Теоретическое и экспериментальное исследование оптических эффектов в ориентированных биологических дисперсных системах тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

РГ6 од

- 8 ОКТ 1996

На правах рукописи

МЕЛЬНИКОВ Андрей Геннадиевич

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ОПТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ В ОРИЕНТИРОВАННЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ДИСПЕРСНЫХ СИСТЕМАХ

01.04.05-оптика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Саратов - 1996

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН)

Научный руководитель: кандидат физико-математических наук, вед. научн. сотр. Хлебцов Н.Г.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Тучин В. В.

кандидат физико-математических наук,

ст. научн. сотр. Аветесян Ю. А.

Ведущая организация: Институт радиотехники и электроники РАН, Саратовский филиал

Защита диссертации состоится

II

мин. на заседа-

нии диссертационного совета Д 063.74.01 в С'

Адрес: 410026, Саратов, ул. Астраханская, 83, Саратовский государственный университет.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке СГУ.

Автореферат разосла]

"7_ " СЛ-ш^О^ 199°)г-

Ученый секретарь диссертационного совета

Аникин В.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В исследованиях дисперсных систем различной природы широко используются методы, основанные на эффекте рассеяния света малыми частицами. Для биологических систем решающее значение имеет тот факт, что эти методы позволяют получать информацию о размере, концентрации, форме частиц и т.д. без серьезного препаративного вмешательства в систему. В этом состоит основное преимущество метода светорассеяния перед другими традиционными методами анализа, например, световой и электронной микроскопией (ЭМ).

В обычных условиях ориентация частиц дисперсных систем хаотична, поэтому измеряемые характеристики рассеянного света являются усредненными по всем ориентациям. С точки зрения обратных задач светорассеяния подобные системы в той или иной мере аналогичны суспензиям сферических частиц, определение эквивалентных параметров которых является целью анализа. При такой постановке проблемы форма частиц является фактором, усложняющим решение обратной задачи в терминах сферической модели. Однако ориентация, созданная внешним полем, приводит к возникновению специфических оптических эффектов и создает новые возможности в анализе дисперсных систем. Например, двойное лучепреломление (ДЛП) или дихроизм зависят от размера и формы частиц. Относительно легко измеряемым эффектом является изменение прозрачности, индуцированное внешним полем. Кроме определения геометрических и оптических параметров частиц, для упорядоченных систем появляется новый тип обратных задач - определение параметров взаимодействия частиц с ориентирующим полем. В частности, электрооптический эффект успешно применяется в физической химии коллоидов [Stoylov, 1991], биофизике микробных популяций [Мирошников и др., 1986], клинической иммунодиагностике [Сирота, 1978]. Однако интерпретационные модели, лежащие в основе этих методик, часто основаны на упрощенной трактовке рассеяния и ослабления света упорядоченными частицами дисперсных систем (приближения Релея и Релея-Дебая-Ганса (РДГ))- Таким образом, дальнейший прогресс в развитии теории и практики электрооптических методов во многом зависит от разработки и экспериментальной проверки более адекватных моделей оптического взаимодействия упорядоченных частиц с зондирующим световым излучением.

Среди разнообразных вариантов метода светорассеяния в неупорядоченных и ориентированных системах мы рассматриваем только вариант, основанный на измерении спектра прошедшего света. В первую очередь, выбор этого варианта метода связан с доступностью аппаратуры для большинства биологических и биофизических лабораторий. Это означает, что те или иные методики, отработанные в рамках научного исследования, имеют определенную перспективу реального практического использования.

Цель работы. Основное содержание диссертационной работы относится к исследованию спектральной прозрачности упорядоченных биологических дисперсных систем. Вместе с тем, целый ряд методических проблем, рассматриваемых в данной работе, тесно связан с известным методом исследования неупорядоченных взвесей - методом спектра мутности [Heller et al., 1964; Кленин и др., 1977]. В частности, это относится к учету малоугловых эффектов при измерении спектральной прозрачности грубодисперсных систем, оценке эффектов спектральной зависимости оптических констант частиц и дисперсионной среды, спектротурбидиметрии (CT) дрожжевых суспензий, разработке строгой оптической модели для золей золота и их конъюгатов со специфическими биомакромолекулами. Таким образом, в диссертации решались следующие задачи:

1. Разработка программного обеспечения для описания эффектов дихроизма, ДЛП и ориентационного турбидиметрического эффекта (ОТЭ) в суспензиях изотропных и анизотропных частиц с использованием:

а) метода интегрального уравнения (1ЕМ) для тензора рассеяния

б) приближений аномальной дифракции (АД) и РДГ

в) анизотропного варианта приближения АД.

2. Разработка пакета программного обеспечения для строгого расчета характеристик рассеяния сфероидов на основе метода Г-матриц.

3. Расчет ориентационных эффектов с использованием строгого Г-матричного подхода.

4. Разработка и испытание приставки к спектрофотометру "Бресогё М-40" для корректных измерений оптической плотности взвесей крупных частиц.

5. Экспериментальная проверка методики спектротурбидиметрического анализа (СТ-анализа) дрожжевых суспензий.

6. Экспериментальная проверка полидисперсного варианта метода спектра мутности с учетом спектральной зависимости оптических констант.

7. Экспериментальное исследование дихроизма и ОТЭ бактериальных и дрожжевых взвесей. Сравнение спектральных и полевых зависимостей ориентационных эффектов с данными теоретического анализа.

8. Компьютерное моделирование спектров ослабления коллоидного золота (метод Г-матриц) и сравнение с экспериментом в области размеров частиц 5-40 нм.

Научная новизна работы состоит в том, что с помощью численного моделирования исследована зависимость ориентационных оптических эффектов от геометрических и оптических параметров частиц и параметров их взаимодействия с ориентирующим полем. Показано, что полевые зависимости стационарных эффектов и релаксационные временные зависимости переходных эффектов в общем случае не совпадают с универсальными зависимостями релеевского приближения и могут быть использованы для решения обратных задач только на основе тщательного анализа оптических факторов.

