Создание устойчивых макромолекулярных покрытий на магнитных наночастицах для применения в биологии и медицине

Бычкова, Анна Владимировна

Создание устойчивых макромолекулярных покрытий на магнитных наночастицах для применения в биологии и медицине тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Бычкова, Анна Владимировна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.04 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Создание устойчивых макромолекулярных покрытий на магнитных наночастицах для применения в биологии и медицине»

Автореферат диссертации на тему "Создание устойчивых макромолекулярных покрытий на магнитных наночастицах для применения в биологии и медицине"

На правах рукописи

Бычкова Анна Владимировна

СОЗДАНИЕ УСТОЙЧИВЫХ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПОКРЫТИЙ НА МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦАХ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ

02.00.04 - Физическая химия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

2 9 НОЯ 2012

Москва-2012

005055717

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор

Коварский Александр Львович

доктор биологических наук, профессор Розенфельд Марк Александрович

Официальные оппоненты: доктор химических наук

Семёнова Мария Германовна, заведующая лабораторией функциональных свойств биополимеров ИБХФ РАН

доктор химических наук, профессор Штильман Михаил Исаакович, руководитель УНЦ «Биоматериалы» РХТУ им. Д.И. Менделеева

Ведущая организация: Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина Российской академии наук

Защита диссертации состоится «26» декабря 2012 г. в 13 час. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической физики им. H.H. Семёнова Российской академии наук.

Автореферат разослан « 23 » ноября 2012 г.

Учёный секретарь

Диссертационного совета Д 002.039.01, кандидат химических наук

Л.И. Мазалецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Исследования, направленные на применение магнитных наночастиц (МНЧ) в различных областях биологии и медицины, находятся в стадии интенсивного развития. Наиболее перспективными областями применения МНЧ признаны магнитно-резонансные исследования, гипертермия, клеточная сепарация, иммунологический анализ, тканевая инженерия, векторная доставка лекарственных препаратов к клеткам-мишеням. Для успешного решения широкого круга биомедицинских задач необходимо конструирование магнитоуправляемых наносистем, составляющими которых являются МНЧ и биологические или синтетические макромолекулы, формирующие покрытия. В настоящее время к покрытиям биомедицинского назначения предъявляют ряд требований, среди которых - биосовместимость, предотвращение процессов агломерирования наносистем в водной дисперсии, наличие в случае необходимости в составе покрытия терапевтических препаратов и биовекторов для нацеливания на биологические мишени, закрепление покрытий на поверхности наночастиц для предотвращения их десорбции при контакте с биообъектами. Наиболее перспективными материалами для создания таких покрытий представляются белки, поскольку их использование гарантирует выполнение большинства из вышеперечисленных требований. Проблема закрепления белков на МНЧ с сохранением их функциональных свойств (ферментативной активности, реакционной способности антигенных детерминант белка и др.) до настоящего времени полностью не решена. Традиционно закрепление белковых покрытий на МНЧ или функционализацню макромолекулярных покрытий белками проводят с использованием бифункциональных сшивателей (например, карбодиимида, глутарового альдегида). Однако сложность и многостадийность процесса получения покрытия, десорбция белковых молекул, закрепленных таким образом, с поверхности МНЧ или образование полидисперсного ансамбля частиц в результате сшивания молекул белка, принадлежащих разным наночастицам, делают использование традиционных сшивателей при создании устойчивых покрытий на МНЧ для биомедицинских целей малоперспективным. Создание устойчивых покрытий требует также эффективных методов исследования адсорбции макромолекул на МНЧ в дисперсии и количественного описания адсорбции. В настоящей работе для этого используются методы электронного магнитного резонанса (ЭМР) — ферромагнитный резонанс (ФМР) и электронный

парамагнитный резонанс (ЭГГР), а также методы динамического и упругого светорассеяния, атомно-силовая микроскопия, ИК-спектроскопия, спектрофотометрия.

Цель и задачи работы

Целью настоящего диссертационного исследования являлась разработка нового способа создания устойчивых ковалентно сшитых макромолекулярных покрытий на поверхности индивидуальных магнитных наночастид; апробирование нового способа сшивания на макромолекулах белков и исследование функциональных свойств белков в составе покрытий; адаптация методов электронного магнитного резонанса (ЭПР и ФМР) к исследованию систем, содержащих магнитные наночастицы и макромолекулы.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать адсорбцию на магнитных наночастицах ряда синтетических (полиэтиленимин и его производные, сополимер Ы-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира) и биологических (бычий фибриноген, бычий сывороточный альбумин, бычий тромбин, иммуноглобулин й человека) макромолекул и осуществить выбор макромолекул, на основе которых могут быть созданы покрытия, удовлетворяющие требованиям биологии и медицины.

2. Разработать применения методов электронного магнитного резонанса к исследованию адсорбции макромолекул на магнитных наночастицах в растворе, провести анализ информативности спектров ферромагнитного резонанса и выявить возможности ЭПР-спектроскопии спиновых меток.

3. Изучить закономерности кластерообразования в дисперсиях, содержащих макромолекулы и наночастицы.

4. Создать макромолекулярные покрытия на поверхности магнитных наночастиц с использованием свободнорадикального сшивания белков, доказать устойчивость полученных покрытий и сохранение функциональных свойств белков в их составе.

Научная новизна

Разработан принципиально новый, не применявшийся ранее, способ

свободнорадикального сшивания белковых макромолекул на поверхности

магнитных наночастиц (МНЧ) магнетита, в результате которого образуется

устойчивое покрытие на наночастицах. Доказано, что использование

свободнорадикального способа сшивания позволяет преодолевать проблемы, традиционно возникающие при создании и закреплении покрытий: многостадийность, десорбция белковых молекул с поверхности МНЧ, образование полидисперсного ансамбля частиц, потеря функциональных свойств белков и др.

Впервые методы электронного магнитного резонанса — ЭПР-спектроскопия спиновых меток и ферромагнитный резонанс - применены для исследования адсорбции макромолекул на поверхности магнитных наночастиц.

Впервые с помощью предложенных методик удалось провести количественное описание адсорбционных процессов на МНЧ без разделения системы на компоненты: оценить количество макромолекул в адсорбционном слое и его толщину, исследовать кинетику адсорбции, а также конкурентные адсорбционные процессы в системах, содержащих макромолекулы различной структуры.

Обнаружено свойство фибриногена вытеснять с поверхности МНЧ адсорбированные ранее макромолекулы. Это свойство фибриногена впервые использовано для оценки устойчивости белковых покрытий на МНЧ.

Детально изучены процессы образования кластеров в системах, содержащих МНЧ и макромолекулы, а также факторы, влияющие на кластерообразование. Полученные данные открывают возможности создания наносистем с контролируемым магнитным моментом.

Научно-практическое значение работы

терапевтические препараты и биовекторы белковой природы (ингибиторы, протеазы, моноклональные антитела и т.п.), закрепление которых может быть осуществлено в ходе одностадийного свободнорадикального процесса. Способ можно рекомендовать при создании наносистем для решения широкого круга задач современной биологии и медицины: векторной доставки лекарственных препаратов, улучшения контраста в магнитно-резонансных исследованиях, гипертермии, клеточной и молекулярной сепарации, тканевой инженерии. Возможности способа не ограничиваются МНЧ магнетита - он может использоваться для создания белковых покрытий на любых поверхностях, содержащих ионы металлов переменной валентности (железа, меди, марганца, хрома), и кардинальным образом расширяет возможности молекулярного белкового дизайна на поверхности МНЧ (заявка на патент РФ № 2011136972, приоритет от 08.09.2011, получено решение о выдаче патента).

Разработанные на основе методов электронного магнитного резонанса подходы к исследованию адсорбции на МНЧ позволяют осуществлять количественное описание адсорбционных процессов in situ в дисперсии наночастиц, не прибегая к механическому отделению наночастиц с адсорбционным слоем от неадсорбировавшихся макромолекул.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Адаптация методов ЭПР-спектроскопии спиновых меток и ферромагнитного резонанса к исследованию адсорбции макромолекул на магнитных наночастицах in situ в дисперсии наночастиц.

2) Данные по адсорбции на МНЧ ряда синтетических (полиэтиленимин и его производные, сополимер N-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира) и биологических (бычий фибриноген, бычий сывороточный альбумин, бычий тромбин, иммуноглобулин G человека) макромолекул.

3) Метод получения дисперсий с различной магнитоуправляемостью варьированием размеров кластеров, содержащих наночастицы магнетита и макромолекулы полиэтиленимина.

4) Новый способ получения устойчивых покрытий из белков (альбумина, тромбина, иммуноглобулина G) на поверхности наночастиц магнетита в водной дисперсии, основанный на свойстве белков подвергаться химической модификации с образованием межцепочечных ковалентных связей под действием свободных радикалов.

5) Способ оценки устойчивости белковых покрытий на наночастицах магнетита, основанный на способности фибриногена частично или полностью вытеснять с поверхности наночастиц другие белковые макромолекулы.

6) Сохранение нативных функциональных свойств белков тромбина (ферментативная активность) и иммуноглобулина G (реакционная способность антигенных детерминант) в составе покрытия при использовании свободнорадикального способа их закрепления на магнитных наночастицах.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на VII, VIII, X, XI и XII Ежегодных Международных конференциях ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Россия, Москва, 12-14 ноября 2007 г., 11-13 ноября 2008 г., 8-10 ноября 2010 г., 9-11 ноября 2011 г. и 29-31 октября 2012 г.), 4-й и 5-й Зимних молодежных школах-конференциях «Магнитный резонанс и его приложения» (Россия, Санкт-Петербург, 3-7 декабря 2007 г. и 1-5 декабря 2008 г.), II Всероссийской научной конференции «Физико-химические и прикладные проблемы магнитных дисперсных наносистем» (Россия, Ставрополь, 14-17 сентября 2009 г.), Всеукраинской конференции с международным участием «Актуальные проблемы химии и физики поверхности» (Украина, Киев, 11-13 мая 2011 г.), Всероссийской молодежной конференции «Успехи химической физики» (Россия, Черноголовка, 21—23 июня 2011 г.), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Россия, Волгоград, 25-30 сентября 2011 г.), Всероссийской конференции с международным участием «Спектроскопия и томография электронного парамагнитного резонанса в химии и биологии» (Россия, Москва, 6-10 октября

2011 г.), Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Россия, Москва, 20-22 марта 2012 г.), II Международной конференции «Модели инновационного развития фармацевтической и медицинской промышленности на базе университетов, как интеграторов науки и индустрии» (Россия, Долгопрудный, 1516 мая 2012 г.), XIV Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2012» (Россия, Тула, 21-25 мая 2012 г.), Международной конференции «Биология - наука XXI века» (Россия, Москва, 24 мая 2012 г.), IV Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 20 - 26 августа

2012 г.).

Публикации

По результатам диссертации получено решение о выдаче патента РФ, опубликовано 11 статей (из них 6 — в изданиях, рекомендованных ВАК, 3 — в международных рецензируемых журналах) и 17 публикаций в сборниках материалов конференций.

Личный вклад автора

Полученный экспериментальный материал, его анализ и интерпретация, а также разработка методики создания устойчивых макромолекулярных покрытий, являются результатом деятельности диссертанта. Формулировка основных выводов и научных положений проводилась совместно с руководителями - д.х.н., проф. Коварским А.Л. и д.б.н., проф. Розенфельдом М.А. Диссертант внес основной вклад в планирование эксперимента, формулировку целей и задач работы. В работах, выполненных в соавторстве, диссертант участвовал на всех этапах исследования — от планирования эксперимента до обсуждения, оформления и публикации результатов.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 361 ссылку. Работа изложена на 186 страницах, содержит 63 рисунка и 14 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Синтез магнитных наночастиц и стабилизация их водных дисперсий

Магнитные наночастицы (МНЧ) магнетита — смешанного оксида железа РеО-Ре2Оз (окись-закись) — синтезировали путем соосаждения солей двух- и трехвалентного железа в мольном соотношении 1:2 в водной среде в присутствии гидроксида аммония по способу Массарта [']:

Ре2+504+ 2Ре3+С13 + 8ЫН4ОН -> Ре304| + (ИН^Од + 6Ш4С1 + 4НгО

Путем изменения концентрации солей железа в процессе синтеза в работе были получены МНЧ со средними размерами от 3 до 60 нм. Наблюдали увеличение ширины распределения частиц по размерам с ростом концентрации солей железа в реакционной системе.

1 Massart R. Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media // IEEE Trans. Magn.-1981.-Vol. 17, №2. - P. 1247-1248.

100 nm

Рис. 1. Микрофотография наночастиц магнетита, полученная методом ПЭМ.

Во всех проведенных исследованиях использовались однодоменные

наночастицы магнетита со средним диаметром 12 нм и формой, близкой к сферической (рис. 1 ). Магнитные наночастицы стабилизировали путем создания двойного электрического слоя, который формировался в результате добавления 0,1 M фосфат-цитратного буфера (0,05 M NaCl) с рН 4,0 к магнитному осадку в условиях диспергирования с использованием ультразвукового генератора МЭФ314. Концентрация наночастиц в полученном гидрозоле составляла 50 мг/мл, что соответствует объемной концентрации 0,96 об. %. Средний эффективный диаметр наночастиц по данным динамического светорассеяния,

соответствующий максимальному вкладу в их объемное распределение по размерам, составлял 16нм (рис. 2).

Анализ кривой распределения частиц по размерам показал, что ее форма удовлетворительно описывается функцией Гаусса (нормальное распределение). Магнитные характеристики МНЧ были определены по спектрам ФМР. Намагниченность насыщения составляла 185 Гс, средний магнитный момент частицы ц = 1,7-10"16 Гс-см3.

IS-, 16

14 12 10 8 6 4 2 0

S Ï

d. нм

100

Рис. 2. Гистограмма объемного распределения частиц по размерам, полученная методом динамического светорассеяния.

Адаптация методов электронного магнитного резонанса к исследованию адсорбции макромолекул на магнитных наночастицах in situ в дисперсии наночастиц

Адсорбция молекул является первой стадией процесса создания покрытий на поверхности МНЧ. Знание закономерностей адсорбции на наночастицах молекул синтетических полимеров и биологических макромолекул необходимо для создания и контроля устойчивости биосовместимых покрытий. Однако, несмотря

на многочисленные работы в этом направлении, адсорбция на наночастицах остается недостаточно изученной.

Метод ферромагнитного резонанса (ФМР) широко используется в настоящее время для исследования систем, содержащих МНЧ. Метод позволяет проводить исследования магнитных частиц в сложных многофазных и непрозрачных системах, взаимодействий между частицами и их агрегирования, однако он до сих пор не использовался для исследования взаимодействия магнитных наночастиц с макромолекулами в растворе. Адсорбция макромолекул на поверхности МНЧ в водных системах влияет на такие параметры спектров ФМР, как ширина линий, параметр асимметрии, положение центра тяжести спектра в поле (рис. 3). Этот эффект следует интерпретировать с позиций тенденции частиц к формированию анизотропных структур — линейных агрегатов — во внешнем магнитном поле, в частности, поле спектрометра [2]. Анализ зависимости формы

линий спектров ФМР магнитных наночастиц от условий (температуры, концентрации МНЧ в дисперсии, молекулярной подвижности среды и др.) показал, что при концентрациях исследуемых МНЧ (12 нм) выше 5 мг/мл в среде с высокой молекулярной подвижностью формирование линейных агрегатов сопровождается появлением в спектрах дополнительного пика в низких полях, тогда как при низких концентрациях МНЧ (менее 5 мг/мл) при комнатной температуре появления дополнительного пика не наблюдается даже при продолжительном воздействии магнитного поля (-60 мин). Положение центра спектра в поле является в этом случае наиболее чувствительным к формированию анизотропных структур параметром. В структуре любого линейного агрегата и в дисперсии МНЧ на каждую частицу оказывает влияние магнитное поле других частиц. Сдвиг центра экспериментального спектра в низкие поля относительно спектра индивидуальных МНЧ определяется

■—1—'—I—•—1—■—I—>—1—■—I—•

2000 2500 3000 3500 4000 4500 Н, Гс

Рис. 3. Спектры ФМР МНЧ в водной дисперсии (1) и МНЧ после 90-минутной инкубации в растворе тромбина с концентрацией 1 мг/мл (2). Концентрация МНЧ 1,7 мг/мл.

