет не менее 22% (масс.). Установлено, что чем выше поверхностная активность БАВ, тем шире область существования микроэмульсии.

3. Установлено, что размеры микроэмульсионных капель, содержащих исследованные БАВ, лежат в интервале 30 - 40 нм (радиус). Определено распределение по размерам для микрокапсул, содержащих гидрохлорид И-бензилморфолина.

4. На базе полученных микроэмульсий, с использованием полимеров -пленкообразователей получены микрокапсулы, содержащие БАВ, размером от 90 до 170 нм, при этом степень включения основного вещества составляет не ниже 50% от исходного количества. Показано, что скорость высвобождения низкомолекулярных БАВ из полученных микрокапсул позволяет обеспечить пролонгированное действие препарата (до 18 дней).

5. Определены значения ^-потенциала для водной суспензии микрокапсул, содержащих гидрохлорид тригексифенидила. Установлено, что в интервале рН 6,5-7,5 единиц ¿^-потенциал составляет 40 — 45 мВ.

6. С использованием обратных микроэмульсий получены устойчивые нанодисперсии металлического серебра, которые проявляют антибактериальную активность и могут применяться в композициях медицинского и косметического назначения.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Букарь Н. В., Краснобаева С. Ю., Ильюшенко Е. В., Авраменко Г. В., Киенская К. И. Методы микрокапсулирования N-бензилморфолина // Журнал прикладной химии. 2008. Т. 81. Вып. 2. С. 286 - 290.

2. Ильюшенко Е. В., Киенская К. И., Авраменко Г. В. Микроэмульсионное инкапсулирование гидрохлорида тригексифенидила // Химическая технология. 2010. № 3. С. 165-169

3. Киенская К. И., Сигал К. Ю., Ильюшенко Е. В., Кузовкова А. А., Яровая О. В., Назаров В. В. Синтез нанодисперсий металлического серебра с использованием реактива Толленса // Коллоидный журнал. 2011. Т. 73. № 2. С. 286-288.

4. Ильюшенко Е. В., Киенская К. И., Авраменко Г. В. Микроэмульсионное инкапсулирование БАВ // XIII Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии»: сб. науч. тр. / ГОУВПО Иван. гос. хим.-технол. ун-т. Иваново: Изд-во ИГХТУ, 2010. С. 185.

5. Ilyushenko Е., Kienskaya К., Avramenko G., Rogacheva М. Phase equilibria in multicomponet systems in the process of microemulsion microencapsulation // Proceedings of the XXVth International symposium on physico-chemical methods of separation "Ars Separatoria 2010" / Nicolaus Copernicus University. Torun: Wydawnictwo Naukowe Uniwersytetu Mikolaja Kopemika, 2010. P. 63 - 66.

6. Ильюшенко E.B., Киенская К.И., Авраменко Г.В., Арустамян Г.А. Микроэмульсионное инкапсулирование инсулина // Всероссийская научная молодежная школа-конференция "Химия под знаком СИГМА: исследования, инновации, технологии": сб. науч. тр. / Российская академия наук, Сибирское отделение. Омск: Изд-во ОмГУ, 2010. С. 300 - 301.

7. Киенская К. И., Сигал К. Ю., Ильюшенко Е. В., Кузовкова А. А., О. В. Яровая, Назаров В. В. Синтез нанодисперсий металлического серебра с использованием реактива Толленса // Химическая технология. 2011. № 9. С. 526 - 532.

8. Sigal К., Kienskaya К., Ilyushenko Е., Kuzovkova A., Nazarov V. Optimization of the silver nanoparticles synthesis in reverse micelles via phase equilibria // Proceedings of the XXVth International symposium on physico-chemical methods of separation "Ars Separatoria 2010" / Nicolaus Copernicus University. Toruñ: Wydawnictwo Naukowe Uniwersytetu Mikolaja Kopernika, 2010. P. 99 - 102.