Экспериментально доказана применимость приближения оптически мягких частиц для описания спектральной зависимости и зависимости от напряженности электрического поля ОТЭ и дихроизма в бактериальных и дрожжевых суспензиях.

Экспериментально доказана достоверность методики СТ-анализа дрожжевых суспензий (включая определение среднего размера, показателя полидисперсности и показателя преломления клеток) и варианта решения обратной задачи метода спектра мутности с учетом спектральной зависимости оптических констант и полидисперсности частиц.

Численным моделированием на основе метода Г-матриц найдена теоретическая модель для количественного описания экспериментальных спектров ослабления золей золота (5 - 40 нм) с учетом полидисперсности и полиморфности частиц, а также зависимости оптических констант от размеров частиц в нанометровом диапазоне.

Практическая значимость. Разработанная приставка для СТ-исследований к спектрофотометру "Бресогс! М-40" используется несколькими лабораториями ИБФРМ РАН при СТ-анализах микробных взвесей. Элементы программного обеспечения для расчета ориентационных оптических эффектов включены в разработку электрооптического спектротурбидиметра, выполняемую в рамках международного научно-технического проекта "ЕОБТ", финансируемого Министерством науки РФ. СТ-методика исследования дрожжевых суспензий использована при

разработке эффективных флоккулянтов для биотехнологии этих культур [Курмае-ва и др., 1989]. Пакет программного обеспечения, реализующий метод Г-матриц, использован при выполнении госзаказа Мин. науки РФ по разработке биоспецифических маркеров на основе конъюгатов коллоидного золота, а также для интерпретации экспериментов по деполяризации света, рассеянного фрактальными дымовыми кластерами сажи [Lu, Sorensen, 1994].

Достоверность результатов. Достоверность основных результатов теоретических расчетов подтверждена экспериментальными проверками для биологических дисперсных систем и совпадением с известными теоретическими результатами для предельных случаев.

На защиту выносятся следующие основные научные положения и результаты:

1. Программное обеспечение для расчета ориентационных оптических эффектов дисперсных систем, позволяющего адекватно описывать основные оптические эффекты в прошедшем свете для бактериальных и дрожжевых суспензий.

2. Пакет программного обеспечения с модульной структурой для метода Г-матриц и его адаптация к различным задачам оптики ориентированных и неупорядоченных дисперсных систем.

3. Модификация кюветного отделения спектрофотометра "Specord М-40", позволяющая корректно измерять спектральную прозрачность дисперсных систем с размером частиц до 5 - 6 мкм.

4. Результаты экспериментальной проверки методик СТ-анализа дрожжевых суспензий (включая определение их показателя преломления) и латексов (с учетом спектральной дисперсии оптических констант).

5. Теоретическая модель, включающая полидисперсность и полиморфность частиц, а также размерную зависимость оптических констант и строгий расчет по методу Г-матриц, позволяющей дать количественное описание спектров ослабления коллоидного золота в диапазоне размеров частиц 5-40 нм.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на: Всесоюзной конференции "Биофизика микробных популяций" - Красноярск, 1987; Г°а Всесоюзной конференции "Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем" - Велигож, 1990; 20"lh Meeting of the FEBS - Budapest (Hungary), 1990; VI International Symposium "Colloid and Molecular Electrooptics" - Varna (Bulgaria), 1991; International Symposium on Biomedical Optics "EUROPE'93" - Budapest (Hungary), 1993; а также на отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН.

Исследования по теме диссертации были частично поддержаны Государственной научной стипендией для молодых ученых России, а также Министерством науки и технической политики РФ, Российским фондом фундаментальных исследований (код проекта 94-03-09286) и Международным научным фондом Дж. Сороса (номер гранта RNROOO).

Публикации. Соискатель является соавтором 23 статей и одного изобретения, опубликованных в отечественной и зарубежной печати в процессе выполнения диссертации.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав и заключения, изложенных на 173 страницах, списка цитируемой литературы из 270 наименований на 25 страницах и приложения на 25 страницах, включает 5 таблиц и иллюстрирована 76 рисунками.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во Введении обосновывается актуальность темы работы и определяется круг основных вопросов, рассматриваемых в диссертации.

Первая глава представляет собой краткий анализ основных литературных результатов по оптике ориентированных дисперсных систем и методу спектра мутности. На основе этого анализа в конце главы формулируются нерешенные проблемы по теме диссертации и основные задачи исследования.

В соответствии с выбором предмета исследования - ориентированные биологические дисперсные системы - в данной работе основное внимание уделено оптическим эффектам в суспензиях однократно рассеивающих оптически мягких частиц, ориентированных внешним полем. При этом для описания собственно ориентаци-онного механизма используется классическая модель Ланжевена-Дебая, основанная на представлении о равновесном больцмановском распределении частиц по ориентациям в заданном силовом поле. Для электрооптического случая это описание сводится к использованию модели аксиально-симметричной частицы с индуцированным и собственным жестким диполем. Указанная модель приводит к аксиально-симметричным распределениям по ориентациям относительно направления, выделенного вектором ориентирующего поля. С практической точки зрения эта модель вполне адекватно описывает все экспериментальные ситуации для случаев ориентации электрическим, магнитным или гидродинамическим полем. Таким образом, предметом исследования становятся дихроизм, ДЛП и изменение прозрачности в суспензиях аксиально ориентированных частиц с вращательной симметрией. В качестве модели таких частиц использована модель сфероида (эллипсоида вращения).