1 Такетоми С., Тикадзуми С. Магнитные жидкости. Мир, Москва, 1989. — С. 272.

величиной локального поля Н\, которая при ориентации магнитных моментов частиц «голова-хвост» вычисляется по формуле [3]:

Я1=4(5г

где ц - магнитный момент частиц, п - количество частиц в агрегате, О -расстояние между частицами. Адсорбция макромолекул на поверхности частиц ослабляет дипольные взаимодействия между МНЧ в агрегатах и препятствует сдвигу спектра МНЧ в низкие поля. По изменению положения центра спектра ФМР в процессе адсорбции макромолекул на поверхности МНЧ может быть сделан качественный вывод о толщине адсорбционного слоя, исследована кинетика его формирования.

Количественные данные по взаимодействию синтетических и биологических макромолекул с поверхностью МНЧ получали с помощью метода ЭПР-спектроскопии спиновых меток. В основе подхода лежит изменение интенсивности ЭПР-спектра спиновых меток (радикалов, ковалентно связанных с макромолекулами) в результате адсорбции спин-меченых макромолекул на поверхности МНЧ. Сближение радикала-метки и МНЧ, которое имеет место при адсорбции макромолекул на поверхности МНЧ, приводит к уширению спектра. Дипольное уширение линии спектра ЭПР радикала дНм можно рассчитать по уравнению [4,5]:

м 3-/3 г3 '

где г - расстояние между радикалом и наночастицей; — средний магнитный

момент наночастицы, ~~ , где М, — намагниченность насыщения наночастиц магнетита, Уцр - объем наночастицы. Наиболее заметное уширение происходит при попадании радикалов в слой толщиной менее 35 нм вокруг МНЧ. Поскольку интенсивность линий спектра ЭПР радикалов обратно пропорциональна квадрату ширины линии, уширение линий спектра сопровождается уменьшением их интенсивности, которое в свою очередь пропорционально доле адсорбированных макромолекул. Исходя из доли адсорбированных макромолекул, может быть получена величина адсорбции

3 Долотов С.В., Ролдугин В.И. Моделирование спектров ЭПР агрегатов металлических наночастиц // Коллоидный журнал. - 2007. - Т.69, № 1. — С. 13-17.

4 Noginova N., Weaver Т., King Т., Bourlinos A.V., Giannelis Е.Р., Atsarkin V.A. NMR and spin relaxation in systems with magnetic nanoparticles // J. Phys.: Cond. Matter. - 2007. - Vol. 19, № 7. -076210 (10 p).

5 Abragam A. Principles of Nuclear Magnetism. - New York: Oxford University Press, 1961.

макромолекул на МНЧ и рассчитано количество молекул в адсорбционном слое, определена толщина адсорбционного слоя (при известном характере упаковки макромолекул на поверхности). Возможность осуществлять измерения без разделения системы на компоненты позволяет исследовать кинетику адсорбции, а также конкурентные адсорбционные процессы в системах, содержащих МНЧ и несколько типов макромолекул, на одном из которых находится спиновая метка.

Некоторые особенности взаимодействия белков с МНЧ

Комплексное исследование взаимодействия биологических макромолекул (бычьего фибриногена, бычьего сывороточного альбумина, бычьего тромбина, иммуноглобулина в человека) с МНЧ методами электронного магнитного резонанса (ЭПР и ФМР), динамического и упругого светорассеяния показало, что фибриноген (ФГ) обладает наибольшей адсорбционной способностью (адсорбируется -4,2 мг белка на 1 мг МНЧ), тогда как адсорбция других макромолекул характеризуются значениями, меньшими на порядок: ~0,5 мг/мг (иммуноглобулин в), ~0,3 мг/мг (тромбин), -0,1 мг/мг (сывороточный альбумин). В системах, содержащих тромбин, альбумин и макромолекулы

адсорбируются преимущественно на индивидуальных МНЧ, тогда как в системах, содержащих фибриноген, адсорбция сопровождается сборкой МНЧ в структуры микронного размера - кластеры. Формирование кластеров может быть объяснено взаимодействием каждой макромолекулы с двумя и более МНЧ или образованием «фибриногеновых мостиков» между индивидуальными наночастицами, покрытыми белковой оболочкой, за счет контактирования соседних Л-областей молекул фибриногена. Кроме того, фибриноген способен вытеснять с поверхности МНЧ адсорбированные макромолекулы другой структуры (например, альбумин). Это свойство ФГ может быть использовано для оценки устойчивости адсорбционных слоев и покрытий из альбумина на МНЧ. Высокая адсорбционная способность фибриногена может объясняться большим количеством неполярных аминокислотных остатков в этом белке, сильными электростатическими взаимодействиями заряженных групп аминокислотных остатков белка с поверхностью МНЧ.

Оценка устойчивости адсорбционных слоев из сывороточного альбумина, тромбина, иммуноглобулина О на поверхности МНЧ методом ультрацентрифугирования показала, что задача создания устойчивых покрытий из этих белков требует ковалентного сшивания адсорбционного слоя на МНЧ.

Исследование процессов образования кластеров в системах, содержащих МНЧ и синтетические полимеры

Исследование взаимодействия макромолекул полиэтиленимина (ПЭИ) и его производных, а также сополимера М-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира с МНЧ методами электронного магнитного резонанса (ЭПР и ФМР),

атомно-силовой микроскопии,

динамического и упругого светорассеяния позволило установить, что в результате взаимодействия синтетических

макромолекул с МНЧ образуются кластеры, размеры которых зависят от различных физических и химических факторов — структуры макромолекул, функциональных групп в их составе, длины полимерной цепи, значения рН. Адсорбция макромолекулы на двух и более МНЧ может приводить к сборке МНЧ в структуры микронного размера (рис. 4). От размера и состава кластеров зависит их устойчивость и стабильность дисперсий МНЧ в адсорбционной оболочке. Наибольшие способности к формированию крупных кластеров проявляет ПЭИ (4 мг/мг). Максимальная адсорбция сополимера М-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира на МНЧ составляет 3 мг/мг. При этом кластеры включают, в среднем, 2-3 наночастицы. Формирование крупных кластеров в системах, содержащих ПЭИ с концентраций 0,5-5,0 мг/мл и МНЧ с концентрацией 0,25 мг/мл, по-видимому, обусловлено большим количеством полярных первичных и вторичных аминогрупп в составе ПЭИ. Такие кластеры могут включать тысячи магнитных наночастиц (табл. 1). Магнитные моменты МНЧ в составе кластеров суммируются, вследствие чего крупные кластеры обладают высокой магнитоуправляемостью. Биомедицинское направление использования наносистем в большинстве случаев ограничивает их размеры диаметром 200 нм. В диссертационной работе был осуществлен подбор условий получения стабильных дисперсий кластеров с высокой магнитной управляемостью. На примере этоксилированного и оксипропилированного ПЭИ было продемонстрировано, что уменьшение количества аминогрупп в макромолекуле в результате химической модификации приводит к уменьшению размеров кластеров и увеличению стабильности дисперсий. Также было показано, что размер кластеров может быть уменьшен при изменении

Рис. 4. АСМ-изображение системы, содержащей ПЭИ (2 мг/мл) и МНЧ (0.25мг/мл), через 3 часа после начала адсорбции (максимальная высота по 2120 нм).

соотношения концентраций МНЧ и ПЭИ в системе. Еще одним способом воздействия на процессы формирования кластеров является ультразвуковая (УЗ) обработка системы. С использованием УЗ обработки были получены стабильные дисперсии кластеров со средним диаметром -85 нм, включающие -40 плотно упакованных наночастиц, покрытых ПЭИ. Такие кластеры обладают высокой магнитной управляемостью, в противоположность индивидуальным наночастицам, не имеют остаточной намагниченности, и могут использоваться как составляющие наносистем биомедицинского назначения. Однако такие покрытия из ПЭИ на поверхности МНЧ нельзя считать устойчивыми по причине отсутствия ковалентных связей между макромолекулами ПЭИ в составе покрытия, а также между макромолекулами ПЭИ и поверхностью МНЧ.

Таблица 1. Некоторые характеристики кластеров, в состав которых входят макромолекулы ПЭИ или его производных и МНЧ: диаметр кластеров с/ (по данным динамического светорассеяния), количество МНЧ в кластере И, и стабильность

Параметр ПЭИ(2 мг/мл) ПЭИ(2 мг/мл), УЗ обработка ПЭИ(0.02 мг/мл) ЭПЭИ(2 мг/мл)

d. нм > 1 мкм -85 нм -48 нм -25 нм

Стабильность < 1 ч > 2 мес. > 2 мес. > 2 мес.

N*, шт. >105 -40 -45 1-2

* рассчитано на основании данных о величине адсорбции и размерах кластеров, макромолекул и МНЧ в приближении плотной упаковки МНЧ и макромолекул в кластерах.

Получение устойчивых покрытий на поверхности МНЧ способом свободнорадикального сшивания макромолекул

В рамках диссертационной работы был создан принципиально новый способ закрепления белков на поверхности МНЧ. Способ основан на свойстве белков вступать в свободнорадикальные реакции с образованием межмолекулярных ковалентных связей [6]. Для получения покрытий из белков, закрепленных по механизму свободнорадикального сшивания, использовались реакционные системы, включающие раствор белка, гидрозоль магнетита и водорастворимый инициатор генерации свободных радикалов - пероксид водорода. Генерация свободных радикалов осуществлялась на поверхности МНЧ магнетита по реакции Фентона:

Ре2+ + Н202 Ре3+ + ОН' + ОН"

6 Stadtman E.R.. Levine R.L. Free radical-mediated oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins // Amino Acids. -2003. - V.25. - P.207-218.

Для создания белковых устойчивых покрытий, сшитых по свободнорадикальному механизму на поверхности МНЧ, были выбраны сывороточный альбумин, тромбин и иммуноглобулин б. Эти белки способны формировать покрытия на индивидуальных наночастицах и не склонны к образованию кластеров при физиологических рН. Являясь белком плазмы крови, сывороточный альбумин может использоваться как универсальная основа устойчивого макромолекулярного покрытия на поверхности МНЧ для биологии и медицины. Способность тромбина превращать фибриноген в фибрин, а иммуноглобулина в вступать в реакцию антитело-антиген могут быть использованы для оценки сохранения функциональных свойств белков в составе покрытия.

Из рис. 5 видно, что в образцах, отличающихся наличием в составе реакционной смеси пероксида водорода, наблюдается бимодальное объемное

распределение частиц по размерам. Первый пик соответствует свободному белку в растворе, а второй пик - МНЧ с адсорбированными на них молекулами белка. Отсутствие влияния пероксида водорода на исходное объемное распределение присутствующих в системе объектов по размерам

свидетельствует о том, что в системе не происходит образования кластеров наночастиц за счет сшивания молекул белка, адсорбированных на различных наночастицах. Для оценки устойчивости покрытия из альбумина на МНЧ нами было использовано свойство фибриногена вытеснять с поверхности МНЧ альбумин с образованием кластеров микронных размеров. Добавление ФГ к образцам приводит к изменению характера объемного

Рис. 5. Объемное распределение по размеру

частиц в образце, содержащем альбумин (2 мг/мл) и МНЧ (5 мг/мл), инкубированном в течение 2 ч при комнатной температуре, и в

том же образце с добавлением до добавления фибриногена (а, в) и через 20 мин после добавления фибриногена (б, г); пунктирной линией на рисунках (а) и (в) представлены кривые объемного распределения МНЧ по размерам.

распределения присутствующих в системе частиц по размерам. В отсутствие инициатора образования свободных радикалов наблюдается формирование кластеров с размерами около 3000 нм, свидетельствующее о вытеснении фибриногеном альбумина с поверхности МНЧ. В образце, содержащем пероксид водорода, введение фибриногена не приводит к существенному изменению размеров частиц, что подтверждает устойчивость покрытия из альбумина.

Прочность ковалентно сшитых белковых покрытий из сывороточного альбумина и тромбина была оценена также методом ультрацентрифугирования. Ультрацентрифугирование систем, содержащих макромолекулы и МНЧ, приводит к выпадению осадка из МНЧ. В состав осадка входит также связанный с поверхностью МНЧ белок. Физически адсорбированный, незакрепленный ковалентно на поверхности МНЧ белок может десорбироваться в процессе центрифугирования и оказывается в надосадочном растворе. Анализ седиментационных осадков на содержание в них белка, проведенный колориметрическим метод Бредфорда, показал, что в образце без пероксида водорода имеет место почти полная десорбция молекул белков с поверхности наночастиц, в то время как в образцах с пероксидом десорбция минимальна. Этот результат указывает на высокую прочность и устойчивость белкового покрытия, что очевидно связано с образованием ковалентных сшивок между молекулами альбумина.

Избирательность свободнорадикального

сшивания покрытий на поверхности МНЧ была доказана на примере сывороточного альбумина (БСА). Надосадочные растворы, полученные после ультрацентрифугирования систем, отличающихся наличием пероксида водорода и аскорбиновой кислоты, способствующей генерации свободных радикалов в объеме реакционной системы, были проанализированы методом ИК-спектроскопии (рис. 6). Отличия спектра надосадочного раствора, полученного после центрифугирования системы, содержащей аскорбиновую кислоту, в области 1200800 см"1 объясняются химической модификацией белка в растворе вследствие свободнорадикального окисления, тогда как перекрестное сшивание молекул белка на поверхности МНЧ в присутствии

Волновое число, см 1

Рис. 6. ИК-спектры надосадков, полученных после ультрацентрифугирования реакционных систем, содержащих БСА (2 мг/мл) и МНЧ (5 мг/мл) (1), БСА. МНЧ и Н202 (2),

БСА. МНЧ. Н?0, и аскорбиновую кислоту (3).

пероксида водорода осуществляется строго избирательно и не затрагивает неадсорбированные молекулы альбумина.

Следует отметить, что для формирования устойчивого белкового покрытия на МНЧ необходимо выполнение двух условий: ковалентного сшивания макромолекул на МНЧ и завершения процесса формирования адсорбционного слоя из макромолекул на поверхности наночастиц. Таким образом, продолжительность формирования устойчивого покрытия из сывороточного альбумина на поверхности МНЧ -100 минут, а для случая тромбина ~80 минут.

Оценка ферментативных свойств тромбина в составе покрытий на МНЧ, сшитых по свободнорадикальному механизму

Оценку ферментативной активности тромбина, входящего в состав сшитого по свободнорадикальному механизму покрытия на поверхности МНЧ, проводили сопоставлением скорости превращения фибриногена в фибрин под действием тромбина (ТР) образцов, содержащих МНЧ и отличающихся содержанием пероксида водорода. Кинетические кривые изменения интенсивности упругого светорассеяния в процессе формирования фибринового геля в обеих системах представлены на рис. 7. Отсутствие

40-

о 35-

£ 30-

£ 25-

Ц 20-

5 15-

10-

3 э -

. им«** • • • • 1

£сс?«> о о о о 2

.сР»

10 15 20 Время, мин.

25 30

принципиальных различии на кинетических кривых напрямую указывает на сохранение

ферментативной активности тромбина при его свободнорадикальном сшивании на поверхности МНЧ. Интенсивность упругого

светорассеяния в случае отсутствия в реакционной системе МНЧ в ~3 раза меньше. Однако по данным ЭПР-спектроскопии спиновых меток на МНЧ адсорбируется около 40% макромолекул тромбина от их начального содержания в растворе. Этот результат может быть объяснен тем, что тромбин, являясь

представителем семейства сериновых протеиназ, обладает свойством аутолиза, т.е. способностью к самогидролизу и, как следствие, самопроизвольному

Рис. 7. Зависимость относительной интенсивности светорассеяния систем,

полученных в результате добавления образцов, содержащих ТР (1 мг/мл). МНЧ

(1,5 мг/мл) и Н202(1), ТР и МНЧ (2), а также образца, представляющего собой

раствор ТР (1 мг/мл) (3) к раствору фибриногена с концентрацией 3 мг/мл в соотношении 1:9 по объему.

снижению ферментативной активности в растворе. Это проявляется в уменьшении как скоростей образования молекул мономерного фибрина, так и их полимеризации [7]. В этом аспекте свободнорадикальный способ иммобилизации ферментов выглядит особенно привлекательным, поскольку иммобилизованные на поверхности МНЧ молекулы фермента теряют способность к аутолизу, что позволяет им значительно дольше сохранять свою ферментативную активность по сравнению с макромолекулами, находящимися в растворе.

