Структурно-чувствительная спектроскопия органических и биоорганических наносистем на основе метода стоячих рентгеновских волн тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

На правах рукописи УДК 538.91, 538.97

НОВИКОВА Наталья Николаевна

СТРУКТУРНО-ЧУВСТВИТЕЛЬНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ ОРГАНИЧЕСКИХ И БИООРГАНИЧЕСКИХ НАНОСИСТЕМ НА ОСНОВЕ МЕТОДА СТОЯЧИХ РЕНТГЕНОВСКИХ ВОЛН

Специальность: 01.04.07 - Физика конденсированного состояния

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

2 6 МАЙ 2011

Москва — 2011

4848207

Работа выполнена в НИЦ «Курчатовский институт».

Научный консультант:

доктор физ.-мат. паук, профессор, член-корреспондент РАН Ковальчук Михаил Валентинович

Официальные оппоненты:

доктор физ.-мат. наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ академик РАН Панченко Владислав Яковлевич доктор физ.-мат. наук, профессор Пикин Сергей Алексеевич доктор физ.-мат. наук, профессор Суворов Эрнест Витальевич

Ведущая организация:

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, физический факультет.

Защита состоится «_» '_ 2011 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д 520.009.01 при НИЦ ^Курчатовский институт», по адресу: пл. Академика Курчатова 1, г. Москва.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИЦ «Курчатовский институт».

Автореферат разослан «_»

2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 520.009.01 кандидат физико-математических наук

А.В.Мерзляков

Актуальность темы.

Создание новых методов формирования и изучения высокоорганизованных органических и биоорганических тонкопленочных систем представляет собой одно из важнейших направлений научных разработок в области нанотехнологий. Возможность модифицировать физические и химические характеристики таких систем в широких пределах позволяет получать тонкопленочные покрытия нанометрового диапазона с заранее заданными и самыми разнообразными свойствами. Важнейшей сферой практического применения органических пленок является молекулярная микроэлектроника. Использование биоорганических пленок открывает новые перспективы для различных биотехнологических приложений, к числу которых относится получение активных элементов для биосенсоров, разработка биокатализаторов, создание синтетических нанобиоструктурных материалов для биомедицинских применений и т.д.

Особый интерес к исследованию упорядоченных белково-липидных пленок связан с тем, что по своему составу и морфологии эти системы представляют собой адекватную модель биологических мембран. Такие исследования позволяют получать информацию о структурно-функциональном состоянии белково-липидных моделей клеточных мембран на молекулярном уровне и могут быть эффективно использованы для решения широкого круга задач, связанных с биомедицинской диагностикой и биофизическими исследованиями. Новые перспективы для фундаментальных и прикладных исследований в области биологии и медицины открывает изучение белково-липидных пленок на поверхности жидкой субфазы, когда не нарушается нативная конформация белковых молекул, а, следовательно, сохраняются их биологические функции. Это дает принципиальную возможность изучать различные биофизические и биохимические процессы, протекающие в функционирующих мембранных моделях.

Дальнейшее расширение границ применения органических и биоорганических слоистых наноструктур тесно связано с развитием новых

физических методик для характеризации объектов, имеющих наноразмерную организацию. К числу наиболее перспективных современных методов диагностики тонкопленочных систем относятся рентгеновские методики, дающие спектрально-селективную структурную информацию, такие как метод стоячих рентгеновских волн (СРВ). Исследования тонкопленочных биоорганических систем с помощью метода СРВ основаны на одновременной регистрации рентгеновского отражения и выхода вторичного излучения (например, характеристической флуоресценции), возникающего при неупругом рассеянии рентгеновских лучей в условиях полного внешнего отражения (ПВО). Главным преимуществом метода СРВ по сравнению с классическими рентгеновскими методиками является возможность напрямую определять местоположение атомов определенного сорта в слоистой системе из анализа угловых зависимостей выхода флуоресценции от этих атомов.

Важным шагом в развитии метода СРВ явиляется применение этого метода для исследования органических и биоорганических пленок на жидкости, что потребовало решения целого ряда аппаратурно-методических задач, связанных с реализацией рентгенофлуоресцентных измерений при неподвижном положении образца. Несмотря на огромный потенциал метода СРВ, исследования органических слоев на жидкости с помощью рентгенофлуоресцентных измерений носят единичный характер. К началу настоящей работы существовали лишь две публикации американских и французских ученых по изучению процессов сегрегации ионов металлов из водной субфазы на монослой, нанесенный на поверхность водной субфазы.

Целью настоящей работы являлось развитие метода стоячих рентгеновских волн в области полного внешнего отражения для нанодиагностики органических и биоорганических пленок на твердых подложках и на поверхности жидкости. Работа включала в себя решение следующих задач:

■ Разработка методики рентгенофлуоресцентных измерений в области полного внешнего отражения для изучения элементного состава и

структурной организации молекулярных пленок, сформированных на поверхности жидкости;

" Проведение исследований органических и биоорганических наносистем на жидкости и на твердых подложках;

■ Теоретический анализ особенностей рассеяния рентгеновского излучения в планарных наносистемах в условиях полного внешнего отражения;

■ Создание математических подходов для обработки экспериментальных данных по нанодиагностике молекулярных пленок на жидкости с применением метода стоячих рентгеновских волн.

Научная новизна. В ходе работы впервые:

1. Метод СРВ экспериментально реализован для исследования композиционного состава и структурной организации мономолекулярных слоев, сформированных на поверхности жидкости.

2. Теоретически изучены особенности волновых полей, формирующихся в слаборассеивающих органических пленках в условиях полного внешнего отражения. Получено аналитическое выражение для интенсивности выхода флуоресценции от мономолекулярного слоя в приближении линейного затухания эвансцентной волны.

3. Исследованы процессы самоорганизации, протекающие в белково-липидных пленках на поверхности жидкости, в условиях, когда липидные и белковые молекулы обладают высокой молекулярной подвижностью. Продемонстрированы принципиально новые возможности, которые открывает применение метода СРВ для изучения белково-липидных моделей биологических мембран в условиях максимально приближенных к условиям их функционирования в живой клетке.

4. Экспериментально и теоретически изучено явление резонансного усиления волнового поля в биоорганических наноструктурах, сформированных на поверхности жидкости.

5. Получена новая информация о молекулярных механизмах повреждающего действия токсических веществ (тяжелые металлы и мочевина) на белково-липидные модели биомембран, сформированные на поверхности жидкости и на твердых подложках.

6. Экспериментально обнаружено явление самопроизвольной адсорбции ионов металлов из воды высокой степени очистки к белковым макромолекулам в результате конформационных перестроек, вызванных действием различных ксенобиотиков (токсические вещества и лекарственные препараты).

7. Метод СРВ применен для изучения молекулярных механизмов действия лекарственных соединений. Предложен новый подход для исследования эффективности и безопасности действия лекарственных соединений с использованием белково-липидных наноструктур в качестве изолированных моделей клеточных мембран.

Практическая значимость. Результаты работы представляют собой научно-методическую основу для спектрально-селективной структурной диагностики органических и биоорганических наносистем на жидкости и на твердых подложках.

■ Развито новое направление в применении метода СРВ - изучение композиционного состава и молекулярной организации органических и биоорганических пленок, сформированных на поверхности жидкой субфазы. Научный задел iio нанодиагностике белково-липидных пленок на жидкости с применением спектрально-селективных рентгеновских измерений позволит существенно расширить возможности биофизических исследований, посвященных изучению структурно-функциональных свойств клеточных мембран.

Разработана методика измерения угловой зависимости выхода флуоресценции от молекулярных пленок в условиях полного внешнего отражения, позволяющая избежать искажений сигнала, связанных с изменением положения области засветки рентгеновским пучком на поверхности жидкой субфазы.

На примерах исследований белково-липидных пленок на жидкой субфазе показаны новые возможности метода СРВ для изучения молекулярной организации, а также механизмов функционирования биологических мембран в физиологических условиях и при патологических воздействиях на клетку.

Предложен метод контроля эффективности и безопасности действия лекарственных препаратов, позволяющий получать дифференциальные данные о механизмах действия лекарственного соединения в отличие от интегральных результатов исследований на целостном организме.

Получена сравнительная оценка действия лекарственных препаратов (ЭДТА, сукцимер и ксидифон), применяемых для лечения острых и хронических интоксикаций тяжелыми металлами.

Разработаны численные и аналитические подходы для математической обработки и интерпретации результатов эксперимента по изучению структуры органических и биоорганических тонкопленочных наносистем на жидкости с помощью метода СРВ.

Положения, выносимые на защиту:

Разработка методических основ для нанодиагностики органических и биоорганических пленок на жидкости с применением метода. СРВ в области полного внешнего отражения. Главным преимуществом разработанной методики является возможность получать спектрально-селективную структурную информацию о динамичных двумерных системах, формирующихся в результате самопроизвольной организации молекул на межфазной границе жидкость/воздух.

Результаты экспериментальных и теоретических исследований рассеяния рентгеновского излучения на органических и биоорганических планарных наносистемах в условиях полного внешнего отражения: особенности интерференционных волновых полей, формирующихся в слаборассеивающих пленках в условиях резонансного усиления; обнаруженные аномалии в экспериментальных угловых зависимостях выхода флуоресценции от тонких пленок; закономерности выхода вторичных излучений от мономолекулярных слоев на жидкости.

Результаты in-situ исследований процессов самоорганизации в биоорганических наносистемах на жидкости в условиях, когда белковые и липидные молекулы обладают высокой молекулярной подвижностью. В том числе: изучение самопроизвольного расслоения термодинамически неустойчивых белково-липидных наносистем; выявление молекулярных механизмов нарушения белково-липидных взаимодействий в биоорганических наносистемах под действием токсических веществ (тяжелые металлы и мочевина).

Развитие метода СРВ для исследований молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов с использованием белково-липидных наносистем в качестве изолированных моделей клеточных мембран. Полученные методом СРВ данные об эффективности комплексообразующих лекарственных препаратов, применяемых для ускорения выведения тяжелых металлов из организма. Обнаруженное явление адсорбции ионов металлов на органические и биоорганические молекулы из водной субфазы, содержащей примеси в следовых количествах (в концентрации меньше 10"7 М). Полученные методом СРВ данные о повреждении молекулярной организации пленок Ленгмюра-Блоджетт в результате адсорбции ионов металлов; результаты исследований влияния различных ксенобиотиков (тяжелые

металлы, лекарственные соединения, мочевина) на увеличение способности белковых молекул адсорбировать ионы металлов.

Личный вклад автора состоит в постановке и организации всех исследований, непосредственном участии в проведении рентгеновских измерений, обработке данных, интерпретации и изложении результатов.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих конференциях: Национальные конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (РСНЭ), Москва 1997, 1999, 2003, 2005, 2007, 2009; Конференция «Рентгеновская оптика-99», Н.Новгород 1999; XVIII международный кристаллографический конгресс, Глазго 1999; Международная конференция «Самоорганизация на границах раздела и в тонких пленках», Гренобль 2000; XII Международная конференция «Малоугловое рассеяние» Венеция 2002; XVII Международный конгресс «Рентгеновская оптика и микроанализ» (ICXOM), Шамони-Монблан 2003; XXIV Европейская кристаллографическая конференция (ЕСМ-24), Маракеш 2007; Международные конференции «Рентгенофлуоресцентный анализ в области полного внешнего отражения» (TXRF), Вена 2000, Будапешт 2005, Тренто 2007, Гетеборг 2009; Четвертая международная конференция «Нанобио-и другие новые и перспективные технологии», Пущино 2007; Второй Международный форум по нанотехнологиям, Москва 2009; III Научно-практическая конференция «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ», Москва 2010; XIV Национальная конференция по росту кристаллов (НКРК), Москва 2010.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I носит обзорный характер и посвящена изложению современного состояния исследования в области упорядоченных органических и биоорганических пленок, а также развитию рентгеновских методик для диагностики такого рода объектов.

Нанотехнологии сегодня интенсивно используют процессы молекулярной и супрамолекулярной организации для создания новых структур, обладающих заранее заданными свойствами; развиваются все новые подходы к конструированию материалов, основанные на субмикронной «сборке» при использовании принципов самоорганизации вещества. Одним из наиболее эффективных методов создания упорядоченных органических наносистем является метод Ленгмюра-Блоджетт (ЛБ), позволяющий контролировать организацию слоистых систем на молекулярном уровне. Основа метода была разработана в 30-х годах 20 века И.Ленгмюром и его сотрудницей К.Блоджетт. Ленгмюровские пленки формируются на границе раздела фаз жидкость/воздух из поверхностно активных веществ, обладающих амфифильными свойствами.

Первая попытка нанесения белковых монослоев (на основе пепсина и уреазы) была предпринята еще И.Ленгмюром. Новая волна интереса к белковым пленкам возникла в 80-х годах 20 века, когда были получены функциональные упорядоченные биоорганические пленки толщиной в одну молекулу, и продемонстрирована возможность применения белковых ЛБ пленок в качестве активных элементов биосенсорных устройств. В настоящее время иммобилизованные биологически активные высокомолекулярные соединения на твердых носителях широко применяются для развития новых областей науки и техники таких, как аналитическая биотехнология, биоэлектроника, биосенсорное приборостроение и т.д. Тонкие пленки на основе ферментов используются в биологии, биохимии и медицине с диагностической целью.

Расширение границ применения молекулярных пленок в сфере фундаментальных и прикладных исследований тесно связано с развитием новых физических методик, позволяющих контролировать наноархитектуру органических и биоорганических планарных систем на молекулярном уровне. Естественно, что различные поверхностно-чувствительные рентгеновские методы, такие как рефлектометрия, двумерная поверхностная дифракция и др., получившие дополнительные экспериментальные возможности с

использованием источников синхротронного излучения, все более активно привлекаются для изучения молекулярных пленок.

Сравнительно недавно, благодаря созданию рентгеновских спектрометров, оснащенных ленгмюровской ванной, начался новый этап в развитии рентгеновских исследований молекулярных пленок. В настоящее время структурная диагностика органических и биоорганических наносистем на жидкости представляет собой важную интенсивно развивающуюся область рентгеновских исследований с применением всего арсенала современных поверхностно чувствительных методик.

Рентгеновские исследования молекулярных пленок на жидкости развиваются, главным образом, по двум направлениям. Первое направление основано на использование двумерной дифракции в скользящей геометрии, когда вектор рассеяния направлен параллельно поверхности пленки. Рентгенодифракционные измерения в такой геометрии позволяют изучать кристаллическую структуру двумерных молекулярных систем вдоль поверхности и являются наиболее широко применяемым методом исследования органических пленок на поверхности жидкости.

Второе направление рентгеновских исследований на жидкости связано с измерениями в стандартной геометрии, когда вектор рассеяния направлен перпендикулярно к поверхности, что позволяет получать информацию о распределении профиля рассеивающей плотности вдоль нормали к поверхности. Это направление базируется на достижениях рентгеновской рефлектометрии и позволяет с атомной точностью локализовать отдельные химические компоненты молекулярной пленки по ее толщине.

Особое место в ряду рентгеновских методик занимает метод СРВ. Метод СРВ основан на одновременной регистрации рентгеновского отражения и выхода вторичного излучения (например, характеристической флуоресценции), возникающего при неупругом рассеянии рентгеновских лучей. Важным преимуществом метода СРВ по сравнению с классическими рентгеновскими методиками является возможность напрямую определять местоположение

атомов данного сорта в слоистой системе из анализа угловых зависимостей выхода флуоресценции от этих атомов.

Первые работы по применению метода СРВ появились около 40 лет назад. Эти исследования были посвящены изучению совершенных кристаллов полупроводников. Новый импульс в своем развитии метод СРВ получил около 20 лет назад с появлением высокоинтенсивных источников рентгеновского излучения - синхротронов, что дало возможность применить метод СРВ для исследования слаборассеивающих тонких приповерхностных слоев, а также границ раздела между кристаллом и тонкой эпитаксиальной пленкой.