Вторая глава диссертации посвящена обсуждению результатов расчета ориен-тационных оптических эффектов в суспензиях оптически мягких частиц. Для аксиально ориентированных взвесей все оптические характеристики прямо прошедшего света определяются тремя независимыми параметрами: оптическими толщинами Т| и т2 для света, поляризованного вдоль и поперек плоскости, содержащей

падающий луч и направление преимущественной ориентации, а также сдвигом фаз \|/ между этими нормальными модами. В случае однократного рассеяния эти параметры выражаются через амплитудную матрицу рассеяния вперед, концентрацию частиц и геометрическую длину пути света в суспензии [Хлебцов, 1988]. Рассматриваются следующие количественные характеристики ориентационных эффектов: дихроизм

Д = (т,-т2)/тх , двойное лучепреломление (ДЛП)

Дп = Яе(«, - п2) , ориентационный турбидиметрический эффект (ОТЭ) £»у =(ту-тх)/1х , V = 1,2,1/ , где 1Х есть оптическая толщина для хаотической ориентации, п{ и п2 - показатели преломления суспензии для двух направлений поляризации, связанные с реальной частью амплитудной матрицы рассеяния вперед, индекс V = и соответствует неполяризованному свету. Следует отметить, что для бактериальных и дрожжевых взвесей поляризационные эффекты (дихроизм и ДЛП) достаточно малы, в то время как ОТЭ легко измеряется даже при небольших степенях упорядоченности и не

требует, вообще говоря, использования поляризованного света. В наших экспериментах при исследованиях ОТЭ использовался неполяризованный свет, поэтому соответствующий параметр Dy помечается индексом "U". Для случая полной или

насыщенной (saturation) ориентации все параметры помечаются индексом "S".

Итак, для расчета перечисленных характеристик ориентационных эффектов необходимо выполнить следующее: 1) задать оптическую модель частиц и рассчитать амплитудную матрицу рассеяния вперед для произвольной ориентации частицы; 2) задать модель взаимодействия частиц с ориентирующим полем, определить их функцию распределения по ориентациям и выполнить необходимое ориентаци-онное усреднение оптических характеристик.

Усреднение по аксиальным ориентациям выполняли по "методу парциальных сечений" [Хлебцов, 1988], в котором используется естественное для аксиально-симметричных систем разложение функции распределения по ориентациям /(и) по полиномам Лежандра. При этом в окончательных расчетных формулах усредненные сечения (или элементы амплитудной матрицы) оказываются факторизованны-ми на мультипликативные сомножители, характеризующие механизм ориентации /„, и оптические парциальные вклады ("парциальные сечения") а„, соответствующие усреднению интегральных сечений по распределениям, задаваемым полиномами Лежандра Рп(о ). Для приближения оптически мягких частиц [Хлебцов, 1988], а также для метода Т-матриц [Mishchenko, 1991; Парамонов, 1994] парциальные вклады могут быть рассчитаны в замкнутом виде. Однако для метода Г-матриц аналитические выражения оказываются достаточно сложными, поэтому в наших программах парциальные вклады вычислялись по прямым интегральным соотношениям (один раз для заданной оптической модели) и затем многократно использовались для разных ориентационных моделей.

Основное преимущество метода парциальных сечений заключается в том, что одни и те же оптические характеристики используются в расчетах ориентационных эффектов для полностью ориентированных систем, систем с произвольной степенью ориентации и переходных процессов после выключения ориентирующего поля. В последнем случае парциальные сечения и коэффициенты f„ умножаются на факторы ехр[-2л(2„ + 1)Лг], где R - коэффициент вращательной диффузии частицы.

Учитывая специфику биологических дисперсных систем, для расчетов ориентационных эффектов использовали различные варианты приближения мягких частиц (РДГ, АД, IEM). Во второй главе приводятся основные расчетные формулы и результаты расчетов, полученные в этих приближениях. Исследуется зависимость параметров дихроизма, ДЛП и ОТЭ от размера, формы, показателя преломления, оптической анизотропии вещества для полностью ориентированных систем и для систем с упорядоченной ориентацией, описываемой распределением Больцмана. Показано, что в приближениях РДГ и IEM для полностью упорядоченных систем имеется характерная зависимость ориентационных эффектов от отношения размера к длине волны с максимумом в области х = Ъщ 1Х = 1 -н2 (oq - радиус сферы эквивалентного объема). Известное классическое соотношение теорий ДЛП и дихроизма («1 -пх)/(п2 -пх) = -2 выполняется только в релеевском пределе и нарушается для больших размеров частиц. Зависимость ориентационных эффектов от геометрических и оптических параметров больших частиц (приближение АД) оп-

ределяется комбинированным параметром фазового сдвига р = 2х(т-1 )(т - относительный показатель преломления). Характерной особенностью приближения АД является отсутствие зависимости ослабления и рассеяния света частицами от поляризации, поэтому единственным ориентационным эффектом в этом приближении будет изменение прозрачности или ОТЭ. Для описания анизотропных оптических эффектов (дихроизм и ДЛП) использовали поляризационную модификацию приближения АД [Мее1еп, 1982; Хлебцов, 1988]. Наибольший практический интерес представляли расчеты зависимости ориентационных эффектов от степени упорядоченности, т.е. от напряженности ориентирующего поля (полевые характеристики) и временные зависимости ориентационных эффектов после выключения поля (релаксационные характеристики). Известные теории [Бюу1оу е1 а!., 1991], основанные на релеевском приближении, предсказывают для этих случаев универсальные зависимости от поля или времени для малых частиц любого размера и формы. Наши расчеты, выполненные с учетом геометрических и оптических параметров частиц, показывают, что полевые и релаксационные характеристики в общем случае не являются универсальными, а зависят от указанных выше параметров частиц.