Оценка функциональных свойств иммуноглобулина С в составе покрытии на МНЧ, сшитых по свободнорадикальному механизму

Сохранение функциональной активности оценивали по их способности взаимодействовать с молекулами апй-^О кролика методом двойной радиальной иммунодиффузии. Образцы, содержащие МНЧ, иммуноглобулин в (^в) и отличающиеся наличием пероксида водорода, осаждали на магните, осадки редиспергировали в буфере и наблюдали за преципитацией, иллюстрирующей взаимодействие по типу «антитело-антиген». Как видно из рис. 8, содержание ^О, обладающего функциональной активностью, в образце, подвергнутом

свободнорадикальному сшиванию, в 22 а й "4 раза превышает содержание Ю24 О ^ 4 О .. ~ О способного к реакции антитело-

j 64

'J O антиген IgG в осадке несшитого

/б

Рис. 8. Картины преципитации при двойной радиальной иммунодиффузии для

образца. Таким образом, может быть сделан вывод о том, что свободнорадикальные процессы не

осажденных на магните и затрагивают структуру антигенных

редиспергированных МНЧ (а) и образцов, детерминант макромолекул

содержащих ^С и МНЧ (б), МНЧ и

Н202 (в), с апП-^О кролика (1 мг/мл). иммуноглобулина в и функцио-

Числа на рисунке — коэффициенты нальная активность белка в реакции

разбавления образцов в лунках. «антиген-антитело» сохраняется.

ВЫВОДЫ

7 Blombäck B. Fibrinogen and fibrin. Proteins with complex roles in hemostasis and thrombosis / Thromb. Res. - 1996. - Vol. 83, No. 1. - P. 1-75.

макромолекулами. Метод позволяет исследовать кинетику адсорбции, определять количество макромолекул в адсорбционном слое. Метод спиновых меток применен для исследования адсорбции на МНЧ полиэтиленимина и его производных, сополимера Ы-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира, фибриногена, сывороточного альбумина, тромбина, иммуноглобулина в.

2. Метод ФМР впервые применен для анализа толщины адсорбционного слоя на МНЧ. Анализ проводится по смещению центра спектра ФМР в магнитном поле в результате изменения диполь-дипольного взаимодействия между МНЧ при формировании адсорбционного слоя. Доказано, что совместное использование методов ФМР и ЭПР-спектроскопии спиновых меток позволяет исследовать конкурентные процессы в системах, включающих два и более вида макромолекул.

3. Комплексное использование методов электронного магнитного резонанса (ЭПР и ФМР), атомно-силовой микроскопии, динамического и упругого светорассеяния показало, что адсорбционная способность макромолекул уменьшается в ряду: фибриноген > полиэтиленимин > сополимер >1-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира > иммуноглобулин в > тромбин > альбумин. Способность фибриногена частично или полностью вытеснять с поверхности МНЧ другие макромолекулы впервые использована для оценки устойчивости адсорбционных слоев и покрытий на МНЧ.

4. Установлено, что в результате взаимодействия макромолекул с наночастицами образуются кластеры, размеры которых зависят от структуры макромолекул, функциональных групп в их составе и длины полимерной цепи. Варьирование этих параметров позволяет получать дисперсии с различными размерами кластеров и их магнитоуправляемостью.

5. Предложен новый свободнорадикальный способ получения устойчивых белковых покрытий на поверхности наночастиц магнетита в водной дисперсии, основанный на свойстве белков подвергаться химической модификации с образованием межцепочечных ковалентных связей под действием свободных радикалов. Впервые получены устойчивые макромолекулярные покрытия из альбумина, тромбина, иммуноглобулина в.

6. Установлено, что генерация свободных радикалов, происходящая строго на поверхности наночастиц магнетита при взаимодействии ионов ¥е+2 с инициатором образования свободных радикалов, обусловливает ковалентное сшивание в адсорбционном слое и не затрагивает макромолекулы, находящиеся в объеме.

7. С помощью биохимических методов доказано сохранение нативных функциональных свойств белков при использовании свободнорадикального способа их закрепления на магнитных наночастицах.

8. Разработанный способ получения устойчивых покрытий может быть использован при создании белковых композиционных покрытий на любых поверхностях, содержащих ионы металлов переменной валентности (железа, меди, марганца, хрома).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Kovarski A.L., Bychkova A.V., Sorokina O.N., Kasparov V.V. Temperature Effects in the FMR Spectra of Magnetic Nanoparticles in Polymer Films and Viscous Fluid. // Magnetic resonance in solids. - 2008. - V. 10. - P. 25-30.

2. Сорокина O.H., Бычкова A.B., Коварский A.JI. Анализ спектров ферромагнитного резонанса агрегатов наночастиц магнетита, сформированных магнитным полем. // Химическая физика. - 2009. - Т. 28, № 4. - С. 91-96.

3. Bychkova A.V., Sorokina O.N., Shapiro А.В., Tikhonov A.P., Kovarski A.L. Spin Labels in the Investigation of Macromolecules Adsorption on Magnetic Nanoparticles. // The Open Colloid Science Journal. - 2009. - V. 2. - P. 15-19.

4. Сорокина O.H., Бычкова A.B., Шапиро А.Б., Тихонов А.П., Коварский A.JI. Применение метода спиновых меток к исследованию адсорбции макромолекул на магнитных наночастицах. // Химическая физика. - 2010. - Т. 29, № 6. — С. 87—91.

5. Бычкова А.В., Сорокина О.Н., Коварский А.Л., Шапиро А.Б., Леонова В.Б., Розенфельд М.А. Взаимодействие фибриногена с наночастицами магнетита. // Биофизика. - 2010. - Т. 55, № 4. - С. 605-611.

6. Коварский А.Л., Бычкова А.В., Сорокина О.Н., Шапиро А.Б., Бинюков В.И., Розенфельд М.А. Кластеризация наночастиц магнетита с полиэтиленимином в водных дисперсиях. // Нанотехнологии и охрана здоровья. - 2010. - Т. II, № 4(5). -С. 26-31.

7. Бычкова А.В., Сорокина О.Н., Коварский А.Л., Леонова В.Б., Розенфельд М.А. Взаимодействие белков плазмы крови с наночастицами магнетита. // Коллоидный журнал. - 2010. - Т. 72, № 5. - С. 694-700.

8. Bychkova A.V., Sorokina O.N., Kovarski A.L., Shapiro A.B., Rosenfeld М.А. The Investigation of Polyethyleneimine Adsorption on Magnetite Nanoparticles by Spin Labels Technique. // Nanoscience and Nanotechnology Letters. - 2011. - V. 3, № 4. - P. 591-593.

9. Коварский А.Л., Бычкова A.B., Сорокина O.H., Шапиро А.Б., Бинюков В.И., Розенфельд М.А. Исследование кластеризации в системе «полиэтиленимин -наночастицы магнетита». // Прикладная аналитическая химия. - 2011. - Т. II, № 1(3).-С. 24-29.

Ю.Бычкова А.В., Леонова В.Б., Розенфельд М.А., Коварский А. Л. Устойчивые

белковые покрытия на основе ферментов на поверхности магнитных наночастиц. // Нанотехнологии и охрана здоровья. - 2012. - Т. IV, № 3(12). - С. 46-51.

П.Бычкова A.B., Сорокина О.Н., Розенфельд М.А., Коварский A.J1. Многофункциональные биосовместимые покрытия на магнитных наночастицах. // Успехи химии.-2012.-Т. 81,№ 11.-С. 1026-1050.

Публикации в сборниках материалов конференций

12. Бычкова A.B., Сорокина О.Н., Коварский А.Л. Температурные и концентрационные эффекты в спектрах ФМР магнитных наночастиц в полимерной матрице. Труды VII Ежегодной Международной конференции ИБХФ РАН-вузы «Биохимическая физика». Москва, Россия, 12-14 ноября 2007 г. С. 50-53.

13. Бычкова A.B., Сорокина О.Н., Коварский А.Л. Анализ концентрационных и температурных зависимостей спектров ФМР наночастиц магнетита в диамагнитной матрице. Материалы 4-й Зимней молодежной школы-конференции «Магнитный резонанс и его приложения». Санкт-Петербург, Россия, 3-7 декабря 2007 г. С. 91-94.

14. Бычкова A.B., Сорокина О.Н., Коварский А.Л., Леонова В.Б., Розенфельд М.А. Исследование взаимодействия белков плазмы крови с магнитными наночастицами. Труды VIII Ежегодной Международной конференции ИБХФ РАН-вузы «Биохимическая физика». Москва, Россия, 11-13 ноября 2008 г. С. 32-35.

15. Бычкова A.B., Сорокина О.Н., Шапиро А.Б., Коварский А.Л. Применение ЭПР-спектроскопии спиновых меток в исследовании взаимодействия белков плазмы крови с наночастицами магнетита. Материалы 5-й Зимней молодежной школы-конференции «Магнитный резонанс и его приложения». Санкт-Петербург, Россия, 1-5 декабря 2008 г. С. 108-110.

16. Бычкова A.B., Сорокина О.Н., Шапиро А.Б., Леонова В.Б., Розенфельд М.А., Коварский А.Л. Исследование адсорбции макромолекул на магнитных наночастицах. Труды II Всероссийской научной конференции «Физико-химические и прикладные проблемы магнитных дисперсных наносистем». Ставрополь, Россия, 14-17 сентября 2009 г. С. 35-41.

17. Бычкова A.B., Коварский А.Л., Сорокина О.Н., Шапиро А.Б., БинюковВ.И., Розенфельд М.А. Исследование адсорбции макромолекул полиэтиленимина на наночастицах магнетита в водных дисперсиях. Труды X Ежегодной Международной конференции ИБХФ РАН-вузы «Биохимическая физика». Москва, Россия, 8-10 ноября 2010 г. С. 35-38.

18. Бычкова A.B., Сорокина О.Н., Коварский А.Л., Шапиро А.Б., Леонова В.Б., Розенфельд М.А. Адсорбция макромолекул на наночастицах магнетита. Тезисы докладов Всеукраинской конференции с международным участием «Актуальные проблемы химии и физики поверхности». Киев, Украина, 11-13 мая 2011 г. С. 406407.

19. Бычкова A.B., Сорокина О.Н., Коварский А.Л., Леонова В.Б., Розенфельд М.А., Шапиро А.Б. Многофункциональные полимерные покрытия на магнитных наночастицах. Проблемы и решения. Сборник тезисов докладов на Всероссийской молодежной конференции «Успехи химической физики». Черноголовка, Россия, 21-23 июня 2011 г. С. 185.

20. Бычкова A.B., Сорокина О.Н., Коварский A.JI., Шапиро А.Б., Леонова В.Б., Розенфельд М.А. Макромолекулярные покрытия на наночастицах магнетита. Сборник трудов XIX Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. Волгоград, Россия, 25-30 сентября 2011 г. Том 2, С. 208.

21. Бычкова A.B., Сорокина О.Н., Коварский А. Л. Исследование адсорбции макромолекул на магнитных наночастицах методом спиновых меток. Сборник трудов Всероссийской конференции с международным участием «Спектроскопия и томография электронного парамагнитного резонанса в химии и биологии». Москва, Россия, 6-10 октября 2011 г. С. 93.

22. Бычкова A.B., Леонова В.Б., Розенфельд М.А., Сорокина О.Н., Шапиро А.Б., Коварский А.Л. Создание магнитоуправляемых наносистем с многофункциональными биосовместимыми покрытиями на основе полиэтиленимина и белков плазмы крови. Труды XI Ежегодной Международной конференции ИБХФ РАН-вузы «Биохимическая физика». Москва, Россия, 9-11 ноября 2011 г. С. 62-66.

23. Бычкова A.B., Розенфельд М.А., Леонова В.Б., Сорокина О.Н., Коварский А.Л. Создание биосовместимых магнитоуправляемых наносистем для адресной доставки терапевтических препаратов. Материалы Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития»). Москва, Россия, 20-22 марта 2012 г. С. 221.

24. Бычкова A.B., Леонова В.Б., Розенфельд М.А., Сорокина О.Н., Коварский А.Л. Новый способ создания устойчивых белковых покрытий на поверхности наночастиц магнетита для биологии и медицины. Материалы П-ой Международной конференции «Модели инновационного развития фармацевтической и медицинской промышленности на базе университетов, как интеграторов науки и индустрии». МФТИ, Долгопрудный, Россия, 15-16 мая 2012 г. С. 27.

25. Бычкова A.B., Сорокина О.Н., Коварский А.Л., Леонова В.Б., Розенфельд М.А.. Устойчивые многофункциональные покрытия на наночастицах магнетита для биологии и медицины. Тезисы докладов XIV Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2012». Тула, Россия, 21-25 мая 2012 г. С. 205.

26. Бычкова A.B., Розенфельд М.А., Леонова В.Б., Сорокина О.Н., Коварский А.Л., Шапиро А.Б. Получение биосовместимых покрытий на магнитных наночастицах для биологии и медицины. Материалы Международной конференции «Биология -наука XXI века». Москва, Россия, 24 мая 2012 г. С. 146-148.

27. Бычкова A.B., Розенфельд М.А., Леонова В.Б., Коварский А.Л. Биосовместимые наносистемы на основе магнитных наночастиц для адресной доставки терапевтических препаратов. Материалы докладов IV Съезда биофизиков России. Нижний Новгород, Россия, 20 - 26 августа 2012 г. Том IV, С. 22.

28. Бычкова A.B., Сорокина О.Н., Пронкин П.Г., Коварский А.Л., Леонова В.Б., Розенфельд М.А., Татиколов A.C. Получение белковых покрытий на наночастицах магнетита и оценка функциональных свойств белков в их составе. Труды XII Ежегодной Международной конференции ИБХФ РАН-вузы «Биохимическая физика». Москва, Россия, 29-31 октября 2012 г. С. 25-29.

Подписано в печать 19.11.2012 г.

Усл.п.л.-1.0 Заказ №11484 Тираж: 130 экз.

Копицентр «ЧЕРТЕЖ.ру» ИНН 7701723201 107023, Москва, ул.Б.Семеновская 11, стр.12 (495) 542-7389 www.chertez.ru

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Бычкова, Анна Владимировна

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Магнитные наночастицы: основные понятия и характеристики.

1.1.1. Намагниченность, однодоменность и суперпарамагнетизм.

1.1.2. Стабилизация магнитных коллоидных систем и агрегирование магнитных наночастиц.

1.1.3. Адсорбционные процессы на поверхности магнитных наночастиц в водных дисперсиях.

1.2. Применение магнитных наночастиц в биологии и медицине.

1.3. Многофункциональные покрытия на магнитных наночастицах.

1.3.1. Основные требования, предъявляемые к покрытиям наночастиц, используемых для биологических целей.

1.3.2. Покрытия на основе ПАВ и синтетических полимеров.

1.3.3. Покрытия на основе природных макромолекул.

1.3.4. Кремнийорганические и неорганические покрытия.

1.3.5. Модификация покрытий биовекторами и лекарственными препаратами

Введение диссертация по химии, на тему "Создание устойчивых макромолекулярных покрытий на магнитных наночастицах для применения в биологии и медицине"

Актуальность работы

Исследования, направленные на применение магнитных наночастиц (МНЧ) в различных областях биологии и медицины, находятся в стадии интенсивного развития. Наиболее перспективными областями применения МНЧ признаны магнитно-резонансные исследования, гипертермия, клеточная сепарация, иммунологический анализ, тканевая инженерия, векторная доставка лекарственных препаратов к клеткам-мишеням. Для успешного решения широкого круга биомедицинских задач необходимо конструирование магнитоуправляемых наносистем, составляющими которых являются МНЧ и биологические или синтетические макромолекулы, формирующие покрытия. В настоящее время к покрытиям биомедицинского назначения предъявляют ряд требований, среди которых - биосовместимость, предотвращение процессов агломерирования наносистем в водной дисперсии, наличие в случае необходимости в составе покрытия терапевтических препаратов и биовекторов для нацеливания на биологические мишени, закрепление покрытий на поверхности наночастиц для предотвращения их десорбции при контакте с биообъектами. Наиболее перспективными материалами для создания таких покрытий представляются белки, поскольку их использование гарантирует выполнение большинства из вышеперечисленных требований. Проблема закрепления белков на МНЧ с сохранением их функциональных свойств (ферментативной активности, реакционной способности антигенных детерминант белка и др.) до настоящего времени полностью не решена. Традиционно закрепление белковых покрытий на МНЧ или функционализацию макромолекулярных покрытий белками проводят с использованием бифункциональных сшивателей (например, карбодиимида, глутарового альдегида). Однако сложность и многостадийность процесса получения покрытия, десорбция белковых молекул, закрепленных таким образом, с поверхности МНЧ или образование полидисперсного ансамбля частиц в результате сшивания молекул белка, принадлежащих разным наночастицам, делают использование традиционных сшивателей при создании устойчивых покрытий на МНЧ для биомедицинских целей малоперспективным. Создание устойчивых покрытий требует также эффективных методов исследования адсорбции макромолекул на МНЧ в дисперсии и количественного описания адсорбции. В настоящей работе для этого используются методы электронного магнитного резонанса (ЭМР) - ферромагнитный резонанс (ФМР) и электронный парамагнитный резонанс (ЭПР), а также методы динамического и упругого светорассеяния, атомно-силовая микроскопия, спектрофотометрия.