Одно из направлений в использовании метода СРВ связано с изучением структуры и композиционного состава сложноорганизованных тонкопленочных наноматериалов, таких как биоорганические слоистые наносистемы, органические молекулярные и полимерные пленки, нанесенные на твердые подложки, и т.д. Широкие возможности метода СРВ для характеризации ЛБ пленок на твердой подложке были продемонстрированы в целом ряде работ. Важным шагом в развитии метода СРВ является применение рентгенофлуоресцентных измерений для исследований биоорганических слоев на жидкости, что позволит получать новые знания о свойствах, принципах функционирования и молекулярной организации белково-липидных моделей клеточных мембран в физиологических условиях и при патологических воздействиях на клетку. Несмотря на огромный потенциал метода СРВ для нанодиагностики органических и биоорганических пленок на жидкости, реализация этих исследований продолжает оставаться малодоступной широкому кругу экспериментаторов из-за серьезных инструментальных и экспериментально-методических проблем. К началу настоящей работы существовали лишь две публикации американских и французских ученых по изучению процессов сегрегации ионов металлов из водной субфазы на монослой жирной кислоты, нанесенный на поверхность водной субфазы. Обе работы были посвящены изучению профиля концентрации ионов металлов в растворе у границы раздела воздух/вода.

Глава II посвящена развитию математических подходов для анализа экспериментальных данных по изучению тонкопленочных наносистем с помощью метода СРВ.

Для математической обработки экспериментальных результатов был использован метод рекуррентных соотношений. В качестве исходной модели многослойной структуры рассмотрим плоскослоистую среду, которая состоит из М однородных, изотропных слоев с постоянными значениями толщин слоев lj и диэлектрической проницаемости £j = 1 - 2Sj - i2f5.. Нулевым слоем является воздух (еь = 1)> а М+ 1 слой - подложка. Пусть на поверхность многослойной структуры под углом в к поверхности падает плоская монохроматическая волна. Ось Z перпендикулярна к поверхности образца и направлена вглубь него. В плоскослоистой среде, свойства которой изменяются только вдоль оси Z, электрическое поле рентгеновской волны в у-ом слое имеет вид:

Ej(zj,х,со)- Ej(zj )ехр(ikxj -ioit) ■ {2.\)

где координата zs отсчитывается от верхней границы у'-слоя. Поле Ej [zj) есть

сумма полей преломленной и отраженной волн с амплитудами Ej(о) и Ej(o), соответственно:

Ej ) = EJ (0)exp(/^ Zj)+ Ef (О)ехр(- ikZj Zj) (2.2)

kz. - Z-компонента волнового вектора в 7-ом слое.

Используя условия непрерывности тангенциальных компонент электрического и магнитного векторов на границе раздела двух соседних слоев j и у+1 можно получить систему рекуррентных уравнений для комплексных амплитуд преломленной и отраженной волн:

= (2.3)

£;(0) = гу..+1£у(0)+/.+и£Д,(0) (2.4)

где:

к -к, / \ kz -kz

2 к, 1\ 2к, t \ —ехр(- ikZi lj ) tJ+lJ = к ехр(- ikZj /,.) (2.6

ZJ+1 zj zj+1

'л/+> =к +к eM-'^h) tj+uj

Решая систему уравнений (2.3 - 2.6), нетрудно получить рекуррентные соотношения для амплитудных коэффициентов отражения и прохождения у'-го слоя:

R fi^W^il

KJ >j.J-i f , /e (2.7)

(2g)

V+ij

Алгоритм вычисления коэффициента отражения многослойной структуры состоит в следующем: начиная с RM=0 последовательно находят все R,, j =

0, 1, 2 ... М. Величина Л02 определяет интенсивность рентгеновского излучения, отраженного многослойной системой.

Для расчета зависимости коэффициента отражения от угла скольжения

Z-компоненту волнового вектора в /-ом слое kZj выражают через параметры

этого слоя (Sj, pj) и угол скольжения в. Используя закон Снеллиуса после несложных преобразований можно получить:

к. =.

2л

IV ^ У

Формулы (2.7), (2.8) и (2.9) определяют схему расчета угловой зависимости коэффициента отражения многослойной системы для проведения численного моделирования и анализа экспериментальных данных.

Расчет интенсивности выхода вторичных излучений. Исследование многослойных структур методом СРВ основано на регистрации вторичных

излучений, возникающих в таких системах при поглощении рентгеновских квантов в условиях полного внешнего отражения и брэговской дифракции. В дипольном приближении фотоэлектрическое поглощение пропорционально локальной интенсивности электрического поля.

В соответствии с этим число квантов вторичного излучения, рожденных на глубине Zj в слое толщиной dzt с единичной площадью и в единицу времени, определяется выражением:

|2 С, +|2 С2 + 2\Rj |С,-1 cos (р

(fa:

(2.10)

Jj =

ш

где введены обозначения: Ля

<pJ=vJ+—BJzJ С, = ехр

4ж .

--Aiz;

2 J у

С2 = ехр

8л- ,

— A izi X J J

фаза амплитудного коэффициента отражения для j-того слоя; Aj, Bj -

мнимая и действительная части величины ~ ISj - Hfij . Ослабление

вторичного излучения учитывается с помощью функции влияния P{z), характеризующей вероятность попадания в детектор кванта вторичного излучения, рожденного на глубине zy. Конкретный вид функции влияния зависит от типа регистрируемого вторичного излучения. В случае флуоресцентного излучения P(z) имеет вид:

P{z)~ ехр

(2.11)

где L — глубина выхода флуоресценции. Интегрируя (2.11) в пределах от 0 до /, с учетом функции влияния, получим выражение, определяющее вклад у'-того слоя в общий выход вторичного излучения.

Интенсивность волнового поля в мономолекулярных пленках в условиях ПВО. При исследовании мономолекулярных пленок необходимо учитывать, что, хотя толщина таких пленок мала, а электронная плотность низкая, в

области малых углов (при углах меньше критического угла ПВО для подложки вс) изменения волнового поля, вызванные присутствием пленки, могут быть существенными. Поэтому даже в простейшем случае, когда мономолекулярную пленку можно представить как один однородный и изотропный слой, форма угловой зависимости выхода флуоресценции от атомов, расположенных в пленке, будет определяться тремя неизвестными параметрами: толщина и электронная плотность пленки (параметры, описывающие изменения интенсивности поля) и расстояние от атомов до границы раздела пленка/подложка. Особый случай представляют пленки, толщина и электронная плотность которых удовлетворяют условию:

2л

4k^djSf «1, (2.12)

где df толщина пленки с показателем преломления nj= l-Sj-ifif. Как будет показано ниже, интенсивность поля в таких пленках зависит только от одного параметра - от числа электронов на единицу площади пленки.

Используя выражения (2.7-2.11),, можно численно рассчитать интенсивность волнового поля в любой точке произвольной слоистой структуры. В частном случае однородного слоя на полубесконечной подложке выражение для интенсивности волнового поля можно получить в аналитическом виде.

С учетом приближения (2.12) в области малых углов в<вс выражение для интенсивности поля в слое, нормированной на интенсивность падающего пучка, имеет вид:

If = Ss+2p2fej^^, P/=k°dfSf- ^

Для простоты изложения приведено выражение при z=df. Сравним

формулу (2.13) с выражением для интенсивности волнового поля на

поверхности чистой подложки, которое можно получить из условий непрерывности на границе вакуум/подложка:

(2.14)

Теперь легко заметить, что изменение интенсивности волнового поля, вызванное присутствием пленки, определяется вторым слагаемым в знаменателе выражения (2.13), причем зависимость этого слагаемого от толщины и электронной плотности пленки описывается через параметр pf. Если учесть, что толщина и электронная плотность пленки входят в выражение для Pf в виде произведения, становится очевидным, что изменение волнового поля целиком определяется поверхностной электронной плотностью пленки.

В области больших углов в >вс для интенсивности поля на границе получим:

Согласно условию (2.12) параметр Л мал по величине, так что с хорошей точностью слагаемое A(8f-8!) в знаменателе выражения (2.15) можно опустить. Это означает, что при больших углах присутствие монослоя на поверхности полубесконечной подложки не приводит к каким либо заметным изменениям волнового поля.

Полученные аналитические результаты представляются особенно важными при изучении молекулярных пленок на поверхности жидкости. Действительно, если химический состав молекул известен, т.е. число электронов в одной молекуле задано, то величина поверхностной электронной плотности пленки будет целиком определяться значением площади, занимаемой одной молекулой в пленке SM0JI. Особенность исследования ленгмюровских пленок на поверхности жидкости состоит в том, что величину SM01I можно оценить из изотермы сжатия независимо от рентгеновских измерений, что позволяет свести к минимуму число неизвестных параметров при подгонке экспериментальных кривых выхода флуоресценции..

/

402

& = 4k2nd2fS

(2.15)

Глава III посвящена развитию метода СРВ для исследования упорядоченных наноструктур на жидкости. С точки зрения экспериментальной техники рентгеновские измерения на жидкости представляют собой достаточно сложную задачу. В отличие от исследований твердых образцов, в измерениях на жидкости положение образца (ленгмюровской ванны) должно оставаться горизонтальным. Поэтому для изменения угла между падающим пучком и поверхностью образца приходится отклонять падающий пучок от горизонтальной плоскости. В такой схеме проведения эксперимента меняется положение области засветки на поверхности жидкости при изменении угла падения. Поэтому в рентгеновских измерениях на жидкости приходится изменять положение ванны по высоте: зная геометрические параметры станции можно рассчитать, на сколько следует поднять или опустить ванну, чтобы при изменении угла положение области засветки на поверхности жидкой субфазы оставалось неизменным.

Специфика измерений методом стоячих рентгеновских волн состоит в том, что в этих экспериментах регистрируют очень слабые флуоресцентные сигналы, которые приходится подолгу копить. При этом уровень жидкости в ленгмюровской ванне неконтролируемым образом изменяется из-за испарения с поверхности водной субфазы. Поэтому при длительных измерениях коррекцию положения ленгмюровской ванны по высоте следует вести в режиме непрерывного мониторинга. В настоящих исследованиях была применена специальная методика измерения углов<эй зависимости интенсивности выхода флуоресценции, позволяющая избежать искажений интенсивности флуоресцентного сигнала, возникающих в процессе проведения исследований из-за изменения положения центра области засветки рентгеновским пучком на поверхности жидкой субфазы. В качестве первого шага модельными объектами исследования были выбраны поверхностно-активные органические соединения, образующие стабильные упорядоченные лэнгмюровские слои на поверхности жидкости. Рентгеновские измерения были выполнены на экспериментальной станции ID 10В в Европейском Центре Синхротронного Излучения (Франция).

Фталоцианины. Раствор смеси Cu(Pc)/Fe(Pc) в хлороформе наносили на поверхность водной субфазы. Измерения выхода флуоресцентного излучения проводили при постоянном давлении монослоя 22 мН/м. Фталоцианин олова Sn(Pc) растворяли в смеси метанола и хлороформа. Измерения проводили при давлении монослоя 22 мН/м.

Циклолинейные полиорганосилоксаны. Раствор полимера в хлороформе наносили на поверхность водной субфазы. Измерения проводили при 8,4 мН/м.

Фосфолипид. 1,2 дипальмитоил-5и-глицерофосфат-3-фосфатидилхолин (DPPC) растворяли в смеси метанола и хлороформа. Измерения проводили при 22 мН/м.

Математическая обработка результатов эксперимента по исследованию монослоев фталоцианинов и фосфолипида проводилась в рамках двухслойной модели. Величина площади на молекулу определялась по изотерме сжатия: 5^=90 А2 для Sn(Pc), SM0Jl= 70 А2 для смеси Cu(Pc)/Fe(Pc), ^„,=45 А2 для DPPC.

Согласно приведенному в главе II рассмотрению, подгонка угловых зависимостей выхода флуоресценции осуществляется по одному варьируемому параметру D - расстояние между ионами, излучающими флуоресценцию, и поверхностью воды. Наилучшее совпадение теоретических и экспериментальных кривых от монослоев Sn(Pc) и Cu(Pc)/Fe(Pc) было получено для D ~ 7 А (рис. 1 а). Величина диаметра макроцикла молекулы фталоцианина, полученная по результатам компьютерного моделирования составляет 13 А. Ион металла расположен в центре макроцикла, поэтому определенное из экспериментальных исследований расстояние между ионами металлов и поверхностью воды (D=7 А), позволяет предположить, что макроциклы молекул фталоцианина расположены перпендикулярно к поверхности воды.

На рис. 1 б представлены угловые зависимости выхода флуоресценции от фосфора, расчетная кривая соответствует тому, что ионы фосфора находятся на расстоянии D-4 А от границы раздела воздух/вода. Угловые зависимости выхода флуоресценции от кремния для монослоя полиорганосилоксана представлены на рис. 1 а (кривая 3). Наилучшее согласие теории и

эксперимента в рамках однослойной модели получено для D-4 А, что соответствует полимерным кольцам, лежащим «плашмя» на поверхности воды.

Рис. 1. Угловые зависимости выхода флуоресценции от монослоев на поверхности выхода: а) кривая 1 - угловые зависимости Си Ка и Fe Ка от Cu(Pc)/Fe(Pc) монослоя; кривая 2 - угловая зависимость Sn Ка флуоресценции от Sn(Pc) монослоя; кривая 3 - угловая зависимость Si Ка от монослоя полиорганосилоксана. б) угловая зависимость выхода флуоресценции Р Ка от монослоя DPPC. Нижние кривые - рентгеновское отражение. Сплошные линии - расчет. Энергия первичного пучка 12,5 кэВ. Вставка - модели молекул фталоцианина (1) и фосфолипида (2).

Обобщая представленные в главе III данные наиболее важные результаты можно сформулировать следующим образом: разработан метод регистрации угловой зависимости выхода флуоресценции в области. полного внешнего отражения с применением рентгенооптической схемы, обеспечивающей горизонтальное положение поверхности жидкости. Показано, что из-за испарения в процессе длительного накопления слабого флуоресцентного сигнала от органических и биоорганических пленок происходит заметное уменьшение уровня жидкости, что приводит к неконтролируемому смещению

области засветки рентгеновским пучком на поверхности жидкой субфазы. Решена задача непрерывной коррекции положения поверхности жидкой субфазы, что позволило избежать искажений рентгенофлуоресцентного сигнала, возникающих из-за смещения области засветки.

Впервые экспериментально получены угловые зависимости выхода флуоресценции от единичного органического монослоя на поверхности жидкости. Продемонстрированы возможности метода СРВ в области полного внешнего отражения для определения местоположения ионов внутри "органического монослоя. Анализ угловых зависимостей выхода позволил определить упаковку молекул в ленгмюровских слоях металозамещенных фтапоцианинов и полиорганосилаксанов.

В главе IV представлены результаты исследований повреждения молекулярной организации многослойных ЛБ пленок в результате инкорпорирования ионов металлов из водной субфазы. Экспериментальные измерения были проведены на источнике синхротронного излучения BESSY (Германия), станция КМС-2.

Пленки на основе фосфолипидов.

Образец №1 (контрольный). Раствор фосфолипида DPPE в смешанном растворителе (метанол и хлороформ) наносили на водную субфазу (тридистиллированная вода). Монослой поджимали до давления 40 мН/м и переносили на гидрофобную кремниевую подложку методом вертикального лифта.

Образец №2. Для приготовления образца монослой фосфолипида формировали на водной субфазе, содержащей ионы свинца (раствор ацетата свинца 1x10"4 М). Остальные условия нанесения были такие же, как и в случае контрольного образца.

На рис. 2 приведены характеристические спектры флуоресцентного излучения от образца №2, записанные при углах падения меньше критического угла ПВО для кремния.

С 1.0-1—1-■-1-II ■ I.-1-'-1-"-П—If-'-г

m i " 1-1-1-1-1-1-1-1-' '

1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

Е(кэВ)

Рис. 2. Характеристические спектры флуоресцентного излучения от фосфолипидного бислоя.

Хотя интенсивность пика Р Ка оказалась слишком слабой и получить количественную информацию о положении ионов фосфора в пленке не удалось, сравнение поведения пиков РЬ Ма и Р Ка на спектрах, представленных на рис. 2, позволяет сделать важные заключения о различном типе распределения этих ионов в пленке. На рис. 2 хорошо видно, что интенсивность выхода Р Ка флуоресценции монотонно растет с увеличением угла от нуля при 0=0 мрад и достигает максимального значения в окрестности критического угла для подложки. Такой ход угловой зависимости выхода флуоресценции наблюдается в том случае, когда атомы-источники флуоресценции образуют тонкий слой в пленке.