Подписано в печать:

17.05.2012

Заказ № 7378 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Ильюшенко, Екатерина Вячеславовна, Москва

Российский химико-технологический университет имени Д. И. Менделеева

На правах рукописи

61 12-2/616

Ильюшенко Екатерина Вячеславовна

Инкапсулирование биологически активных веществ с использованием обратных микроэмульсий

02.00.11 - Коллоидная химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: доктор химических наук профессор Г.В. Авраменко

Москва - 2012

Содержание

Введение..........................................................................................................................................5

1. Литературный обзор............................................................................................................9

1.1. Методы микрокапсулирования....................................................................................9

1.2. Микроэмульсионное микрокапсулирование..................................................15

1.2.1. Основы метода..........................................................................................................................15

1.2.2. Факторы, определяющие существование микроэмульсии................15

1.2.3. Подбор ПАВ и соПАВ для получения микроэмульсии........................18

1.2.4. Солюбилизация в микроэмульсиях........................................................................22

1.3. Кинетика высвобождения активного вещества из микрокапсул 29

1.3.1. Методы исследования кинетики высвобождения....................................29

1.3.2. Основные механизмы высвобождения активного вещества из микрокапсул................................................................................................................................31

1.4. Преимущества микрокапсулированных препаратов..............................35

1.5. Выводы из литературного обзора............................................................................38

2. Объекты и методы исследования..............................................................................39

2.1. Объекты исследования......................................................................................................39

2.2. Методики проведения экспериментов..................................................................41

2.2.1. Методика синтеза гидрохлорида 1М-бензилморфолина........................41

2.2.2. Методика определения температуры плавления........................................42

2.2.3. Методика приготовления обратной микроэмульсии..............................42

2.2.4. Методика микроэмульсионного инкапсулирования..............................42

2.2.5. Методика инкапсулирования упариванием легколетучего растворителя................................................................................................................................43

2.2.6. Методика определения средневязкостной молекулярной массы полимеров......................................................................................................................................44

2.2.7. Методика измерения межфазного натяжения..............................................46

2.2.8. Методика спектрофотометрических исследований................................48

2.2.9. Методика определения размеров частиц............................................................49

2.2.10. Методика фазовых исследований............................................................................51

2.2.11. Методика исследования кинетики высвобождения БАВ из

микрокапсул................................................................ 52

2.2.12 Методика определения электрофоретической подвижности

микрокапсул................................................................ 52

2.2.13. Методика синтеза наночастиц серебра в обратной

микроэмульсии............................................................. 53

3. Коллоидно-химические закономерности микроэмульсионного инкапсулирования ГХБ................................................... 54

3.1. Получение обратных микроэмульсий, содержащих ГХБ в водной фазе.................................................................. 54

3.2. Поверхностно-активные свойства ГХБ............................... 61

3.3. Микроэмульсионное инкапсулирование ГХБ........................ 65

3.4. Кинетика высвобождения ГХБ из микрокапсул.................... 69

4. Коллоидно-химические закономерности микроэмульсионного инкапсулирования ГТГФ................................................ 71

4.1. Получение обратных микроэмульсий, содержащих ГТГФ в водной фазе................................................................. 71

4.2. Поверхностно-активные свойства ГТГФ............................. 73

4.3. Микроэмульсионное инкапсулирование ГТГФ..................... 74

4.4. Кинетика высвобождения ГТГФ из микрокапсул.................. 75

5. Коллоидно-химические закономерности микроэмульсионного инкапсулирования инсулина............................................ 77

5.1. Получение обратных микроэмульсий, содержащих инсулин в водной фазе................................................................. 77

5.2. Микроэмульсионное инкапсулирование инсулина...................... 79

5.3. Инкапсулирование инсулина методом упаривания легколетучего растворителя ............................................. 81

6. Синтез наночастиц серебра в обратных микроэмульсиях......... 83

6.1. Получение обратных микроэмульсий, содержащих в водной

фазе реактив Толленса и глюкозу...................................... 83

6.2. Синтез наночастиц серебра в обратной микроэмульсии....................86

7. Заключение......................................................................................................................................90

8. Выводы..............................................................................................................................................92

9. Литература....................................................................................................................................93

10. Приложения ................................................................................................................................107

10.1. Определение молекулярной массы полимеров вискозиметрическим методом....................................................................................107

10.2. Спектрофотометрические исследования............................................................109

10.3. Концентрационные границы существования микроэмульсионных областей....................................................................................111

Введение

Актуальность работы. Микрокапсулирование - это процесс заключения мелких частиц вещества (твердого, жидкого или газообразного) в оболочку из пленкообразующего материала. Первоначально микрокапсулирование биологически активных веществ осуществлялось с целью повышения их эффективности, снижения токсичности или для стабилизации, в основном - в фармацевтической промышленности и в производстве пестицидов. В настоящее время микрокапсулирование - это хорошо известная, интенсивно разрабатываемая и широко используемая в различных отраслях промышленности технология.