Цель и задачи работы

Целью настоящего диссертационного исследования являлась разработка нового способа создания устойчивых ковалентно сшитых макромолекулярных покрытий на поверхности индивидуальных магнитных наночастиц; апробирование нового способа сшивания на макромолекулах белков и исследование функциональных свойств белков в составе покрытий; адаптация методов электронного магнитного резонанса (ЭПР и ФМР) к исследованию систем, содержащих магнитные наночастицы и макромолекулы.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать адсорбцию на магнитных наночастицах ряда синтетических (полиэтиленимин и его производные, сополимер 1Ч-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира) и биологических (бычий фибриноген, бычий сывороточный альбумин, бычий тромбин, иммуноглобулин в человека) макромолекул и осуществить выбор макромолекул, на основе которых могут быть созданы покрытия, удовлетворяющие требованиям биологии и медицины.

3. Изучить закономерности кластерообразования в дисперсиях, содержащих макромолекулы и наночастицы.

Научная новизна

Разработан принципиально новый, не применявшийся ранее, способ свободнорадикального сшивания белковых макромолекул на поверхности магнитных наночастиц (МНЧ) магнетита, в результате которого образуется устойчивое покрытие на наночастицах. Доказано, что использование свободнорадикального способа сшивания позволяет преодолевать проблемы, традиционно возникающие при создании и закреплении покрытий: многостадийность, десорбция белковых молекул с поверхности МНЧ, образование полидисперсного ансамбля частиц, потеря функциональных свойств белков и др.

Впервые методы электронного магнитного резонанса - ЭПР-спектроскопия спиновых меток и ферромагнитный резонанс - применены для исследования адсорбции макромолекул на поверхности магнитных наночастиц.

Научно-практическое значение работы

Белковые покрытия, полученные с использованием предложенного в работе способа свободнорадикального сшивания, характеризуются высокой устойчивостью и позволяют предотвращать процессы агломерирования наносистем в дисперсии (обеспечить стабильность дисперсии), обеспечивать биосовместимость наносистем, возможность их локализации в биологических мишенях, защиту магнитных ядер наносистем от воздействия биологической среды при попадании в организм, в том числе уменьшить риск тромбообразования. Важно отметить, что функциональные свойства белков (ферментативная активность, реакционная способность антигенных детерминант белка и др.) при их свободнорадикальном сшивании не изменяются. Благодаря этому предложенный в диссертационной работе способ свободнорадикального сшивания белковых макромолекул на поверхности МНЧ существенно упрощает технологию получения устойчивых композиционных покрытий, включающих терапевтические препараты и биовекторы белковой природы (ингибиторы, протеазы, моноклональные антитела и т.п.), закрепление которых может быть осуществлено в ходе одностадийного свободнорадикального процесса. Способ можно рекомендовать при создании наносистем для решения широкого круга задач современной биологии и медицины: векторной доставки лекарственных препаратов, улучшения контраста в магнитно-резонансных исследованиях, гипертермии, клеточной и молекулярной сепарации, тканевой инженерии. Возможности способа не ограничиваются МНЧ магнетита - он может использоваться для создания белковых покрытий на любых поверхностях, содержащих ионы металлов переменной валентности (железа, меди, марганца, хрома), и кардинальным образом расширяет возможности молекулярного белкового дизайна на поверхности МНЧ (заявка на патент РФ № 2011136972, приоритет от 08.09.2011, получено решение о выдаче патента).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Адаптация методов ЭПР-спектроскопии спиновых меток и ферромагнитного резонанса к исследованию адсорбции макромолекул на магнитных наночастицах in situ в дисперсии наночастиц.

2. Данные по адсорбции на МНЧ ряда синтетических (полиэтиленимин и его производные, сополимер N-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира) и биологических (бычий фибриноген, бычий сывороточный альбумин, бычий тромбин, иммуноглобулин G человека) макромолекул.

3. Метод получения дисперсий с различной магнитоуправляемостью варьированием размеров кластеров, содержащих наночастицы магнетита и макромолекулы полиэтиленимина.

4. Новый способ получения устойчивых покрытий из белков (альбумина, тромбина, иммуноглобулина G) на поверхности наночастиц магнетита в водной дисперсии, основанный на свойстве белков подвергаться химической модификации с образованием межцепочечных ковалентных связей под действием свободных радикалов.

5. Способ оценки устойчивости белковых покрытий на наночастицах магнетита, основанный на способности фибриногена частично или полностью вытеснять с поверхности наночастиц другие белковые макромолекулы.

6. Сохранение нативных функциональных свойств белков тромбина (ферментативная активность) и иммуноглобулина G (реакционная способность антигенных детерминант) в составе покрытия при использовании свободнорадикального способа их закрепления на магнитных наночастицах.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на VII, VIII, X, XI и XII Ежегодных Международных конференциях ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Россия, Москва, 12-14 ноября 2007 г., 11-13 ноября 2008 г., 8-10 ноября 2010 г., 911 ноября 2011 г. и 29-31 октября 2012 г.), 4-й и 5-й Зимних молодежных школах-конференциях «Магнитный резонанс и его приложения» (Россия, Санкт-Петербург, 3-7 декабря 2007 г. и 1-5 декабря 2008 г.), II Всероссийской научной конференции «Физико-химические и прикладные проблемы магнитных дисперсных наносистем» (Россия, Ставрополь, 14-17 сентября 2009 г.), Всеукраинской конференции с международным участием «Актуальные проблемы химии и физики поверхности» (Украина, Киев, 11-13 мая 2011 г.), Всероссийской молодежной конференции «Успехи химической физики» (Россия, Черноголовка, 21-23 июня 2011 г.), XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Россия, Волгоград, 25-30 сентября 2011 г.), Всероссийской конференции с международным участием

Спектроскопия и томография электронного парамагнитного резонанса в химии и биологии» (Россия, Москва, 6-10 октября 2011 г.), Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» в рамках Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Россия, Москва, 20-22 марта 2012 г.), II Международной конференции «Модели инновационного развития фармацевтической и медицинской промышленности на базе университетов, как интеграторов науки и индустрии» (Россия, Долгопрудный, 15-16 мая 2012 г.), XIV Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2012» (Россия, Тула, 21-25 мая 2012 г.), Международной конференции «Биология - наука XXI века» (Россия, Москва, 24 мая 2012 г.), IV Съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 20 - 26 августа 2012 г.).

Автор была удостоена 3-го места на Конкурсе молодых ученых на лучшую научно-исследовательскую работу в рамках Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 2012 г.), 1-го места на Конкурсе научных работ по биологии и медицине ИБХФ РАН (2012 г.), диплома Лауреата XIV Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии-2012».

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена в рамках Государственного контракта № 02.513.11.3092, при поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (гранты РФФИ №№ 05-03-32753, 08-04-00632а, 12-03-31452), а также по программе Президиума РАН «Поддержка инноваций и разработок в 2012 году».

Публикации

По результатам диссертации получено решение о выдаче патента РФ, опубликовано 11 статей (из них 6 - в изданиях, рекомендованных ВАК, 3 - в международных рецензируемых журналах) и 17 публикаций в сборниках материалов конференций.

Личный вклад автора

Полученный экспериментальный материал, его анализ и интерпретация, а также разработка методики создания устойчивых макромолекулярных покрытий, являются результатом деятельности диссертанта. Формулировка основных выводов и научных положений проводилась совместно с руководителями - д.х.н., проф. Коварским А.Л. и д.б.н., проф. Розенфельдом М.А. Диссертант внес основной вклад в планирование эксперимента, формулировку целей и задач работы. В работах, выполненных в соавторстве, диссертант участвовал на всех этапах исследования -от планирования эксперимента до обсуждения, оформления и публикации результатов.

Объем и структура диссертации

Заключение диссертации по теме "Физическая химия"

выводы

1. Разработан и экспериментально обоснован метод анализа адсорбционного слоя макромолекул на поверхности МНЧ по спектрам ЭПР стабильных нитроксильных радикалов (спиновых меток), ковалентно связанных с макромолекулами. Метод позволяет исследовать кинетику адсорбции, определять количество макромолекул в адсорбционном слое. Метод спиновых меток применен для исследования адсорбции на МНЧ полиэтиленимина и его производных, сополимера !Ч-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира, фибриногена, сывороточного альбумина, тромбина, иммуноглобулина О.

3. Комплексное использование методов электронного магнитного резонанса (ЭПР и ФМР), атомно-силовой микроскопии, динамического и упругого светорассеяния показало, что адсорбционная способность макромолекул уменьшается в ряду: фибриноген > полиэтиленимин > сополимер }Ч-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира > иммуноглобулин в > тромбин > сывороточный альбумин. Способность фибриногена частично или полностью вытеснять с поверхности МНЧ другие макромолекулы впервые использована для оценки устойчивости адсорбционных слоев и покрытий на МНЧ.

6. Установлено, что генерация свободных радикалов, происходящая строго на поверхности наночастиц магнетита при взаимодействии ионов Бе+2 с инициатором образования свободных радикалов, обусловливает ковалентное сшивание в адсорбционном слое и не затрагивает макромолекулы, находящиеся в объеме.

5.4. Заключение

В Главе V совокупностью физико-химических методов было доказано, что новый подход, основанный на способности белков подвергаться свободнорадикальной модификации, позволяет получать устойчивые белковые покрытия на поверхности магнитных наночастиц. Было показано, что генерация свободных радикалов происходит на поверхности МНЧ при добавлении в реакционную систему, содержащую белки и МНЧ, пероксида водорода. На примере макромолекул БСА было продемонстрировано, что генерация свободных радикалов локально на поверхности МНЧ обеспечивает избирательность сшивания макромолекул. Избирательность сшивания исключает возможность образования перекрестных сшивок между макромолекулами белка, не адсорбированными на поверхности частиц и находящимися в растворе, а также возможность образования полидисперсного ансамбля частиц вследствие сшивания молекул белка, иммобилизованных на различных частицах, которые имеют место при использовании традиционных бифункциональных сшивателей.

В настоящей работе на поверхности наночастиц магнетита было создано устойчивое покрытие из сывороточного альбумина толщиной ~3 нм. На примере тромбина и иммуноглобулина в было продемонстрировано, что свободнорадикальное закрепление белкового покрытия на МНЧ практически полностью сохраняет функциональные свойства макромолекул. Исследования покрытий из тромбина показали, что ТР, связанный с поверхностью МНЧ, сохраняет функциональные свойства в большей степени, чем ТР в растворе, что делает свободнорадикальный способ иммобилизации ферментов особенно привлекательным для биомедицины.

Взаимодействие ионов Ре поверхности МНЧ с инициатором генерации свободных радикалов и их окисление на стадии получения устойчивых покрытий снижает токсичность поверхности МНЧ магнетита, предотвращая возможную неконтролируемую генерацию свободных радикалов при попадании таких наносистем в организм.

Ниже представлена схема наносистемы на основе МНЧ с многокомпонентным белковым покрытием, отвечающим всем требованиям, предъявляемым к покрытиям для биомедицины. В основе получения такой наносистемы лежит одностадийный процесс свободнорадикального сшивания белковой композиции на поверхности наночастиц магнетита. Таким образом, разработанный в работе подход существенно расширяет возможности молекулярного дизайна поверхности наночастиц и может быть использован в принципиально новых технологиях создания перспективных наноматериалов и высокодисперсных систем с заданными свойствами поверхности для векторной доставки лекарственных и биологически активных веществ. терапевтический препарат ковалентнаяI биосовместимый компонент

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Бычкова, Анна Владимировна, Москва

1. Ozin G.A., Cademartiri L. Nanochemistry: What 1. Next? // Small. - 2009. - V. 5, № 11.-P. 1240-1244.

2. Головин Ю.И. Введение в нанотехнологию // М.: Машиностроение-1, 2003. -112 с.

3. Cornell R.M., Schwertmann U. (Eds.) The iron oxides: structure, properties, reactions, occurrences, and uses. // Wiley-VCH, 2003. 664 p.

4. Помогайло А.Д., Розенберг А.С., Уфлянд И.Е. Наночастицы металлов в полимерах. // М.: Химия, 2000. 672 с.

5. Gorshenev V.N., Bibikov S.B., Spector V.N. Simulation, synthesis and investigation of microwave absorbing composite materials. // Synth. Met. 1997. - V. 86. -P. 2255-2256.

6. Frey N.A., Peng S., Cheng K., Sun S. Magnetic nanoparticles: synthesis, functionalization, and applications in bioimaging and magnetic energy storage. // Chem. Soc. Rev. 2009. - V. 38. - P. 2532-2542.

7. Denisyuk I.Yu., Fokina M.I. A review of high nanoparticles concentration composites: semiconductor and high refractive index materials, in: Nanocrystals. (Ed. Masuda Y.) InTech, Croatia, 2010. P. 109-142.

8. Sobha K., Surendranath К., Meena V., Jwala Т.К., Swetha N. and Eatha K.S.M. Emerging trends in nanobiotechnology. // Biotechnol. Mol. Biol. Rev. 2010. - V. 5, № l.-P. 001-012.

9. Такетоми С., Тикадзуми С. Магнитные жидкости. // М.: Мир, 1989. С. 272.

10. Губин С.П., Кокшаров Ю.А., Хомутов Г.Б., Юрков Г.Ю. Магнитные наночастицы: методы получения, строение и свойства. // Усп. Хим. 2005. -Т. 74, №6.-С. 539-574.

11. Kolesnichenko V.L. Synthesis of Nanoparticulate Magnetic Materials, In: Magnetic nanoparticles. (Ed. Gubin S.). // Wiley-VCH, Weinheim, 2009. P. 25-58.

12. Gupta A.K., Gupta M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. // Biomaterials. 2005. - V. 26. - P. 3995-4021.

13. Tartaj P., Morales M.P., Veintemillas-Verdaguer S., Gonzalez-Carreno Т., Serna C.J. The preparation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine. // J. Phys. D: Appl. Phys. 2003. - V. 36. - P. R182-R197.

14. Wu W., He Q., Jiang C. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis and surface functionalization strategies. // Nanoscale Res. Lett. 2008. - V. 3. - P. 397-415.

15. Qiao R., Yang C., Gao M. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles: from preparations to in vivo MRI applications. // J. Mater. Chem. 2009. - V. 19. -P. 6274-6293.

16. Pileni M.P., Moumen N. Hochepied J.F., Bonville P., Veillet P. Control of the Size of Cobalt Ferrite Nanoparticles: Synthesis and Properties.// J. Phys. IV. 1997. -V. 7.-P. cl-505-cl-508.

17. Gyergyek S., Makovec D., Kodre A., Arcon I., Jagodic M., Drofenik M. Influence of synthesis method on structural and magnetic properties of cobalt ferrite nanoparticles.//J. Nanopart. Res.-2010.-V. 12.-P. 1263-1273.

18. Koseoglu Y. Effect of surfactant coating on magnetic properties of Fe304 nanoparticles: ESR study // J. Magn. Magn. Mater. 2006. - V. 300. - P. e327-e330.

19. Przybylski M., Gradmann U., Krop K. Influence of coating materials on magnetic properties of thin iron films // Surf. Hyperfine Interact. 1990. - V. 57. - P. 20452051.