Совершенно иной характер имеет угловая зависимость выхода флуоресценции от ионов свинца: интенсивность пика РЬ Ма на спектрах практически не меняется. Как видно из рис. 3 кривая выхода флуоресценции от ионов свинца повторяет форму угловой зависимости отражения рентгеновских лучей и описывается соотношением 1+R, где R интенсивность отраженного

рентгеновского пучка. Такая форма угловой зависимости характерна для ситуации, когда атомы-источники флуоресцентного излучения образуют островковую структуру в пленке. Одной из возможной причин такого рода угловой зависимости выхода вторичного излучения может быть то, что ионы свинца в бислое DPPE образуют отдельные частицы, которые могут формироваться под фосфолипидным монослоем на водной субфазе благодаря гидратации и формированию гидроксо-мостиковых структур.

3 -

2

Ф

о о х m

о 1

X CD IX S

g 0,6 X CD

I 0.3

н o

0,0

I,■ ■ ■ "

_1_,_I_,—J_,_I_,_1_I_I . I

"1—....

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 G(мрад)

Рис. 3. Экспериментальная угловая зависимость выхода флуоресценции от ионов свинца, присутствующих в фосфолипидном бислое.

Пленки на основе жидкокристаллического соединения. Были исследованы пленки на основе жидкокристаллического (ЖК) комплекса европия с основанием Шиффа.

Образец №1. Ленгмюровский монослой поджали до поверхностного давления 25 мН/м. Так как монослой был не стабилен, выжидали 1 час. Затем сделали 7 погружений подложки методом горизонтального лифта.

Образец №2. Сразу же после формирования монослоя сделано 10 погружений подложки методом горизонтального лифта.

Образец №3. Сразу же после формирования монослоя сделано 20 погружений подложки методом горизонтального лифта.

Для исследования термостабильности пленок на основе комплекса Eu(III) образцы были подвергнуты отжигу при t=85°C (температура фазового перехода ЖК составляет 90°С).

На характеристических спектрах флуоресцентного излучения от всех образцов помимо европия (который входит в состав молекулы ЖК) были обнаружены пики от целого набора ионов металлов: Fe, Zn, Си, Са (рис. 4).

8 9 10 Е (кэВ)

Рис. 4. Характеристические спектры флуоресцентного излучения от пленок на основе ЖК комплекса европия.

Рис. 5. Угловые зависимости выхода флуоресценции и интенсивности рентгеновского отражения (нижняя кривая) от образца №1 (а). Сравнение угловых зависимостей выхода флуоресценции от образца №3 до и после отжига (б).

При подгонке угловых зависимостей выхода флуоресценции от Ей и Си для образца № 1 наилучшее согласие теории и эксперимента было получено для общего числа монослоев равного 11 (рис. 5 а), что не соответствует числу погружений, которое для этого образца составляло 7. Такое расхождение может быть связано с тем, что в процессе приготовления этого образца ленгмюровский слой инкубировали в течение 1 часа на водной субфазе, при этом заметно сокращалась площадь слоя. Вероятно, пленка комплекса Eu(III) на поверхности жидкости представляла собой не мономолекулярный слой, а систему доменов с различным количеством монослоев, так что средняя толщина перенесенной на подложку пленки оказалась больше, чем число погружений.

Сравнение данных для ионов Fe и Zn, полученных на разных образцах, показывает, что форма кривых выхода флуоресценции от этих ионов зависит от способа нанесения пленки. Так для образца №1 (ленгмюровский слой выдерживали в течения 1 часа перед перенесением на твердую подложку) форма кривых выхода от Fe и Zn повторяет кривую отражения (рис. 5 а). Тогда как на образцах № 2 и 3 (ленгмюровский слой переносили на твердую подложку сразу же после формирования) эти кривые имеют некоторый промежуточный вид.

Результаты по исследованию термостабильности ЛБ пленок на основе комплекса Eu(HI) приведены на рис. 5 б. Как видно из рисунка, при отжиге образца № 3 заметно изменились все кривые: угловые зависимости выхода флуоресценции от Fe и Zn до отжига имели промежуточную форму, после отжига эти кривые стали более походить на кривую отражения. Изменения кривой выхода от* Ей носили такой же характер.

При обсуждении полученных результатов следует, прежде всего, принять во внимание, что в состав молекул исследуемого ЖК соединения входят в качестве лигандов Р-дикетонат и фенантролин, которые являются сильными хелатирующими агентами для большинства металлов. В процессе формирования ленгмюровского слоя на водной субфазе молекулы фенантролина могли выйти из координационной сферы европия и сформировать более устойчивые комплексы с ионами железа и цинка из субфазы. Комплексы железа и цинка с фенантролином могли агрегировать и образовывать отдельную от Р-дикетоната фазу. В результате этих изменений в ленгмюровском слое возникают отдельные островки соединений железа и цинка в структурно упорядоченном слое комплекса Eu(III).

Принимая во внимание приведенные выше рассуждения, форму кривых выхода флуоресценции от железа и цинка, полученных для образца №1, можно объяснить следующим образом: в процессе инкубирования слоя комплекса Eu(III) на водной субфазе (в течение часа), произошло фазовое разделение слоя. Так что большая часть ионов железа и цинка в слое присутствует в виде

отдельных островков. При приготовлении образца №2 пленку переносили на твердую подложку сразу после формирования слоя на водной субфазе. В этом случае, фазовое разделение слоя еще не завершилось, поэтому распределение ионов железа и цинка в пленке носит промежуточный характер.

Что касается кривых выхода флуоресценции от ионов меди (которые по форме совпадают с кривыми выхода от ионов европия), то по литературным данным константа устойчивости комплекса меди с Шиффовыми основаниями значительно выше, чем для других металлов. Это позволяет предположить возможность частичного замещения в исследуемом комплексе Eu(III) атомов европия на атомы меди.

Представленные результаты экспериментальных исследований нарушений структурной организации ЛБ пленок, вызванных адсорбцией ионов металлов из водной субфазы, наглядно демонстрируют преимущества метода СРВ, в котором спектральная селективность сочетается с возможностью получения структурной информации. Анализ полученных экспериментальных данных позволил определить композиционный состав многослойных органических наносистем, а также локализовать положение ионов металлов, инкорпорированных в органические слои из водной субфазы в процессе нанесения пленок. Обнаружено, что, даже в том случае, когда примеси присутствуют в водной субфазе в следовых концентрациях (ниже чем 10~7 М), самопроизвольная адсорбция органическими молекулами ионов металлов привела к значительным перестройкам молекулярной организации пленок.

В главе V представлены результаты исследований молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов с применением метода стоячих рентгеновских волн, предложены новые подходы для исследования эффективности и безопасности действия лекарственных соединений с использованием белково-липидных наносистем в качестве изолированных моделей клеточных мембран. Экспериментальные измерения были проведены на источнике синхротронного излучения BESSY (Германия), станция КМС-2.

Общая схема нанесения белковых пленок. Монослой фосфолипида формировали на поверхности водной субфазы и переносили на гидрофобные кремниевые подложки методом Ленгмюра-Блоджетт. Подложку с монослоем фосфолипида помещали в кювету, находившуюся на дне ленгмюровской ванны. Затем кювету с подложкой вынимали из ванны. Адсорбционную иммобилизацию белковых молекул на ЛБ слое фосфолипида проводили из рабочего раствора белка при комнатной температуре. После адсорбции белка образец, не вынимая из кюветы, промывали дистиллированной водой. Затем кювету помещали на дно ленгмюровской ванны, заполненной дистиллированной водой. На поверхности субфазы вновь формировали монослой фосфолипида. После чего подложку с иммобилизованным белковым слоем вынимали через вновь сформированный монослой. Таким образом, пленка состояла из 3 слоев (см. рис. 6).

иШЦШиШиШ - монослой липидов

^ -белковые молекулы

-А : У _

- монослой липидов

Si подложка

Рис. 6. Схема белково-липидной пленки.

Белковые пленки на основе Са АТФазы.

Образец №1. При солюбилизации Са-АТФазы в раствор добавили ацетат свинца, концентрация свинца в растворе составляла ЗхЮ"4 М. Смесь инкубировали в течение 1 часа. Иммобилизацию белка на монослой фосфолипида DPPE проводили по общей схеме, описанной выше.

Образец Л^2..При солюбилизации Са-АТФазы в раствор добавили ацетат свинца, концентрация свинца в растворе составляла ЗхШ"4 М. Смесь инкубировали в течение 1 часа. Иммобилизацию белка проводили по общей схеме. Однако после инкубирования в течение суток в рабочем белковом растворе образец, не вынимая из кюветы, промыли сначала дистиллированной водой, а затем выдерживали три часа в растворе лекарственного препарата

ксидифон (концентрация 0,07 М). Снова промыли водой и поместили кювету с образцом на дно ленгмюровской ванны, заполненной дистиллированной водой. Остальная процедура нанесения не отличалась от общей схемы, описанной выше.

е(мрад)

Рис.7. Угловые зависимости выхода Pb La флуоресценции от белково-липидных пленок. Кривая 1 - экспериментальные данные для образца № 1, сплошная линия - расчет для толщины слоя свинца 1 нм, пунктирная линия - расчет для толщины слоя свинца 3 нм. Кривая 2 — экспериментальные данные для образца №2, сплошная линия - расчет для толщины слоя свинца 13 нм, пунктирная линия - расчет для толщины слоя свинца 15 нм Нижние кривые - экспериментальная и расчетная угловые зависимости рентгеновского отражения.

Количественные оценки толщин распределения ионов свинца были получены из подгонки экспериментальных угловых зависимостей выхода флуоресценции к расчетным кривым (рис. 7). Наилучшее совпадение теоретических кривых с экспериментальными данными было получено для следующих значений толщин распределения ионов свинца: 13 нм для образца №1 и 1 нм для образца №2. Согласно полученным данным, в образце №1 ионы

свинца распределены по всей толщине белкового слоя, тогда как после инкубации пленки в растворе ксидифона, ионы свинца сохранились в тонком слое у нижней границы пленки.

Белковые пленки на основе щелочной фосфатазы (ЩФ). При растворении ЩФ в раствор добавили раствор ацетата свинца, концентрация свинца в растворе составляла 3x10"4 М. Смесь инкубировали в течение 5 часов. Иммобилизацию белка на смешанный монослой DPPC и холестерина проводили по общей схеме. Однако после инкубирования в течение 10 часов в рабочем белковом растворе, образец, не вынимая из кюветы, промыли сначала дистиллированной водой, а затем выдерживали 2 часа в растворе комплексообразующего соединения. Остальная процедура нанесения не отличалась от общей схемы.

Образец №3. В кювету с подложкой добавили 2% раствор ксидифона.

Образец №4. В кювету с подложкой добавили 0,04 % раствор ЭДТА.

Образец №5. В кювету с подложкой добавили 0,02 % раствор сукцимера.

На спектрах от всех образцов интенсивность пика Pb La оказалась очень низкой. Это позволило сделать заключение, что в результате применения каждого из трех исследованных комплексообразующих препаратов наблюдается значительное уменьшение количества ионов свинца в белково-липидных пленках. Тем не менее, согласно полученным данным, после обработки комплексообразующим соединением в каждой из пленок сохранилось некоторое количество ионов свинца.

Таким образом, представленные в настоящей главе исследования белково-липидных пленок позволили напрямую определить положение ионов свинца в пленках до и после применения комплексообразующих лекарственных препаратов. Продемонстрированы возможности метода стоячих рентгеновских волн для изучения белково-липидных мембранных моделей на твердых подложках. Установлено, что в случае изолированной белково-липидной пленки применение исследованных комплексообразующих лекарственных препаратов ЭДТА, сукцимера и ксидифона дает возможность максимально, но

не полностью удалить из молекул ферментов Са АТФаза и щелочная фосфатаза ионы свинца, связанных в процессе преинкубации белка в растворе уксуснокислого свинца. Показана высокая эффективность отечественнго бифосфонового комплексообразующего соединения - ксидифона, не уступающая по элиминирующим свойствам патентованным комплексонам ЭДТА и сукцимер.

Глава VI. Исследования, представленные в этой главе, посвящены изучению процессов самоорганизации сложных биоорганических наносистем на поверхности жидкой субфазы. Экспериментальные измерения выполнены в Европейском Центре Синхротронного Излучения (Франция), станция ID10B.

Пленки на основе щелочной фосфатазы. Раствор фосфолипида DPPC в хлороформе наносили на субфазу (TRIS рН=8,3). Монослой DPPC поджимали до поверхностного давления 12 мН/м, затем слой разжимали и вводили под монослой 200 мкл белково-липидной смеси (ЩФ и фосфатидилинозитол). Слой выдерживали 30 мин и опять поджимали до 12 мН/м. Снова разжимали, добавляли 300 мкл белково-липидной смеси. Еще раз выдерживали слой в течение 30 мин и поджимали до 30 мН/м.

Наилучшее совпадение теоретических кривых с экспериментальными угловыми зависимостями выхода флуоресценции было получено в рамках модели, состоящей из 4 слоев (рис. 8). На основе полученных результатов можно предположить, что после нанесения смеси диспергированного в водной среде фосфолипида фосфатидилинозитол и водного раствора белка ЩФ под ленгмюровский слой фосфолипида DPPC произошло самопроизвольное расслоение этой термодинамически неустойчивой дисперсионной системы. При этом молекулы фосфатидил-инозитода могли образовать агрегатные структуры типа мицелл или визикул (слой В на рис. 8) под слоем DPPC, а молекулы ЩФ самоорганизовались в отдельный слой (слой С), не содержащий фосфолипидных молекул. Часть молекул фосфолипида присутствует под слоем белка (слой D).

[_p+_Ni Слой А (ЗОА)

I Р+Мионы| Слой В (200А)

JT2:

Zfu Ni ионьР Слой С (250А)

p+Ni HOHrii Слой D (800А)

Водная субфаза

Молекулы липида DPPC

Мицелы

'2п

Молекулы белка

Молекулы липидов

1,5 2,0

6(мрад)

Рис. 8. Угловые зависимости выхода флуоресценции от белково-липидной пленки на основе смеси щелочной фосфатазы и фосфолипида фосфатидилинозитол. Точки - экспериментальные данные, сплошные линии - расчет. Нижняя кривая - экспериментальная угловая зависимость рентгеновского отражения. Модель белково-липидной пленки на основе смеси щелочной фосфатазы и фосфолипида фосфатидилинозитол.

Следует отметить, что модуляции на кривых выхода флуоресценции связаны с явлением резонансного усиления волнового поля, возникающего в слоистых системах при рассеянии рентгеновского излучения в условиях ПВО. Резонансное усиление возникает в пленке, если электронная плотность пленки меньше чем электронная плотность подложки 0f<0s (0f и 0S - критические углы ПВО для пленки и подложки соответственно). В этом случае в интервале углов 6t<9<0s падающая волна проникает в пленку и испытывает полное внешнее отражение на границе пленка/подложка. В результате когерентного сложения преломленной и отраженной волн в пленке формируется стоячая рентгеновская волна. При углах, когда разность фаз между преломленной и отраженной

волнами достигает величины 2тт (п=1, 2, 3 ...) происходит значительное усиление амплитуды СРВ (рис. 9).

200 400 600 800 1000 1200

Z(A)

Рис. 9. Расчетные зависимости интенсивности волнового поля от глубины в белково-липидной пленке, рассчитанные при фиксированных углах падения: 0] (кривая 1) и 02 (кривая 2), отмеченных на рис. 8.

Если толщина слоя достаточно велика, то условия резонансного усиления волнового поля в слое реализуются при нескольких значениях углов из интервала 0f<0<0s. Наличие 2 максимумов на экспериментальной кривой выхода от цинка указывает на то, что толщина слоя, в котором распределены ионы цинка, оказалась достаточно большой, и в этом слое дважды выполняются условия резонансного усиления волнового поля, что в свою очередь привело к значительному увеличению интенсивности выхода флуоресценции при этих углах.