Различные методы микрокапсулирования позволяют получить частицы различных размеров - от долей микрона до сотен микрон. Один из методов, позволяющих получить частицы в нанометровом диапазоне — микроэмульсионное инкапсулирование. Микроэмульсия - дисперсная система, содержащая капли размером до 500 нм и состоящая в общем случае из трех обязательных компонентов — масла, воды и поверхностно-активного вещества (ПАВ). В отличие от эмульсий, которые могут обладать только кинетической устойчивостью, микроэмульсия представляет собой термодинамически устойчивую систему.

микроэмульсий, капли которых, содержащие БАВ, впоследствии будут заключены в полимерную оболочку.

Для получения микрокапсулированных препаратов с заданными свойствами методом микроэмульсионного инкапсулирования необходимо располагать знаниями об основных коллоидно-химических свойствах даных микроэмульсионных систем - областях существования микроэмульсий, размере их капель, величинах межфазного натяжения, а также о том влиянии, которое оказывают строение и свойства инкапсулируемого биологически активного вещества (БАВ) на свойства микроэмульсии.

Цель работы заключалась в установлении коллоидно-химических закономерностей микроэмульсионного инкапсулирования ряда биологически активных водорастворимых веществ различной природы: гидрохлорида Ы-бензилморфолина (ГХБ), гидрохлорида тригексифенидила (ГТГФ), инсулина; а также исследовании возможности получения нанодисперсий металлического серебра в обратных микроэмульсиях без использования токсичных реагентов. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• отработать методики получения микроэмульсий, содержащих в дисперсной фазе БАВ различного химического строения - ГХБ, ГТГФ, инсулин и частиц металлического серебра;

• подобрать полимер-пленкообразователь, способный формировать оболочку микрокапсул, содержащих БАВ;

• выделить микрокапсулы, содержащие БАВ, определить их размер и степень включения основного вещества;

• исследовать кинетику высвобождения БАВ из полученных микрокапсул.

Научная новизна. На основании установленных коллоидно-химических закономерностей для ряда водорастворимых биологически активных веществ - ГХБ, ГТГФ и инсулина - с использованием обратных микроэмульсий впервые получены микрокапсулированные системы. Определены области существования микроэмульсий, содержащих указанные БАВ. Установлена взаимосвязь области существования микроэмульсий и поверхностной активности ГХБ и ГТГФ. Выявлены факторы, влияющие на область существования микроэмульсий - температура, концентрация БАВ, концентрация ПАВ и со-ПАВ. Определены основные характеристики полученных микрокапсул - распределение частиц по размерам, величина ^-потенциала и скорость высвобождения БАВ из микрокапсул. Показано, что в исследованных микроэмульсиях возможно получение устойчивых нанодисперсий металлического серебра с использованием реактива Толленса без использования токсичных реагентов.

Практическая_значимость. Разработанный способ

микрокапсулирования позволяет получать микрокапсулы, содержащие водорастворимые БАВ, со степенью включения основного вещества не менее 50%. Такие микрокапсулы могут быть использованы как в медицине, так и в косметологии, с последующим созданием на их основе средств пролонгированного действия.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения, списка литературы и приложений. Работа представлена на 115 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу, 44 рисунка, библиографический список включает 138 наименований.

1. Литературный обзор 1.1. Методы микрокапсулирования

Все существующие в настоящее время методы микрокапсулирования могут быть разделены, хотя и достаточно условно, на три основные группы (по природе процессов, протекающих при микрокапсулировании): это физические, физико-химические и химические методы.

В основе физических методов лежит механическое получение оболочки микрочастиц; к этой группе методов могут быть отнесены экструзия, напыление в псевдоожиженном слое, конденсация паров [1]. Эти методы достаточно технологичны и высокопроизводительны; однако они применимы в основном для получения относительно крупных частиц (размером 100 мкм и более). Основные методы этой группы -микрокапсулирование в псевдоожиженном слое и микрокапсулирование экструзией. Принцип метода микрокапсулирования в псевдоожиженном слое [2] заключается в создании витающего слоя частиц капсулируемого вещества (что достигается в цилиндрическом аппарате путем подачи нагретого газа через нижнюю часть аппарата) и орошении его раствором пленкообразующего вещества в легколетучем растворителе. Скорость газа, подаваемого под слой капсулируемого вещества, должна быть достаточной для поддержания турбулентного режима, что, в свою очередь, обеспечивает равномерность нанесения покрытия. Метод микрокапсулирования экструзией [3] заключается в формировании тонкой вязкой пленки из материала оболочки на поверхности инкапсулируемого вещества при продавливании смеси сквозь отверстия малого диаметра.