20. Battle X., Labarta A. Finite-Size Effects in Fine Particles: Magnetic and Transport Properties. // J. Phys. D. 2002. - V. 35. - P. R15-R42.

21. Sorensen C.M. Particles as Molecules, in: Nanoscale Materials in Chemistry (Ed. Klabunde K.J.) // Wiley-Interscience Publication, New York, 2001. P. 37-69.

22. Магнетизм. (Под ред. С.В.Вонсовского) // Наука, Москва, 1971. 1032 с.

23. Chen В., Scott D. Vibrating Sample Magnetometry: A Magnetic Study of Nickel, Gadolinium, and Exchange Bias at Room Temperature and Liquid Nitrogen Temperatures. Internet source http://mxp.phvsics.umn.ediu's03/Proiects/S030VSM/

24. Crangle J., Goodman G.M. The Magnetization of Pure Iron and Nickel. // Proceedings of the Royal Society of London, Series A, Mathematical and Physical Sciences. 1971,-V. 321.-P. 477-491.

25. Петров A.E., Петинов В.И., Платэ И.В., Федорова Е.А., Ген М.Я. Магнитные свойства малых аэрозольных частиц кобальта. // ФТТ. 1971. - Т. 13, № 6. -С.1573-1577.

26. Петров Ю.И., Федоров Ю.И. Электромагнитные свойства коллоидной суспензии никеля в парафине. // ЖТФ. 1967. - Т. 37, № 4. - С. 726-728.

27. Corner W.D., Mundell P.A. Properties of ferromagnetic micropowders. // J. Magn. Magn. Mater. 1980. - V. 20. - P. 148-157.

28. Ферромагнитные домены. Физическая энциклопедия, Т.5 (Под ред. Прохорова A.M.) // Советская энциклопедия, Москва, 1988. С. 301.

29. Бухарев А.А., Овчинников Д.В., Нургазизов Н.И., Куковицкий Е.Ф., Кляйбер М., Вейзендангер Р. Исследование микромагнетизма и перемагничивания наночастиц Ni с помощью магнитного силового микроскопа. // ЖТФ. 1998. -V. 40.-Р. 1277-1283.

30. Iwaki T., Kakihara Y., Toda Т., Abdullah M., Okuyama. К. Preparation of high coercivity magnetic FePt nanoparticles by liquid process // J. Appl. Phys. 2003. -V. 94.-P. 6807-6811.

31. Аремов JI.JI., Панов A.B. Остаточная намагниченность Ультрадисперсных магнетиков. // Издательство дальневосточного университета, Владивосток, 2004. 192 с.

32. Crangle J. Solid State Magnetism. // Edward Arnold, London, UK, 1991.-256 p.

33. Labaye Y., Crisan O., Berger L., Greneche J.M., Coey J.M.D.Surface anisotropy in ferromagnetic nanoparticles. // J. Appl. Phys. 2002. - V. 91. - P. 8715-8717.

34. Garanin D.A., Kachkachi H. Surface contribution to the anisotropy of magnetic nanoparticles. // Phys. Rev. Lett. 2003. - V. 90. - P. 065504-065519.

35. Hormes J., Modrow H., Bonnemann H., Kumar C.S.S.R. The influence of various coatings on the electronic, magnetic, and geometric properties of cobalt nanoparticles (invited) // J. Appl. Phys. 2005. - V. 97, № 10. - P. 10R102-10R102-6.

36. Paulus P.M., Bonnemann H., van der Kraan A.M., Luis F., Sinzig J., de Jongh L.J. Magnetic properties of nanosized transition metal colloids: the influence of noble metal coating // Eur. Phys. J. D. 1999. - V. 9. - P. 501-504.

37. Thanh N.T.K., Green L.A.W. Functionalisation of nanoparticles for biomedical applications. // Nano Today. 2010. - V. 5. - P. 213-230.

38. Néel L. Théorie du traînage magnétique des ferromagnétiques en grains fins avec application aux terres cuites. // Ann. Géophys. 1949. - V. 5 - P. 99-136.

39. Chantrell R.W., Lyberatos A., El-Hilo M., O'Grady K. Time dependence effects in disordered systems // J. Appl. Phys. 1994. - V. 76. - P. 6368-6370.

40. Lopez-Diaz L., Torres L., Moro E. Transition from ferromagnetism to superparamagnetism on the nanosecond time scale // Phys. Rev. B. 2002. - V. 65. -P. 224406 (1-6).

41. Colloidal Hydrodynamics. (Ed. Ven Theo G.M.van de) // Academic Press Inc. London, U.K., 1989.-582 p.

42. Parsegian V.A., Weiss G.H., Spectroscopic parameters for computation of van der Waals forces // J.Colloid Interface Sci. 1981. -V. 81. - P. 285-289.

43. Фролов Ю.Г. Курс коллоидной химии. Поверхностные явления и дисперсные системы // Альянс, Москва, 2004. 464 с.

44. Handbook of Surface and Interface of Materials. In 5 V: V 3. (Ed. Nalwa H.S.) // Stanford Scientific Corp., Los Angeles, U.S.A., 2001. 2911 p.

45. Lefebure S., Dubois E., Cabuil V., Neveu S., Massart R. Monodisperse magnetic nanoparticles: Preparation and dispersion in water and oils. // J. Mater. Res. 1998. -V. 13.-P. 2975-2981.

46. Диполь-дипольное взаимодействие. Физическая энциклопедия Т.1 (Под. ред. Прохорова A.M.) Советская энциклопедия, Москва, 1988. 630 с.

47. Islam M.F., Lin К.Н., Lacoste D., Lubensky Т.С., Yodh A.G. Field induced structures in miscible ferrofluid suspension with and without latex spheres // Phys. Rev. E. 2003. - V. 67. - P. 021402-1-021402-8.

48. Richardi J. Assemblies of Magnetic Nanoparticles, In: Nanomaterials and Nanochemistry. (Eds. C.Brechignac, P.Houdy, M.Lahmani) Springer, 2008. P. 515528.

49. Stevens M.J., Grest G.S. Coexistence in dipolar fluids in a field. // Phys. Rev. Lett. -1994.-V. 72.-P. 3686-3689.

50. Kruse Т., Spanoudaki A., Pelster R. Monte Carlo simulations of polydisperse ferrofluids: Cluster formation and field-dependent microstructure. // Phys. Rev. B. -2003.-V. 68.-P. 542081-5420812.

51. Wang Z., Holm C. Structure and magnetization properties of polydispersed ferrofluids: A molecular dynamics study. // Phys. Rev. E. 2003. - V. 68. -P. 041401-1-041401-11.

52. Furst E.M., Gast A.P. Dynamics and lateral interactions of dipolar chains. // Phys. Rev. E. 2000. - V. 62. - P. 6916-6925.

53. Halsey T.C., Toor W. Structure of electrorheological fluids // Phys. Rev. Lett. -1990.-V. 65.-P. 2820-2823.

54. Бибик. E.E. Магнитооптический эффект агрегирования в поперечном электрическом поле // Коллоидный журн. 1970. - Т. 32, № 2. - С. 307.

55. Райхер Ю.Л. Физические свойства магнитных жидкостей. // УНЦ АН СССР, Свердловск, 1983. 58 с.

56. Sorokina O.N., Kovarski A.L., Lagutina М.А., Dubrovskii S.A., Dzheparov F.S. Magnetic Nanoparticles Aggregation in Magnetic Gel Studied by Electron Magnetic Resonance (EMR). //Appl. Sci. 2012. - V. 2. - P. 342-350.

57. Kovarski A.L., Sorokina O.N. Study of local magnetic fields and magnetic ordering in fluid and solid matrices containing magnetite nanoparticles using TEMPOL stable radical // J. Magn. Magn. Mater. 2007. - Vol. 311.- P. 155-161.

58. Джепаров Ф.С., Сорокина O.H., Коварский A.JI. Форма линии спектров ЭПР парамагнитных частиц в магнитной жидкости. Теория и эксперимент. // Письма в ЖЭТФ. 2009. - Т. 89, № 11. с. 665-669.

59. Sorokina O.N., Kovarski A.L., Dzheparov F.S. Estimation of the Oblongness of Aggregates of Magnetic Particles Formed in Static Magnetic Field Using ESR Spectroscopy//AIP Proceedings, 1311.-2010.-P. 96-102.

60. Ролдугин В.И. Физикохомия поверхности: Учебник-монография. // Долгопрудный: Издательский Дом «Интеллект», 2011. 568 С.

61. Pan Н, Qin М, Meng W, Cao Y, Wang W. How do proteins unfold upon adsorption on nanoparticle surfaces? // Langmuir. 2012. - V. 28(35). - P. 12779-12787.

62. Boyer C., Whittaker M.R., Bulmus V., Liu J., Davis T.P. The design and utility of polymer-stabilized iron-oxide nanoparticles for nanomedicine applications. // NPG Asia Mater. 2010. - V. 2. - P. 23-30.

63. Shen L., Laibinis P.E., Hatton T.A. Bilayer Surfactant Stabilized Magnetic Fluids: Synthesis and Interactions at Interfaces. // Langmuir. 1999. - V. 15. - P. 447-453.

64. Губин С.П., Катаева Н.А. Координационная химия наночастиц. // Координационная хим. 2006. - Т. 32, №12. - С. 883-893.

65. Xu C.J., Хи К.М., Gu H.W., Zheng R.K., Liu Н, Zhang Х.Х., Guo Z.H., Xu В. Dopamine as a robust anchor to immobilize functional molecules on the iron oxide shell of magnetic nanoparticles. // J. Am. Chem. Soc. 2004. - V. 126. - P. 99389939.

66. Wang L„ Yang Z.M., Gao J.H., Xu K.M., Gu H.W., Zhang В., Zhang X.X., Xu В. A Biocompatible Method of Decorporation: Bisphosphonate Modified Magnetite Nanoparticles to Remove Uranyl Ions from Blood. // J. Am. Chem. Soc. 2006. -V. 128.-P. 13358-13359.

67. Chen L.X., Liu Т., Thurnauer M.C., Csencsits R., Rajh T. Fe203 Nanoparticle Structures Investigated by X-ray Absorption Near-Edge Structure, Surface Modifications, and Model Calculations. // J. Phys. Chem. B. 2002. - V. 106. -P. 8539—8546.

68. Sahoo Y., Goodarzi A., Swihart M.T., Ohulchanskyy T.Y., Kaur N., Furlani E.P., Prasad P.N. Aqueous Ferrofluid of Magnetite Nanoparticles: Fluorescence Labeling and Magnetophoretic Control. // J. Phys. Chem. B. 2005. - V. 109. - P. 3879-3885.

69. Sahoo Y., Pizem H., Fried Т., Golodnitsky D., Burstein L., Sukenik C.N., Markovich G. Alkyl Phosphonate/Phosphate Coating on Magnetite Nanoparticles: A Comparison with Fatty Acids // Langmuir. 2001. - V. 17. - P. 7907-7911.

70. Patent US 20080299046, 2008.

71. White M.A., Johnson J.A., Koberstein J.Т., Turro N.J. Toward the Syntheses of Universal Ligands for Metal Oxide Surfaces: Controlling Surface Functionality through Click Chemistry. // J. Am. Chem. Soc. 2006. - V. 128. - P. 11356-11357.

72. Daou Т.J., Begin-Colin S., Greneche J.M., Thomas F., Derory A., Bernhardt P., Legare P., Pourroy G. Phosphate adsorption properties of magnetite-based nanoparticles // Chem. Mater. 2007. - V. 19. - P. 4494-4505.

73. Иржак В.И., Розенберг Б.А. О роли адсорбции в процессах получения неорганических наночастиц: кинетическая модель. // Коллоидный журн. 2009. -Т. 71, №2.-С. 186-193.

74. Cai W., Wan J. Facile synthesis of superparamagnetic magnetite nanoparticles in liquid polyols. // J.Colloid Interface Sci. 2007. - V. 305. - P. 366-370.

75. Lee J., Isobe Т., Senna M. Preparation of ultrafine Fe304 particles by precipitation in the presence of PVA at high pH. // J.Colloid Interface Sci. 1996. - V. 177. -P. 490-494.

76. Xu H., Yan F., Monson E.E., Kopelman R. Room-temperature preparation and characterization of poly (ethylene glycol)-coated silica nanoparticles for biomedical applications. // J. Biomed. Mater. Res. Part A. 2003. - V. 66. - P. 870-879.

77. Нехаев А.И. На все случаи жизни. Универсальные свойства полиэтиленимина. // Химия и жизнь. 1977. - Т. 7. - С. 24-27.

78. Wang X., Zhou L., Ma Y., Li X., Gu H. Control of Aggregate Size of Polyethyleneimine-Coated Magnetic Nanoparticles for Magnetofection. // Nano Res. -2009.-V. 2.-P. 365-372.

79. Cedervall Т., Lynch I., Foy M., Berggard Т., Donnelly S.C., Cagney G., Linse S., Dawson K.A. Detailed identification of plasma proteins adsorbed on copolymer nanoparticles. // Angew. Chem. Int. Ed. 2007. - V. 46. - P. 5754-5756.

80. Owens D.E., Peppas N.A. Opsonization, biodistribution, and pharmacokinetics of polymeric nanoparticles. // Int. J. Pharm. 2006. - V. 307. - P. 93-102.

81. Bulte J.W.M., Kraitchman D.L. Iron oxide MR contrast agents for molecular and cellular imaging. // NMR Biomed. 2004. - V. 17. - P. 484-489.

82. Chen Y.-J., Tao J., Xiong F., Zhu J.-B., Gu N., Zhang Y.-H., Ding Y., Ge L. Synthesis, self-assembly, and characterization of PEG-coated iron oxide nanoparticles as potential MRI contrast agent. // Drug Dev. Ind. Pharm. 2010. -V. 36.-P. 1235-1244.

83. Jain Т.К., Morales M.A., Sahoo S.K., Leslie-Pelecky D.L., Labhasetwar V. Iron oxide nanoparticles for sustained delivery of anticancer agents. // Mol. Pharm. -2005. V. 2, № 3. - P. 194-205.

84. Neuberger Т., Schopf B, Hofmann H., Hofmann M., von Rechenberg B. Superparamagnetic nanoparticles for biomedical applications: Possibilities and limitations of a new drug delivery system // J. Magn. Magn. Mater. 2005. - V. 293. -P. 483-496.

85. Першина А.Г., Сазонов А.Э., Мильто И.В. Использование магнитных наночастиц в биомедицине. // Бюллетень сибирской медицины. 2008. - Т. 2. -С. 70-78.

86. Vatta L.L., Sanderson D.R., Koch K.R. Magnetic nanoparticles: Properties and potential applications. // Pure Appl. Chem. 2006. - V. 78, № 9. - P. 1793-1801.

87. Shinkai M. Functional Magnetic Particles for Medical Application. // J. Biosci. Bioeng. 2002. - V. 94.-P. 606-613.

88. Berry C.C., Curtis A.S.G. Functionalisation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine. // J. Phys. D: Appl. Phys. 2003. - V. 36. - P. R198-R206.

89. Pankhurst Q.A., Connolly J., Jones S.K., Dobson J. Applications of Magnetic Nanoparticles in Biomedicine // J. Phys. D: Appl. Phys. 2003. - V. 36. - P. R167-R181.

90. Mornet S., Vasseur S., Grasset F., Duguet E. Magnetic nanoparticle design for medical diagnosis and therapy // J. Mater. Chem. 2004. - V. 14. - P. 2161-2175.

91. Lu A.H., Salabas E.L., Schiith F. Magnetic Nanoparticles: Synthesis, Protection, Functionalization, and Application. // Angew. Chem. Int. Ed. 2007. - V. 46. -P. 1222-1244.

92. Trahms L. Biomedical Applications of Magnetic Nanoparticles. // Lect. Notes Phys. 2009. - V. 763. - P. 327-358.

93. Safarik I., Safarikova M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. // Biomagn. Res. Technol. 2004. - V. 2, № 1. - P. 7.

94. Sonti S., Bose A. Cell-separation using protein-a-coated magnetic nanoclusters. // J. Colloid Interface Sci. 1995. - V. 170. - P. 575-585.

95. Gao Y. Biofunctionalization of Magnetic Nanoparticles, In: Nanotechnologies for the Life Sciences (Ed. C.Kumar), Vol. 1, Wiley: New York. 2005. P. 72-98.