Пленки на основе глюкозооксидазы (ГО). Для формирования смешанных белково-липидных пленок был использован метод адсорбции белка на ленгмюровский монослой поверхностно активного вещества: водный раствор ГО наливали в Ленгмюровскую ванну, а затем на поверхности этой субфазы

наносили монослой бегеновой кислоты. Слой поджимали до поверхностного давления 20 мН/м.

Пленки на основе ГО, обработанной растворами солей свинца и хрома. В рабочий раствор ГО добавляли растворы ацетата свинца (измерение №1) и хлорида хрома (измерение №2). Концентрация РЬ в рабочем растворе белка составляла 3x10'5 М, а концентрация Сг - 3,86x10' М. Формирование смешанной белково-липидной пленки проводили по общей схеме, описанной выше.

С точки зрения измерений методом СРВ, ионы металлов, связанные белковыми молекулами, являлись своего рода метками, что дало возможность, определить местоположение белковых молекул в белково-липидной пленке из анализа угловых зависимостей выхода флуоресценции от ионов металлов. Кривые выхода флуоресценции от свинца и хрома, показаны на рис. 10: обе кривые имеют классическую форму, которая наблюдается, в том случае, когда атомы-источники флуоресцентного излучения расположены в тонком слое вблизи отражающей поверхности.

Математическая обработка экспериментальных угловых зависимостей выхода флуоресценции позволила определить толщину d и плотность р слоев, в которых распределены ионы металлов для каждой из исследованных белково-липидных пленок. Согласно полученным данным в пленке, сформированной на основе ГО, обработаной раствором свинца, ионы свинца присутствуют в слое, расположенном у границы раздела пленка/воздух, толщина и плотность этого слоя составили d=120 А, р=0,6*рго (где рго - плотность монослоя ГО при плотной упаковке молекул белка). Для пленки на основе ГО, обработанной раствором хрома, наилучшее совпадение теоретических кривых с экспериментальными данными было получено в рамках двухслойной модели. Параметры верхнего слоя имеют значения: dA=29 А, Ра=Рбк (где рБк -плотность монослоя бегеновой кислоты при плотной упаковке молекул жирной кислоты), параметры нижнего слоя: dB=80 А и рв=0,8*рго, причем в этой пленке ионы хрома присутствуют только в нижнем слое.

4,5

4,0

ч: ш 3,5

6.

с 3,0

л

н о 2,5

о

а 2,0

s

о

X О) 1,5

I S 1,0

0,5

0,0

Слой А

_^ Молекулы бегеновой

--L- ," кислоты

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8

9 (мрад)

Рис. 10. Угловые зависимости выхода флуоресценции от белково-липидных пленок на основе глюкозооксидазы, обработанной растворами солей свинца и хрома. Точки - экспериментальные данные, сплошные линии - расчет.

Слой А ~

Водная субфаза

Мопекупы белка

Пленки на основе ГО, подвергнутой обработке мочевиной. Обработку ГО мочевиной проводили по следующей схеме: в раствор белка добавляли мочевину, концентрация мочевины в рабочем растворе составляла 90 мМ, смесь инкубировали при комнатной температуре в течение различного периода времени 12 (измерение №3) и 24 часов (измерение №4).

Рентгенофлуоресцентные измерения позволили выявить существенные изменения композиционного состава биоорганических пленок в результате обработки белка раствором мочевины. По сравнению с чистой ГО на спектрах появились интенсивные пики от Са, Zn и РЬ (рис. 11). Следует подчеркнуть, что для приготовления всех рабочих белковых растворов, а также буферных растворов субфазы была использована вода высокой степени очистки (сопротивление >18 Мом/см).

Обнаруженное в представленных исследованиях накопление ионов металлов в пленке ГО, обработанной мочевиной, возможно, связано с тем, что в результате действия мочевины произошло изменение пространственного расположения отдельных пептидных фрагментов на поверхности белковой макромолекулы. Это могло привести к увеличению доступности

аминокислотных остатков с функциональными группами, которые обладают высокой способностью координировать ионы металлов.

Е, КЭВ

Рис. 11. Характеристические спектры флуоресцентного излучения от белковой пленки на основе фермента ГО обработанной мочевиной: кривая 1 — длительность обработки 12 ч, кривая 2 -24 ч.

Угловые зависимости выхода флуоресценции от наиболее интенсивных пиков примесей (Zn Ка для измерения №3 и Са Ка для измерения №4) для пленок на основе ГО, обработанной раствором мочевины, представлены на рис. 12. Форма кривой выхода флуоресценции от пленки на основе ГО, подвергнутой обработке мочевиной в течение 12 часов, совпадает с кривой, полученной на пленке ГО, обработанной хромом. В том случае, когда обработку ГО раствором мочевины проводили в течение 24 часов (измерение №4), ход экспериментальной кривой выхода флуоресценции от белкового слоя имел более сложный характер (рис. 12 б). На первом этапе измерений форма этой кривой совпадает с кривой выхода от хрома, полученной в измерении №2. Затем ход угловой зависимости меняется, и эта кривая совпадает с кривой выхода от свинца, полученной в измерении №1.

9 (мрад)

Рис. 12. Угловые зависимости выхода флуоресценции от белково-липидных пленок на основе фермента ГО, обработанной растворами мочевины: а) длительность обработки 12 часов; б) длительность обработки 24 часа. Для сравнения приведена угловая зависимость выхода флуоресценции от белково-липидных пленок на основе ГО, обработанной раствором свинца (измерение №1) и хрома (измерение №2). Точки -экспериментальные данные, сплошные линии - расчет.

Проведенные в настоящих исследованиях рентгенофлуоресцентные измерения смешанных белково-липидных пленок на основе фермента глюкозооксидаза показали, что в результате обработки белка раствором мочевины происходит самопроизвольная адсорбция ионов металлов из воды высокой степени очистки.

Анализ угловых зависимостей выхода флуоресценции от ионов металлов, связанных молекулами ГО, позволил определить характер изменений молекулярной организации в белково-липидных пленках при токсическом воздействии тяжелых металлов (свинец, хром) и мочевины. Согласно полученным результатам после обработки свинцом молекулы ГО встраиваются в монослой бегеновой кислоты, образуя рыхлый слой непосредственно на границе раздела воздух/пленка (плотность слоя р<рго, а толщина слоя больше, чем толщина белкового монослоя). Для пленки с хромом слой белка расположен, под монослоем бегеновой кислоты, причем плотность слоя оказалась больше, а толщина меньше, чем в пленке со свинцом. Эти различия в молекулярной организации белково-липидных пленок могут быть связаны с конформационными перестройками белковой глобулы, вызванными обработкой растворами повреждающих агентов. Так, под действием свинца могло произойти частичное разрушение нативной конформации белковой глобулы, при этом число гидрофобных участков на поверхности молекулы увеличилось, и молекулы ГО начали встраиваться в гидрофобную область липидного слоя, образуя слой непосредственно у границы раздела пленка/воздух.

При обработке ГО раствором хрома концентрация хрома в растворе была меньше, и изменения конформации белковых молекул, по-видимому, оказались не столь существенными. Так что в этом случае заметного изменения способности ГО сорбировать на монослой липидов не произошло, и белковые молекулы концентрировались под монослоем бегеновой кислоты, не встраиваясь в сам монослой. 1

Обработка ГО мочевиной также привела к разрыву водородных связей на поверхности белковой глобулы. Так как концентрация мочевины была невысокой, нарушения конформации оказались не столь глубокими, и белок адсорбировался у нижней границы монослоя бегеновой кислоты. Однако, при увеличении длительности обработки мочевиной, процесс деструкции пошел более интенсивно, и в измерениях №4 было обнаружено, что белок сначала адсорбировался под монослоем, а затем начал всплывать к поверхности.

Таким образом, проведена серия исследований упорядоченных биоорганических наноструктур на поверхности жидкой субфазы. Впервые решалась задача изучения с помощью метода СРВ процессов самоорганизации, протекающих в белковых системах на поверхности жидкой субфазы, в условиях, когда белковые молекулы сохраняют свою подвижность. Установлено, что в термодинамически неустойчивой биоорганической наносистеме на основе фермента щелочная фосфатаза и фосфолипида фосфатидилинозитол произошло самопроизвольное расслоение, при этом белковые молекулы самоорганизовались в отдельный слой, не содержащий фосфолипидных молекул. Обнаружено, что в сформированной слоистой структуре происходит резонансное усиление интенсивности волнового поля, приводящее к соответствующему усилению интенсивности выхода флуоресценции от атомов белково-липидной пленки.

Кроме того, метод СРВ был применен для изучения влияния различных

токсических веществ (тяжелые металлы и мочевина) на формирование

упорядоченных биоорганических наносистем на жидкости (пленки на основе

фермента глюкозооксидаза и бегеновой кислоты). Согласно полученным

данным, токсические агенты даже в малых дозах оказывают существенное

влияние на молекулярную организацию белково-липидных пленок. Кроме того

обнаружено, что малые дозы мочевины (не вызывающие денатурации белковых

/

молекул) приводят к существенному увеличению адсорбционной способности белковых макромолекул, тем самым заметно изменяя микроэлементный состав биоорганических наносистем.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Впервые предложена и реализована методика спектрально-селективных рентгеновских исследований планарных органических и биоорганических наносистем на жидкости, что позволило существенно расширить исследовательские возможности метода стоячих рентгеновских волн (XRSW). Получена принципиально новая информация о структурной организации белково-липидных наносистем на жидкости в условиях, когда белковые молекулы находятся в подвижном состоянии и сохраняют свою нативность, при этом фактически заложены основы метода стоячих рентгеновских волн для изучения различных мембранных процессов (ионный транспорт, взаимодействие с мембраноактивными веществами, обменные процессы и т.д.) в условиях максимально приближенных к условиям функционирования биомембраны в живых клетках.

1.1 Разработан метод регистрации угловой зависимости выхода флуоресценции в области полного внешнего отражения с учетом специфики рентгеновских измерений на жидкости, связанной с необходимостью сохранять поверхность образца (поверхность жидкости в легмюровской ванне) в горизонтальном положении в процессе измерений. Решена задача непрерывного мониторинга положения поверхности жидкости, что позволило проводить коррекцию неконтролируемого уменьшения уровня жидкости из-за испарения.

1.2 Предложенная методика экспериментально реализована с использованием синхротронного излучения для исследования молекулярной организации органических пленок металозамещенных фталоцианинов и полиорганосилаксанов. Впервые получены угловые зависимости выхода флуоресцентного излучения от мономолекулярных слоев, сформированных на поверхности жидкости. Определен тип упаковки органических молекул (ориентация макроциклов молекул) в пленках.

1.3 Метод стоячих рентгеновских волн применен для in-situ исследований процессов самоорганизации в сложных биоорганических наносистемах в условиях, когда белковые и липидные молекулы сохраняют свою подвижность и могут свободно распределяться у границы раздела

воздух/жидкость: изучены механизмы самопроизвольного расслоения термодинамически неустойчивых биоорганических наностистем; получена информация о влиянии токсических веществ на формирование биоорганических наносистем на жидкости.

1.4 Предложены численные и аналитические подходы для анализа рассеяния рентгеновского излучения в планарных наносистемах в условиях полного внешнего отражения. На основе рекуррентных уравнений разработаны алгоритмы для математической обработки экспериментальных данных по изучению органических и биоорганических пленок с помощью метода стоячих рентгеновских волн.

1.5 Проведен анализ формирования стоячей рентгеновской волны в слаборассеивающих молекулярных пленках в условиях полного внешнего отражения. Впервые экспериментально зарегистрировано резонансное усиление стоячей рентгеновской волны в биоорганических планарных наносистемах на жидкости.

2. Продемонстрированы возможности метода стоячих рентгеновских волн для нанодиагностики белково-липидных моделей клеточных мембран на твердых подложках. Предложен новый подход для изучения эффективности и безопасности действия лекарственных препаратов, позволяющий получать информацию о молекулярных механизмах взаимодействия лекарственного соединения с биологическими макромолекулами.

2.1 Методом рентгенофлуоресцентного анализа в полном внешнем отражении (TXRF) получена сравнительная оценка эффективности комплексообразующих лекарственных препаратов, применяемых для ускорения выведения тяжелых металлов из организма. Изучено действие комплексообразующих лекарственных препаратов (ксидифон, медифон, ЭДТА и сукцимер) при повреждении белково-липидных моделей клеточных мембран ионами свинца.

2.2 Установлено, что применение всех исследованных препаратов не обеспечило полного удаления ионов свинца из белково-липидных пленок. Методом стоячих рентгеновских волн определено местоположение остаточных ионов свинца внутри пленок. Показано,

что ионы свинца, связанные в активных центрах белковых молекул, оказались недоступны для действия лекарственных препаратов.

2.3 Проведены исследования влияния высоких доз комплексообразующих лекарственных соединений на элементный состав белковых молекул. Впервые обнаружено явление значительного увеличения адсорбционной способности белковых молекул в результате обработки растворами комплексообразующих соединений.

3. Метод стоячих рентгеновских волн применен для характеризации многослойных пленок Ленгмюра-Блоджетт на твердых подложках.

3.1 Впервые зарегистрированы аномалии в экспериментальных угловых зависимостях выхода флуоресценции от тонких пленок в угловой области полного внешнего отражения. Установлено, что в том случае, когда атомы-источники флуоресцентного излучения не образуют сплошного слоя в пленке, кривая выхода флуоресценции повторяет по форме кривую отражения рентгеновских лучей.

3.2 Обнаружены существенные повреждения структуры фосфолипидной пленки, сформированной на водной субфазе, содержащей ионы свинца в концентрации 1x10^ М. Установлено, что ионы свинца в бислое фосфолипида образуют отдельные частицы.

3.3 Проведены исследования влияния следовых количеств ионов металлов (концентрация ниже чем 10"7 М), присутствующих в водной субфазе, на молекулярную организацию ленгмюровского слоя жидкокристаллического соединения. Показано, что, несмотря на низкий уровень концентрации ионов металлов в водной субфазе, самопроизвольная адсорбция этих ионов привела к значительным нарушениям структурной организации органических пленок.

По материалам диссертации опубликовано 29 статей в российских и зарубежных журналах, а также 30 тезисов докладов, получено 2 патента на изобретение. Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Zheludeva S. I., Kovalchuk М. V., Novikova N. N., Sosphenov A. N., Petty M.

C., Howarth V. A., Cernik R. I., Collins S. P. Ion permeation through

Langmuir-Blodgett layers investigated by total external reflection and fluorescence study. // Materials Science & Engineering. 1995. V.3. P.211-214.

2. Zheludeva S.I., Kovalchuk M.VNovikova., N.N., Sosphenov A.N., Salaschenko N.N., Shamov E.A., Prokhorov K.A., Burattini E., Cappuccio G. X-ray Standing Waves in X-ray Specular Reflection and Fluorescence Study of Nano-Films. // J.Appl.Cryst. 1997. V. 30. P. 833-838.

3. Желудева С.И., Новикова H.H., Терещенко Е.Ю., Салащенко Н.Н. Возможности характеризации многослойных структур в области полного внешнего отражения рентгеновских лучей при регистрации флуоресцентного излучения. // Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 1997. N11. С.17-22.

4. Zheludeva S.I., Kovalchuk M.V., Novikova N.N. Total reflection X-Ray fluorescence study of organic nanostructures. // Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy. 2001. V.56. P.2019-2026.

5. Лепихин B.B., Лидер B.B., Желудева С.И., Новикова Н.Н., Вологин В.И., Шишков В.А., Шилин Ю.Н. Блок формирования и управления пучком рентгеновского излучения для исследования молекулярных слоев на поверхности жидкости на источнике синхротронногоизлучения. // Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 2002. N12. С.21-24.

6. Желудева С.И., Новикова Н.Н., Коновалов О.В., Ковальчук М.В., Степина Н.Д., Юрьева Э.А., Мягков И.В., Годовский Ю.К., Макарова Н.Н., Рубцов

A.M., Лопина О.Д., Ерко А.И., Толстихина А.Л., Гайнутдинов Р.В., Лидер

B.В., Терещенко Е.Ю., Янусова Л.Г. Возможности рентгеновской флуоресценции в области полного внешнего отражения для исследования ленгмюровских монослоев на поверхности жидкости и твердой подложке. // Кристаллография. 2003. Т.48. N6. С. 30-42.

