Свободно-радикальные реакции и супрамолекулярное комплексообразование билирубина и других биомолекул

Соломонов, Алексей Владимирович

Свободно-радикальные реакции и супрамолекулярное комплексообразование билирубина и других биомолекул тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.04 ВАК РФ

Соломонов, Алексей Владимирович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Иваново МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.04 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Свободно-радикальные реакции и супрамолекулярное комплексообразование билирубина и других биомолекул»

Автореферат диссертации на тему "Свободно-радикальные реакции и супрамолекулярное комплексообразование билирубина и других биомолекул"

На правах рукописи

<г

СОЛОМОНОВ Алексей Владимирович

СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ И СУПРАМОЛЕКУЛЯРНОЕ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ БИЛИРУБИНА И ДРУГИХ БИОМОЛЕКУЛ

02.00.04 - физическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Иваново — 2013

005546579

Работа выполнена на кафедре неорганической химии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ивановский государственный химико-технологический университет»

Научный руководитель:

кандидат химических наук Румянцев Евгений Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Вацадзе Сергей Зурабович

(ФГБОУ ВГЮ «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», профессор кафедры органической химии)

доктор химических наук, профессор

Лефёдова Ольга Валентиновна

(ФГБОУ ВПО «Ивановский государственный химико-технологический университет», профессор кафедры физической и коллоидной химии)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет», г. Казань

Защита состоится «16» декабря 2013 г. в часов на заседании диссертационно-

го совета Д 212.063.06 при ФГБОУ ВПО «Ивановский государственный химико-технологический университет» по адресу: 153000, г. Иваново, пр. Фридриха Энгельса, 7.

Тел.:(4932)32-54-33 Факс:(4932)32-54-33 e-mail: dissovet@isuct.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Информационном центре

ФГБОУ ВПО «ИГХТУ» по адресу:

153000, г. Иваново, пр. Фридриха Энгельса, 10.

Автореферат разослан « » ноября 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.063.06 Егорова Елена Владимировна

e-mail: Egorova-D6@yandex.ru

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Желчные пигменты, их производные и синтетические аналоги составляют интересное семейство соединений, мультифункциопальных по физико-химическим свойствам, что определяет их биохимические функции и практически полезные характеристики. Среди всех желчных пигментов наиболее ярким представителем является билирубин (BR). Ранее рассматривавшийся исключительно как балластный и токсический продукт метаболизма, в настоящее время он считается одним из важнейших биологически активных соединений.

Усиление интереса к исследованию свойств желчных пигментов обусловлено способностью BR к подавлению окисления липидов клеточных мембран. Клинически доказано, что нормальные физиологические концентрации этого пигмента являются жизненно необходимыми. Однако вследствие наличия в молекуле BR нескольких реакционных центров для взаимодействия с активными частицами и значительного влияния природы окислителей и растворителей на процессы, в которых он принимает участие, детальный механизм антирадикального действия BR в настоящее время остается во многом неизвестным. В связи с этим, исследование превращений BR и, в особенности, кинетики его окисления в различных условиях является важной и актуальной задачей современной физической химии.

Основная транспортная форма билирубина в организме - макромолекулярные комплексы с альбуминами. Недавно обнаруженная способность BR выступать в качестве хромофора в лиганд-активируемых флуоресцентных белках UnaG, является значимым открытием в химии желчных пигментов. В этой связи актуальным является исследование влияния его присутствия в составе транспортного белка-носителя на физико-химические параметры процессов супрамолекулярного комплексообразова-ния различных биомолекул и лекарственных препаратов. Такой подход является основой для разработки современных тест-систем по определению типа и способности низкомолекулярных соединений к взаимодействию с белками, что, в свою очередь, будет полезным для дизайна новых лекарственных препаратов и развития теории молекулярного распознавания.

Таким образом, обозначенный круг проблем актуален для современной химии билирубина и его аналогов в аспекте исследований слабых межчастичных взаимодействий, установления механизмов сложных химических процессов во взаимосвязи с реакционной способностью и строением исследуемых соединений.

Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК № 14.740.11.0617), грантов РФФИ (проекты № 12-03-31309 и 13-03-90743) и стипендии Президента РФ молодым ученым и аспирантам по приоритетным направлениям модернизации российской экономики (2013-2015 гг.) № СП-6898.2013.4. Доклады, сделанные по результатам работы, были отмечены грамотами, дипломами и премиями на Всероссийской конференции молодых ученых и III школы «Окисление, окислительный стресс и антиоксиданты» им. Академика Н.М. Эмануэля (Москва, 2008), XII Всероссийской конференция по химии органических и элементоорганических пероксидов «Пероксиды» (Уфа, 2009), на конкурсе работ молодых ученых в рамках XVI Международной специализированной выставки «Химия» (Москва, 2011).

Цель работы заключалась в установлении закономерностей окислительных реакций BR, а также выяснении его роли в процессах нековалентного взаимодействия

биомолекул с белковыми носителями. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Исследование процессов окисления ВЯ и его комплекса с альбумином (ВКВЭЛ) в различных модельных системах, инициирующих свободные радикалы.

2. Выявление закономерностей в реакциях окисления тетрапиррольного пигмента, а также сравнение кинетических параметров реакций окисления в зависимости от природы и концентрации хромофоров и окислителей, белкового окружения, природы растворителя.

3. Квантово-химическое моделирование реакций окисления В к в газовой и жидкой фазах, определение энергетически предпочтительных маршрутов реакций.

4. Изучение влияния присутствия ВЦ в молекуле альбумина на кинетические и термодинамические параметры связывания низкомолекулярных лигапдов — аскорбиновой кислоты (АА), гидрохинона (Н2С>), урацила (и), 5-гидрокси-6-метилурацила (5Ц), .мезо-тетракис-и-сульфофенилпорфина (ТЭРР), борфторидного комплекса мезо-метил-3,3,,5,5'-тетрак1етил-4,4,-дисульфо-2,2'-дипирролилметена (ВОГМРУ) с белками.

Научная новизна. Впервые получены кинетические характеристики окислительных реакций билирубина в водных и неводных растворах под действием инициаторов неорганической и органической природы. Совокупность спектральных и кинетических данных, а также результатов квантово-химических расчетов, позволила установить, что в водных растворах образование биливердина и дипирролилметенов, как продуктов окислительной деструкции, энергетически менее предпочтительно, чем образование монопиррольных производных. Установлено влияние макромолекуляр-ного комплексообразования билирубина с альбумином на кинетику реакций окисления - обнаруживается эффект «белковой защиты». Показано, что в реакциях совместного окисления билирубин ингибирует окисление аскорбиновой кислоты, в то время как замена витамина С на гидрохинон приводит к обратному эффекту.

Впервые установлена роль билирубина в составе альбуминового конъюгата в процессах нековалентного взаимодействия биомолекул с белковыми носителями. Показано его влияние на кинетические и термодинамические параметры образования макромолекулярных комплексов биологически активных молекул (антиоксидантов, оснований РНК, олигопирролов) и белков. Установлено, что взаимодействие белков с низкомолекулярными лигандами носит неспецифический характер.

Практическая значимость. Полученные результаты вносят вклад в развитие химии олигопирролов в целом и химии билирубина и его аналогов. Понимание механизмов антиоксидантного и антирадикального действия билирубина позволит развить существующие и создать новые представления о биохимических функциях соединений на основе тетрапиррольной структуры. Полученные данные по окислению билирубина активными формами кислорода в водных и неводных растворах смогут найти применение при моделировании мембранных структур клетки, в особенности при условиях окислительного стресса, позволяя глубже понять процессы старения. Практическая значимость работы также во многом связана с необходимостью поиска новых технологий удаления избыточных количеств билирубина из биологических сред при гипербилирубинемиях. Конкурирующие реакции окисления билирубина и других фо-точувствителъных пигментов во многом позволяют понять молекулярные механизмы фотодинамической терапии опухолевых заболеваний и лечения желтух. Выявленные закономерности в области влияния билирубина на физико-химические параметры связывания низкомолекулярных веществ с белками вносят вклад в формирование базы, необходимой для медицинской и супрамолекулярной химии. Полученные резуль-

таты используются в образовательном процессе при преподавании дисциплин «Основы координационной и супрамолекулярной химии», «Основы молекулярной биологии», «Химические основы жизни» студентам Ивановского отделения ВХК РАН.