Основным преимуществом приближения мягких частиц является определенная простота расчетов, возможность исследования оптических характеристик систем частиц различной формы в широком диапазоне размеров и с учетом оптической анизотропии вещества частиц. Тем не менее, точность самих этих приближений должна быть проверена с помощью более строгих методов, допускающих точное решение оптической задачи для некоторых моделей. В частности, для изотропных сфероидов такую возможность предоставляет метод Г-матриц. Третья глава диссертации посвящена разработке программного обеспечения, реализующего этот метод. В этой главе приведены основные соотношения метода и описан пакет основных программ для расчета Г-матриц на персональных ЭВМ. На базе этого пакета были разработаны различные программы для расчета:

1) интегральных характеристик и матрицы Мюллера неупорядоченных систем;

2) ОТЭ, дихроизма и ДЛП систем несферических частиц с полной ориентацией и с произвольной степенью упорядоченности, заданной распределением Больц-мана;

3) спектров ослабления света полидисперсными и полиморфными золями золота. Следует отметить, что блочная организация разработанных программ позволяет легко проводить их адаптацию для любой конкретной задачи, что является важным свойством при работе с пакетами большой сложности.

Хотя сравнение результатов расчетов по строгим и приближенным методам является важным моментом для оценки адекватности последних, наибольший интерес представляет сопоставление теоретических расчетов с экспериментальными измерениями для реальных систем. Такое сопоставление проводится в четвертой главе диссертации. В качестве объектов исследования были выбраны бактериальные и дрожжевые суспензии, которые являются хорошей моделью для приближения мягких частиц.

Основные экспериментальные измерения выполняли на оригинальной однолу-чевой электрооптической установке [Хлебцов и др., 1989], включающей: галогенную лампу, схему формирования узкого параллельного цилиндрического пучка, монохроматор на интерференционных фильтрах, электрооптическую ячейку, генератор импульсов ориентирующего поля, фотоприемный блок с устройствами регистрации (запоминающий осциллограф С8-17 и цифровой вольтметр Щ1516). В качестве электрооптической ячейки использовали фотометрические кюветы с уста-

новленными в них золочеными или графитовыми электродами. Часть спектральных измерений ориентационных эффектов была выполнена на двухлучевом спектрофотометре "Specord М-40". Поскольку этот прибор имеет большой апертурный угол приема и не приспособлен для измерения оптической плотности рассеивающих дисперсных систем, была изготовлена и испытана специальная приставка для турбидиметрических измерений к этому спектрофотометру. В этой приставке исследуемая суспензия освещается сходящимся в горизонтальной плоскости световым пучком, который формирует изображение спектральной щели монохроматора в плоскости щелевой апертурной диафрагмы УФС-4. Апертурная диафрагма помещается на расстоянии порядка 14 см от плоскости входа пучка в кювету. Ширина пучка на входе в кювету ограничивается специальной диафрагмой. Апертурный угол фотоприема регулируется шириной раскрытия апертурной щели. Приближенное уравнивание интенсивностей рабочего и эталонного пучков производится с помощью жалюзного ослабителя. Разработанная приставка использовалась как для анализа неупорядоченных взвесей методом спектра мутности, так и для суспензий с ориентированными частицами. В последнем случае в эту приставку устанавливалась электрооптическая ячейка.

В качестве примера на рис. 1 приведены результаты измерений спектров ослабления суспензии (OD - оптическая плотность) дрожжевых клеток Candida lambica различных концентраций, выполненных в стандартном кюветном отделении спектрофотометра и с приставкой. Из результатов измерений с приставкой видно, что с хорошей точностью выполняется линейная зависимость ослабления от концентрации. Кроме того, при различных концентрациях, основная спектральная характеристика ослабления - волновой экспонент (w= -31ogOZ)/3IogX.), остается постоянной. Стандартный же вариант использования прибора "Specord М-40" для СТ-измерений оказывается совершенно неприемлемым. Детальные результаты испытания приставки приведены в начале пятой главы.

В экспериментальных исследованиях ориентационных эффектов использовали фиксированные глутаровым альдегидом (для повышения стабильности) культуры бактериальных Azospirillum Sp245 = Kl, Е. coli J-62 = K2, Bacillus polimyxa = КЗ и дрожжевых Candida lambica ВНБ-579 = K4 клеток, отмытых и диспергированных в бидистиллированной воде.

Ориентация клеток в электрооптической ячейке осуществлялась с помощью переменного электрического поля напряженностью до 140 В/см, возбуждаемого пачкой низкочастотных импульсов типа меандр (частота от 5 до 40 Гц). При этом направление пучка света было перпендикулярно направлению преимущественной ориентации.

С/С,,

Рис. 1. Концентрационная зависимость оптической плотности для взвеси Candida lambica в воде, измеренная для трех длин волн с приставкой (-) и без нее (---).

К 0-

е-

<

в •

т_т_г

т.

~г

0.20 0.16 0.12 0.08 ■0.04 3

а

0.00 -0.04 -О.ОЙ -0.12

Рис. 2. Зависимость изменения коэффициента пропускания ДТу (I, 2) и параметра

(3, 4) от оптической толщины для дисперсий К1(1, 3) и К4 (2, 4). Точки - измерения в неполяризованном свете X = 810 (1, 3) и 400 нм (2, 4), полная ориентация в поле меандра 40 Гц.

V. см"1- 10"3

1.5 20 25 И

5-0.18 О

-0.20 --0.22 -0.24 --0.25

0.8 оУ~ Х.мки

Рис. 3. Экспериментальная спектральная зависимость ОТЭ Иц^ для водных дисперсий К3(1,2) и К4(3). 1 - теоретический расчет для модели КЗ: Оо=0.84 мкм, е = 4.7,

п = 1.40, р0 = 1.48 ; 3 - для К4: 0$ = 2.26

мкм, е = 2, « = 1.40, утах= 22600 см"1

(данные морфометрии и СТ); 2 - расчет с учетом дисперсии п.