7. Novikova N.N., Zheludeva S.I., Konovalov O.V., Kovalchuk M.V., Stepina N.D., Myagkov I.V., Godovsky Yu.K., Makarova N.N., Tereschenko E.Yu., Yanusova L.G. Total reflection X-ray fluorescence study of Langmuir monolayers on water surface. // J. Appl. Cryst. 2003. V.36. P.727-731.

8. Zheludeva S.I., Novikova N.N., Konovalov O.V., Kovalchuk M.V., Stepina N.D., Tereschenko E.Yu. Langmuir monolayers on water surface investigated by X-ray total reflection fluorescence. // Materials Science and Engineering. 2003. V.23. P.567-570.

9. Новикова H.H., Юрьева Э.А., Желудева С.И., Ковальчук М.В., Степина Н.Д., Коновалов О.В., Толстихина А.Л., Гайнутдинов Р.В., Урусова Д.В., Матковская Т.А., Рубцов A.M., Лопина О.Д., Ер1ко А.И. Исследование белково-липидных мембранных моделей с помощью рентгенофлуоресцент-ных методик. // Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. 2005. N8. С.67-73.

10.Novikova N.N., Yur'eva Е.А., Zheludeva S.I., Kovalchuk M.V., Stepina N.D., Tolstikhina A.L., Gainutdinov R.V., Urusova D.V., Matkovskaya T.A., Rubtsov A.M., Lopina O.D., Erko A.I., Konovalov O.V. X-ray fluorescence

methods for investigations lipid/protein membrane models. // J.Synchrotron Rad. 2005. V.12. P. 511-516.

П.Новикова H.H., Желудева С.И., Степина Н.Д., Толстихина А.Л., Гайнутдинов Р.В., Ерко А.И., Хаазе В., Галяметдинов Ю.Г. Структурная локализация следовых количеств примесных ионов в пленках Ленгмюра-Блоджетт с помощью метода стоячих рентгеновских волн. // Кристаллография. 2006. Т.51. С.1110-1116.

12.Novikova N.N., Zheludeva S,I., Stepina N.D., Tolstikhina A.L., Gaynutdinov R.V., Haase W., Erko A.I., Knyasev A.A., Galyametdinov Yu.G. Arrangement of trace metal contaminations in thin films of liquid crystals studied by X-ray standing wave technique. // Spectrochimica Acta Part B. 2006. V.61. P. 12291235.

13.Zheludeva S., Novikova N., Stepina N., Yurieva E., Konovalov O. Molecular organization in protein-lipid film on the water surface studied by x-ray standing wave measurements under total external reflection. // Spectrochimica Acta B. 2008. V.63. P. 1339-1403

14.Novikova N.N., Zheludeva S.I., Stepina N.D., Tolstikhina A.L., Gaynutdinov R.V., Haase W., Erko A.I., Knyazev A.A., Galyametdinov Yu.G. X-ray standing wave studies of metal ions incorporation in Langmuir-Blodgett films. // Appl Phys A. 2009. V.94. P. 461-466.

15.Желудева С.И., Новикова H.H., Ковальчук M.B., Степина Н.Д., Коновалов О.В., Юрьева Э.А. Рентгенофлуоресцентные измерения для исследования элементного состава и молекулярной организации белковных пленок на поверхности жидкой субфазы. // Кристаллография. 2009. Т. 54. N6. С. 968-976.

16.Novikova N.N., Zheludeva S.I., Kovalchuk M.V., Stepina N.D., Erko A.I., Yur'eva E.A. Investigation of molecular mechanisms of action of chelating drugs on protein-lipid model membranes by x-ray fluorescence. // Crystallography Reports. 2009. V.54. N 7. P. 1208-1213.

17.Гайнутдинов P.B., Толстихина А.Л., Степина Н.Д., Новикова Н.Н., Юрьева Э.А., Хрипунов А.К. АСМ-исследование адсорбции белковых молекул на перенесенном ленгмюровском монослое. // Кристаллография. 2010. Т. 55. №3. С. 520-525.

Подписано в печать 22.03.2011. Формат 60x90/16 Печать офсетная. Усл. печ. л. 2,75 Тираж 80. Заказ 39

Отпечатано в НИЦ «Курчатовский институт» 123182, Москва, пл. Академика Курчатова, д. 1

6

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ РЕНТГЕНОВСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ОРГАНИЧЕСКИХ И БИООРГАНИЧЕСКИХ НАНОСИСТЕМ

1.1. Упорядоченные органические и биоорганические наностистемы: свойста, применение и методы формирования.

1.1.1. Белково-липидные пленки как модели клеточных мембран.

1.1.2. Метод Ленгмюра-Блоджетт.

1.1.3. Формирование биоорганических пленок на поверхности жидкой субфазы

1.1.4. Нанесение биоорганических пленок на твердые подложки.

1.2. Рентгеновские исследования молекулярных пленок на жидкости.

1.3. Метод длинно периодических стоячих рентгеновских волн.

1.3.1. Основные принципы.

1.3.2. Стоячие рентгеновские волны в многослойных периодических структурах.!,

1.3.3. Метод стоячих рентгеновских волн для исследования органических и биоорганических наносистем.

ГЛАВА II. МАТЕМАТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ АНАЛИЗА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ ПО ИЗУЧЕНИЮ ТОНКОПЛЕНОЧНЫХ НАНОСИСТЕМ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА СТОЯЧИХ РЕНТГЕНОВСКИХ ВОЛН

2.1. Метод рекуррентных уравнений.

2.1.1. Схема расчета рентгеновского отражения от многослойной системы

2.1.2 Расчет интенсивности волнового поля.

2.1.3. Расчет интенсивности выхода вторичных излучений.

2.2. Метод СРВ для исследования тонких пленок в условиях полного внешнего отражения.

2.3. Особенности рассеяния рентгеновского излучения в мономолекулярных пленках на поверхности жидкости.

ГЛАВА III. РАЗВИТИЕ МЕТОДА СРВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ УПОРЯДОЧЕННЫХ НАНОСИСТЕМ НА ЖИДКОСТИ

3.1. Введение.

3.2. Особенности рентгеновских измерений на жидкости.

3.3. Описание экспериментальной станции ID10, ESRF, Франция.

3.4. Структурная нанодиагностика ленгмюровских слоев на поверхности жидкости с помощью метода СРВ.

ГЛАВА IV. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПРИМЕСНЫХ ИОНОВ В ПЛЕНКАХ ЛЕГМЮРА-БЛОДЖЕТТ НА ТВЕРДЫХ ПОДЛОЖКАХ

4.1. Введение.

4.2. Описание экспериментальной станции КМС-2, BESSY II, Германия.

4.3. Нанесение ЛБ пенок на основе фосфолипидов и жидкокристаллических соединений на твердые подложки.

4.4. Исследования морфологии поверхности органических пленок методом атомно-силовой микроскопии.

4.5. Изучение структурных нарушений в фосфолипидных бислоях под действием ионов тяжелых металлов.

4.6. Структурная локализация следовых количеств примесных ионов в пленках Лэнгмюра-Блоджетт на основе жидкокристаллических соединений.

ГЛАВА V. ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА СТОЯЧИХ РЕНТГЕНОВСКИХ ВОЛН

5.1.Введени е.

5.2. Комплексообразующие соединения как ускорители выведения тяжелых металлов из организма.

5.3.Формирование упорядоченных белковых пленок на твердых подложках.

5.4. Исследования морфологии поверхности белковых пленок методом атомно-силовой микроскопии.

5.5. Исследования молекулярных механизмов действия лекарственных соединений с использованием белково-липидных наносистем в качестве изолированных моделей клеточных мембран.

5.6. Сравнительная оценка действия лекарственных препаратов, применяемых для ускорения выведения тяжелых металлов.

5.7. Изменения композиционного состава и молекулярной организации изолированных мембранных моделей при применении лекарственных препаратов в высоких дозах.

ГЛАВА VI. МЕТОД СТОЯЧИХ РЕНТГЕНОВСКИХ ВОЛН ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭЛЕМЕНТНОГО СОСТАВА И МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БИООРГАНИЧЕСКИХ НАНОСИСТЕМ НА ПОВЕРХНОСТИ ЖИДКОСТИ

6.1. Введение.

6.2. Исследование процессов самоорганизации в смешанных белково-липидных пленках на основе щелочной фосфатазы.

6.2.1. Формирование белково-липидной пленки на основе щелочной фосфатазы на поверхности жидкости.

6.2.2. Изучение элементного состава белковых пленок.

6.2.3.Исследования молекулярной организации белковных пленок методом стоячих рентгеновских волн.

6.3. Исследования механизмов нарушения белково-лииидных взаимодействий под влиянием повреиедающих агентов.

6.3.1. Формирование белковой пленки на основе глюкозаоксидазы на поверхности жидкости.

6.3.2. Исследования пленок на основе глюкозооксидазы, обработанной растворами солей свинца и хрома.

6.3.3. Исследования пленок на основе глюкозооксидазы, подвергнутой обработке мочевиной.

Создание новых методов формирования и изучения высокоорганизованных органических и биоорганических тонкопленочных систем представляет собой одно из важнейших направлений научных разработок в области нанотехнологий. Возможность модифицировать физические и химические характеристики таких систем в широких пределах позволяет получать тонкопленочные покрытия нанометрового диапазона с заранее заданными и самыми разнообразными свойствами. Важнейшей сферой практического применения органических пленок является молекулярная микроэлектроника. Использование биоорганических пленок открывает новые перспективы для различных биотехнологических приложений, к числу которых относится получение активных элементов для биосенсоров, разработка биокатализаторов, создание синтетических нанобиоструктурных материалов для биомедицинских применений и т.д.

Особый интерес к исследованию упорядоченных белково-липидных пленок связан с тем, что по своему составу и морфологии эти системы представляют собой адекватную модель биологических мембран. Такие исследования позволяют получать информацию о структурно-функциональном состоянии белково-липидных моделей клеточных мембран на молекулярном уровне и могут быть эффективно использованы для решения широкого круга задач, связанных с биомедицинской диагностикой и биофизическими исследованиями. Новые перспективы для фундаментальных и прикладных исследований в области биологии и медицины открывает изучение белково-липидных пленок на поверхности жидкой субфазы, когда не нарушается нативная конформация белковых молекул, а, следовательно, сохраняются их биологические функции. Это дает принципиальную возможность изучать различные биофизические и биохимические процессы, протекающие в функционирующих мембранных моделях.

Дальнейшее расширение границ применения органических и биоорганических слоистых наноструктур тесно связано с развитием новых физических методик для характеризации объектов, имеющих наноразмерную организацию. К числу наиболее перспективных современных методов диагностики тонкопленочных систем относятся рентгеновские методики, дающие спектрально-селективную структурную информацию, такие как метод стоячих рентгеновских волн (СРВ). Исследования тонкопленочных биоорганических систем с помощью метода СРВ основаны на одновременной регистрации рентгеновского отражения и выхода вторичного излучения (например, характеристической флуоресценции), возникающего при неупругом рассеянии рентгеновских лучей в условиях полного внешнего отражения (ПВО). Главным преимуществом метода СРВ по сравнению с классическими рентгеновскими методиками является возможность напрямую определять местоположение атомов-определенного сорта в слоистой системе из анализа угловых зависимостей выхода флуоресценции от этих атомов.

Важным шагом в развитии метода СРВ явиляется применение этого метода для исследования органических и биоорганических пленок на жидкости, что потребовало решения целого ряда аппаратурно-методических задач, связанных с реализацией рентгенофлуоресцентных измерений при неподвижном положении образца. Несмотря на огромный потенциал метода СРВ, исследования органических слоев на жидкости с помощью рентгенофлуоресцентных измерений носят единичный характер. К началу настоящей работы существовали лишь две публикации американских и французских ученых по изучению процессов сегрегации ионов металлов из водной субфазы на монослой, нанесенный на поверхность водной субфазы.

Целью настоящей работы являлось развитие метода стоячих рентгеновских волн в области полного внешнего отражения для нанодиагностики органических и биоорганических пленок на твердых подложках и на поверхности жидкости. Работа включала в себя решение следующих задач: Разработка методики рентгенофлуоресцентных измерений в области полного внешнего отражения для изучения элементного состава и структурной организации молекулярных пленок, сформированных на поверхности жидкости;

Проведение исследований органических и биоорганических наносистем на жидкости и на твердых подложках;

Теоретический анализ особенностей рассеяния рентгеновского излучения в планарных наносистемах в условиях полного внешнего отражения;

Создание математических подходов для обработки экспериментальных данных по нанодиагностике молекулярных пленок на жидкости с применением метода стоячих рентгеновских волн.

Научная новизна. В ходе работы впервые:

1. Метод СРВ экспериментально реализован для исследования композиционного состава и структурной организации мономолекулярных слоев, сформированных на поверхности жидкости.

2. Теоретически изучены особенности волновых полей, формирующихся в слаборассеивающих органических пленках в условиях полного внешнего отражения. Получено аналитическое выражение для интенсивности выхода флуоресценции от мономолекулярного слоя в приближении линейного затухания эвансцентной волны.

3. Исследованы процессы самоорганизации, протекающие в белково-липидных пленках на поверхности жидкости, в условиях, когда липидные и белковые молекулы обладают высокой молекулярной подвижностью. Продемонстрированы принципиально новые возможности, которые открывает применение метода СРВ для изучения белково-липидных моделей биологических мембран в условиях максимально приближенных к условиям их функционирования в живой клетке.

4. Экспериментально и теоретически изучено явление резонансного усиления волнового поля в биоорганических наноструктурах, сформированных на поверхности жидкости.

5. Получена новая информация о молекулярных механизмах повреждающего действия токсических веществ (тяжелые металлы и мочевина) на белково-липидные модели биомембран, сформированные на поверхности жидкости и на твердых подложках.

6. Экспериментально обнаружено явление самопроизвольной адсорбции ионов металлов из воды высокой степени очистки к белковым макромолекулам в результате конформационных перестроек, вызванных действием различных ксенобиотиков (токсические вещества и лекарственные препараты).

7. Метод СРВ применен для изучения молекулярных механизмов действия лекарственных соединений. Предложен новый подход для исследования эффективности и безопасности действия лекарственных соединений с использованием белково-липидных наноструктур в качестве изолированных моделей клеточных мембран.

Практическая значимость. Результаты работы представляют собой научно-методическую основу для спектрально-селективной структурной диагностики органических и биоорганических наносистем на жидкости и на твердых подложках. Развито новое направление в применении метода СРВ — изучение композиционного состава и молекулярной организации органических и биоорганических пленок, сформированных на поверхности жидкой субфазы. Научный задел по нанодиагностике белково-липидных пленок на жидкости с применением спектрально-селективных рентгеновских измерений позволит существенно расширить возможности биофизических исследований, посвященных изучению структурно-функциональных свойств клеточных мембран.

Разработана методика измерения угловой зависимости выхода флуоресценции от молекулярных пленок в условиях полного внешнего отражения, позволяющая избежать искажений сигнала, связанных с изменением положения области засветки рентгеновским пучком на поверхности жидкой субфазы.

На примерах исследований белково-липидных пленок на жидкой субфазе показаны новые возможности метода СРВ для изучения молекулярной организации, а также механизмов функционирования биологических мембран в физиологических условиях и при патологических воздействиях на клетку.

Предложен метод контроля эффективности и безопасности действия лекарственных препаратов, позволяющий получать дифференциальные данные о механизмах действия лекарственного соединения в отличие от интегральных результатов исследований на целостном организме.

Получена сравнительная оценка действия лекарственных препаратов (ЭДТА, сукцимер и ксидифон), применяемых для лечения острых и хронических интоксикаций тяжелыми металлами.

Разработаны численные и аналитические подходы для математической обработки и интерпретации результатов эксперимента по изучению структуры органических и биоорганических тонкопленочных наносистем на жидкости с помощью метода СРВ.