Основные положения, выносимые на защиту. Кинетика индивидуального окисления билирубина и его альбуминового комплекса в водных растворах пероксида водорода, 2,2-яз0б!/с(2-амидинопропан)а, системе Фентона. Кинетика совместного окисления BR с АА и H2Q. Кинетика окисления BR пероксидом бензоила в органических растворителях. Квантовохимические моделирование процессов окисления BR в части описания энергетики реакций. Результаты исследования влияния присутствия BR в молекуле альбумина на кинетические и термодинамические параметры связывания низкомолекулярных лигандов - АА, H2Q, U, 5U, TSPP и BOD1PY с белками.

Вклад автора. Подбор и анализ научной литературы по теме диссертации, экспериментальная часть работы, проведение компьютерного моделирования и обработка полученных результатов и их обсуждение выполнены лично автором. Стратегическое планирование исследований и методологии выполнения эксперимента, обсуждение результатов выполнены под руководством к.х.н., доцента Румянцева Е.В.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на V Международной конференции по порфиринам и фталоцианинам «ICPP-5» (Москва, 2008); X Международной конференции по физической химии порфиринов и их аналогов «ICPC-10» (Иваново, 2009); XII Молодежной конференции по органической химии (Суздаль, 2009); VIII Всероссийской конференции с международным участием «Химия и медицина, ОРХИМЕД» (Уфа, 2010); VIII Школе-конференции молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений (Абхазия, Гагра, 2009); VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010); И Международной научной конференции «Новые направления в химии гетероциклических соединений» (Железноводск, 2011); XIX Международном Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011); XVI Международной выставке химической промышленности и науки «Химия» (Москва, 2011); Международной молодёжной научной школе «Химия порфиринов и родственных соединений» в рамках фестиваля науки (Иваново, 2012); XIX Международном научном форуме студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2012), XXX Всероссийском симпозиуме по химической кинетике (Москва, 2012), II Всероссийской молодежной конференции «Успехи химической физики» (Черноголовка, 2013), XVth Conference on Heterocycles in Bioorganic Chemistry (Рига, 2013).

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 9 статьях (8 статей в журналах из Перечня ВАК), а также в тезисах 14 докладов, опубликованных в трудах научных конференций различного уровня.

Объем н структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 140 страницах, содержит 24 таблицы, 60 рисунков, 3 схемы и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, основных результатов и выводов, списка цитируемой литературы, включающего 220 наименований цитируемых литературных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обоснована актуальность работы, выбор объектов исследования, определена научная новизна и практическая значимость, а также сформулированы цель и задачи исследования.

Глава 1 (Литературный обзор) состоит из 3 разделов. Первый раздел посвящен классификации, номенклатуре и структурным типам линейных олигопирролов, желчных пигментов и их производным. Рассматривается строение, биосинтез, биологические функции и физико-химические свойства желчных пигментов, их природных и синтетических аналогов. Рассмотрены новые аспекты химии BR и его производных, выявлены важнейшие вопросы, решаемые на сегодняшний день в этом направлении. Во втором разделе обсуждаются вопросы, посвященные окислительным реакциям, антиоксидантной и антирадикалыюй активности желчных пигментов и, в особенности, билирубина. В третьем разделе обсуждаются проблемы, связанные с физико-химическими аспектами макромолекулярного комплексообразования биологически активных низкомолекулярных веществ, в том числе, и желчных пигментов с макромолекулами. Обсуждаются методы хемоинформатики и компьютерного прогноза межлекарственного взаимодействия и биотрансформации лекарств.

Глава 2 (Экспериментальная часть) включает описание методов очистки используемых соединений и растворителей. Приводится методология проведения спек-трофотометрического, спектрофлуориметрического и кинетического экспериментов, а также характеристик аппаратуры и оборудования, методов проведения квантово-химических расчетов.

Мс 1 Мс Глава 3 (Результаты и обсуждение) состоит из 5

разделов. Раздел 1 посвящен сравнительному анализу кинетических параметров для реакций индивидуального окисления BR (рис. 1) и его альбуминового комплекса в водных растворах под действием перокснда водорода и системы Фентона.

Рис- 1. Структура BR a «ridge-tile» в ходе реакции окисления BR во всех случаях на-

5Z, 15Z-KO нфо рмаци и. Стрелками ^

отмечены потенциальные центры блЮДаеТСЯ уменьшение интенсивности ПОЛОСЫ при 438

атаки свободными радикалами. нм, соответствующей поглощению пигмента. В диапа-

зоне концентраций Н202 от 1.0- Ю-6 до 1.02 моль/л и BR от 5.2-10"6 до 3.1-10 5 моль/л, соответственно, в спектрах поглощения не фиксируется появление полос, характерных для биливердина (BV) - пигмента, образующегося при окислении метиленового спейсера в положении 10 (-СН2-) до метанового (-СН=). Полученные данные свидетельствуют о разрушении тетрапиррольного хромофора до монопиррольных продуктов без стадии образования билатриена. Реакция окисления описывается формальным кинетическим уравнением псевдопервого порядка по пигменту. Учитывая, что применение хинонов, FeCh, билирубиноксидазы, а также электрохимического окисления приводит к образованию BV, использование пероксида водорода изменяет механизм превращений BR.

Результаты кинетического эксперимента, а также данные литературы свидетельствуют о возможности взаимодействия протонов NH-групп молекул BR с пероксиль-ными радикалами, образующимися в результате распада пероксида водорода в лимитирующей стадии с образованием радикального интермедиата с высокой реакционной способностью: BR-NH + НОО* — BR-N" + Н202.

Соединение Aote'lOV

н2о2 Система Фентона

BR BRBSA 13.3±0.8 4.4±0.6 31.1±1.5 17.4±0.9

Замена Н->СЬ на систему Фентона (металлоин- Таблица X. Эффективные (feb.) констан-дуцированный распад Н202) - систему генерации ра- ™ —™

дикалов ОН В реакции М0Й Фентона в фосфатном буфере при

Fe*' + Н202 = Fe" + ОН" + ОН*, сопровождается аналогичными изменениями в ЭСП растворов с существенным ростом константы скорости (табл. 1 ), что связано с преимущественным образованием в системе гидроксильных радикалов, аналогичным образом взаимодействующих с NH-центрами молекулами BR:

BR-NH + НО* —► BR-N* + Н20. Тем не менее, учитывая более высокую реакционную способность НО'-радикалов, этот путь не является единственно возможным, что и обусловливает роет константы скорости окислительных процессов для данной системы. Таким образом, из имеющихся в литературе сведений о трех возможных механизмах окислительных превращений BR лишь один из них находит экспериментальное подтверждение (подробнее см. диссертацию, рис. 2.22 с. 38).

Связывание BR с альбумином (BSA) в молекулярный комплекс (BRBSA) приводит к заметному понижению реакционной способности пигмента (эффект «белковой защиты», рис. 2).

Сравнительный анализ наблюдаемых констант скоростей реакций окисления BR и BRBSA указывает на снижение реакционной способности комплекса по сравнению со свободным пигментом как в случае *„,„(BR)

окислителя Н202

- = 3.0

,A0JBRBSA)

так и в случае окислительной системы Фентона

0 1000 2000 3000 Т,с

Рис. 2. Кинетические кривые окисления водных растворов ВИ (1,3) (с°= 1.92 10 5 М) и ВЯВЗА (2,4) (с° = 2.13-10 5 М) системой Фентона (1,2) и Н202 (с0 = 1.05 М) (3,4) при Т = 298.2 К в полулогарифмических координатах.