Мы начнем обсуждение результатов измерений с концентрационной зависимости изменения прозрачности АТ$ для полностью ориентированных клеток К1 и К4. Теоретический анализ [Хлебцов и др., 1990] предсказывает следующую зависимость изменения прозрачности от оптической толщины тх: Д7$ =

ехр(-т-ДехрС-Д^т .<)-!]. Эта зависимость имеет характерный экстремум при хх =1 независимо от размера и формы частиц. На рис. 2 приведены результаты концентрационных измерений (в терминах оптической толщины) параметра ОТЭ и абсолютного изменения прозрачности Д7^. Теоретические зависимости А7у от тх показаны сплошными линиями. Расчет параметра в приближении АД с учетом данных морфометрии и СТ дает значение -0.115 для К1 (увеличение пропускания Г в ориентированном состоянии) и +0.2 для К4 (уменьшение Т). Эти значения очень хорошо совпадают с данными измерений в разбавленных дисперсиях (рис. 2, кривые 3,4). Если перестроить экспериментальные кривые 1, 2 в координатах Д77 ДГтах = /(тл), то

они дадут одну, практически универсальную кривую с максимумом при тл=1. Полученный вывод имеет

важное значение для оптимизации соотношения сигнал/шум в экспериментах с ориентированными частицами. Приводимые ниже данные получены, как правило, при оптимальной концентрации клеток.

На рис. 3 приведены теоретические и экспериментальные спектральные зависимости ОТЭ (параметр

при насыщенной ориентации клеток КЗ и К4. Вертикальные линии показывают среднеквадратическую ошиб-

10

\

\

ку в параллельных опытах. Теоретическая кривая 1 построена для модели (КЗ): dg = 0.84 мкм, показатель преломления клеток п = 1.40, фактор формы (осевое отношение) е - 4.7, фазовый сдвиг сферы эквивалентного объема р0 =1.48 (при X =500 нм), полученной по данным СТ и морфометрии. За исключением коротковолновой части спектра, согласие между теорией и экспериментом удовлетворительное. Расхождение между расчетом и измерениями можно связать с дисперсией п(Х), не учтенной в простейшей модели. На кривой 3 рис. 3 представлены результаты измерений Dus для дисперсии К4 (сверху дана шкала волновых чисел v = 1 / X для этого эксперимента). Теоретическая кривая 3 хорошо описывает не только изменение знака Dus вблизи волнового числа v » 16000 см-1, но даже абсолютные значения Dy^ ■ Отклонения экспериментальных значений от теоретических в коротковолновой части спектра связаны, вероятно, с малоугловыми искажениями и, возможно, дисперсией п(Х).

Экспериментальная спектральная зависимость дихроизма для клеток К2 представлена на рис. 4 (темные значки). Ис- 7 пользуя независимо измеренные геометрические параметры клеток и из- 6 вестные из литературы значения показателей преломления [Хлебцов и др., « 5 1990], мы рассчитали теоретическую — спектральную зависимость дихроизма <♦в приближении РДГ (кривая 1). Несмотря на известную структурную неоднородность клеток, расчет для модели изотропного однородного сфероида дает очень хорошее согласие с измерениями спектральной зависимости ори-ентационного дихроизма. Если даже не ,

придавать большого значения слиш- „ . _ ,мк"

Рис. 4. Спектральная зависимость пара-ком хорошим количественным совпа- r г

дениям (в силу известной неопределен- метР°в дихроизма Ai (1) и Dv (2) для дис-НОСТИ в п), ТО все равно качественное Персии E.coli J-62. Разными значками обо-

поведение Дс(Л) удается описать со- значе"ы Результаты независимых измере-°х ' J нии. Пунктирные кривые - расчет по моде-

вершенно корректно. На этом же ри- ди. ^=0.636 мкм, е = 15 (морфомегрия), сунке мы приводим спектральную зависимость параметра Dus , измерен- п = ' ^ "о = ^ ■

ную в неполяризованном свете. Интересно отметить парадоксальный на первый взгляд результат: для клеток КЗ с фактором формы е = 4.7 экспериментальное значение Dus = -0.165 (при X = 400нм) практически совпадает со значением Dus = -0.16 (при X = 400нм) для клеток К2 с фактором формы е= 2.5. Объяснение этого результата следует из разработанной теории в приближении АД. Согласно этой теории, в области р0 <3 ориентационный эффект, возрастает по модулю с увеличением фактора формы, но убывает с ростом р0 . Поэтому как расчет, так и

\ \ 2 к

Ч ; în

2.0 2.4 1-1......-1

-1.8

о ,.73 Q

эксперимент дают для менее крупных и менее несферических клеток К2 то же значение Dus , что и для более крупных и более несферичных клеток КЗ.

Зависимость оптических эффектов от напряженности ориентирующего поля (так называемые полевая характеристика) широко используется в физической химии коллоидов, биофизике, микробиологии. Однако результаты, получаемые для одних и тех же объектов разными методами, часто не согласуются между собой. Причина подобных расхождений заключается в некритическом использовании выводов теории малых частиц для интерпретации экспериментов с дисперсиями, частицы которых заведомо не удовлетворяют условиям релеевского рассеяния. Теоретические расчеты показывают, что в области выполнения закона Керра угловой коэффициент зависимости ориентационного эффекта от напряженности поля становится функцией геометрических и оптических параметров частиц. Это означает, что для нахождения важнейшего параметра физической химии дисперсных систем - поверхностной поляризуемости [Stoylov, 1991] - необходимо сравнивать абсолютные экспериментальные и теоретические значения эффекта или проводить нормировку с учетом параметров частиц.