Положения, выносимые на защиту:

Разработка методических основ для нанодиагностики органических и биоорганических пленок на жидкости с применением метода СРВ в

10 области полного внешнего отражения. Главным преимуществом разработанной методики является возможность получать спектрально-селективную структурную информацию о динамичных двумерных системах, формирующихся в результате самопроизвольной организации молекул на межфазной границе жидкость/воздух.

Результаты экспериментальных и теоретических исследований рассеяния рентгеновского излучения на органических и биоорганических планарных наносистемах в условиях полного внешнего отражения: особенности интерференционных волновых полей, формирующихся в слаборассеивающих пленках в условиях резонансного усиления; обнаруженные аномалии в экспериментальных угловых зависимостях выхода флуоресценции от тонких пленок; закономерности выхода вторичных излучений от мономолекулярных слоев на жидкости.

Результаты т-эки исследований процессов самоорганизации в биоорганических наносистемах на жидкости в условиях, когда белковые и липидные молекулы обладают высокой молекулярной подвижностью. В том числе: изучение самопроизвольного расслоения термодинамически неустойчивых белково-липидных наносистем; выявление молекулярных механизмов нарушения белково-липидных взаимодействий в биоорганических наносистемах под действием токсических веществ (тяжелые металлы и мочевина).

Развитие метода СРВ для исследований молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов с использованием белково-липидных наносистем в качестве изолированных моделей клеточных мембран. Полученные методом СРВ данные об эффективности комплексообразующих лекарственных препаратов, применяемых для ускорения выведения тяжелых металлов из организма.

Обнаруженное явление адсорбции ионов металлов на органические и биоорганические молекулы из водной субфазы, содержащей примеси в следовых количествах (в концентрации меньше 10" М). Полученные методом СРВ данные о повреждении молекулярной организации пленок Ленгмюра-Блоджетт в результате адсорбции ионов металлов; результаты исследований влияния различных ксенобиотиков (тяжелые металлы, лекарственные соединения, мочевина) на увеличение способности белковых молекул адсорбировать ионы металлов.

Личный вклад автора состоит в постановке и организации всех исследований, непосредственном участии в проведении рентгеновских измерений, обработке данных, интерпретации и изложении результатов.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих конференциях: Национальные конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (РСНЭ), Москва 1997, 1999, 2003, 2005, 2007, 2009; Конференция «Рентгеновская оптика-99», Н.Новгород 1999; XVIII международный кристаллографический конгресс, Глазго 1999; Международная конференция «Самоорганизация на границах раздела и в тонких пленках», Гренобль 2000; XII Международная конференция «Малоугловое рассеяние» Венеция 2002; XVII Международный конгресс «Рентгеновская оптика и микроанализ» (1СХОМ), Шамони-Монблан 2003; XXIV Европейская кристаллографическая конференция (ЕСМ-24), Маракеш 2007; Международные конференции «Рентгенофлуоресцентный анализ в области полного внешнего отражения» (ТХКБ), Вена 2000, Будапешт 2005, Тренто 2007, Гетеборг 2009; Четвертая международная конференция «Нанобио- и другие новые и перспективные технологии», Пущино 2007; Второй Международный форум по нанотехнологиям, Москва 2009; III Научно-практическая конференция «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ», Москва 2010; XIV Национальная конференция по росту кристаллов (НКРК), Москва 2010.

Диссертация состоит из шести глав, введения и заключения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Впервые предложена и реализована методика спектрально-селективных рентгеновских исследований планарных органических и биоорганических наносистем на жидкости, что позволило существенно расширить исследовательские возможности метода стоячих рентгеновских волн (XRSW). Получена принципиально новая информация о структурной организации белково-липидных наносистем на жидкости в условиях, когда белковые молекулы находятся в подвижном состоянии и сохраняют свою нативность, при этом фактически заложены основы метода стоячих рентгеновских волн для изучения различных мембранных процессов (ионный транспорт, взаимодействие с мембраноактивными веществами, обменные процессы и т.д.) в условиях максимально приближенных к условиям функционирования биомембраны в живых клетках.

1.1 Разработан метод регистрации угловой зависимости выхода флуоресценции в области полного внешнего отражения с учетом специфики рентгеновских измерений на жидкости, связанной с необходимостью сохранять поверхность образца (поверхность жидкости в легмюровской ванне) в горизонтальном положении в процессе измерений. Решена задача непрерывного мониторинга положения поверхности жидкости, что позволило проводить коррекцию неконтролируемого уменьшения уровня жидкости из-за испарения.

1.2 Предложенная методика экспериментально реализована с использованием синхротронного излучения для исследования молекулярной организации органических пленок металозамещенных фталоцианинов и полиорганосилаксанов. Впервые получены угловые зависимости выхода флуоресцентного излучения от мономолекулярных слоев, сформированных на поверхности жидкости. Определен тип упаковки органических молекул (ориентация макроциклов молекул) в пленках.

1.3 Метод стоячих рентгеновских волн применен для т-эки исследований процессов самоорганизации в сложных биоорганических наносистемах в условиях, когда белковые и липидные молекулы сохраняют свою подвижность и могут свободно

210 распределяться у границы раздела воздух/жидкость: изучены механизмы самопроизвольного расслоения термодинамически неустойчивых биоорганических наностистем; получена информация о влиянии токсических веществ на формирование биоорганических наносистем на жидкости.

1.4 Предложены численные и аналитические подходы для анализа рассеяния рентгеновского излучения в планарных наносистемах в условиях полного внешнего отражения. На основе рекуррентных уравнений разработаны алгоритмы для математической обработки экспериментальных данных по изучению органических и биоорганических пленок с помощью метода стоячих рентгеновских волн.

1.5 Проведен анализ формирования стоячей рентгеновской волны в слаборассеивающих молекулярных пленках в условиях полного внешнего отражения. Впервые экспериментально зарегистрировано резонансное усиление стоячей рентгеновской волны в биоорганических планарных наносистемах на жидкости.

2. Продемонстрированы возможности метода стоячих рентгеновских волн для нанодиагностики белково-липидных моделей клеточных мембран на твердых подложках. Предложен новый подход для изучения эффективности и безопасности действия лекарственных препаратов, позволяющий получать информацию о молекулярных механизмах взаимодействия лекарственного соединения с биологическими макромолекулами.

2.1 Методом рентгенофлуоресцентного анализа в полном внешнем отражении (ТХШ7) получена сравнительная оценка эффективности комплексообразующих лекарственных препаратов, применяемых для ускорения выведения тяжелых металлов из организма. Изучено действие комплексообразующих лекарственных препаратов (ксидифон, медифон, ЭДТА и сукцимер) при повреждении белково-липидных моделей клеточных мембран ионами свинца.

2.2 Установлено, что применение всех исследованных препаратов не обеспечило полного удаления ионов свинца из белково-липидных пленок. Методом стоячих рентгеновских волн определено местоположение остаточных ионов свинца внутри пленок. Показано, что ионы свинца, связанные в активных центрах белковых молекул, оказались недоступны для действия лекарственных препаратов.

2.3 Проведены исследования влияния высоких доз комплексообразующих лекарственных соединений на элементный состав белковых молекул. Впервые обнаружено явление значительного увеличения адсорбционной способности белковых молекул в результате обработки растворами комплексообразующих соединений.

3. Метод стоячих рентгеновских волн применен для характеризации многослойных пленок Ленгмюра-Блоджетт на твердых подложках.

3.1 Впервые зарегистрированы аномалии в экспериментальных угловых зависимостях выхода флуоресценции от тонких пленок в угловой области полного внешнего отражения. Установлено, что в том случае, когда атомы-источники флуоресцентного излучения не образуют сплошного слоя в пленке, кривая выхода флуоресценции повторяет по форме кривую отражения рентгеновских лучей.

3.2 Обнаружены существенные повреждения структуры фосфолипидной пленки, сформированной на водной субфазе, содержащей ионы свинца в концентрации 1x10"4 М. Установлено, что ионы свинца в бислое фосфолипида образуют отдельные частицы.

3.3 Проведены исследования влияния следовых количеств ионов металлов (концентрация ниже чем

10" М), присутствующих в водной субфазе, на молекулярную организацию ленгмюровского слоя жидкокристаллического соединения. Показано, что, несмотря на низкий уровень концентрации ионов металлов в водной субфазе, самопроизвольная адсорбция этих ионов привела к значительным нарушениям структурной организации органических пленок.

По материалам диссертации опубликовано 29 статей в российских и зарубежных журналах, а также 30 тезисов докладов, получено 2 патента на изобретение.

Автор выражает глубокую благодарность своему научному консультанту доктору физико-математических наук, члену-корреспонденту РАН Ковальчуку Михаилу Валентиновичу за постановку научной проблематики, постоянный интерес к работе, ценные советы и обсуждения.

Автор искренне признателен доктору физико-математических наук Желудевой Светлане Ивановне за неоценимую помощь на начальных этапах работы, а также за доброе внимание и поддержку.

Автор хочет подчеркнуть, что разработка рассматриваемого направления происходила при непосредственном участии его коллег: кандидата химмческих наук Степиной Нины Дмитриевны и кандидата физико-математических наук Коновалова Олега Вениаминовича.

1. Zheludeva S.I., Kovalchuk M.V., Novikova N.N. Total reflection X-Ray fluorescence study of organic nanostructures. // Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy. 2001. V.56. P.2019-2026.

2. Желудева С.И., Новикова Н.Н., Коновалов О.В., Ковальчук М.В., Степина Н.Д., Юрьева Э.А., Мягков И.В., Годовский Ю.К., Макарова Н.Н., Рубцов

3. A.M., Лопина О.Д., Ерко А.И., Толстихина А.Л., Гайнутдинов Р.В., Лидер

4. B.В., Терещенко Е.Ю., Янусова Л.Г. Возможности рентгеновской флуоресценции в области полного внешнего отражения для исследования ленгмюровских монослоев на поверхности жидкости и твердой подложке. // Кристаллография. 2003. Т.48. N6. С. 30-42.

5. Zheludeva S.I., Novikova N.N., Konovalov O.V., Kovalchuk M.V., Stepina N.D., Tereschenko E.Yu. Langmuir monolayers on water surface investigated by X-ray total reflection fluorescence. // Materials Science and Engineering. 2003. V.23. P.567-570.

6. Гайнутдинов P.B., Толстихина A.JI., Степина Н.Д., Новикова Н.Н., Юрьева Э.А., Хрипунов А.К. АСМ-исследование адсорбции белковых молекул на перенесенном ленгмюровском монослое. // Кристаллография. 2010. Т. 55. №3. С. 520-525.

7. Ерохин В.В., Фейгин JI.A. К истории исследования ленгмюровских пленок. //Биолг. Мембр. 1999. 7. 10. С. 1065-1067.

8. Ямпольская Г.П., Левачев С.М., Харлов А.Е., Фадеев А.С., Измайлова В.Н. Мономолекулярные слои белков и перспективы конструирования наноматериалов на их основе. // Вестн. Моск. Ун-та. Серия 2. Химия. 2001. 42. 5. С. 355-362.

9. Тычинский В.П., Голубев C.C., Вышенская T.B., Кретушев А.В. Зависимость оптической разницы хода в липидных мультислоях от электрического поля. // Биол. Мембр. 2005. 22. 2. С. 131-136.

10. Aveyard R., Clint J.H., Nees D., Paunov V.N. Compression and structure of monolayers of charged latex particles at air/water and octane/water interfaces. // Langmuir. 2000. 16. P. 1969-1979.

11. Nalma H.S. Handbook of Thin Film Materials. Langmuir-Blodgett Films of Biological Molecules. // 2002. Acad. Press. P. 523-557.

12. Овсянникова M.B., Масловский C.JI., Малютина Н.П. Структурное состояние мембран эритроцитов в патогенезе опийной наркомании. // Биол. Мембр. 2005. 22. 4. С. 322-326.

13. Измайлов Д.Ю., Владимиров Ю.А. Математическое моделирование кинетического цепного окисления липидов в мембранных системах. // Биол. Мембр. 2003. 20. 4. С. 349-359.

14. Giess F., Friedrich M.G., Heberle J., Naumann R., Knoll W. The protein tethered lipid bilayer a novel mimic of the biological membrane. // Biophys. J. 2004. 87. P. 3213-3220.

15. Дунина-Барковская А.Я. Щелевые контакты — двуслойные белок-липидные рафты. //Биол. Мембр. 2005. 22. 1. С. 27-33.

16. Qingchai Xu, Lam K.S. Protein and Chemical Microarrays-Powerful Tools for Proteomics. // J. Biomed. Biotechnol. 2003. 2003. 5. P. 257-266.

17. Пашковская A.K., Борисенко B.H., Вули Г.А. и др. Взаимодействие синтетических амфифильных полианионов с положительно заряженным пептидом грамицидином на плоской бислойной липидной мембране. // Биол. Мембр. 2004. 21. 1. С. 65-71.

18. Gang-Yu Liu, Nabil A. Amro. Positioning protein molecules on surfaces: A nanoengineering approach to supramolecular chemistry. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2002. 99. 8. P. 5165-5170.

19. Lee H.J., Yan Y., Marriott G. and Corn R.M. Quantitative functional analysis of protein complexes on surfaces. // J. Physiol. 2004. 563. 1. P. 61-71.

20. Sanchez-Gonzalez J., Ruiz-Garcia J., Galvez-Ruiz M.J.Langmuir-Blodgett films of biopolymers: a method to obtain protein multilayers. // J Colloid Interface Sci. 2003. 267. 2. P. 286-293.

21. Бурлакова Е.Б. Липиды. Структура, биосинтез, превращения и функции. //М.: Наука. 1977. С. 16-30.

22. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. // М.: Просвещение. 1987. 368 с.

23. Дунина-Барковская А .Я. Фагоцитоз — три в одном: эндоцитоз, экзоцитоз, адгезия. // Биол. Мембр. 2004. 21. 3. С. 243-270.

24. Некрасова О.Е., Минин Ан.А., Кулик А.В., Минин А.А. Регуляция фибронектином формы и внутриклеточного распределения митохондрий. // Биол. Мембр. 2005. 22. 2. С. 105-112.

25. Erochin V. Langmuir-Blodgett films of biological molecules. // Handbook of Thin Film Materials. Nalwa H.S. (Eg). 2002. Acad. Press. 1. P. 523-557.

26. Усольцева H.B. Химическая характеристика, биологическое и медицинское значение лиотропных жидких кристаллов. // Ж. Всесоюзн. Хим. Общ. Им. Менделеева. 1983. 28. 2. С. 36-45.

27. Финеан Д., Колмен Г., Мичелл Р. Мембраны и их функции в клетке. // М.: Мир. 1977. 205 с.

28. Варфоломеев С.Д. Химическая энзимология. М.: "Академия". 2005. 480 с.

29. Trudell J.R. A unitary theory of anesthesia based on lateral phase separations in nerve membranes. // Anesthesiology. 1977. 46. P. 5-10.

30. Мухин С.И., Баукина C.B. Межслойное проскальзывание и релаксация латеральных напряжений в двуслойной липидной мембране в условиях эксперимента. //Биол. Мембр. 2004. 21. 5. С. 506-518.

31. Nguyen Q.T., Glinel К., Pontie М., Ping Zh. Immobilization of bio-macromolecules onto membranes via an adsorbed nanolayer. An insight into the mechanism. // J. Membrane Sci. 2003. 213. 1. P. 85-95.

32. Батищев O.B., Инденбом A.B. Формирование бислойных липидных мембран на отверстиях в гидрофобизированных стеклах. // Биол. Мембр. 2004.21. 5. С. 415-420.

33. Gershfeld N.L. The liquid condensed/liquid expanded transition in lipid films: a critical analysis of the film balance experiment. // J. Colloid. Interface Sci. 1982. 85. l.P. 28-40.

34. Forzani E.S., Teijelo M.L., Nart F., Calvo E.J., Solis V.M. Effect of the polycation nature on the structure of layer-by-layer electrostatically self-assembled multilayers of polyphenol oxidase. // Biomacromolecules. 2003. 4. P. 869-879.

35. Mitaku S., Ikegami A., Sakanishi A. Ultrasonic studies of lipid bilayer. Phase transition in synthetic phosphatidylcholine liposomes. // Biophys. Chem. 1978. 8. 4. P. 295-304.