¿„JBR)

= 1.9 , что подтвержда-

ет наличие этого эффекта (см. табл. 1).

Наибольший вклад в стабилизацию белкового комплекса BR вносят донорно-акцепторные взаимодействия между >Ш-группами пиррольных колец и электронодо-норными группами радикалов аминокислотной последовательности альбумина. Таким образом, предложенная схема обменного взаимодействия МН-групп BR с НОО*-радикалами позволяет объяснить резкое понижение реакционной способности тетра-пиррольного пигмента в связанном с белком состоянии.

Увеличение рИ растворов приводит к усложнению характера окислительных превращений BR. Даже в отсутствие окислителя - Н202, происходит постепенное уменьшение концентрации BR в растворе с появлением промежуточного продукта -ВУ (рис. 3). Реакция окисления, как и в предыдущих случаях, описывается формальным кинетическим уравнением псевдопервого порядка по пигменту.

Резкое возрастание наблюдаемых констант скорости окисления BR с 3.8- 1СГ5 до 9.2-10" с-1 при увеличении рН с 7.7 до 12.7 связано со смещением кислотно-основного равновесия: H2BR = Н+ + НВЯ~ = 2Н+ + BR2~ в сторону образования моноанионной и неустойчивой дианионной форм BR с дальнейшим распадом молекулы.

X, нм

Рис. 3. Изменения в ЭСП водного раствора 13К (с0 1.68 !О 1 моль/л) при рН 11.71 ггри Т = 298.2 К; г, с: У - 0; 2 - 3600. Стрелками показано направление эволюции спектра

Кроме того, причиной изменений в спектрах поглощения BR может быть лактам-лактимная таутомерия, характерная для пиррометенонов. При увеличении рН среды происходит разрушение «ridge-Ше»-конформации пигмента и, соответственно, увеличивается число реакционных центров - NH-групп пиррольных колец и именно переход билирубина из конфор-мации «ridge-tile» в «helical» объясняет появление BV в реакционной смеси.

В разделе 2 обсуждаются результаты совместного окисления BR с АА и H2Q в

водных растворах. Окислительные реакции характеризуются теми же спектральными изменениями, наблюдаемыми для растворов индивидуальных соединений. Маршрут реакции окисления ВЯ не отличается от окисления его в свободном состоянии в данных условиях: в ЭСП не фиксируется полос поглощения ВУ. Присутствие АА не оказывает влияния на механизм окисления В Я, конечными продуктами которого, как и в случае пероксида водорода, являются монопиррольные продукты. Анализ кинетических параметров приводит к выводу о весьма существенном влиянии присутствия АА на скорость окисления ВЯ. Значения к0ъ$ для реакции окисления АА кислородом воздуха в присутствии ВЯ уменьшается в 2 раза, а окисление ВЯ в присутствии АА несколько ускоряется (табл. 2). Аналогичная зависимость наблюдается при окислении соединений пероксидом водорода.

Формальное кинетическое уравнение реакций окисления ВЯ и АА пероксидом

водорода имеет вид: -

Н«:)

Таблица 2. Константы скоростей кйья и к для реакции окисления В К и АА кислородом воздуха (02) и пероксидом водорода (Н202) в фосфатном буфере при

рН7.4иГ = 298.2К

Окислитель - 02 Окислитель - Н202

Система „-1 с Система (}^tl.lx) ^ м\ с-1 кНА -10\ М-'с-1

АА (265) BR (438) АА + BR (265) АА + BR (438) 2.4 ±0.1 1.1 ±0.1 1.2 ± 0.1 1.3 ±0.9 АА (265) BR (438) АА + BR (265) АА + BR (438) 20 ±2 1.3 ±0.2 1.4 ± 0.1 2.0 ±0.4 72 ±5 1.4 ± 0.1 0.85 ± 0.06 3.3 ± 0.3

Сравнение констант скоростей реакций окисления исследуемых соединений пероксидом водорода также свидетельствует об эффективном торможении реакции окисления АА в присутствии ВЯ: скорость

* Прим. Указана «рабочая» длина волны, на которой была определена скорость реакции.

окисления АА понижается более чем в 80 раз, в то время как скорость окисления ВЯ увеличивается в 2.5 раза (эффект активации). Наблюдаемый эффект ингибирования окисления АА и активации окисления ВЯ связан со взаимной конкуренцией субстратов за активные формы кислорода. Увеличение скорости окисления ВЯ с учетом обменного механизма взаимодействия протонов ТМН-групп со свободными радикалами в лимитирующей стадии связано также с разрушением «ridge-tile»-кoнфopмaции пигмента.

При совместном окислении ВЯ и Н2С> в условиях окисления кислородом воздуха, а также в присутствии пероксида водорода в спектрах реакционной смеси наблюдается появление хинона (С), 245 нм) и уменьшение максимумов поглощения соответствующих Н2<3 (290 нм) и ВЯ. Однако в присутствии пероксида водорода в спектрах

появляется максимум, соответствующий поглощению ВУ (650 нм). Применение Н202 как источника радикалов приводит к существенному уменьшению константы скорости окисления В!? и незначительному росту таковой для Н2С? по сравнению с окислением их в свободном состоянии (табл. 3).

Таблица 3. Наблюдаемые (Л\:ч.;) константы скоростей реакции окисления ВИ и I кислородом воздуха (Ог) и пероксидом водорода (Н202) в фосфатном буфере при рН 7.4 и Г= 298.15 К*

Система 5 -1 /W10 , с Система Кы 5 -1 10 , с

(KJ о, н,о, «А

H2Q(290) 1.0 1.0 BR + H2Q (290) 9.1 -

BR (438) 9.1 1100 BR + H2Q (438) 8.4 2.2

H2Q(245) 21.0 5.2 BR + H,Q(650) - 6.6

* Прим. Указана «рабочая» длина волны, на которой была определена скорость реакции. Погрешность в определении ¿0ьч составила не более 10 %.

Таким образом, в отличие от АА, полученные данные свидетельствуют об ингибировании окисления В11 и активации данного процесса для Н2С). В ходе реакции происходит конкуренция между гидрохиноном и В Я за перок-сильные радикалы. Более высокая скорость взаимодействия Н2() с гид-ропероксидом на промежуточных стадиях, а также образование активных антирадикалов - семи.хинонов, объясняет ранее отсутствие в спектрах полос, соответствующих монопиррольным продуктам.

Образование ВУ происходит в процессе последовательной цепи сопряжения: Н2<3 + Н202 +-» (3 + 2И20; <3 + ВЯ <-> ВУ + Н2(3; ВУ + £>—>• продукты окисления.

В разделе 3 представлены результаты экспериментов по выявлению закономерностей в реакциях окисления билирубина и его альбуминового комплекса инициирующими агентами органической природы в водных и неводных растворах. В качестве водорастворимого инициатора был использован 2,2-азобмс-2-амидинопропан (АВАР), в качестве органорастворимого - пероксид бензоила (ВР).

В хлороформе основным продуктом окисления является пурпурин, который в дальнейшем окисляется до бесцветных моно-пиррольных продуктов. В диметилеульфок-сиде (ДМСО) и диметилформамиде (ДМФА) окисление протекает через стадию образования ВУ (рис. 4), который далее окисляется до пурпурина и затем до холетелина. Превращения пигмента в ДМСО и ДМФА связаны с возможностью взаимодействия пигмента с радикалами, образованными в результате гемолитического распада пероксида бензоила.

Предполагается обменное взаимодействие радикала по метиленовому мостику пигмента с последующей локализацией электрона на ближайшем атоме азота одного из пиррольных колец. Второй радикал, образованный пероксидом, аналогичным образом вступает в реакцию по метиленовому спейсеру с образованием ВУ. Образование пурпурина и холетелина происходит схожим образом, за исключением присоединений атома кислорода по метановым мостикам фрагментов дипирролилметенов (положения 5 и 15). Образование биливердина, пурпурина и холетелина подтверждается данными спектрофотометрии и хроматографического анализа.