96. Gu H., Xu K., Xu C., Xu B., Biofunctional magnetic nanoparticles for protein separation and pathogen detection. // Chem. Commun. 2006. - P. 941-949.

97. Safarik I., Safarikova M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. // J Chromatogr. B Biomed Sci Appl. 1999. - V. 722. - P. 33-53.

98. Vadala M.L., Zalich M.A., Fulks D.B., St.Pierre T.G., Dailey J.P., Riffle J.S. Cobalt-silica magnetic nanoparticles with functional surfaces. // J. Magn. Magn. Mater. -2005.-V. 293.-P. 162-170.

99. Miiller R., Steinmetz H., Hiergeist R., Gawalek W. Magnetic particles for medical applications by glass crystallization. // J. Magn. Magn. Mater. 2004. - V. 272-276. -P. 1539-1541.

100. Hafeli U.O., Pauer G.J. In vitro and in vivo toxicity of magnetic microspheres. H J. Magn. Magn. Mater. 1999. - V. 194. - P. 76-82.

101. Jeng H.A., Swanson J. Toxicity of Metal Oxide Nanoparticles in Mammalian Cells. // J. Environ. Sci. Health, Part A. 2006. - V. 41:12. - P. 2699-2711.

102. Schulze E., Ferrucci J.T.Jr., Poss K., Lapointe L., Bogdanova A., Weissleder R. Cellular uptake and trafficking of a prototypical magnetic iron oxide label in vitro. // Invest. Radiol. 1995. -V. 30. - P. 604-610.

103. Weissleder R., Stark D.D., Engelstad B.L., Bacon B.R., Compton C.C., White D.L., Jacobs P., Lewis J. Superparamagnetic iron oxide: pharmacokinetics and toxicity. // AJRAm. J.Roentgenol.- 1989.-V. 152.-P. 167-173.

104. Soenen S.J., De Cuyper M. Assessing cytotoxicity of (iron oxide-based) nanoparticles: an overview of different methods exemplified with cationic magnetoliposomes. // Contrast Media Mol. Imaging. 2009. - V. 4. - P. 207-219.

105. Doraiswamy P.M., Finefrock A.E. Metals in our minds: therapeutic implications for neurodegenerative disorders. // Lancet Neurol. 2004. V. 3. - P. 431-434.

106. Huang Y.-W., Wu Ch.-H., Aronstam R.S. Toxicity of Transition Metal Oxide Nanoparticles: Recent Insights from in vitro Studies. // Materials. 2010. - V. 3. -P. 4842-4859.

107. Freeman M.W., Arrot A., Watson J.H.L. Magnetism in Medicine. // J. Appl. Phys. -1960.-V. 31.-P. S404-405.

108. Torchilin V.P. Drug Targeting. // Eur. J. Pharm. Sci. 2000. - V. 11. - P. S81-91.

109. Arruebo M., Fernández-Pacheco R., Ibarra M.R., Santamaría J. Magnetic nanoparticles for drug delivery. // Nanotoday. 2007. - V. 2. - P. 22-32.

110. Ahn C.H., Choi J.W., Cho H.J. In: Encyclopedia of Nanoscience and Nanotechnology. Vol. 6 (Ed. H.S.Nalwa). // American Scientific Publishers, Stevenson Ranch, CA, 2004. 815 p.

111. Zhang J., Misra R.D.K. Magnetic drug-targeting carrier encapsulated with thermosensitive smart polymer: Core-shell nanoparticle carrier and drug release response. // Acta Biomater. 2007. - V. 3. - P. 838-850.

112. Штильман М.И. Полимеры медико-биологического назначения. // Высокомолек. соед., Сер. А. -2010. Т. 52, №9.-С. 1551-1569.

113. Vogelson С.Т. Advances in drug delivery systems. Modern Drug Discovery from concept to development. // Focus: Nanotechnol. 2001. - V. 4, № 4. -PP. 49-50, 52.

114. Scherer F., Anton M., Schillinger U., Henke J., Bergemann C., Krtlger A., Gansbacher B., Plank C. Magnetofection: enhancing and targeting gene delivery by magnetic force in vitro and in vivo. // Gene Ther. 2002. - V. 9. - P. 102-109.

115. Krotz F., Sohn H.Y., Gloe T., Plank C., Pohl U. Magnetofection potentiates gene delivery to cultured endothelial cells. // J. Vase. Res. 2003. - V. 40. - P. 425-434.

116. Prijic S., Sersa G. Magnetic nanoparticles as targeted delivery systems in oncology. // Radiol. Oncol. 2011. - V. 45(1). - P. 1-16.

117. Nichol C., Kim E.E. Molecular imaging and gene therapy. // J. Nucl. Med. 2001. -V. 42.-P. 1368-1374.

118. Russ V., Wagner E. Cell and tissue targeting of nucleic acids for cancer gene therapy. // Pharm Res. 2007. - V. 24. - P. 1047-1057.

119. Lu Y., Madu C.O. Viral-based gene delivery and regulated gene expression for targeted cancer therapy. // Expert Opin. Drug Deliv. 2010. - V. 7. - P. 19-35.

120. Koh I., Josephson L. Magnetic nanoparticle sensors. // Sensors. 2009. -V. 9. -P. 8130-8145.

121. Koenig S.H., Keller K.E. Theory of 1/T1 and 1/T2 NMRD profiles of solutions of magnetic nanoparticles. // Magn. Reson. Med. 1995. - V. 34. - P. 227-233.

122. Tartaj P. In: Encyclopedia of Nanoscience and Nanotechnology. Vol. 1. (Ed. Nalwa H.S.), American Scientific Publishers, Stevenson Ranch, CA, 2004. -P. 177.

123. Sun C., Lee J.S.H., Zhang M. Magnetic nanoparticles in MR imaging and drug delivery. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2008. - V. 60. - P. 1252-1265.

124. McDermott S., Guimaraes A.R. Magnetic Nanoparticles in the Imaging of Tumor Angiogenesis. // Appl. Sci. 2012. - V. 2. - P. 525-534.

125. Zandonella C. Cell nanotechnology: the tiny toolkit. // Nature. 2003. -V. 423(6935).-P. 10-12.

126. Wunderbaldinger P., Josephson L., Weissleder R. Crosslinked iron oxides (CLIO): a new platform for the development of targeted MR contrast agents. // Acad Radiol. -2002,-V. 9.-P. S304-S306.

127. Nune S.K., Gunda P., Thallapally P.K., Lin Y.Y., Forrest M.L., Berkland C.J. Nanoparticles for biomedical imaging. // Expert Opin. Drug Deliv. 2009. - V. 6. -P.1175-1194.

128. Pankhurst Q.A., Thanh N.K.T., Jones S.K., Dobson J. Progress in applications of magnetic nanoparticles in biomedicine. // J. Phys. D: Appl. Phys. 2009. -V. 42. -P. 22401.

129. Sosnovik D.E., Nahrendorf M., Weissleder R. Magnetic nanoparticles for MR imaging: agents, techniques and cardiovascular applications. // Basic Res. Cardiol. -2008.-V. 103(2).-P. 122-130.

130. Weissleder R., Elizondo G., Wittenberg J., Rabito C.A., Bengele H.H., Josephson L. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: characterization of a new class of contrast agents for MR imaging. // Radiology. 1990. - V. 175. - P. 489-493.

131. Chertok B., David A.E., Moffat B.A., Yang V.C. Substantiating in vivo magnetic brain tumor targeting of cationic iron oxide nanocarriers via adsorptive surface masking. // Biomaterials. 2009. - V. 30. - P. 6780-6787.

132. Jun Y.-W., Lee J.-H., Cheon J. Chemical design of nanoparticle probes for highperformance magnetic resonance imaging. // Angew. Chem. Int. Ed. 2008. - V. 47. -P. 5122-5135.

133. Neilsen O.S., Horsman M., Overgaard J. A future hyperthermia in cancer treatment. //Eur. J. Cancer.-2001.-V. 37.-P. 1587-1589.

134. Babincova M., Sourivong P., Leszczynska D., Babinec P. Blood-specific whole-body electromagnetic hyperthermia. // Med. Hyptoth. 200. - V. 55. - P. 459-460.

135. Rosensweig R.E. Heating magnetic fluid with alternating magnetic field. // J. Magn. Magn. Mater. 2002. - V. 252. - P. 370-374.

136. Jordan A., Wust P., Fahling H., John W., Hinz A., Felix R. Inductive heating of ferrimagnetic particles and magnetic fluids Physical evaluation of their potential for hyperthermia. // Int. J. Hyperthermia. - 1993. - V. 9. - P. 51-68.

137. Kuznetsov A.A., Shlyakhtin O.A., Brusentsov N.A., Kuznetsov O.A. "Smart" mediators for self-controlled inductive heating // Eur. Cells Mater. 2002. - V. 3. -P. 75-77.

138. Sharifi I., Shokrollahi H., Amiri S. Ferrite-based magnetic nanofluids used in hyperthermia applications. // J. Magn. Magn. Mater. 2012. - V. 324. - P. 903-915.

139. Brannon-Peppas L., Blanchette J.O. Nanoparticle and targeted systems for cancer therapy. // Adv. Drug. Del. Rev. 2004. - V. 56. - P. 1649-1659.

140. Matsumura Y., Maeda H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. // Cancer Res. 1986. - V. 46. - P. 6387-6392.

141. Zhao X., Li H., Lee R.J. Targeted drug delivery via folate receptors. // Expert Opin. Drug Deliv. 2008. - V. 5,№3.-P. 309-319.

142. Weissleder R., Kelly K., Sun E.Y., Shtatland Т., Josephson L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. // Nat. Biotech. -2005.-V. 23.-P. 1418-1423.

143. Choi J., Lee J.I, Lee Y.B, Honga J.H, Kim I.S, Park Y.K, Hur N.H. Chem Immobilization of biomolecules on biotinylated magnetic ferrite nanoparticles. // Chem. Phys. Lett. 2006. - V. 428. - P. 125-129.

144. Narain R, Gonzales M, Hoffman A.S, Stayton P.S, Krishnan K.M. Synthesis of Monodisperse Biotinylated p(NIPAAm)-Coated Iron Oxide Magnetic Nanoparticles and their Bioconjugation to Streptavidin. // Langmuir. 2007. - V. 23(11). -P. 6299-6304.

145. Boyer C, Bulmus V, Priyanto P, Teoh W.Y, Amal R, Davis T.P. Stabilisation and bio-functionalisation of iron oxide nanoparticles using heterotelechelic polymers. // J. Mater. Chem. 2009. - V. 19. - P. 111-123.

146. Pirko I, Johnson A, Ciric B, Gamez J, Macura S.I, Pease L.R, Rodriguez M. In vivo magnetic resonance imaging of immune cells in the central nervous system with superparamagnetic antibodies. // FASEB J. 2004. - V. 18. - P. 179-182.

147. Carter P. Improving the efficacy of antibody- based cancer therapies. // Nat. Rev. Cancer.-2001.-V. l.-P. 118-129.

148. Кульбачинский A.B. Методы отбора аптамеров к белковым мишеням. // Усп. биол. хим. 2006. - Т. 46 - С. 193-224.

149. Gu F, Zhang L, Teply B.A, Mann N, Wang A, Radovic-Moreno A.F, Langer R, Farokhzad O.C. Precise engineering of targeted nanoparticles by using self-assembled biointegrated block copolymers. // Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 2008. -V. 105.-P. 2586-2591.

150. Sperling R.A. Surface Modification and Functionalization of Colloidal Nanoparticles. Ph.D. Dissertation, der Philipps-Universitat, Marburg/Lahn, 2008. -185 p.

151. Byrne J.D., Betancourt T., Brannon-Peppas L. Active targeting schemes for nanoparticle systems in cancer therapeutics. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2008. -V. 60.-P. 1615-1626.

152. Hafeli U.O. Magnetically modulated therapeutic systems // Int. J. Pharm. 2004. -V. 277.-P. 19-24.

153. Liibbe A.S., Alexiou C., Bergemann C. Clinical Applications of Magnetic Drug Targeting. // J. Surg. Res. 2001. - V. 95. - P. 200-206.

154. Plank C., Schillinger U., Scherer F., Bergemann C., Remy J.S., Krotz F., Anton M., Lausier J., Rosenecker J. The magnetofection method: using magnetic force to enhance gene delivery. // Biol. Chem. 2003. - V. 384. - P. 737-747.

155. Rosensweig R.E. In Ferrohydrodynamics. Dover Publications, Inc., Mineola, New York, 1985.-333 p.

156. Babincova M., Babinec P., Bergemann C. High-gradient magnetic capture of ferrofluids: Implications for drug targeting and tumor embolization. // Zeitschrift fur Naturforschung Sect. C J. Biosci. - 2001. - V. 56. - P. 909-911.

157. Beni C.E., Bruno O.P. Accurate Algorithm Enabling Efficient Solution of a Drug Delivery Problem. // In Proceedings of Southwest Conference on Integrated Mathematical Methods in Medical Imaging in preparation. Tempe, Arizona, USA, 2010.-P. 3.

158. Ganguly R., Gaind A.P., Sen S., Puri I.K. Analyzing ferrofluid transport for magnetic drug targeting. // J. Magn. Magn. Mater. 2005. - V. 289 - P. 331-334.

159. Li X.L., Yao K.L., Liu Z.L. CFD study on the magnetic fluid delivering in the vessel in high-gradient magnetic field. // J. Magn. Magn. Mater. 2008. - V. 320. -P.1753-1758.

160. Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carriers (Eds. U.Hafeli, W.Schutt, J.Teller, M.Zbrorowski). // Plenum Press, New York, 1997. 652 p.

161. Gao H., Shi W., Freund L.B. Mechanics of receptormediated endocytosis. // Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. -2005. -V. 102. P. 9469-9474.

162. Alexis F., Pridgen E., Molnar L.K., Farokhzad O.C. Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles. // Mol. Pharmaceutics. 2008. - V. 5. -P. 505-515.

163. Dobrovolskaia M.A., McNeil S.E. Immunological properties of engineered nanomaterials. // Nat. Nanotechnol. 2007. - V. 2. - P. 469-478.

164. McNeil S.E. Nanoparticle therapeutics: A personal perspective. // WIREs Nanomed. Nanobiotechnol. -2009. V. 1. - P. 264-271.

165. Nel A.E., Madler L., Velegol D., Xia T., Hoek E.M.V., Somasundaran P., Klaessig F., Castranova V., Thompson M. Understanding biophysicochemical interactions at the nano-bio interface. // Nat. mater. 2009. - V. 8(7). - P. 543-557.

166. Petri-Fink A., Chastellain M., Juillerat-Jeanneret L., Ferrari A., Hofmann H. Development of functionalized superparamagnetic iron oxide nanoparticles for interaction with human cancer cells. // Biomaterials. 2005. - V. 26. - P. 2685-2694.

167. Papisov M.I., Bogdanov Jr. A., Schaffer B., Nossiff N., Shen T., Weissleder R., Brady T.J. Colloidal magnetic resonance contrast agents: effect of particle surface on biodistribution. // J. Magn. Magn. Mater. 1993. - V. 122. - P. 383-386.

168. Decuzzi P., Ferrari M. The role of specific and nonspecific interactions in receptormediated endocytosis of nanoparticles. // Biomaterials. 2007. - V. 28. -P.2915-2922.

169. Gao H., Shi W., Freund L.B. Mechanics of receptormediated endocytosis. // Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 2005. - V. 102. - P. 9469-9474.

170. Saltzman W.M. Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy. // Oxford University Press, New York, 2001. 327 p.

171. Prabha S., Zhou W.Z., Panyam J., Labhasetwar V. Size-dependency of nanoparticle-mediated gene transfection: studies with fractionated nanoparticles. // Int. J. Pharm. -2002.-V. 244.-P. 105-115.

172. Longmire M., Choyke P.L., Kobayashi H. Clearance properties of nano-sized particles and molecules as imaging agents: considerations and caveats. // Nanomedicine. 2008. - V. 3. - P. 703-717.

173. Zolnik B.S., Gonzalez-Fernandez A., Sadrieh N., Dobrovolskaia M.A. Minireview: Nanoparticles and the Immune System // Endocrinol. -2010. V. 151. - P. 458— 465.

174. Inoue K., Takano H., Yanagisawa R., Sakurai M., Ichinose T., Sadakane K., Yoshikawa T. Effects of nano particles on antigen-related airway inflammation in mice. // Respir. Res. 2005. - V. 6. - P. 106.