36. Langmuir I, Schaefer V. Activities of urease and pepsin monolayers/ // J.Amer.Chem.Soc. 1938. V.60. P.1351-1360.

37. Зайцев С.Ю., Дзехцер Г., Зубов В.П. // Биоорганическая химия. 1988. Т.84. С.850.

38. Okahata Y., Tsuruta Т., Ijiro. К., Ariga К. Langmuir-Blodgett Films of an Enzyme-Lipid Complex for Sensor Membranes // Langmuir. 1988. 4. P. 13731375.

39. Fare T.L., Palmer C.A., Silvestre C.G., Cribbs D.H., Turner D.C., Brandow S.L., Gabert B.P. Langmuir-Blodgett studies and atomic forse microscope images of nicotinic acetylcholine receptor films //Langmuir. 1992. 8. P. 3116-3121.

40. Fujiwara I., Ohnishi M., Seto J. Atomic force microscopy study of protein-incorporating Langmuir-Blodgett films // Langmuir. 1992. 8. P. 2219-2222.

41. Gidalevitz D., Huang Z., Rice S.A. Urease and hexadecyleamine-urease films at the air-water interface: An X-Ray reflection and grasing incidence X-ray diffraction study // Biophysical Journal. 1999. 76. 5. P. 2797-2802.

42. Gidalevitz D., Ishitsuka Y., Muresan A.S., Konovalov O., Waring A.J., Lehrer R.I., Lee K.Y. Interaction of antimicrobial peptide protein with biomembranes //PNAS. 2003. 100. 11. P. 6302-6307.

43. Heckl W.M., Tompson M., Moehwald H. Fluorescence and electron microscopic study of lectin-polyaccharide and immunochemical aggregation at phospholipids Langmuir-Blodgett monolayers // Langmuir. 1989. 5. P. 390-394.

44. Gidalevitz D., Ohnishi M., Rice S.A. Protein folding at the air-water interface studied with X-ray reflectivity // PNAS. 1999. 96. 6. P. 2608-2611.

45. Xu Z., Marchant R.E. Adsorption of plasma proteins on polyethylene oxide-modified lipid bilayers studied by total internal reflection fluorescence // Biomaterials. 2000. 21. 10. P. 1075-1083.

46. Xu G., Wang W., Grovesdagger J.T., Hecht H. Self-assembled monolayers from a designed conbinatorial library of de novo beta-sheet proteins // PNAS. 2001.98. 7. P. 3652-3657.

47. Ronson F., Desbat D., Chauvet J.-P., Roux B. Behavior of a GPI-anchored protein in phospholipid monolayers at the air-water interface // Biochim Biophys Acta. 2002. 1560. P. 1-13.

48. Zhang A., Jaffrezic-Renault N., Wan J., Hou Y., Chovelon J.-M. Optimization of the mixed urease/amphiphile Langmuir-Blodgett film and its application for biosensor development // Materials Science and Engineering C. 2002. 21. P. 91-96.

49. Soldatkin A.P., Volotovsky V., El'skaya A.V., Jaffrezic-Renault N., Martelet C. Improvement of urease based biosensors characteristics using additional layers of charged polymers // Analyrica Chimica Acta. 2000. 403. P. 2529.

50. Zhang A., Hou Y., Jaffrezic-Renault N., Wan J., Soldatkin A., Chovelon J.-M. Mixed urease/amfifile LB films and their application for biosensor development//Bioelectrochemistry. 2002. 56. P. 157-158.

51. Wan K., Chovelon J.-M., Jaffrezic-Renault N. Enzyme-octadecylamine Langmuir-Blodgett membranes for ENFET biosensors // Talanta. 2000. 52. P. 663670.

52. Ladam G., Schaaf P., Cuisinier F., Decher G., Yoegel J-C. Protein adsorbtion onto auto-assembled polyelectrolyte films // Langmuir. 2001. 17. 3. P. 878-882.

53. Moskovitz Y., Srebnik S. Mean-field model of immobilized enzymes embedded in a grafted polymer layer // Biophysical Journal. 2005. 89. P. 22-31.

54. Sun S., Ho-Si P.-H., Harrison D.J. Preparation of active Langmuir-Blodgett films of glucose oxidase // Langmuir. 1991. 7. P. 727-737.

55. Shnek D.R., Pack D.W., Sasaki D.Y., Arnold F.H. Specific protein attachment membranes via coordination to lipid-bound copper (II) // Langmuir. 1994. 10. P. 2382-2388.

56. Onda M., Ariga K., Kunitake T. Activity and stability of glucose oxidase in molecular films assembled alternately with polyions // J. Biosci Bioeng. 1999. 87. l.P. 69-75.

57. Onda M., Lvov Y., Ariga K., Kunitake T. Sequential actions of glucose oxidase and peroxidase in molecular films assembled by layer-by-layer alternate adsorption//Biotechnology and Bioengineering. 1996. 51. 2. P. 163-167.

58. Owaku K., Goto M. Protein A Langmuir-Blodgett film for antibody immobilization and its use in optical immunosensing // Anal. Chem. 1995. 67. P. 1613-1616.

59. Petrigliano A., Tronin A., Nicolini C. Deposition and enzymatic activity of Langmuir-Blodgett films of alkaline phosphotase // Thin Solid Films. 1996. 284285. P. 752-756.

60. Krol S., Janshoff A., Ross M., Galla H-J. Structure and function of surfactant protein В and С in lipid monolayers: a scanning force microscopy study // Phys. Chem. Chem. Phys. 2000. 2. P. 4586-4593.

61. Von Nahmen A., Post A., Galla H.-J., Sieber M. The phase behavior of lipid monolayers containing pulmonary surfactant protein С studied by fluorescence light microscopy // European Biophysical Journal. 1997. 26. 5. P. 359-369.

62. Lvov Y., Katusiko A., Ichinose I., Kunitake T. Assembly of multicomponent protein films by means of electrostatic layer-by-layer adsorption // Journal of American Chemical Society. 1995. 117. P. 6117-6123.

63. Pechkova E., Nicolini C. From art to science in protein crystallization by means of thin-film nanotechnology // Nanotechnology. 2002. 13. P. 460-464.

64. Pechkova E., Nicolini C. Protein nucleation and crystallization by homologous protein thin film template // Journal of Cellular Biochemistry. 2002. 85. 2. P. 243-251.

65. Тривен M. Иммобилизованные ферменты. // M.: Мир. 1983. 256 с.

66. Simonian A. L., Flounders A. W., Wild J. R. FET-Based Biosensors for The Direct Detection of Organophosphate Neurotoxins. // Electroanalysis. 2004. 16. 22. P. 1896-1906.

67. Arya A., Krull U.J., Thompson M., Wong, H.E. Langmuir-Blodgett deposition of lipid films on hydrogel as a basis for biosensor development.// Anal. Chim. Acta. 1985. 173. P. 331-336.

68. Okahata Y., Tsuruta Т., Ijiro. K., Ariga K. Langmuir-Blodgett Films of an Enzyme-Lipid Complex for Sensor Membranes // Langmuir. 1988. 4. P. 13731375.

69. Sriyudthsak M., Yamagishi H., Moriizumi T. Enzyme-immobilized Langmuir-Blodgett film for a biosensor. // Thin Solid Films. 1988. 160. P. 463469.

70. Зайцев С.Ю., Калабина H.A., Зубов В.П. Биосенсор на основе ленгмюровских пленок глюкозоксидазы. // Журн. аналитич. химии. 1990. 45.7. С. 1452-1455.

71. Simons К., Vaz W.L. Model systems, lipid rafts, and cell membranes. // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2004. 33. P. 269-295.

72. Singhal R., Gambhir A., Pandey M.K., Annapoorni S., Malhotra B.D. Immobilization of urease on poly(N-vinyl carbazole)/stearic acid Langmuir-Blodgett films for application to urea biosensor. // Biosens Bioelectron. 2002. 17.8. P. 697-703.

73. Rodriguez B.B., Bolbot J.A., Tothill I.E. Urease-glutamic dehydrogenase biosensor for screening heavy metals in water and soil samples. // Analytical and Bioanalytical Chem. 2004. 380. 2. P. 284-292.

74. Курочкин И.Н., Попов Б.Н., Чернов С.Ф. Физико-химические и физические принципы функционирования биосенсоров. //Биол. Мембр. 1990. 7. 10. С. 1068-1070.

75. Erochin V. Langmuir-Blodgett films of biological molecules. // Handbook of Thin Film Materials. Nalwa H.S. (Eg). 2002. Acad. Press. 1. P. 523-557.

76. Decher G., Hong J.-D., Schmitt J. Buildup of ultrathin multilayer films by a self-assembly process: III. Consecutively alternating adsorption of anionic and cationic polyelectrolytes on charged surfaces.// Thin Solid Films. 1992. 210/211. P. 831-835.

77. Будашов И.А., Курочкин И.Н., Цибезов B.B., Кальнов С.JI. и др. Структурные и функциональные свойства ленгмюровских пленок антител на основе амфифильных полиэлектролитов. // Биол. Мембр. 1999. 16. 3. С. 325334.

78. Турко И.В., Пикулева И.А., Ерохин В.В. Селективная гидрофобизация фрагментов Fab IgG и формирование из них ленгмюровских пленок. // Биол. Мембр. 1990. 7. 10. С. 1081-1085.

79. Giess F., Friedrich M.G., Heberle J., Naumann R., Knoll W. The protein tethered lipid bilayer a novel mimic of the biological membrane. // Biophys. J. 2004. 87. P. 3213-3220.

80. Haddour N, Cosnier S, Gondran C. Electrogeneration of a poly(pyrrole)-NTA chelator film for a reversible oriented immobilization of histidine-tagged proteins. //J. Am. Chem. Soc. 2005. 127. 16. P. 5752-5753.

81. Калабина H.A., Зайцев С.Ю., Кутузов M.A., Золотарев А.С. и др. Сравнительное исследование монослоев белков фотосинтетических реакционных центров. //Биол. Мембр. 1990. 7. 10. С. 1086-1088.

82. Rahul Singhal, Asha Chaubey, Toemsak Srikhirin, Sukanya Aphiwantrakul, Shyam S. Pandey, Bansi D. Malhotra. Immobilization of glucose oxidase onto Langmuir-Blodgett films of poly-3-hexylthiophene. // Current Applied Physics. 2003.3. P. 275-279.

83. Патент Yano EJ., Yagishita A., Takei F., Sugama A., Kozima N. Л5 63231257 от 1988-09-27.

84. Antolini F., Paddeu S., Nicolini C. Heat stable Langmuir-Blodgett film of Glutatione-S-transfears // Langmuir. 1996. 11. P. 2719-2725.

85. Boussaad S., Dziri L., Arechabaleta R., Tao N.J., Leblanc R.M. Electron-transfer properties of cytochrome C Langmuir-Blodgett films and interactions of cytochrome c with lipids // Langmuir. 1998. 14. P. 6215-6219.

86. Brar L.K., Rajev P., Raychaudhuri A.K., Chatterji D. Langmuir monolayer as a tool toward visualization of a specific DNA-protein complex // Langmuir. 2005.8. 21. P. 10671-10675.

87. Daly S.M., Heffernan L.A. Barger W.R., Shenoy D.K. Photopolymerisation of mixed monolayers and black lipid membranes cantaining gramicidin A and diacetylenic phospholipids // Langmuir. 2006. 31. 22. 3. P. 1215-1222.

88. Matsuda T., Sugawara T. Photochemical protein fixation on polymer surfaces via derivatized phenyl azido group // Langmuir. 1995. 11. P. 2272-2276.

89. Als-Nielsen J., Pershan P.S. Synchron X-ray diffraction study of liquid surfaces. //Nucl. Instr. Methods. 1983. 208. P. 545-548.

90. Grubel G., Als-Nielsen J., Freund A. The multicrystal monochromators of the TROIKA beamline at ESRF. // J. Phys. IV 1994. 4. P. 27.

91. Daillant J. Short-lelgthscale investigations of liquid surfaces and interfaces// SRN. 1999. 12. P. 17-24.

92. Als-Nielsen J., Jacquemain D., Kjaer K. et.al. Principals and applications of grazing incidence x-ray and neutron scattering from ordered monolayers at the air-water interface. //Phys. Rep. 1994. 246. P. 251-313.

93. Regan MJ., Pershan P.S., Magnussen O.M. et.al. X-ray reflectivity studies of liquid metal and alloy surfaces. // Phys. Rev. 1997. B55. P. 15874-15884.

94. Оско В., Wu X., Sirota E. et.al. Surface freezing in chain moleculas. // Phys. Rev. E 1997. 55. P. 3164.

95. Kjaer К., Als-Nielsen J. et.al. Ordering in lipid monolayers studied by synchrotron X-ray diffraction and fluorescence microscopy. // Phys. Rev. Lett. 1987.58.21. P. 2224-2227.

96. Rapaport H., Kuzmenko I., Kjaer K., Als-Nielsen J., Weissbuch I., Lahav M., Leiserowitz L. Crystalline architectures at the air-liquid interface: from nucleationto engineering. // Synchrotron Radiation News. 1999. 12. 2. P. 25-33.

97. KonovalovO., MyagkovL, StruthB., Lohner K. Lipid discrimination in phospholipids monolayers by antimicrobial frog skin peptide PGLa. A synchrotron X-ray granzing incidence and reflectivity study. // Europ. Biophys. Jour. 2002. 31. P. 428-437.

98. Als-Nielsen J. Early days of SR studies of liquid surfaces-phases of liquid crystalline materials// SRN. 1999. 12. P. 5-9.

99. Gang O., Ocko B., Wu X., Sirota E., Deutsch M. Surface freezing in chain moléculas. // Synchrotron Radiation News. 1999. 12. 2. P. 34-39.

100. Daillant J., Pignat J., Cantin S., Perrot F., Mora S., Konovalov O. Elascity of two-dimentional crystalline monolayers of fatty acid salts at an air-water surface. // Soft Matter. 2009. 5. P. 203-207.

101. Lifshitz Y., Golan Y., Konovalov O., Berman A. Structural transitions in polyacetylene Langmuir films. // Langmuir. 2009. 25. 8. P. 4469-4477.

102. Hermelink A., Brezesinski G. Do unsaturated phosphadidylchlorine model membranes? // J. of Lipid research. 2008. 49. P. 1918.

103. Solomonov I., Daillant J., Fragneto G., Kjaer K., Micha J., Rieutord F., Leiserowitz L. Hydrated cholesterol: phospholipid domains probed by synchrotron radiation. // Eur. Phys. J. 2009. 30. P. 215-221.

104. Richardson R., Roser S. X-ray reflectivity from insoluble monolayers spread on aqueous subphases. // Liquid crystals. 1987. 2. 6. P. 797-814.

105. Braslau A., Pershan P., Swislow G. et al. Capillary waves on the surface of simple liquids measured by X-ray reflectivity. // Physical Review A. 1988. 38. 5. P.2457-2461.

106. Sanyal M.K., Sinha S.K., Huang K.G. et.al. X-ray scattering study of capillary-wave fluctuations at a /liquid surface. / Phys. Rev. Lett. 1991. 66. P. 628631.

107. Bosio L., Benattar J., Rieutord F. X-ray reflectivity of a Langmuir monolayer on water. // Rev. Phys. Appl. 1987. 22. P. 775-778.

108. Yamaoka H., Matsuoka H., Kago K., Endo H., Eckelt J., Yoshitome R. Monolayer X-ray reflectometry at the air-water interface. // Chemical Physics Lett. 1998. 295. 3. P. 245-248.

109. Vaknin D., Kjaer K., Ringsdorf H. et.al. X-ray and neutron reflectivity studies of a protein monolayer adsorbed to a fiinctionalized aqueous surface // Langmuir 1993. 9. P. 1171-1174.

110. Braslau A., Deutsch M., Pershan P.S., Weiss A.H., Als-Nielsen J., Bohr J. Surface roughness of water measured by x-ray reflectivity // Phys. Rev. Lett. 1985. 54. P. 114-121.

111. Schalke M., Kruger P., Weygand M. et.al. Submolecular organization of DMPA in surface monolayers: beyond the two-layer model. // BBA. 2000. 1464. P. 113-126.