Скорость реакции в ДМСО превышает таковую по сравнению с водными растворами в случае применения неорганических пероксидов за счет стабилизации иного переходного состояния (табл. 4).

290 490 690

Рис. 4. Изменения в электронных спектрах поглощения растворов BR (с° = 2 9-10 5 М ) пероксидом бензоила (с0 = 0.013 М) при 298.2 К, т, с: 1 - 0; 2 - 3600. Стрелкой показано направление эволюции спектра.

В результате окисления BR АВАР наблюдаются аналогичные изменения в спектрах, что и в случае использования неорганических радикалов. Однако, ввиду появления в спектрах четко фиксируемой полосы BV, в данном случае в механизм окислительных превращений необходимо включить стадии образования и распада билатриена.

Конечным продуктом также являются монопиррольные соединения. Аналогичным образом, при замене BR на BRBSA для водных систем четко прослеживается эффект «белковой защиты» с одновременным понижением энергии активации процесса окисления. Таким образом, кинетическое проявление данного эффекта заключается в стабилизации переходного состояния белком и большой роли энтропийного вклада, однако процесс лимитирован диссоциацией комплекса: BRBSA = BR + BSA. Одной из интересных особенностей протекания данного процесса является также и то, что образование BV из BR в связанном состоянии кинетически контролируемо: образующийся BV связывается с белком и оказывается менее подвержен действию активных частиц, в отличие от окисления свободного BR.

В разделе 4 представлены результаты квантово-химических расчетов исследуемых свободно-радикальных процессов с участием BR. Полуэмпирическими методами АМ-1, РМ-3 и с помощью методов функционала плотности DFT/B3LYP/6-31G (d,p), а также с применением теории 3D-RISM, проведено моделирование и сравнительный анализ реакций окисления BR пероксильными и гидроксильными радикалами. Отправной точкой при построении схем явились многоцентровая модель антирадикального действия BR (см. рис. 1), экспериментальные данные по окислению BR Н202, а также ранние исследования окисления пигмента в подобных условиях и анализ соот-

Окисление метанового спейсера одного из диттирролилметено-вых фрагментов молекулы BR с последующим элиминированием терминального пир-рольного кольца в виде метилвинилмалеимида (схема 1), как следует из данных табл. 5., является энергетически выгодным. На следующих стадиях обсуждаемого маршрута возможно окисление дипиррола до монопроизводных, среди которых фигурирует диформилпиррол или через производные дипирролилметена (с преобладанием первого процесса). Трипирреновые соединения также могут подвергаться окислению по метиленовому и/или метановому спейсеру с образованием многих продуктов, среди которых можно обнаружить дипиррольные и нерадикальные монопиррольные соединения, в том числе и гематиновую кислоту, как это было показано в работах по электрохимическому окислению BR.

Таблица 4. Эффективные (каЬа) и бимолекулярные (к) константы скорости реакции окисления BR пе-эоксидом бензоила в ДМСО. _

г, к с(ПБ)10'.М Wio-V1 к, M-V

0.28 0.30 ±0.02

298.2 1.9 1.11 ±0.06 0.58 ±0.04

3.1 1.7 ± 0.1

0.61 0.75 ±0.04

308.2 1.64 1.9 ±0.1 1.6±0.1

3.0 5.1 ±0.3

0.37 2.2 ±0.2

315.2 1.94 3.1 ±0.3 1.9 ±0.1

3.2 6.2 ± 0.4

ветствующих продуктов окисления.

Схема 1. Схема окисления ВК пероксидом водорода с отщеплением терминальных пиррольных групп.

Другой вариант маршрута реакции (схема 2) - окисление метиленового мостика с образованием дипирро-лилметеновых производных, которые затем

Схема 2. Схема окисления BR пероксндом водорода до дипирролилметено-вых фрагментов.

Схема 3. Схема реакций окисления BR до BV пероксидом водорода с образованием «ridge-tile» (1) и «helical» (2) конформаций.

окисляются по метиновому спенсеру до монопиррольных продуктов, в частности, диформилпиррола.

Другие варианты этого процесса аналогичны рассматриваемому и отличаются только тем, что продукты окисления имеют иные периферийные заместители. Этот процесс, в отличие от предыдущего, энергетически менее выгоден.

Третьим возможным способом окисления BR (схема 3) является образование BV -пигмента, получающегося в ходе окисления билирубина по метиле-новому спейсеру. Расчет энергетики путей образования двух конформаций BV («ridge-tile» и «helical») показывает, что наиболее предпочтительным является процесс с образованием «ЬеНса1»-конформации: для образования BV необходим разрыв сетки внутримолекулярных водородных связей.

Перенос исследуемых ре- Таблица 5. Энергетический эффект реакций в каждой из схем акций из газовой фазы в водный раствор с рН 7 коррелирует с данными для газовой фазы: образование монопирролов остается энергетически более выгодным, по сравнению с остальными процессами (см. табл. 5). Таким образом, квантовохимические расчеты подтверждают экспериментальные данные, а также предположения относительно маршрута реакции и окисления BR до монопиррольных соединений. Фактически, варьируя тип растворителя и природу окисляющего агента, возможно увеличить или уменьшить как дифференциальную, так и интегральную селективность реакции окисления BR в BV и, соответственно, замедлить или ускорить остальные реакции.

В разделе 5 представлен анализ исследования взаимодействия различных биологически значимых соединений со свободным альбумином, и будучи связанным в мак-ромолекулярный комплекс с билирубином. В качестве лигандов были использованы АА, H:Q, U, 5U, TSPP и BODIPY.

Полученные с помощью флуоресцентной спектроскопии результаты свидетельствуют о том, что связывание лигандов с активными центрами белков носит неспецифический характер и осуществляется за счет различного рода универсальных взаимодействий: образующиеся макромолекулярные комплексы являются легкодиссоции-рующими.

Реакция РМ-3 АМ-1 B3LYP/6-31G (d,p) 3D-R1SM

Схема 1(1) -239.5 -298.6 -299.6 -321.4

Схема 1(2) -251.7 -284.0 -257.8 -275.4

Схема II -176.1 -220.1 -194.1 -258.2

Схема 111(1) -99.4 -156.5 -141.2 -211.3

Схема П1(2) -122.6 -187.2 -230.0 -251.6

АА

Структурные формулы исследуемых лигандов

H2Q

д . .

О-^ NH R2

RbR2 = H(U) R, = ОН, R2 = Me (SU)

TSPP

Me Me Me

1000

800

400

Тем не менее, в каждом из случаев можно выделить некоторые особенности протекания данных процессов. Общим для всех исследуемых систем является то, что интенсивность флуоресценции BSA и BRBSA при увеличении концентрации лигандов в растворе закономерно уменьшается (рис. 5).

Однако при одинаковой концентрации растворов белков интенсивность флуоресценции последнего в 2.5 раза ниже: при взаимодействии BSA с BR часть энергии флуорофора рассеивается на практически неизлучающий пигмент и флуоресценция белка в составе BRBSA уже частично потушена за счет комплек-сообразования с BR, а также за счет взаимодействия BR - триптофан.

Для всех соединений линейность в координатах уравнения Штерна-Фольмера, которое связано со взаимодействием триплетной молекулы с тушителем при простейшем соударении, характеризующее динамическое тушение (кинетический аспект), сохраняется только на небольшом участке концентраций тушителя (стах) после чего наблюдается положительное отклонение графика, свидетельствующее об образовании макромолекулярных комплексов. Тем не менее, отмечается, что присутствие BR в составе белка способствует росту константы скорости тушения в случае азотистых оснований, в отличие от других соединений (табл. 6).