На рис. 5 приведены полевые характеристики для культур К.2 и КЗ. Измерения

выполнены в неполяризованном свете X = 400 нм в поле меандра частотой 40Гц. Определение анизотропии электрической низкочастотной поляризуемости Ду проводили следующим образом. Поведение Dy в слабых полях с хорошей точностью следует закону Керра, и экспериментальный наклон в координатах lg|Z)(/|-lg£ равен 2.1 . Используя данные морфометрии мы рассчитали зависимость Dy от параметра ориентационного взаимодействия [Хлебцов и др., 1989] q2 (отношение ориентационной энергии к энергии теплового движения) и сопоставили ее с прямой Dy = const£2 в слабых полях. Отсюда была найдена связь между q2 и Е2 (прямые 3,4) и рассчитана анизотропия электрической поляризуемости 41-10~28Ф-м2 для культуры К2 и 4010~27Ф-м2 для КЗ. После определения Ду можно сопоставить измеренную и рассчитанную полевые зависимости Dy от напряженности поля или безразмерного параметра q2. На рис. 5 мы приводим первый вариант (сплошные кривые 1,2). Согласие теоретических и экспериментальных зависимостей не только по форме кривой, но и по абсолютным значениям ориентационного эффекта указывает на адекватное описание данной теорией изменения прозрачности суспензии клеток в электрическом поле.

42

Рис. 5. Экспериментальная зависимость параметра Иу от напряженности электрического поля Е (1,2- точки) и зависимость Е2 от д2 (3, 4) (определение Ду ) для

дисперсий К2 (точки 1, 3) и КЗ (точки 2, 4); кривые 1,2- теоретический расчет.

В заключительной части этой главы представлены результаты измерения спектральной зависимости ориентационного дихроизма полностью ориентированных бактериальных клеток К2, диспергированных в воде, и сравнение с результатами теоретических расчетов по IEM и метода Г-матриц (Extended Boundary Condition Method - ЕВСМ).

Экспериментальные результаты приведены на рис. 6 вместе с теоретическими кривыми 1,2 (IEM) и 3,4 (ЕВСМ), рассчитанными для двух значений фактора формы е = 22,25. Отметим, что IEM дает завышенные значения дихроизма, в то время как ЕВСМ дает отличное согласие с экспериментальными значениями А$(к). Таким образом, моделирование клеток изотропным однородным сфероидом позволяет правильно описать такой "тонкий" эффект, как спектральная зависимость консервативного дихроизма.

Интересно отметить, что переход от IEM к обычному приближению тационного дихроизма для клеток Е. coli в пгтр /„„„„„„ о „„„„„„,„ „ „„„„„„„ воде. Теоретические кривые вычислены по РДГ (кривая 5), приводит к гораздо 1Ш * ЕВСМ J М0рф0м<ггриче-

лучшему согласию с экспериментом. *

Этот результат довольно парадокса- ских параметров: q, = 650 мкм; е= 22(1,

лен, т.к. в области слева от спектраль- 3), 2.5 (2, 4); т = 1.05. Штриховая линия 5 -ного максимума консервативного вычисления по РДГ (т 1), е = 22. дихроизма (х<2) приближение РДГ

дает заведомо худшую точность, чем IEM. Можно предположить, что для больших х происходит компенсация ошибок различной физической природы и результаты РДГ довольно близки к точным. Именно это, вероятно, и объясняет совпадение данных РДГ и эксперимента на рис. 4.

Пятая глава диссертации посвящена экспериментальной проверке разработанных методик СТ-анализа дисперсных систем. Первая из этих методик относится к спектротурбидиметрии дрожжевых суспензий. Определение среднего размера, числовой концентрации и биомассы клеток основано на измерении абсолютной величины и спектрального положения максимума ослабления. Необходимым элементом этой методики является независимое определение показателя преломления клеток. Для СТ-определения показателя преломления клеток был предложен следующий подход [Хлебцов, Мельников, 1987]. По спектрам ODiy), полученным для серии иммерсионных сред, рассчитывается волновой экспонент для выбранного V . Поскольку с увеличением показателя преломления иммерсионной среды щ параметр р убывает, то волновой экспонент должен быть возрастающей функцией

Hq. По значению w и формуле p = 3(2-w)"2 [Хлебцов, 1980] находим функцию р(/Ц)), график которой представляет собой прямую линию, пересекающую ось абсцисс В ТОЧКе Hq ~ П клеток. Угловой коэффициент этой прямой равен 4na^v и может быть использован для определения размера клеток. Иммерсионная среда должна

o.ia o.io а.Ь oio X ,fj,m

Рис. 6. Спектральная зависимость ориен-

Рис. 7. Зависимость фазового сдвига и волнового экспонента от показателя преломления иммерсионной среды Пц (водные

растворы ПЭГ-2000) для взвеси Candida lambica.

быть прозрачной, нетоксичной, обладать показателем преломления не ниже 1.38, низкой вязкостью и малым осмотическим эффектом. Последние два требования противоречат друг другу, так как вязкость увеличивается с ростом молекулярной массы, а осмотическое давление - уменьшается. Всему комплексу условий удовлетворяют низкомолекулярные (2000 - 6000) растворы полиэтиленгликоля (ПЭГ)- На рис. 7 представлены результаты определения п дрожжевых клеток Candida lambica по предложенному методу. Значение п = 1.402 согласуется с данными независимого определения размера и с литературными данными [Koga, Fujita, 1961; Пришивалко, 1973].

Вторая методика относится к спек-тротурбидиметрии полидисперсных

систем с учетом спектральной зависимости показателя преломления [Хлебцов, Мельников, 1992]. Для экспериментальной проверки этой методики использовали монодисперсные латексы фирмы "Balzers Union" (Австрия) В 8010 020 08 и В 8010 020 09, применяющиеся как тест-объекты для ЭМ. Согласно паспортным данным фирмы, диаметр частиц сферической формы равен 91±3нми 312±2нм соответственно. Кроме того, использовали полистирольные латексы НТК "Метрология", аттестованные с помощью ЭМ и имеющие средние диаметры 76, 460 и 780 нм. Для исключения эффектов многократного рассеяния, а также концентрационных эффектов измерения спектров ослабления проводили для трех концентраций (последовательные разведения) и трех геометрических толщин слоя (1, 2 и 5 см). Для повышения точности фотометрирования мы использовали одну и ту же кювету, жестко фиксированную в приставке, для записи нулевых точек (вода) и спектров ослабления латексов. Пучок сравнения использовался только для ориентировочного уравнивания оптической схемы с помощью жалюзного ослабителя. Запись спектров проводили в цифровом режиме на 9 длинах волн с равномерным логарифмическим шагом в диапазоне 459.5 - 664.2 нм при фиксированной ширине спектральной щели 50 см-'. Ширина и высота апертурной щели выбирались таким образом, чтобы малоугловые эффекты были пренебрежимо малы.