112. Cavalcanti L., Konovalov 0.,Torriani I. Lipid Model membranes for drug interaction study. // Eur. Biophys. J. 2006. 35. P. 431-438.

113. Saint Martin E., Konovalov O., Daillant J. Studies of phospholipid monolayer at liquid/liquid interface in presence of an antimicrobical peptide. // Thin Solid Films. 2007. 515. P. 5687-5690.

114. Cristofolini L., Berzina T., Erokhin V., Tenti M., Fontana M., Erokhina S., Konovalov O. The structure of DNA-containing complexes suggests the idea for a new adaptive sensor. // Colloids and Surfaces A. 2008. 321. P. 158-162.

115. Kubowicz S., Hartman M., Daillant J. et.al. Gold nanoparticles at the liquidliquid interface: X-ray study and Monte-Carlo simulation. // Langmuir 2009. 25. P. 952-958.

116. Batterman B. Effect of dynamical diffraction in X-ray fluorescence scattering. // Physical Rev. 1964. 133. 3A. P.759-764.

117. Golovchenko J.A., Batterman B.W., Brown W.I. Observation of internal x-ray wave fields during Bragg diffraction with an application to impurity lattice location. // Phys.Rev. B. 1974. 10. P. 4339-4343.

118. Annaka S., Kikuta S., Köhra К. Intensity Anomaly of X-Ray Compton and Thermal Scatterings Accompanying the Bragg Reflections from Perfect Si and Ge Crystals. //Jappl. Soc. Jpn. 1966. 21. P. 1559.

119. Щемелев B.H., Круглов M.B., Пронин В.П. Угловая зависимость внешнего рентгеновского фотоэффекта в совершенных монокристаллах германия и кремния. // ФТТ. 1970. 12. 8. С. 2495.

120. Thiess Т., Lee Т., Bottin F. et al. Site specific XPS: Structural and electronic properties investigated by X-ray standing waves. // Synch. Rad. in Natur. Sei. 2010. V. 9. P. 54-56.

121. Barbee Т., Warburton W. X-ray evanescent-and standing-wave fluorescence studies using a layered synthetic microstructure. // Materials Letters. 1984. 3. 1.2. P.17.

122. Kortrigth J., Fisher-Coldrie A. Standing wave enchanced scattering in multilayer structures. //J. App. Phys. 1987. 61. 3. P. 1130.

123. Желудева С.И., Ковальчук M.B., Новикова H.H., Сосфенов A.H., Харитонов И.Ю., Платонов Ю.Я., Ахсахалян А.Д., Салащенко H.H. Стоячие рентгеновские волны в многослойных синтетических структурах. // Письма в ЖТФ. 1989. Т. 15. Вып.20, С.49-54.

124. De Boer D. Glancing-incidence x-ray fluorescence of layered materials. // Phys. Rev. B. 1991. 44. 2. P. 498.

125. Matsushita Т., Iida A., Ishikawa Т., Nakagiri Т., Sakai K., X-ray standing waves excited in multilayered structures. // Nucl. Instr. Methods. 1986. 246. P. 751-754.

126. Ghose S., Dev B. X-ray standing wave and reflectometric characterization of multilayer structures. //Phys. Rev. B. 2001. 63. P. 245409-245420.

127. Bera S., Bhattacharjee K., Kuri G., Dev B. Probing atomic migration in nanostructured multilayers: applications of x-ray standing wave fields. // Phys. Rev. Let. 2007. 98. P. 196103-196109.

128. Bedzyk M. New trands in x-ray standing waves. // Nuc. Instr. Meth. In Phys. Res. A. 1988. 266. P. 679-683.

129. Zheludeva S.I., Kovalchuk M.V., Novikova N.N., Sosphenov A.N. X-Ray standing waves in LSM for characterization of ultra-thin films. // J.Phys.D. Appl.Phys. 1993. V.26. P.A206-A209

130. Gupta A., Kumar D., Meneghini C. Interface structure in magnetic multilayers using x-ray standing waves. // Phys. Rev. B. 2007. 75. P. 064424064429.

131. Gupta A., Kumar D., Phatak V. Asymmetric diffusion at the interfaces in Fe/Si multilayers. // Phys. Rev. B. 2010. 81. P. 155402-155406.

132. Lin J., Kellar J., Kim J., Kim J.-H., Yoder N.L., BevanK.H., Nguyen S.T., Hersam M.C., Bedzyk M.J. Atomic-scale X-ray structural analysis of self-assemled monolayers on Silicon // Europ. Phys. Journal. 2009. 167. P. 33-39.

133. McNellis E., Mercurio G, Hagen S. et. all. Bulky spacer groups a valid strategy to control the coupling of functional moleculas to surfaces? // Chem. Phys. Let. 2010. 499. P. 247-249.

134. Iida A., Matsushita T., Ishikawa T. Observation of x-ray wave field during Bragg reflection in multilayer of lead stearate. // Jap. Journ. Of Appl. Phys. 1985. 24. 9. P. 675-678.

135. Nakagiri T., Sakai K., Iida A., Ishikawa T., Matsushita T. X-ray standing wave method applied to the structural study of Langmuir-Blodgett films. // Thin Solid Films. 1985. 133. P. 219-225.

136. Wang J., Bedzyk M., Penner Т., Caffrey M. Structural studies of membranes and surface layers up to 1000 A thick using x-ray standing waves. // Nature. 1991. 354. P. 377.

137. Bedzyk M., Bilderback D., Bommarito G., Caffrey M., Schildkraut J. X-ray standing waves: a molecular yardstick for biological membranes. // Science. 1988. 241. P. 1788.

138. Bedzyk M., Bommarito G., Schildkraut J. X-ray standing waves at a reflecting mirror surface. // Phys. Rev. Let. 1989. 62. 12. P. 1376.

139. Libera J., Gurney R., Schwartz С et al. Comparative x-ray standing wave analysis of metal-phosphonate multilayer films of dodecane and porphyrin molecular square. // J. Phys. Chem. B. 2005. 109 P. 1441-1450.

140. Lin W., Lee Т., Lyman P., Lee J. X-ray Standing Wave Studies of Self-Assembled Chromophoric Superlattices with Large Second-Order Optical Nonlinearity. //J.Am.Chem.Soc. 1997. 119. P. 2205-2211.

141. Wang J., Wallace C., Clark-Lewis I., Caffrey M. Structure characterization of membrane bound and surface adsrobed protein. // J.Mol.Biol. 1994. 237. P 1-4.

142. Bloch J., Sansone M., Rondelez F. Concentration profile of a dissolved polymer near the air-liquid interface: X-ray fluorescence study.// Phys. Rev. Letters. 1985. 54. P. 1039-1042.

143. Daillant J., Bosio L., Benattar J. J., Blot C. Interaction of cations with a fatty-acid monolayer a grazing incidence X-ray fluorence and reflectivity study. // Langmuir. 1991. 7. 4 P. 611-614.

144. Виноградов A.B., Брытов И. А., Грудский А .Я., Коган М.Т., Кожевников И.В., Слемзин В.А. Зеркальная рентгеновская оптика. // Ленинград: Машиностроение, 1989. 463 с.

145. Мишетт А. Оптика мягкого рентгеновского излучения. // Москва, Мир. 1989. 351 с.

146. Takagi S. Dynamical theory of diffraction applicable to crystals with any kind of small distortion. // Acta Cryst. 1962. 15. P. 1311-1312.

147. Parratt L.G. Surface study of solids by total reflection of X-rays. // Phys. Rev. 1954. 95. 2. P. 359-369.

148. Darwin C.G. The theory of X-ray reflexion. // Phyl. Mag. 1914. 27. P. 315.

149. Новикова H.H. Стоячие рентгеновские волны в многослойных синтетических микроструктурах и молекулярных пленках Ленгмюра-Блоджетт. Канд. диссертация, МГУ, Москва, 1990.

150. Афанасьев A.M., Кон В.Г. Внешний фотоэффект при дифракции рентгеновских лучей в кристаллах с нарушенным поверхностным слоем. // ЖЭТФ. 1978. 74. С. 300-313.

151. Ковальчук М.В., Кон В.Г. Рентгеновские стоячие волны— новый метод исследования структуры кристаллов. // УФН. 1986. 149. С. 69.

152. Klockenkamper R. Total-reflection X-ray fluorescence analysis. // Wiley, New York. 1997. 245 p.

153. Als-Nielsen J., Christensen F., Pershan P.S. Smectic-^4 Order at the Surface of a Nematic Liquid Crystal: Synchrotron X-Ray Diffraction. // Phys. Rev. Lett. 1982. 48. P. 1107.

154. Bloch J., Eisenberger P. Adsorption of counterions to a stearate monolayer spread at the water-air interface: A synchrotron X-Ray study // Nucl. Inst. Methods. B. 1988. 31. P. 468.

155. YunW.B., BlochJ.M. X-ray near total external fluorescence method: Experiment and analysis. // J.Appl. Phys. 1990. 68. 4. P. 1421-1428.

156. Barger W.R., Snow A.W., WohltjenH. Derivatives of phthalocyanine prepared for deposition as thin films by the Langmuir-Blodgett technique. // Thin Solid Films. 1985. 133. P. 197-206.

157. DentN., Grundy M., Richardson R., Roser S., McKeown N., Cook, M. X-Ray and Neutron-Scattering from Spread Monolayers and Lb Films. // J. Chim. Physique. 1993. 85. P. 103.

158. Makarova N.N., Godovsky Yu.K. Liquid-crystalline cyclochain organosilicon compounds. //Progr. Polym. Sci. 1997. 22. P. 1001.

159. Buzin A., Godovsky Y., Makarova N. et.al. Stepwise collapse of monolayers of cyclolinear poly(organosiloxane)s at the air/water interface: A brewster-angle microscopy and scanning force microscopy study. // J. Phys. Chem. B. 1999. 103. P. 11372-11378.

160. Meister A., Forster G., Thunemann A.F. et.al. Nanoscopic structure of a metallo-supramolecular polyelectrolyte-amphiphile complex, elucidated by X-ray scattering and molecular modeling. // Chemphyschem. 2003. 4. P. 1095-1100.

161. Fendler J.H. Membrane-mimetic approach to advanced materials. // Springer, Berlin, 1994. 236 p.

162. Sigiyama N., Shimizu A., Nakamura M. et.al. Molecular-scale structures of Langmuir Blodgett films of fatty acids observed by atomic force microscopy (II) - cation dependence. // Thin Solid Film. 1998. 331. P. 170.

163. Gaines G.L. Insoluble Monolayers at Liquid-Gas Interfaces. // N.Y.: I.Prigogine Interscience, 1966. 386 p.

164. Lednev I.K., Petty M.C. Ion Sensitive LB films of a chromoionophore. // Thin Solid Film. 1996. 284-285. P. 683.

165. Zasadzinski J.A., Schwartz D., Viswanathan R., Madsen L., Garnaes J. Langmuir-Blodgett Films. I I Science. 1994. 263. P. 1726.

166. Bloch J.M., Yun W. Condensation of monovalent and divalent metal ions on a Langmuir monolayer // Phys.Rev. A. 1990. 41. P. 844.

167. Galyametdinov Yu.G., Haase W., Malykhina L. Synthesis, mesomorphism, and unusual magnetic behaviour of lanthanide complexes with perfluorinated counterions. // Chem.Eur.J. 2001. 7. P. 99.

168. Pang S, C.Li, Huang J. Liang. Monolayers of novel amphiphile with Schiff base moiety as headgroup and its complex of copper(II). // Colloids Surf. A. 2001. 178. P.143-147.

169. Kwon K.O., Kim M.J., Abe M., Ishinomori Т., Ogino K. Thermotropic behavior of a phospholipid bilayer interacting with metal ions. // Langmuir. 1994. 10. P. 1415.

170. Sillen L.G., Martell A.E. Stability constants of metal ion complexes. // L.: Chem.Soc. 1969. 295 p.

171. Теоретическая и прикладная химия (3-дикетонатов металлов. // Под ред. СпицинаВ.И. иМартыненко Л.И. М.: Наука, 1985. С. 11-23.

172. Пешкова В.М., Мельчакова Н.В. (З-Дикетоны. // Серия аналитические реагенты. Ред Руденко Н.П. М.: Наука. 1986. 200 с.

173. Вельтищев Ю.Е., Фокеева В.В. Экология и здоровье детей. Химическая экопатология. М: Приложение к «Российский вестник перинтологии и педиатрии», 1996. 57 с.

174. Дятлова Н.М., ТемкинаВЛ., Попов К.И. Комплексоны и комплексонаты металлов. М.: Химия, 1988. 163 с.

175. Bellinger D., Needleman H.L. The health effects of low level exposure to lead. //Am. Rev. Publ. Health. 1992. 12. P. 111-140.

176. Матковская Т.А., Попов К.И., Юрьева Э.А. Бисфосфонаты. М.: Химия, 2001.248 с.

177. Архипова О.Г., Зорина JI.A., Сорокина Н.С. Комплексоны в клинике профессиональных болезней. М.: Медицина, 1975. 160 с.

178. Н.Д.Степина, С.И.Желудева, М.В.Ковальчук, Е.А.Юрьева, А.К.Хрипунов, Н.Н.Новикова «Способ формирования белковых пленок на твердых подложках», Патент № 2317100 от 01.03.2006.

179. Toyoshima С., Nakasako M., Nomura H., Ogawa H. Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 A resolution. // Nature. 2000. 405. P. 647.

180. Schwartz J.H., Lipmann F. Phosphate incorporation into alkaline phosphatase ofE. coli. //Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1961. 47. P. 1996-2005.

181. Coleman J.E. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. //Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1992. 21. P. 441-483.

182. McComb R.B., Posen S. Alkaline Phosphatase. // N.Y.: Plenum Press. 1979. 279 P.

183. L.Ma, E.R.Kantrowitz. Mutations at histidine 412 alter zinc binding and eliminate transferase activity in Escherichia coli alkaline phosphatase. // J.Biological Chem. 1994. 269. P. 31614-31619.

184. РитовВ.М., Мельгунов В.И., Комаров П.Г., Алексеева О.Н., Акимова Е.И. Интегральные мембранные белки саркоплазматического ретикулума скелетных мышц кролика и карпа. // Докл. АН СССР. 1977. 233. С. 727-733.

185. Чухрай Е.С., Атякшева Л.Ф. Физико-химический взгляд на активность, стабильность и адсорбционные свойства ферментов. // Журнал Физ. Химии. 2010. 84. 5. С. 805-818.

186. Атякшева Л.Ф., Чухрай Е.С., Степина Н.Д., Новикова Н.Н., Юрьева Э.А. Механизмы действия комплексообразующих лекарственных препаратов на щелочную фосфатазу. // Журнал Физ. Химии. 2011. 85. 6. С. 1-7.

187. Tuleva В., Vasileva-Tonkova Е., Galabova D. A specific alkaline phosphatase from phosphatase activity.//FEMS Microb.Lett. 1998. 161, P. 139.

188. Heurtault В., Saulinier P., Pech В., Proust J., Benoit J. Physico-chemical stability of colloidal lipid particles. // Biomaterials. 2003. 24. P. 4283-4300.

189. Геннис P. Биомембраны: молекулярная структура и функции. М.: Мир, 1997. 624 с.

190. Gottesman М, Simpson R.T., Vallee B.L. Kinetic properties of cobalt phosphatase. //Biochem. 1969. 8. 9. P. 3776-3783.

191. Wang J., Bedzyk M.J., Caffrey M. Resonance enchanced X-rays in thin films: a structure probe for membranes and structure layers. // Science. 1992. 258. P. 775-778.

192. Dev B.N., Das A.K., Dev S., Schubert D., Stamm M., Materlic G. Resonance enhancement of x rays in layered materials: Application to surface enrichment in polymer blends. // Phys.Rev.B. 2000. 61. P. 8462.

193. Hecht H., Kalisz H., Hendle J., Schmid R., Schomburg D. Crystal structure of glucose oxidase from Aspergillus niger refined at 2.3 A resolution. // J. Mol. Biol. 1993.229. P. 153.

194. Шейман Д.А. Патофизиология почки. M.: БИНОМ 1999. 205 с.У