Таблица 6. Константы динамического тушения для различных взаимодействующих систем в среде фосфатного

Рис. 5. Спектры эмиссионной флуоресценции BSA (с0 = 1.76-10"5 М) в присутствии урацила (c(U)-ÏO4, M от / до 7: 0; 2.33; 3.89; 5.83; 8.03; 11.7; 16.1) и график уравнения Штерна-Фольмера для системы BSA + U при Г= 298.2 К.

Белок - BSA Белок - BRBSA

Лиганд Ksv- ЮЛ М-1 V ю-'2, М"1 с"' с„„104, M .Ksi,-10 Л M-1 Vie l2. M'V CW.-104, M

АА h2q и SU TSSP BODIPY 2.1 ±0.2 0.048 ± 0.004 0.120 ±0.008 0.84 ±0.04 13 ± 2 5.8 ±0.4 2.1 ±0.2 0.048 ± 0.004 0.120 ±0.008 0.84 ±0.04 13 ±2 5.8 ± 0.4 1.0 17 3.9 1.1 0.13 0.028 1.6±0.I 0.040 ±0.003 0.17 ± 0.10 1.23 ±0.8 8.0 ±0.5 2.9 ±0.2 1.6±0.1 0.039 ± 0.003 0.17±0.10 1.23 ±0.8 8.0 ±0.5 2.9 ±0.2 1.0 18 5.4 1.1 0.21 0.028

Увеличение скорости тушения связано с увеличением скорости (коэффициента) диффузии урацилов к фотоактивным центрам молекул билирубин-связанного протеина. Таким образом, комплекс BRBSA оказывается более проницаем для молекул и

и 5и, по сравнению с другими исследуемыми соединениями. Согласно приведенным данным, все константы скоростей тушения в 5-500 превышают диффузионный предел тушения (МО10 М_1-с~') при максимальном разбросе столкновений тушителей и биополимеров. То есть, динамическая составляющая не является доминирующей, а тушение флуоресценции белков лигандами вызвано образованием в основном состоянии нефлуоресцирующих молекулярных комплексов белков и биомолекул. В образовании комплексов, наряду с универсальными, в том числе гидрофобными взаимодействиями, могут принимать участие донорно-акцепторные и водородные связи между аминокислотными остатками белка и функциональными группами лигандов.

Определение параметров взаимодействия в рамках теории статического тушения было сделано по уравнению, являющемуся модификацией уравнения Штерна-Фольмера с поправкой на число сайтов связывания молекул лигандов на белке (табл.

7).

Показано, что даже с учетом параметра и наблюдается корреляция констант связывания с динамическим тушением. Наиболее термодинамически стабильными оказываются комплексы с Т8РР и ВООТРУ, наименее стабильными - системы белок-и, 511.

Эффективность взаимодействия ВЭА и ВЯВ8А с лигандами была описана в рамках модели безызлучательного переноса энергии Фёрстера (флуоресцентный резонансный перенос энергии).

Все полученные значения г лежат в пределах 0.5Яо < г < 2/?0, что свидетельствует о высокой вероятности переноса энергии с остатков триптофана исследуемых белков на лйганды (табл. 8).

Эффективнее всего

это происходит в случае ТвРР и В001РУ, причем замена ВБА на комплекс с ВК существенно влияет на эффективность переноса энергии, чего не происходит в случае АА и 51Л. Корреляция ферстеровского радиуса и констант тушения свидетельствует о высокой степени эффективности тушения в случае пиррол-содержащих соединений.

Структурные изменения в белках при взаимодействии с лигандами были изучены с помощью синхронной флуоресценции. Полученные результаты позволяют предположить, что все соединения способны связываться с белками в областях, где расположены остатки тирозина и триптофана (рис. 6, а и б) соответственно.

Практически во всех исследуемых системах происходит изменение формы и положения максимумов флуоресценции каждого из аминокислотных остатков. Бато-

Таблнца 7. Термодинамические параметры, характеризующие статическое тушение белков лигандами.__

Белок - В8А Белок - ВЯВБА

Лиганд Кь; 10' М1 до', кДж/моль п АС, кДж/моль п

АА н2<з и 5и ТБЭР ВОО!РУ 20.1 ± 1.2 0.59 ± 0.04 1.77 ±0.10 8.67 ±0.45 130 ±8 61.2 ±4 -24.1 ± 1.4 -15.6 ±0.8 -18.2 ±0.8 -22.6 ±1.0 -28.6 ± 1.3 -27.3 ±1.2 1.63 2.80 1.62 1.86 0.90 1.12 15.2 ± 1.4 0.49 ±0.05 I.84 ± 0.10 II.8 ± 1.0 26.3 ± 1.4 6.51 ±0.40 -23.5 ± 1.3 -15.1 ±0.7 -18.3 ±0.8 -22.8 ±0.8 -24.7 ±0.9 -21.7 ±1.0 1.23 4.20 1.54 2.23 1.38 0.60

Таблица 8. Характеристики флуоресцентного резонансного переноса энергии, рассчитанные по уравнению Фёрстера для разных систем._

Белок - В5А Белок - ВЯВЗА

Лиганд Я «о, г, Е Д>.)-1015 г,

им нм

АА 0.264 0.2488 1.42 1.69 0.202 0.6017 1.65 2.07

ВД 0.009 0.1788 1.35 2.94 0.038 0.1853 1.35 2.32

и 0.029 0.1801 1.35 2.42 0.139 0.1786 1.31 1.77

5и 0.165 1.4730 1.91 2.51 0.170 1.5468 1.93 2.51

ТБвР 0.695 60.63 3.55 3.10 0.774 45.67 3.39 2.96

ВСЮ1РУ 0.375 0.1043 2.65 2.88 0.677 0.1388 2.77 2.46

хромные смещения спектров в случае А А, II, 5и связаны с перемещением остатков

Однако в спектре белка в присутствии гидрохинона наблюдается бимодальное расщепление полосы флуоресценции триптофана, что связано с переходом одного из двух этих остатков в гидрофильный, а другого - в гидрофобный карман. Следует отметить, что скорость тушения флуоресценции белков максимальна для Т8РР и ВООГРУ, это приводит к частичной денатурации белка, проявляющейся в отсутствии изменений в спектрах синхронной флуоресценции.

Таким образом, учитывая широкий спектр используемых систем «флуорофор-тушитель», можно легко подобрать эти комбинации для решения различного рода практических задач, в частности, для селективного тушения определенного флуоро-фора и выяснения влияния факторов связывания биолигандов с протеинами на анти-оксидантную активность протеин-связанных молекул.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. По данным электронной и флуоресцентной спектроскопии с привлечением квантово-химических расчетов изучена формальная кинетика реакций окисления билирубина в водных и неводных растворах (ДМФА, ДМС'О, хлороформ) с использованием пероксида водорода, системы Фентона, 2,2-азобие-2-амидинопропана, а также пероксида бензоила в качестве окислителей. Определены константы скоростей исследуемых реакций и активационные параметры.

2. Установлено, что в водных растворах конечными продуктами окисления билирубина являются монопиррольные производные. Показано, что увеличение рН водных растворов приводит к распаду билирубина с образованием на промежуточной стадии биливердина. Применение органических растворителей и окислителей аналогичным образом приводит к увеличению констант скоростей окисления ВЯ. изменению механизма его деструкции и появлению в продуктах реакции различных билат-риенов, в то время как связывание билирубина альбумином приводит к уменьшению констант скоростей реакций окисления пигмента вне зависимости от природы используемых окислителей, что связано с кинетическим проявлением эффекта «белковой защиты».

3. В реакциях совместного окисления билирубина, аскорбиновой кислоты и гидрохинона показано ингибирование окисления аскорбата, в случае гидрохинона наблюдается обратный эффект.