К преимуществам физических методов относятся высокая производительность и однородность получаемого продукта. Методы этой группы были разработаны одними из первых, еще в 60-е гг. XX века [4, 5] и до настоящего времени находят применение [6-9]. Однако эти технологии практически неприменимы для получения микрокапсул, содержащих жидкие вещества, а также микросфер размером менее 100 мкм.

Физико-химические и химические методы в принципе близки между собой, однако есть и принципиальное отличие: химические методы предусматривают образование полимера непосредственно на поверхности инкапсулируемых частиц за счет реакции полимеризации или поликонденсации; при использовании физико-химических методов в системе происходит фазоразделение с образованием фазы, обогащенной полимером, который осаждается на поверхности частиц.

Методы, основанные на получении оболочек микрокапсул из мономеров, подразделяются на поликонденсационные [10-12] и полимеризационные [13 - 17]. Для осуществления микрокапсулирования полимеризацией необходимо, чтобы мономер содержался в виде раствора в одной или обеих жидких фазах. Для инициирования полимеризации в систему вводят катализатор или инициатор полимеризации, а также другие добавки, позволяющие понизить температуру процесса. Иногда для инициирования полимеризации фазу, содержащую растворенный мономер и катализатор, перед эмульгированием нагревают. После этого, также при повышенной температуре, проводят эмульгирование и перемешивают реакционную массу в течение нескольких часов для обеспечения полноты протекания полимеризации и упрочнения оболочки. Поликонденсацией обычно получают оболочки из полиуретанов, полиамидов, полиэфиров, эпоксидных смол или полисилоксанов. Наиболее удобный метод заключается в том, что сначала получают эмульсию, содержащую в диспергированной фазе только один из конденсирующихся мономеров, а затем в дисперсионную среду вводят второй мономер.

Размеры частиц, получаемых химическими методами, могут варьироваться от десятков и сотен микрометров до сотен нанометров. Например, при помощи межфазной полимеризации можно получить микросферы с оболочкой из поли(алкилцианоакрилатов) размером от 100 до 500 нм [18 - 20].

К преимуществам методов, основанных на реакциях поликонденсации, относятся сравнительно мягкие условия процесса, высокая степень регулируемости, возможность применения для капсулирования как масло-, так и водорастворимых веществ. Общими недостатками химических методов являются возможность химической реакции между мономером и капсулируемым веществом, а также вероятность того, что в системе может остаться непрореагировавший мономер, который необходимо удалять.

На практике часто используется сочетание различных методов микрокапсулирования. Выбор метода определяется множеством различных факторов, но главным образом - свойствами капсулируемого вещества и требуемыми свойствами конечного продукта. Для инкапсулирования БАВ химические и физические методы практически непригодны. В случае физических методов предполагается либо механическое воздействие на частицы инкапсулированного вещества (что, например, затрудняет инкапсулирование растворов), либо воздействие высоких температур (в то время как многие БАВ могут при повышенной температуре разрушаться или вступать в различные химические реакции). В случае же применения химических методов, когда образование полимерного материала оболочки происходит непосредственно в ходе инкапсулирования, сохраняется вероятность того, что в системе останется некоторое количество мономера. Как правило, этот мономер токсичен, и его присутствие в конечном продукте даже в следовых количествах недопустимо, в особенности при производстве лекарственных средств. Поэтому при инкапсулировании БАВ, как правило, используют физико-химические методы микрокапсулирования. В настоящее время это наиболее распространенные и достаточно хорошо исследованные методы.

К физико-химическим методам относятся методы, в основе которых лежит процесс коацервации - осаждение вследствие ухудшения качества растворителя, образование новой фазы при изменении температуры, упаривание легколетучего растворителя, высушивание распылением и др.

Эти методы, как правило, являются легко контролируемыми и дают возможность получения конечного продукта с любыми заданными свойствами.

Явление коацервации (от латинского "асегуш" - скопление, объединение), заключается в возникновении в ра