Результаты исследования монодисперсных латексов показали, что с учетом предложенных модификаций метод спектра мутности можно использовать как простой экспрессный тест метрологического контроля среднего размера, не уступающий в точности ЭМ. Эффекты полидисперсности изучали на специально приготовленном полидисперсном образце (средний диаметр 76 нм) и на модельных бимодальных смесях монодисперсных латексов. Мы пришли к выводу, что средний размер, определяемый как корень квадратный из отношения шестого момента к четвертому, достаточно точно находится по монодисперсной сферической калибровке волнового экспонента.

Заключительная часть пятой главы посвящена исследованию спектральных свойств коллоидного золота. Теоретические спектры ослабления (обусловленные, в основном, поглощением) рассчитывали по методу Г-матриц с учетом полидис-

персности по размерам, полиморфное™ по факторам формы и зависимости оптических констант от размера металлических частиц нанометрового диапазона. Золи золота с диаметром частиц от 5 до 40 нм были синтезированы в нашей лаборатории по нескольким методикам [Богатырев и др., 1993]. Экспериментальные спектры ослабления регистрировали с помощью приставки в диапазоне 350 - 850 нм. Концентрация золота во всех золях была постоянной и равной 57 мкг/мл, толщина слоя 1 см. Точность определения величины и положения максимума экстинкции составляли ±0.002 и ±0.5 нм соответственно. По результатам ЭМ анализа полидис-перность частиц моделировали нормальным распределением с полушириной а , a полиморфность - равномерным распределением по осевым отношениям удлиненных частиц с верхней границей фактора формы, зависящей от размера. Отметим, что форма частиц не слишком сильно отличалась от сферической. Положение максимума ослабления очень критично к выбору спектральной зависимости оптических констант массивного золота. Мы использовали 5 экспериментальных наборов подобных зависимостей: Gl - [Hagemann, 1974], G2 - [Schulz, 1954], G3 - [Irani, 1971], G4 - [Otter, 1961], G5 - [Römer, 1961], а также кубический сплайн G1-4, построенный по константам Gl - G4.

Размерная зависимость оптических констант моделировалась в виде поправки к диэлектрической проницаемости е(м). Эта поправка записывалась в виде разности двух друдевских вкладов с объемным и размерно-зависимым временем свободного пробега электронов. При этом использовали три модели: нулевая поправка (модель 1), размерная модификация только мнимой части е(<а) [Борен, Хафмен, 1986] (модель 2) и размерная модификация реальной и мнимой части е(ш) (модель 3).

Основные результаты этих исследований сводятся к следующему (рис. 8). В области размеров частиц меньше 10 нм использование объемных констант (модель 1) или модифицированных по модели 3 принципиально не согласуется с экспериментальными измерениями зависимости положения максимума экстинкции от размера

Длина волны, нм Средний размер частиц, нм

Рис. 8. Спектр ослабления золя (размер частиц 5 нм, концентрация золота 57 мкг/мл (а) и

зависимость длины волны максимума ослабления Хтах от диаметра золотых частиц (б). 1 -экспериментальные данные. Расчет для монодисперсных сферических частиц (2), сфероидов с распределением только по факторам формы (5) и с распределением по факторам формы и размерам: а =0.3-4, а =0.1 -5. Использованы оптические константы <34(модель 2).

частиц. Наилучшее теоретическое описание этой зависимости достигается при использовании набора оптических констант модифицированного по модели 2, а также с учетом полидисперсности и полиморфности частиц (рис. 86). Эта же обобщенная модель обеспечивает хорошее воспроизведение полного спектра ослабления в диапазоне 350 - 800 им (см. пример на рис. 8а и подробнее работу [22] из списка публикаций).

Мы получили также сглаженные аналитические экспериментальные калибровки для быстрого определения среднего размера частиц золя по положению максимума экстинкции и определения количества восстановителя, необходимого для получения частиц заданного размера.

ВЫВОДЫ

1. С помощью численного моделирования исследована зависимость ориентаци-онных оптических эффектов от геометрических и оптических параметров частиц и параметров их взаимодействия с ориентирующим полем. Показано, что полевые зависимости стационарных эффектов и релаксационные временные зависимости переходных эффектов в общем случае не совпадают с универсальными зависимостями релеевского приближения и могут быть использованы для решения обратных задач только на основе тщательного анализа оптических факторов.

2. Экспериментально показано, что оптическая плотность дрожжевых взвесей не зависит от степени упорядоченности клеток при длине волны около 600 им (точка нулевого турбидиметрического эффекта). В красной области (к > 600 нм) упорядоченные взвеси более прозрачны, чем хаотические, а в коротковолновой области - наоборот. В целом спектральная зависимость прозрачности упорядоченных дрожжевых и бактериальных взвесей описывается приближением аномальной дифракции.

3. Экспериментально показано, что для неупорядоченных дрожжевых взвесей размер, числовая концентрация и биомасса дрожжевой взвеси могут быть определены из положения и величины максимума оптической плотности В(Хтах), измеренных с помощью разработанной приставки для турбидиметрических измерений. Предложена и экспериментально апробирована методика определения показателя преломления крупных клеток на основе измерения спектров ослабления в серии иммерсионных сред.

4. Экспериментально показано, что для полистирольных латексов с диаметром

частиц менее 100 нм волновой экспонент (В~ ) имеет сверхрелеевское значение №>4, которое не связано с эффектами многократного или кооперативного рассеяния, а объясняется спектральной зависимостью оптических констант. Экспериментально проверена методика решения обратной задачи с учетом спектральной дисперсии оптических констант и показано хорошее согласие с данными электронной микроскопии.