4. Исследовано влияние присутствия билирубина в макромолекулярном комплексе с альбумином на характер макромолекулярных взаимодействий с биомолекулами (ТЭРР, В001РУ, АА, 511, и, Н2С>). Установлено, что тушение флуоресценции белков является результатом комплексообразования флуорофор-лиганд. Показано, что степень взаимодействия биомолекул с белками, как в случае ВвА, так и ВИВвА изменяется в ряду ТЭРР > ВОО!РУ > АА > 5и > и > Н2С>. Образующиеся комплексы явля-

тирозина и триптофана в гидрофильную область.

Рнс. 6. Спектры синхронной флуоресценции BSA при Л/. = 15 нм и АХ = 60 нм (вставка) в присутствии урацила (c(U)-lO4, M от 1 до 6: 0; 2.33; 3.89: 5.83; 11.7; 16.1) при 7'= 298.2 К.

ются среднепрочными (константы образования составляют ~103-105 л/моль). Влияние билирубина в составе комплекса отрицательно сказывается на параметрах взаимодействия белков и лигандов, за исключением U и 5U.

5. Согласно данным синхронной флуоресценции, при взаимодействии TSPP и BODIPY происходит частичная денатурация белка и его конъюгата, причем порфи-рин способен вытеснять билирубин из его комплекса с протеином. Во всех остальных случаях происходит перемещение остатков тирозина и триптофана в гидрофильные и гидрофобные области. Доминирующий вклад в стабилизацию комплексов вносит статический механизм тушения флуоресценции посредством неспецифических взаимодействий.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Solomonov, A.V. Serum albumin and its bilirubin complex as drug-carrier proteins for water-soluble porphyrin: a spectroscopic study / A.V. Solomonov, E.V. Rumyantsev, E.V. Antina // Monatshette filr Chemie/Chemical Monthly-2013.-V. 144. No. 11.-P. 1743-1749.

2. Solomonov, A.V. The study of molecular mechanisms of antioxidant action of bile pigments and investigating their role during the interaction of biomolecules with a drug carrier protein / A.V. Solomonov, E.V. Rumyantsev, B.A. Kochergin, M.K. Serebiyakova, p.v. Uckhov, E.V. Antina // FEBS Journal. -2013. - V. 280. Suppl. 1 - P. 611.

3. Solomonov, A.V. Spectroscopic Studies of the Supramolecular Interactions Between Uracil and 5-Hydroxy-6-Methyluracil with Bovine Serum Albumin and its Bilirubin Complex / A.V. Solomonov, E.V. Rumyantsev, S.P. Ivanov, B.A. Kochergin, E.V. Antina // The Protein Journal. - 2013. - V 32 No 5. - P. 343-355.

4. Соломонов, A.B. Молекулярное комплексообразование урацила с бычьим сывороточным альбумином и его бшшрубиновым комплексом по данным спектральных исследований / А.В. Соломонов, Е В. Румянцев, С.П. Иванов, Б А. Кочерпш, Е В. Антона // Известия Академии наук. Серия химическая. - 2012. - № 10. - С. 1974-1979.

5. Соломонов, А. В. Кинетика окисления билирубина и аскорбиновой кислоты при совместном присутствии / А.В. Соломонов, Е.В. Румянцев, Б.А. Кочерпш, Е.В. Антона // Журнал физической химии. -2012. - Т. 85. № 7. - С. 1162-1167.

6. Соломонов, А.В. Формальная кинетика окисления билирубина и его комплекса с альбумином пероксидом водорода / А.В. Соломонов, Е.В. Румянцев, Е.В. Ангина // Журнал физической химии. - 2010. - Т. 84. - № 12. - С. 2255-2259.

7. Marfm, J.S. Linear tetrapyrroles: relation physical-chemistry properties and biochemical functions / J.S. Marfin, E.V. Rumyantsev, E.V. Antina, G.B. Guseva, S.P. Makarova, A.V. Solomonov // J. Porphyrins and phthalocyanines. - 2008. - Vol. 12. No 3-6. - P. 631.

8. Соломонов, A.B. Спектральное исследование взаимодействия аскорбиновой кислоты с бычьим сывороточным альбумином и его комплексом с билирубином / А.В. Соломонов, Е.В. Румянцев, Б А. Кочергин, Е.В. Антона // Известия ВУЗов. Серия Химия и химическая технология. - 2013. -Т. 56. №3. - С. 51-55.

9. Соломонов, А.В. Теоретическое и экспериментальное исследование окислительных превращений билирубина в различных модельных системах / А.В. Соломонов, Е.В. Румянцев, АС. Тимин, М.К. Серебрякова // VI Всероссийская молодежная школа-конференция «Квантово-химические расчеты»: мат. конф. (сб. стат.) - Иваново, 2013. - С. 351-355.

10. Kochergin, B.A Interaction of bodipy with albumin and its bilirubin complex / B.A. Kochergin, A.V. Solomonov, E.V. Rumyantsev // XVth Conference on Heterocycles in Bio-organic Chemistry: abst book. -Riga, 2013. -P. 197.

11. Ухов, П.В. Антирадикальные свойства билирубина и его комплекса с альбумином в модельной реакции инициированного окисления / П.В. Ухов, А.В. Соломонов, Е.В. Румянцев, Е.В. Ангина // Успехи химической физики: И Всероссийская молодежная конференция: тез. докл. - Черноголовка, 2013.-С. 72.

be US Lb* V1СШ htä'r» ^

12. Серебрякова, M.K. Кинетика окисления билирубина в неводных растворителях / М.К. Серебрякова, A.B. Соломонов, Е.В. Румянцев, Е.В. Ангина // XXX Всероссийский симпозиум по химической кинетике: тез. докл. - Москва, 2012. - С. 30.

13. Серебрякова, М.К. Формальная кинетика инициированного окисления билирубина в модельных растворителях / М.К. Серебрякова, A.B. Соломонов, Е.В. Румянцев Е.В., A.B. Антина // Химия порфиринов и родственных соединений: Международная молодёжная научная школа в рамках фестиваля науки: тез. докл. - Иваново, 2012. - С. 119-120.

14. Соломонов, A.B. Молекулярный докинг биомолекул и антирадикалов на биополимерах и реакции их сопряженного окисления по данным спектральных исследований [Электронный ресурс] / A.B. Соломонов // Ломоносов-2012: XIX Международный научный форум (конференция): тез. докл. - Москва, 2012.

15. Соломонов, A.B. Билирубин и другие биомолекулы как антиоксиданты и носители в реакциях индивидуального и сопряженного окисления / A.B. Соломонов // Химия-2011: XVI Международная выставка химической промышленности и науки: тез. докл. - Москва, 2011 - С. 11-12.

16. Соломонов, A.B. Спектральные исследования супрамолекулярных взаимодействий антирадикалов и биополимеров и реакции их сопряженного окисления / A.B. Соломонов, Е.В. Румянцев, Б.А. Кочергин, Е.В. Антина // XIX Международный Менделеевский съезд по общей и прикладной химии: тез. докл. -Волгоград, 2011. -Т. 1. -С. 288.

17. Соломонов, A.B. Окислительные реакции билирубина и его макромолекулярных комплексов в водных растворах / A.B. Соломонов, Е.В. Румянцев, Б.А. Кочергин, Е.В. Антина // Новые направления в химии гетероциклических соединений: II Международная научная конференция: тез. докл. -Железноводск, 2011. - С. 90.

18. Соломонов, A.B. Исследование антирадикальной активное™ билирубина в модельных системах / A.B. Соломонов, Е.В. Румянцев, Е.В. Антина // Биоантиоксидант: VIH Международная конференция: тез. докл. -Москва, 2010. -С. 442-444.

19. Соломонов, A.B. Окислительные реакции билирубина и аскорбиновой кислоты в водных растворах / A.B. Соломонов, Е.В. Румянцев, Е.В. Антина. / Химия и медицина: VIII Всероссийская конференция с международным участием: тез. докл. - Уфа, 2010. - С. 312-313.