175. Verma A., Stellacci F. Effect of Surface Properties on Nanoparticle-Cell Interactions //Small.-2010.-V. 6.-P. 12-21.

176. Leroueil P.R. Wide varieties of cationic nanoparticles induce defects in supported lipid bilayers. // Nano Lett. 2008. - V. 8. - P. 420^124.

177. Goodman C.M., McCusker C.D., Yilmaz T.; Rotello V.M. Toxicity of gold nanoparticles functionalized with cationic and anionic side chains. // Bioconjugate Chem. 2004. - V. 15. - P. 897-900.

178. Huang Y.-W., Wu Ch.-H. Aronstam R.S. Toxicity of Transition Metal Oxide Nanoparticles: Recent Insights from in vitro Studies. // Materials. 2010. - V. 3. -P.4842-4859.

179. Lewinski N., Colvin V., Drezek R. Cytotoxicity of Nanoparticles. // Small. 2008. -V. 4.-P. 26-49.

180. Mahmoudi M., Hofmann H., Rothen-Rutishauser B., Petri-Fink A. Assessing the In Vitro and In Vivo Toxicity of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles. // Chem. Rev. 2012. - V. 112(4). - P. 2323-2338.

181. Du G.H., Liu Z.L., Xia X., Jia L.H., Chu Q., Zhang S.M. Functionalization of Fe304 magnetic nanoparticles. // Nanoscience. 2006. - V. 11(1). - P. 49-54.

182. Peng Z.G., Hidajat K., Uddin M.S. Adsorption of bovine serum albumin on nanosized magnetic particles. // J. Colloid Interface Sci. 2004. - V. 271. - P. 277283.

183. Wang W.-C., Neoh K.-G., Kang E.-T. Surface functionalization of Fe304 Magnetic Nanoparticles via RAFT-Mediated Graft Polymerization. // Macromol. Rapid Com. -2006.-V. 27.-P. 1665-1669.

184. Na H.B., Lee I.S., Seo H„ Park Y.I., Lee J.H., Kim S.-W., Hyeon T. Versatile PEG-derivatized phosphine oxide ligands for water-dispersible metal oxide nanocrystals. // Chem. Commun. 2007. - V. 48. - P. 5167-5169.

185. Cheng K., Peng S., Xu C., Sun S. Porous Hollow Fe304 Nanoparticles for Targeted Delivery and Controlled Release of Cisplatin. // J. Am. Chem. Soc. 2009. - V. 131. -P. 10637-10644.

186. Yu M.K., Jeong Y.Y., Park J., Park S., Kim J.W., Min J.J., Kim K., Jon S. Drug-Loaded Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles for Combined Cancer Imaging and Therapy In Vivo. // Angew. Chem. Int. Ed. 2008. - V. 47. - P. 5362-5365.

187. Denizot B., Tanguy G., Hindre F., Rump E., Jeune J., Jallet P. Phosphorylcholine coating of iron oxide nanoparticles. // J. Colloid Interface Sci. 1999. - V. 209(1). -P. 66-71.

188. Lin C.L., Lee C.F., Chiu W.Y. Preparation and properties of poly(acrylic acid) oligomer stabilized superparamagnetic ferrofluid. // J. Colloid Interface Sci. 2005. -V. 291.-P. 411-420.

189. Lu L.T., Tung L.D., Robinson I., Ung D., Tan B., Long J., Cooper A.I., Fernig D.G., Thanh N.T.K. Size and shape control for water-soluble magnetic cobalt nanoparticles using polymer ligands. // J. Mater. Chem. 2008. - V. 18. - P. 2453-2458.

190. Kandori K., Fukuoka M., Ishikawa T. Effects of citrate ions on the formation of ferric oxide hydroxide particles // J. Mater. Sci. 1991. - V. 26. - P. 3313-3319.

191. Giri J., Thakurta S.G., Bellare J., Nigam A.K., Bahadur D. Preparation and characterization of phospholipid stabilized (PC) uniform sized magnetite nanoparticles // J. Magn. Magn. Mater. 2005. - V. 293. - P. 62-68.

192. Kim S.W., Kim S., Tracy J.B., Jasanoff A. Bawendi M.G. Phosphine Oxide Polymer for Water-Soluble Nanoparticles // J. Am. Chem. Soc. 2005. - V. 127. - P. 45564557.

193. Babincova M., Cicmanec P., Altanerova V., Altaner C., Babinec P. AC-magnetic field controlled drug release from magnetoliposomes: design of a method for site-specific chemotherapy. // Bioelectrochemistry. 2002. - V. 55. - P. 17-19.

194. Lattuada ML Hatton T.A. Functionalization of Monodisperse Magnetic Nanoparticles. //Langmuir. 2007. - V. 23. - P. 2158-2168.

195. Deng Y., Yang W., Wang C., Fu S. A Novel Approach for Preparation of Thermoresponsive Polymer Magnetic Microspheres with Core-Shell Structure. // Adv. Mater.-2003.-V. 15.-P. 1729-1732.

196. Gupta A.K., Wells S. Surface modified superparamagnetic nanoparticles for drug delivery: preparation, characterization and cytotoxicity studies. // IEEE Trans Nanobiosci. 2004. -,V. 3. - P. 66-73.

197. Штильман М.И. Полимеры в биологически активных системах. // Соросовский образовательный журн. 1998. - Т. 5. - С. 48-53.

198. Tomitaka A., Yamada Т., Takemura Y. Magnetic Nanoparticle Hyperthermia Using Pluronic-Coated Fe304 Nanoparticles: An In Vitro Study. // J. Nanomater. 2012. -V. 2012.-P. 480626-480630.

199. Albornoz C., Jacobo S.E. Preparation of a biocompatible magnetic film from an aqueous ferrofluid. // J. Magn. Magn. Mater. 2006. - V. 305. - P. 12-15.

200. Гембицкий П.А., Жук Д.С., Каргин В.А. Полиэтиленимин. Наука, Москва, 1971.-204 с.

201. Wei W., Xu С., Wu Н. Use of PEI-coated magnetic iron oxide nanoparticles as gene vectors. // J. Huazhong Univ. Sci. Technol. Med. Sci. 2004. - V. 24. - P. 618-620.

202. Zhang Y., Kohler N., Zhang M. Surface modification of superparamagnetic magnetite nanoparticles and their intracellular uptake. // Biomaterials. 2002. -V. 23-P. 1553-1561.

203. Klibanov A.L., Maruyama K., Torchilin V.P., Huang L. Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes. // FEBS Lett. 1990. - V. 268. - P. 235-237.

204. Prencipe G., Tabakman S.M., Welsher K., Liu Z., Goodwin A.P., Zhang L., Henry J., Dai H. PEG Branched Polymer for Functionalization of Nanomaterials with Ultralong Blood Circulation. // J. Am. Chem. Soc. 2009. - V. 131. - P. 4783-4787.

205. Xu L., Kim M.-J., Kim K.-D., Choa Y.-H., Kim H.-T. Surface modified Fe304 nanoparticles as a protein delivery vehicle. // Colloids Surf. A. 2009. - V. 350. - P. 8-12.

206. Berry C.C., Wells S., Charles S., Curtis A.S.G. Dextran and albumin derivatised iron oxide nanoparticles: influence on fibroblasts in vitro. // Biomaterials. 2003. - V. 24. -P. 4551-4557.

207. Schwalbe M., Buske N., Vetterleinr M., Höffken K., Pachmann K., Clementr J.H. The Carboxymethyl Dextran Shetl is an Important Modulator of Magnetic Nanoparticle Uptake in Human Cells. // J. Phys. Chem. 2006. - V. 220. - P. 125131.

208. Osborne E.A., Atkins T.M., Gilbert D.A., Kauzlarich S.M., Liu K., Louie A.Y. Rapid microwave-assisted synthesis of dextran-coated iron oxide nanoparticles for magnetic resonance imaging. //Nanotechnology. -2012. -V. 23. P. 215602.

209. Shih L.B., Goldenberg D.M., Xuan H„ Lu H., Sharkey R.M., Hall T.C. Anthracycline immunoconjugates prepared by a site-specific linkage via an amino-dextran intermediate carrier // Cancer Res. 1991. - V. 51. - P. 4192-4198.

210. Josephson L., Tung C.H., Moore A., Weissleder R. High-Efficiency Intracellular Magnetic Labeling with Novel Superparamagnetic-Tat Peptide Conjugates. // Bioconjugate Chem. 1999. - V. 10. - P. 186-191.

211. Patel M.P., Patel R.R., Patel J.K. Chitosan Mediated Targeted Drug Delivery System: A Review. // J. Pharm. Pharm. Sei. 2010. - V. 13. - P. 536-557.

212. Patent US 20110110868, 2011.

213. Koneracka M., Kopcansky P., Antalik M., Timko M., Ramchand C.N., Lobo D., Mehta R., Upadhyay R.V. Immobilization of proteins and enzymes to fine magnetic particles // J. Magn. Magn. Mater. 1999. - V. 201. - P. 427-430.

214. Wunderbaldinger P., Josephson L., Weissleder R. Tat peptide directs enhanced clearance and hepatic permeability of magnetic nanoparticles. // Bioconjugate Chem. -2002. V. 13.-P. 264-268.

215. Nishimura К, Hasegawa M, Ogura Y, Nishi T, Kataoka K, Handa H, Abe M. 4°C preparation of ferrite nanoparticles having protein molecules immobilized on their surfaces. // J. Appl. Phys. 2002. -V. 91. - P. 8555-8556.

216. Ho K.C, Tsai P.J, Lin Y.S, Chen Y.C. Using biofiinctionalized nanoparticles to probe pathogenic bacteria. // Anal. Chem. 2004. - V. 76. - P. 7162-7168.

217. Safarik I, Ptackova L, Koneracka M, Safarikova M, Timko M, Kopcansky P. Determination of selected xenobiotics with ferrofluid-modified trypsin. // Biotechnol. Lett. 2002. - V. 24. - P. 355-358.248. Патент РФ 236751, 2009.

218. Ohmori M, Matijevic E. Preparation and Properties of Uniform Coated Inorganic Colloidal Particles 8. Silica on Iron // J. Colloid Interface Sci. 1993. - V. 160. -P. 288-292.

219. Fu W, Yang H, Chang L, Li M, Bala H, Yu Q, Zou G. Preparation and characteristics of core-shell structure nickel/silica nanoparticles. // Colloids Surf. A. -2005. V. 262.-P. 71-75.

220. Kobayashi Y, Horie M, Konno M, Rodriguez-Gonzalez B, Liz-Marzan L.M. Preparation and Properties of Silica-Coated Cobalt Nanoparticles. //J. Phys. Chem. B. 2003. - V. 107. - P. 7420-7425.

221. Connolly J, Pierre T.G.St, Rutnakornpituk M, Riffle J.S. Silica coating of cobal nanoparticles increases their magnetic and chemical stability for biomedical applications. // Eur. Cells Mater. 2002. - V. 3. - P. 106-109.

222. Wagner J, Autenrieth T, Hempelmann R. Core shell particles consisting of cobalt ferrite and silica as model ferrofluids CoFe204 -Si02 core shell particles. // J. Magn. Magn. Mater. 2002. - V. 252. - P. 4-6.

223. Vestal C.R, Zhang Z.J. Synthesis and Magnetic characterization of Mn and Co spinel ferrite -silica nanoparticles with tunable magnetic core. // Nano Lett. 2003. -V. 3.-P. 1739-1743.

224. Chaneac C, Tronc E, Jolivet J.P. Magnetic iron oxide-silica nanocomposites. Synthesis and characterization. //J. Mater. Chem. 1996. - V. 6. - P. 1905-1911.

225. Andrade A.L, Souza D.M, Pereira M.C, Fabris J.D, Domingues R.Z. Synthesis and characterization of magnetic nanoparticles coated with silica through a sol-gel approach. // Ceramica. 2009. - V. 55. - P. 420-424.

226. Popovici M, Savii C, Enache C, Niziiansky D, Subrt I, Vecemikova E. Sol-gel derived iron oxide-silica nanocomposites, starting from iron chloride and iron nitrate. // J. Optoelectron. Adv. Mater. 2005. - V. 7, № 5. - P. 2753-2762.

227. Stöber W., Fink A., Bohn E.J. Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range. // J. Colloid Interface Sei. 1968. - V. 26. - P. 62-69.

228. Li Y.-S., Church J.S., Woodhead A.L., Moussa F. Spectrochim. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. // Spectrochim. Acta, Part A. 2010. - V. 76. - P. 484-489.

229. Ismail A.M., Ibrahim A.A., Zikry F., Sharaf M.A. Preparation of spherical silica nanoparticles: Stober silica. // J. Am. Sei. 2010. - V. 6(11). - P. 985-989.

230. Wang G., Harrison A. Preparation of Iron Particles Coated with Silica. // J. Colloid Interface Sei. 1999. - V. 217. - P. 203-207.

231. Taira S., Moritake S., Hatanaka T., Ichiyanagi Y., Setou M. Micro and Nano Technologies in Bioanalysis, In: Methods in Molecular Biology. Chapter 36 (Eds. Weifu Lee J.and Foote R.S.) Springer, 2009. V. 544. - 668 p.

232. Giani G., Fedi S., Barbucci R. Hybrid Magnetic Hydrogel: A Potential System for Controlled Drug Delivery by Means of Alternating Magnetic Fields. // Polymers. -2012. V. 4. - P. 1157-1169.

233. Mashhadizadeh M.H., Amoli-Diva M. Drug-Carrying Amino Silane Coated Magnetic Nanoparticles as Potential Vehicles for Delivery of Antibiotics. // Nanomed. Nanotechol. 2012. - V. 3-4. - P. 1000139-1000145.

234. De Palma R., Peeters S., Van Bael M.J., Van den Rul H., Bonroy K., Laureyn W., Mullens J., Borghs G., Maes G. Silane Ligand Exchange to Make Hydrophobic Superparamagnetic Nanoparticles Water-Dispersible. // Chem. Mater. 2007. -V. 19. -P. 1821-1831.

235. B rul lot W., Reddy N.K., Wouters J., Valev V.K., Goderis B., Vermant J., Verbiest T. Versatile ferro fluids based on polyethylene glycol coated iron oxide nanoparticles. // J. Magn. Magn. Mater. 2012. - V. 324(11). - P. 1919-1925.

236. Graf C., Vossen D.L.J., Imhof A., Van Blaaderen A. A general method for the controlled embedding of nanoparticles in silica colloids. // Langmuir. 2003. -V. 19.-P. 6693-6700.

237. Nikitenko S.I., Koltypin Y., Palchik O., Feiner I., Xu X.N., Gedanken A. Synthesis of Highly Magnetic, Air-Stable Iron-Iron Carbide Nanocrystalline Particles by Using Power Ultrasound. // Angew. Chem. 2001. - V. 113. - P. 4579-4581.

238. Melancon M.P., Li C. Core-Shell Magnetic Nanomaterials in Medical Diagnosis and Therapy. In: Magnetic Nanomaterials (Ed. C.S.S.R.Kumar). Wiley-VCH. Weinheim, Germany, 2009. P. 259-290.

239. Faraji M., Yamini Y., Rezaee M. Magnetic Nanoparticles: Synthesis, Stabilization, Functionalization, Characterization, and Applications. // J. Iran. Chem. Soc. 2010. -V. 7.-P. 1-37.

240. Sounderya N., Zhang Y. Use of Core-Shell structured nanoparticles for biomedical applications. // Recent Pat. Biomed. Eng. 2008. - V. 1. - P. 34-42.

241. Andrés-Vergés M., del Puerto Morales M., Veintemillas-Verdaguer S., Palomares F.J., Serna C.J. Core/Shell Magnetite/Bismuth Oxide Nanocrystals with Tunable Size, Colloidal, and Magnetic Properties. // Chem. Mater. 2012. - V. 24(2).-P. 319-324.

242. Tiwari P.M., Vig K., Dennis V.A., Singh S.R. Functionalized Gold Nanoparticles and Their Biomedical Applications. //Nanomaterials. 2011. - V. 1. - P. 31-63.

243. Chen M., Yamamuro S., Farrell D., Majetich S.A. Gold-coated iron nanoparticles for biomedical applications. //J. Appl. Phys. 2003. -V. 93. - P. 7551-7553.