5. Экспериментально показано наличие перегиба в спектральной зависимости положения максимума ослабления от размера золотых частиц в области размеров менее 10 нм. Этот перегиб не может быть объяснен в рамках теории Ми с объемными оптическими константами частиц. Показано, что физическая природа перегиба связана с ограничением времени свободного пробега электронов в золотых частицах нанометрового диапазона.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г. Спектротурбидиметрия дрожжевых суспензий // Журн. прикл. спектр. -1987. -Т.47, №5. -С.807-810.

2. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г., Давыдова М.В., Шварцбурд Б.И. Спектро-турбидиметрический метод изучения дрожжевых суспензий // Прикл. биохим. мик-робиол. -1988. -Т.24, №4. -С.581-586.

3. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г. Теория двойного лучепреломления в приближении физической оптики // Журн. прикл. спектр. -1989. -Т.50, №6. -С.977-983.

4. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г., Богатырев В.А., Сирота А.И. Дихроизм ориентированных дисперсий в приближении физической оптики // Журн. прикл. спектр. -1989. -Т.51, №1. -С.99-105.

5. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г. Оптические эффекты в ориентированных дисперсных системах. 1. Стационарный дихроизм в дисперсиях мелких и крупных частиц // Опт. и спектр. -1989. -Т.67, №2. -С.389-394.

6. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г. Оптические эффекты в ориентированных дисперсных системах. 2. Дихроизм аксиально ориентированных дисперсий мягких анизотропных частиц, сравнимых с длиной волны света // Опт. и спектр. -1990. -Т.68, №1. -С.237-238.

7. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Мельников А.Г., Сирота А.И. Оптические эффекты в ориентированных дисперсных системах. 3. Экспериментальное исследование электрического дихроизма в биологических дисперсиях // Опт. и спектр. -1990. -Т.68, №1. -С.238.

8. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г. Оптические эффекты в ориентированных дисперсных системах. 4. Стационарная теория ДЛП в дисперсиях с аксиальной симметрией // Опт. и спектр. -1990. -Т.68, №1. -С.238-239.

9. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Мельников А.Г., Сирота А.И. О дипольном моменте бактериальных клеток // Биофизика. -1990. -Т.35, №1. -С.173.

10. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Мельников А.Г., Сирота А.И. Дихроизм бактериальных суспензий в электрическом поле // Журнал прикл. спектр. -1990. -Т.52, №6. -С.978-983.

11. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г. Теория дихроизма ориентированных дисперсий анизотропных частиц // Коллоидн. журн. -1990. -Т.52, №5. -С.928-934.

12. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г. Двойное лучепреломление в дисперсных системах, ориентированных внешним полем // Коллоидн. журн. -1990. -Т.52, №6. -С.1147-1153.

13. Хлебцов Н.Г., Никифоров В.В., Мельников А.Г., Меркулова Т.К., Сердобин-цев JI.H. Спектроскопия упругого рассеяния растворов капсульного белка чумного микроба // Биополимеры и клетка. -1990. -Т.6, №2. -С. 81-87.

14. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г., Щеголев С.Ю. Спектротурбидиметрия дисперсных систем с учетом дисперсии показателя преломления // Коллоидн. журн. -1991. -Т.53, №5. -С.928-933.

15. Khlebtsov N.G., Melnikov A.G. Integral equation for light scattering problems: application to the orientationally induced birefringence of colloidal dispersions // J. Colloid Interface Sei. -1991. -Vol.142, №2. -396-408.

16. Khlebtsov N.G., Melnikov A.G., Bogatyrev V.A. The linear dichroism and birefringence of colloidal dispersions: approximate and exact approaches // J. Colloid Interface Sei. -1991. -Vol.146, №2. -P.463-478.

17. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г. Спектротурбидиметрия полидисперсных систем с учетом спектральной дисперсии оптических констант // Журн. прикл. спектр. - 1992. -Т.56, №3. -С.435-440.

18. Khlebtsov N.G., Melnikov A.G., Bogatyrev V.A., Sirota A.I. The orientational optic effects in colloidal systems: aproximate and exact approaches // Colloid and Molecular Electro-Optics / B.R.Jennings, S.P.Stoylov, Eds. - Bristol and Philadelphia: IOP Publ. -1992. -P. 13-20.

19. Khlebtsov N.G., Melnikov A.G., Shchyogolev S.Yu., Bogatyrev V.A., Sirota A.I. Anisotropic and spectral properties of biological scattering objects with the ordered particle orientation // Proc. SPIE, -1993. -Vol.2082. -P.33-42.

20. Khlebtsov N.G., Melnikov A.G. Structure factor and exponent of scattering by polydisperse fractal colloidal aggregates // J. Colloid Interface Sci. -1994. -Vol.163, №1. -P.145-151.

21. Хлебцов Н.Г., Богатырев B.A., Дыкман JI.А., Мельников А.Г. Оптические свойства коллоидного золота и его конъюгатов с биоспецифическими макромолекулами // Коллоида, журн. -1995. -Т.57, №3. -С.412-423 (поправка: Коллоида, журн. -1996. -Т.58, №1. -С.144).

22. Хлебцов Н.Г., Мельников А.Г. Деполяризация света, рассеянного фрактальными дымовыми кластерами: приближенная анизотропная модель // Опт. и спектр. -1995. -Т.79, №4. -С.656-661.

23. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Мельников А.Г. Спектральные свойства коллоидного золота. // Опт. и спектр. -1996. -Т.80, №1. -С.128-137.

24. Щеголев С.Ю., Игнатова Е.Н., Кладиев А.А., Мельников А.Г., Вишневецкая О.А. Способ определения резистентности мембранных структур. // Авторское свидетельство №4023383/28-14.