20. Соломонов, A.B. Квантово-химический анализ реакций окисления билирубина / A.B. Соломонов, Е.В. Румянцев, Е.В. Антина // XII Молодежная конференция по органической химии: тез. докл. - Суздаль, 2009. - С. 377-380.

21. Соломонов, A.B. Квантово-химическое моделирование реакций свободно-радикального окисления билирубина / A.B. Соломонов, Е.В. Румянцев, Е.В. Антина // VIII Школа-конференция молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений: тез. докл. — Гагра, Абхазия, 2009. - С. 50-51.

22. Соломонов, A.B. Особенности окислительных реакций билирубина / A.B. Соломонов, Е.В. Румянцев, Е.В. Антина // ICPC-10: X Международная конференция по физической химии порфиринов и их аналогов: тез. докл. - Иваново, 2009. - С. 164.

23. Marfin, J.S., Linear Tetrapyrroles: Relation Phisical-chemistry Properties and Biological Functions / J.S. Martin, E.V. Rumyantsev, E.V. Antina, G.B. Guseva, S.P. Makarova, A.V. Solomooov // ICPP-5: International Conference on Porphyrins and Phthalocyanines: abst. book. - Moscow, 2008. - P. 469.

Автор выражает свою признательность научному руководителю кх.н., доц. Румянцеву Е.В. за неоценимую помощь и при подготовке диссертации, а также всему коллективу кафедры неорганической химии за всестороннюю поддержку.

Подписано в печать 14.11.2013. Формат 60x84 1/16. Бумага писчая. Усл.печ.л. 1,00. Уч.-изд.л. 1,03. Тираж 80 экз. Заказ 3414

ФГБОУ ВПО Ивановский государственный химико-технологический университет

Отпечатано на полиграфическом оборудовании кафедры экономики и финансов ФГБОУ ВПО «ИГХТУ» 153000, г. Иваново, пр. Ф. Энгельса, 7

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Соломонов, Алексей Владимирович, Иваново

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ивановский государственный химико-технологический университет»

На правах рукописи

04201452228

СОЛОМОНОВ АЛЕКСЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫЕ РЕАКЦИИ И СУПРАМОЛЕКУЛЯРНОЕ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ БИЛИРУБИНА И ДРУГИХ БИОМОЛЕКУЛ

02.00.04 - физическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: к.х.н. Румянцев Евгений Владимирович

Иваново 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................4

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ............................10

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................12

2.1. Линейные олигопирролы, желчные пигменты и их аналоги: строение, биохимические и физико-химические аспекты............................................12

2.1.1. Структурное разнообразие желчных пигментов и их аналогов..........12

2.1.2. Особенности биосинтеза и биохимические функции желчных пигментов млекопитающих...............................................................................18

2.1.3. Физико-химические свойства билирубина и родственных желчных пигментов.............................................................................................................22

2.1.4. Билирубин и желчные пигменты в аспекте патогенеза желтух..........27

2.1.5. Синтетические аналоги олигопирролов и перспективы в исследованиях желчных пигментов..................................................................31

2.2. Билирубин и его производные как природные антирадикалы...................37

2.3. Некоторые аспекты супрамолекулярного комплекообразования биолигандов и биополимеров........................................................................55

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.................................................................65

3.1. Подготовка материалов и реактивов.............................................................65

3.2. Исследование кинетики реакций окисления с использованием спектрофотометрии.........................................................................................67

3.3. Исследование процессов супрамолекулярного комплекообразования с использованием флуоресцентной спектроскопии.......................................69

3.4.Квантовохимические вычисления и молекулярный докинг.......................71

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ...........................................................73

4.1. Реакции индивидуального окисления и его альбуминового комплекса неорганическими окислителями в водных растворах.................................73

4.2. Кинетика реакций совместного окисления билирубина с аскорбиновой кислотой и гидрохиноном в водных растворах............................................83

4.3. Закономерности окислительных процессов билирубина и его альбуминового комплекса органическими окислителями в водных и неводных растворах.........................................................................................89

4.4. Квантовохимический анализ окислительных процессов с участием билирубина.....................................................................................................100

4.5. Особенности влияния билирубина на процессы супрамолекулярного комплексообразования альбумина и биомолекул......................................106

5. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.................................................121

6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ................................................123

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Желчные пигменты, их производные и синтетические аналоги составляют интересное семейство соединений, мультифункцио-нальных по физико-химическим свойствам, что определяет их биохимические функции и практически полезные характеристики. Среди всех желчных пигментов наиболее ярким представителем является билирубин (ВЯ). Ранее рассматривавшийся исключительно как балластный и токсический продукт метаболизма, в настоящее время он считается одним из важнейших биологически активных соединений.

Усиление интереса к исследованию свойств желчных пигментов обусловлено способностью ВЯ к подавлению окисления липидов клеточных мембран. Клинически доказано, что нормальные физиологические концентрации этого пигмента являются жизненно необходимыми. Однако вследствие наличия в молекуле В11 нескольких реакционных центров для взаимодействия с активными частицами и значительного влияния природы окислителей и растворителей на процессы, в которых он принимает участие, детальный механизм антирадикального действия ВЯ в настоящее время остается во многом неизвестным. В связи с этим, исследование превращений ВЯ и, в особенности, кинетики его окисления в различных условиях является важной и актуальной задачей современной физической химии.

Основная транспортная форма билирубина в организме - макромолеку-лярные комплексы с альбуминами. Недавно обнаруженная способность ВЯ выступать в качестве хромофора в лиганд-активируемых флуоресцентных белках ипав, является значимым открытием в химии желчных пигментов. В этой связи актуальным является исследование влияния его присутствия в составе транспортного белка-носителя на физико-химические параметры процессов су-прамолекулярного комплексообразования различных биомолекул и лекарственных препаратов. Такой подход является основой для разработки современных тест-систем по определению типа и способности низкомолекулярных

соединений к взаимодействию с белками, что, в свою очередь, будет полезным для дизайна новых лекарственных препаратов и развития теории молекулярного распознавания.

Цель работы заключалась в установлении закономерностей окислительных реакций BR, а также выяснении его роли в процессах нековалентного взаимодействия биомолекул с белковыми носителями. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Исследование процессов окисления BR и его комплекса с альбумином (BRBSA) в различных модельных системах, инициирующих свободные радикалы.

2. Выявление закономерностей в реакциях окисления тетрапиррольного пигмента, а также сравнение кинетических параметров реакций окисления в зави-

симости от природы и концентрации хромофоров и окислителей, белкового окружения, природы растворителя.

3. Квантово-химическое моделирование реакций окисления ВЯ в газовой и жидкой фазах, определение энергетически предпочтительных маршрутов реакций.

4. Изучение влияния присутствия ВЫ в молекуле альбумина на кинетические и термодинамические параметры связывания низкомолекулярных лигандов -аскорбиновой кислоты (АА), гидрохинона (Н2(3), урацила (и), 5-гидрокси-6-метилурацила (511), л<езо-тетракис-«-сульфофенилпорфина (Т8РР), борфторид-ного комплекса л1езо-метил-3,3',5,5'-тетраметил-4,4'-дисульфо-2,2'-дипирролилметена (ВСЮ1РУ) с белками.

Научная новизна. Впервые получены кинетические характеристики окислительных реакций билирубина в водных и неводных растворах под действием инициаторов неорганической и органической природы. Совокупность спектральных и кинетических данных, а также результатов квантово-химических расчетов, позволила установить, что в водных растворах образование биливер-дина и дипирролилметенов, как продуктов окислительной деструкции, энергетически менее предпочтительно, чем образование монопиррольных производных. Установлено влияние макромолекулярного комплексообразования билирубина с альбумином на кинетику реакций окисления - обнаруживается эффект «белковой защиты». Показано, что в реакциях совместного окисления билирубин ингибирует окисление аскорбиновой кислоты, в то время как замена витамина С на гидрохинон приводит к обратному эффекту.