244. Cho S.-J., Idrobo J.-C., Olamit J., Liu K., Browning N.D., Kauzlarich S.M. Growth Mechanisms and Oxidation Resistance of Gold-Coated Iron Nanoparticles. // Chem. Mater.-2005.-V. 17.-P. 3181-3186.

245. Ban Z., Barnakov Y.A., Li F., Golub V.O., O'Connor C.J. The Synthesis of Core-Shell Iron@Gold Nanoparticles and Their Characterization. // J. Mater. Chem. -2005.-V. 15.-P. 4660-4662.

246. Bao Y., Krishnan K.M. Preparation of functionalized and goldcoated cobalt nanocrystals for biomedical applications. // J. Magn. Magn. Mater. 2005. - V. 293. -P. 15-19.

247. Cheng G., Hight Walker A.R. Synthesis and characterization of cobalt/gold bimetallic nanoparticles. // J. Magn. Magn. Mater. 2007. -V. 311(1). -P. 31-35.

248. Carpenter E.E. Iron nanoparticles as potential magnetic carriers. // J Magn. Magn. Mater.-2001.-V. 225.-P. 17-20.

249. Caruntu D., Cushing B.L., Caruntu G., O'Connor C.J. Attachment of gold nanograms onto colloidal magnetite nanocrystals. // Chem. Mater. 2005. - V. 17. - P. 33983402.

250. Wu W., He Q., Chen H., Tang J., Nie L. Sonochemical synthesis, structure and magnetic properties of air-stable Fe304/Au nanoparticles. // Nanotechnology. 2007. -V. 18.-P. 145609.

251. Lin J., Zhou W., Kumbhar A., Fang J., Carpenter E.E., O'Connor C.J. Gold-Coated Iron (Fe@Au) Nanoparticles: Synthesis, Characterization, and Magnetic Field-Induced Self-Assembly. // J. Solid State Chem. 2001. - V. 159. - P. 26-31.

252. Thomas M., Klibanov A.M. Conjugation to gold nanoparticles enhances polyethylenimines transfer of plasmid DNA into mammalian cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.-2003.-V. 100.-P. 9138-9143.

253. Shi F., Hui W. Facile approach to modification of Fe304/Au assembled composite nanoparticles. // J. Optoelectron. Adv. Mater. 2011. - V. 13, № 2. - P. 141-145.

254. Migneault I., Dartiguenave C., Bertrand M.J., Waldron K.C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. // BioTechniques. 2004. - V. 37, № 5. - P. 790-801.

255. Sun E.Y., Josephson L., Weissleder R. Clickable' nanoparticles for targeted imaging. // Mol. Imaging. 2006. - V. 5(2). - P. 122-128.

256. Sun E.Y., Josephson L., Kelly K.A., Weissleder R. Development of Nanoparticle Libraries for Biosensing. // Bioconjugate chem. 2006. - V. 17. - P. 109-113.

257. Sun J., Li Y., Liang X.-J., Wang P.C. Bacterial Magnetosome: A Novel Biogenetic Magnetic Targeted Drug Carrier with Potential Multifunctions. // J. Nanomater. -2011. V. 2011. - P. 469031-469043.

258. Massart R. Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media // IEEE Trans. Magn. 1981.-Vol. 17, №2.-P. 1247-1248.

259. Bondi A. Physical Properties of Molecular Crystals. New York: Wiley, 1968. -502 p.

260. Черненко Г.Т., Махмудов T.M., Худайбердиев M.A. Салгивин новый коллоидный кровезаменитель бифункционального действия // Вестник службы крови России, 1999.-№3,-С. 51-52.

261. Понеделькина И.Ю., Лукина Е.С., Одиноков В.Н., Кислые гликозаминогликаны и их химическая модификация. // Биоорганическая хим. 2008. - Т. 34, № 1. -С. 5-28.

262. Kemp М.М., Linhardt R.J. Heparin-based nanoparticles. // Wiley Interdiscip. Rev.: Nanomed. Nanobiotechnol. -2010. V. 2(1).-P. 77-87.

263. Weisel J.V. Fibrinogen and fibrin // Adv. Protein Chem. 2005. - V. 70. - P. 247299.

264. Blomback В., Fibrinogen and fibrin. Proteins with complex roles in hemostasis and thrombosis // Thromb. Res. 1996. - V. 83, № 1. - P. 1-75.

265. Bachmann L., Schmitt-Fumain W.W., Hammel R., Lederer K. Size and shape of fibrinogen, 1. Electron microscopy of the hydrated molecule. // Makromol. Chem.2003.-V. 176, №9.-P. 2603-2618.

266. Lim В., Lee E.H., Sotomayor M., Schulten K. Molecular Basis of Fibrin Clot Elasticity // Structure. 2008. - V. 16. - P. 449-459.

267. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии: В 3-х томах. Т. 3. Пер. с англ./ Перевод Гинодмана JLM.; Под ред. Овчинникова Ю.А. М.: Мир, 1981.-726 с.

268. Физиология человека (под ред. Покровского В.М., Коротько Г.Ф.) // М.: Медицина, 2007. 565 с.

269. Bhattacharya А.А., Curry S., Franks N.P. Binding of the General Anesthetics Propofol and Halothane to Human Serum Albumin. High resolution crystal structures //J. Biol. Chem. 2000. - V. 275, №49.-P. 38731-38738.

270. Bode W. Structure and interaction modes of thrombin. // Blood Cells, Mol. Dis. -2006,-V. 36.-P. 122-130.

271. Sandin S., Ofverstedt L.-G., Wikstrom A.-C., Wrange O., Skoglund U. Structure and Flexibility of Individual Immunoglobulin G Molecules in Solution // Structure.2004.-V. 12.-P. 409-415.

272. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах. // Соросовский образовательный журн. 2000. - № 12. - С. 13-19.

273. Stadtman E.R., Levine R.L. Free radical-mediated oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins // Amino Acids. 2003. - V. 25. - P. 207-218.

274. Лущак В.И. Свободнорадикальное окисление белков и его связь с функциональным состоянием организма // Биохимия. 2007. - Т. 72. - С. 9951017.

275. Блюменфельд Л.А., Воеводский В.В., Семенов А.Г. Применение ЭПР в химии. // Новосибирск: СО АН СССР, 1962. 240 с.

276. Альтшуллер С.А., Козырев Б.М. Электронный парамагнитный резонанс. // М.: Физматгиз., 1961.-368 с.

277. Ферромагнитный резонанс (под ред. Вонсовского С.В.) // М.: Государственное издательство физмат, литературы, 1960. 344 с.

278. Кузнецов А.Н. Метод спинового зонда (основы и применение). // М.: Наука, 1976. 210 с.

279. Вассерман A.M., Коварский A.JT. Спиновые зонды и метки в физикохимии полимеров. // М.: Наука, 1986. 245 с.

280. Применение электронного парамагнитного резонанса для исследования биологических систем: сб. статей (под ред. A.JI. Коварского) // М.: ИБХФ им. Н.М. Эмануэля РАН, 2005. 167 с.

281. Gorcester J., Millhauser G. L., Freed J.H. Two-Dimensional Electron Spin Resonance, In: Modern Pulsed and Continuous Wave Electron Spin Resonance (Ed. by Kevan L.and Bowman M.K.) // N.Y.: Wiley, 1990. P. 119-194.

282. Dzuba S.A., Tsvetkov Yu.D., Maryasov A.G. Echo-induced EPR spectra of nitroxides in organic glasses: model of molecular orientational motion near equilibrium position//Chem. Phys. Lett. 1992. - V.188. - P. 217-222.

283. Анциферова Л.И., Вассерман A.M., Иванова A.H., ЛифшицВ.А., НаземецН.С. Атлас спектров электронного парамагнитного резонанса спиновых меток и зондов. // М.: Наука, 1977. 160 с.

284. Физическая энциклопедия. Том 5. Гл. ред. A.M. Прохоров. // М.: «Большая Российская энциклопедия», 1998. 687 с.

285. Kittel С. Physical theory of ferromagnetic domains. // Rev. Mod. Phys. 1949. -V. 21, №4.-P. 541-583.

286. Киренский Л.В. Магнетизм. // M.: Наука, 1967. 196 с.

287. Raikher Yu.L., Stepanov V.I. Ferromagnetic resonance in a suspension of singledomain particles // Phys. Rev. B. 1994. - V. 50, № 9. - P. 6250-6259.

288. Kliava J., Berger R. Size and shape distribution of magnetic nanoparticles in disordered systems: computer simulations of superparamagnetic resonance spectra // J. Magn. Magn. Mater. 1999. - V. 205. - P. 328-342.

289. Noginova N., Chen F., Weaver Т., Giannelis E.P., Bourlinos A.B., Atsarkin V.A. Magnetic resonance in nanoparticles: between ferro- and paramagnetism // J. Phys.: Condens. Matter. 2007. - V. 19. - P. 246208-246217.

290. Berger R., Bissey J.-C., Kliava J., Daubric H., Estournes C. Temperature dependence of superparamagnetic resonance of iron oxide nanoparticles // J. Magn. Magn. Mater. 2001. - V. 234.-P. 535-544.

291. Okamura Т., Torizuka Y., Kojima Y. The g-factor of ferrites // Phys. Rev. 1952. -V. 88.-P. 1425-1426.

292. Clarricoats P.J.P. Microwave Ferrites. // N-Y.: John Wiley & Sons Inc., 1961. -260 P.

293. Sharma V.K, Baiker A. Superparamagnetic effects in the ferromagnetic resonance of silica supported nickel particles // J. Chem. Phys. 1981. -V. 75. - P. 5596-5601.

294. D. Faivre, A. Fischer, I. Garcia-Rubio, G. Mastrogiacomo, A.U. Gehring. Development of Cellular Magnetic Dipoles in Magnetotactic Bacteria. // Biophys. J.- 2010. V. 99(4).-P. 1268-1273.

295. Rodbell D.S. Ferromagnetic Resonance of Iron Whisker Crystals // J. Appl. Phys. -1959.-V. 30.-P. 187-188.

296. Скворцов А.И, Кондратов B.M, Борисов А.А. Ферромагнитный резонанс в металлах и сплавах. Ежегодная научно-техническая конференция "Наука -производство технология - экология": сб. материалов // Киров: ВятГТУ, 1999. -Т. 1,-С. 69-70.

297. Weiss В.Р, Kim S.S, Kirschvink J.L, Корр R.E, Sankaran M, Kobayashi A, Komeili A. Ferromagnetic resonance and low-temperature magnetic tests for biogenic magnetite // Earth Planet. Sci. Lett. 2004. - V. 224. - P. 73-89.

298. Юликов M.M, Аборнев И.С, Мартьянов O.H, Юданов В.Ф, Исупов В.П, Чупахина Л.Э, Тарасов К.А, Митрофанова Р.П. Ферромагнитный резонанс наночастиц никеля в аморфной оксидной матрице // Кинетика и катализ. -2004.-Т. 45(5).-С. 1-4.

299. Лоу В. Парамагнитный резонанс в твердых телах. // М.: Инлит, 1962. 242 с.

300. Van Vleck J.H. The dipolar broadening of Magnetic Resonance Lines in crystals // Phys. Rev. 1958.-V. 74.-P. 1168-1183.

301. Kratky O, Porod G. Diffuse Small-Angle scattering of X-rays in Colloid Systems // J. Colloid Interface Sci. 1949. - V. 4. - P. 35-70.

302. Bradford M.M, A rapid and sentivite method for the quantitation of micro gram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem.- 1976.-V. 72.-P. 248-254.

303. Ouchterlony O. Antigen-antibody reactions in gels. // Acta Pathol. Microbiol. Scand.- 1949.-V. 26(4).-P. 507-515.

304. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983, 304 с.

305. Vassilikou-Dova А.В, Lehmann G. Investigation of minerals by electron paramagnetic resonance. // Fortschr. Miner. 1987. - V. 65. - P. 173-202.

306. Calas G. Electron paramagnetic resonance, in: Spectroscopic Methods in Mineralogy and Geology, Hawthorne F.C., ed., Reviews in Mineralogy. Vol.18. // Mineralogical Association of America. Chelsea, 1988. P. 513-571.

307. Pawse A., Beske-Diehl S., Marshall S.A. Use of magnetic hysteresis properties and electron spin resonance spectroscopy for the identification of volcanic ash: a preliminary study. // Geophys. J. Int. 1998. - V. 132. - P. 712-720.

308. Chantrell R.W., Bradbury A., Popplewell J. and Charles S.W. Agglomerate formation in a magnetic fluid // J. Appl. Phys. 1982. - V. 53. - P. 2742-2744.

309. Медведев В.Ф., Краков M.C. Магнитные жидкости. М.: Химия, 1989. 238 с.

310. Гуревич А.Г. Магнитный резонанс в ферритах и антиферромагнетиках. // М.: Наука, 1973.-591 с.

311. Ролдугин В.И., Долотов С.В. Электронный парамагнитный резонанс во фрактальных агрегатах металлических наночастиц // Коллоидный журн. 2004. -Т. 66, №3,-С. 428-430.

312. Абрагам А., Гольдман П. Ядерный магнетизм: порядок и беспорядок. В 2 Т. // М.: Мир, 1984.-660 С.

313. Долотов С.В., Ролдугин В.И. Моделирование спектров ЭПР агрегатов металлических наночастиц // Коллоидный журн. 2007. - Т. 69, № 1. - С. 1317.

314. Li J., Huang Y., Liu X., Lin Y., Bai L., Li Q. Effect of aggregates on the magnetization property of ferrofluids: A model of gaslike compression. // Sci. Tech. Adv. Mater. 2007. - V. 8. - P. 448-454.

315. Kim Т., Shima M. Reduced magnetization in magnetic oxide nanoparticles // J. Appl. Phys. 2007. - V. 101.-P. 09M516-09M518.

316. Kovarski, A.L. New Concepts in Polymer Science. Molecular Dynamics of Additives in Polymers. // Utrecht: VSP, 1997. 276 P.

317. Noginova N., Weaver Т., King Т., Bourlinos A.V., Giannelis E.P., Atsarkin V.A. NMR and spin relaxation in systems with magnetic nanoparticles // J. Phys.: Condens. Matter. 2007. - V. 19, № 7. - P. 076210-076219.

318. Abragam A. Principles of Nuclear Magnetism. // New York: Oxford University Press, 1961.-618 P.

319. Vasserman A.M., Kovarskii A.L., Yasina L.L., Buchachenko A.L. Exchange and dipole interactions and local concentrations of stable radicals in polymers // Theor. Exp. Chem. 1977. - V. 13, № l.-P. 19-23.

320. Anisimov O.A., Nikitaev A.T., Zamaraev K.I., Molin Yu.N. Separation of exchange and dipole-dipole broadening on the basis op viscosity changes in ESR spectra // Theor. Exp. Chem. 1974. - V. 7, № 5. - P. 556-559.

321. Першина А.Г., Сазонов А.Э., Итин В.И., Терехова О.Г., Магаева А.А. Адсорбция белков на частицах наноразмерного порошка CoFe204 // Наносистеми, наноматер1али, нанотехнологи. 2008. - Т. 6, № 3. - С. 10191028.

322. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В 2 Т. // М.: Новая Волна, 2002. -1148 с.

323. Rozenfel'd М.А., Vasil'eva M.V. Mechanism of aggregation of fibrinogen molecules: the influence of fibrin-stabilising factor // Biomed. Sci. 1991. - Vol. 2. -P. 155-161.

324. Розенфельд M.A., Леонова В.Б., Константинова М.Л., Разумовский С.Д. Самосборка мономерного фибрина и агрегации фибриногена при окислении озоном. // Биохимия. 2009. - Т.74. - С. 54-61.

325. Kitagawa М., Tokiwa Y. Polymerization of vinyl sugar ester using ascorbic acid and hydrogen peroxide as a redox reagent. // Carbohydr. Polym. 2006. - V. 64. -P. 218-223.

326. Smith C.E., Stack M.S., Johnson D.A. Ozone effects on inhibitors of human neutrophil proteinases. // Arch. Biochem. Biophys. 1987. - V. 253. - P. 146-155.r1. БЛАГОДАРНОСТИ

327. Автор благодарит своих родителей и супруга за терпение и поддержку, без которых было бы невозможно выполнение настоящей работы, а также всех тех людей, которые не оставались равнодушными к деятельности автора все эти годы.