Впервые установлена роль билирубина в составе альбуминового конъюга-та в процессах нековалентного взаимодействия биомолекул с белковыми носителями. Показано его влияние на кинетические и термодинамические параметры образования макромолекулярных комплексов биологически активных молекул (антиоксидантов, оснований РНК, олигопирролов) и белков. Установлено, что взаимодействие белков с низкомолекулярными лигандами носит неспецифический характер.

Практическая значимость. Полученные результаты вносят вклад в развитие химии олигопирролов в целом и химии билирубина и его аналогов. Понимание механизмов антиоксидантного и антирадикального действия билирубина позволит развить существующие и создать новые представления о биохимических функциях соединений на основе тетрапиррольной структуры. Полученные данные по окислению билирубина активными формами кислорода в водных и неводных растворах смогут найти применение при моделировании мембранных структур клетки, в особенности при условиях окислительного стресса, позволяя глубже понять процессы старения. Практическая значимость работы также во многом связана с необходимостью поиска новых технологий удаления избыточных количеств билирубина из биологических сред при гипер-билирубинемиях. Конкурирующие реакции окисления билирубина и других фоточувствительных пигментов во многом позволяют понять молекулярные механизмы фотодинамической терапии опухолевых заболеваний и лечения желтух. Выявленные закономерности в области влияния билирубина на физико-химические параметры связывания низкомолекулярных веществ с белками вносят вклад в формирование базы, необходимой для медицинской и супрамо-лекулярной химии. Полученные результаты используются в образовательном процессе при преподавании дисциплин «Основы координационной и супрамо-лекулярной химии», «Основы молекулярной биологии», «Химические основы жизни» студентам Ивановского отделения ВХК РАН.

Основные положения, выносимые на защиту. Кинетика индивидуального окисления билирубина и его альбуминового комплекса в водных растворах пероксида водорода, 2,2-а?о*шс(2-амидинопропан)а, системе Фентона. Кинетика совместного окисления ВЯ с АА и Н2С). Кинетика окисления ВЯ перок-сидом бензоила в органических растворителях. Квантовохимические моделирование процессов окисления В11 в части описания энергетики реакций. Результаты исследования влияния присутствия ВЯ в молекуле альбумина на кинетические и термодинамические параметры связывания низкомолекулярных лиган-дов - АА, Н2С>, и, 5и, ТБРР и В001РУ с белками.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на V Международной конференции по порфиринам и фталоцианинам «ICPP-5» (Москва, 2008); X Международной конференции по физической химии порфи-ринов и их аналогов «ICPC-10» (Иваново, 2009); XII Молодежной конференции по органической химии (Суздаль, 2009); VIII Всероссийской конференции с международным участием «Химия и медицина, ОРХИМЕД» (Уфа, 2010); VIII Школе-конференции молодых ученых стран СНГ по химии порфиринов и родственных соединений (Абхазия, Гагра, 2009); VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010); II Международной научной конференции «Новые направления в химии гетероциклических соединений» (Железно-водск, 2011); XIX Международном Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград, 2011); XVI Международной выставке химической промышленности и науки «Химия» (Москва, 2011); Международной молодёжной научной школе «Химия порфиринов и родственных соединений» в рамках фестиваля науки (Иваново, 2012); XIX Международном научном форуме студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2012), XXX Всероссийском симпозиуме по химической кинетике (Москва, 2012), II Всероссийской молодежной конференции «Успехи химической физики» (Черноголовка, 2013), XVth Conference on Heterocycles in Bioorganic Chemistry (Рига, 2013).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 140 страницах, содержит 24 таблицы, 60 рисунков, 3 схемы и состоит из введе-

ния, обзора литературы, экспериментальной части, основных результатов и выводов, списка цитируемой литературы, включающего 220 наименований цитируемых литературных источников.

Список сокращений и условных обозначений

АВАР — 2,2-азобмс(2-амидинопропан) Ala - аланин Arg — аргинин

Asp - аспарагиновая кислота BP - пероксид бензоила BR - билирубин

BRBSA — комплекс билирубина с бычьим сывороточным альбумином BS А - бычий сывороточный альбумин BV - биливердин

CQ — 2,3-дихлоро-5,6-дицианобензохинон DFT — теория функционала плотности Et — этил

Glu - глутаминовая кислота Gly — глицин

GSH, GSSG - восстановленная и окисленная димеризованная формы

глутатиона Hb - гемоглобин His - гистидин Ile - изолейцин Leu - лейцин Me - метил Р - пропил Pc - фикоцианин Phe - фенилаланин RISM - reference interaction site model Ser - серин ТРМ - трипиррол Тгр - триптофан Туг - тирозин Val - валин Vn - винил

АА - аскорбиновая кислота ГК (GA) - гематиновая кислота

ГЭБИ - 2-(2-гидрокси-3-этоксибензилиден)-1,3-индендион

ДГА - дегидроаскорбат

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДОФА - дигидрооксифенилаланин

ДПМ - дипирролилметен

ДФП (йРР) - диформилпиррол

МВМ (МУМ) - метилвинилмалеимид

НАДФ+ и НАДФН (ТЧАВР+, NADPH) - окисленный и восстановленный

никотинамидадениндинуклеотидфосфат РСА - рентгено-структурный анализ СР - свободные радикалы ФДТ - фотодинамическая терапия ЭСП - электронный спектр поглощения ЯМР — ядерно-магнитный резонанс

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Линейные олигопирролы, желчные пигменты и их аналоги: строение, биохимические и физико-химические аспекты

2.1.1. Структурное разнообразие желчных пигментов и их аналогов

Билирубин (от лат. bilis — желчь и ruber - красный) и его аналоги относятся к представителям семейства природных и синтетических соединений, большинство из которых имеют яркую окраску. Билирубин и его природные производные объединяют в группу «желчных пигментов» («bile pigments») — красящих веществ желчи - продуктов распада гемоглобина и других гемсодержащих белков животных организмов. К настоящему времени синтезировано и выделено из организма большое число соединений - структурных аналогов билирубина, объединяемых под общим названием «линейные олигопирролы». Этим указывается отсутствие циклизации в молекулах (в отличие от порфиринов, фта-лоцианинов и других макроциклических соединений на основе пиррольных циклов) и наличие в них преимущественно не более 4-6 пиррольных фрагментов. Наиболее распространенными представителями таких соединений являются дипирролилметаны, дипирролилметены, биладиены и билатриены, молекулы которых построены из двух или четырех пиррольных колец, соединенных, как правило, при помощи метинового и/или метиленового спейсеров, в отличие от структурно родственной группы соединений - полипирролов, в молекулах которых пиррольные циклы соединены напрямую [1] (рис. 2.1).

Переход от моно- и ди- к три- и тетрапиррольным структурам сопровождается усложнением их строения, а, следовательно, номенклатуры и функционала. Главными причинами столь широкого структурного разнообразия являются изомерия положения метиленовых (метановых) связей и изомерия расположения периферийных заместителей. Однако в природе реализуются не все возможные варианты, что обусловлено высокой структурной и стереоселектив-ностыо ферментативных реакций, лежащих в основе биосинтеза линейных тет-рапирролов. Кроме того, большое влияние на физико-химические свойства и биохимические функции линейных тетрапирролов оказывает конформационная изомерия.

Ме

НООС СООН

I I

Уп Ме (СН2)2 (СН2)2 ме Ме Уп

О N^1

I \

ЫН NH

Билирубин

'Ш О

-СН2-< У~СН2-1 сн2-

ЫН КН N11 N11

Билан

^ у=СН—(1 >—сн2-1 >—сн2-N ЫН N11

Билен-а

ЫН

1ГЫ

2,2 '-Дипирролипметен

-СН2-< >—СН=< Л СН ЫН КН N N4

Билен-Ь

СН2-< >—СН2^ > Ч Ь=СН-<. >—СН=Л ^У- СН2-N4 N11 Ш N N11 ]М' ЫН

Трипирран

Бшадиен-