Трансформация углеводородного загрязнения в почве под действием биодеструкторов

Матвеева, Ольга Николаевна

Трансформация углеводородного загрязнения в почве под действием биодеструкторов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

Матвеева, Ольга Николаевна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Иркутск МЕСТО ЗАЩИТЫ

2006 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.03 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Трансформация углеводородного загрязнения в почве под действием биодеструкторов»

Автореферат диссертации на тему "Трансформация углеводородного загрязнения в почве под действием биодеструкторов"

На правах рукописи

Матвеева Ольга Николаевна

ТРАНСФОРМАЦИЯ УГЛЕВОДОРОДНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ В ПОЧВЕ ПОД ДЕЙСТВИЕМ БИОДЕСТРУКТОРОВ

02.00.03 - Органическая химия 03.00.16-Экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степей" кандидата химических наук

Иркутск - 2006

Работа выполнена на кафедре органической химии химического факультета Иркутского Государственного университета

Научные руководители: кандидат химических наук,

доцент Пройдаков Алексей Гаврилович

доктор биологических наук, профессор Стом Дэвард Иосифович

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор

Каницкая Людмила Васильевна

доктор химических наук, профессор Корчевин Николай Алексеевич

Ведущая организация: Институт химии нефти СО РАН,

г. Томск

Защита диссертации состоится 18 января 2006 года в 10 часов па заседании диссертационного совета Д 212.074.06 при Иркутском Государственном университете по адресу: 664033, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 126, химический факультет ИГУ.

С диссертацией можно ознакомился в научной библиотеке ИГУ.

Отзывы на автореферат высылать по адресу: 664003, Ирку1ск-3, ул. К. Маркса, 1. ИГУ, Учёному секретарю диссертационного совета Эдельштейн O.A.

Автореферат разослан 16 декабря 2005 г

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Эдельштейн O.A.

¿м?бА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Нефть и продукты её переработки - основные источники загрязнения окружающей среды. Попадая в почву, нефтепродукты резко ухудшают её агрофизические и агрохимические свойства. Разработка способов очистки почвы от загрязнения углеводородами нефти - одна из важнейших задач при решении проблемы снижения антропогенного воздействия на окружающую среду.

В настоящее время наиболее перспективным методом для очистки нефтезагрязненных почв, как в экономическом, так и в экологическом плане является биотехнологический подход, основанный на использовании различных групп микроорганизмов, обладающих повышенной способностью к биодеградации нефтей и продуктов её переработки.

Изучение процессов биологической трансформации углеводородов нефти является фундаментальной основой для разработки теоретических основ и осуществления процессов биоремедиации нефтезагрязнённых территорий. Биологическую трансформацию органических соединений можно рассматривать как ряд сложных химических процессов, общих для животного и растительного мира. Известно большое количество работ, посвященных трансформации углеводородов микроорганизмами, однако, результаты, полученные различными авторами, противоречивы и неоднозначны. Поэтому установление путей превращения доминирующих компонентов нефти при биологическом воздействии является весьма актуальным и представляет несомненный практический интерес.

Трансформация любых органических загрязнений в почве в природных условиях происходит под действием комплекса организмов, включающего представителей разных трофических уровней. Дождевые черви являются одним из важнейших компонентов агроценозов различных почвенных зон и важнейшим фактором, определяющим плодородие почв, и формирование её агрофизических характеристик. На основании известной высокой эффективности использования дождевых червей для переработки различных сельскохозяйственных и бытовых отходов целесообразно было изучить эффективность биотрансформации нефтепродуктов, восстановления плодородия почв и, прежде всего её агрофизических свойств при совместном применении для биоремедиации нефтеразрушающих микробиологических препаратов и дождевых червей.

Цель работы: Изучение основных закономерностей процесса биотрансформации углеводородов, моделирующих отдельные классы соединений и нефть в целом, под действием микробиологических препаратов и дождевых червей.

Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи: определить токсичность углеводородов различных классов и товарных нефтепродуктов для олигохет;

- установить основные закономерности и возможные пути

трансформации алифатических

дождевого червя и микробиологического препарата «Деворойл» при раздельном и совместном внесении;

проанализировать динамику и установить возможные пути трансформации нафтеновых и нафтеново-ароматических углеводородов под воздействием коммерческого микробиологического препарата «Деворойл»;

охарактеризовать количественные изменения содержания нефти, происходящие в процессе ее трансформации под воздействием дождевого червя и коммерческого микробиологического препарата «Дестройл» при раздельном и совместном внесении, и оценить происходящие при этом изменения токсичности и агрофизических свойств почв;

- оптимизировать условия проведения процесса комплексной биодеградации как отдельных углеводородов, так и нефти в целом под воздействием нефтеокисляющих микроорганизмов и дождевых червей;

оценить перспективы применения и возможную роль дождевых червей для трансформации углеводородного и нефтяного загрязнения и рекультивации почв, а также совместного использования коммерческих нефтеокисляющих препаратов и дождевых червей.

Научная новизна. Впервые показано, что при совместном использовании микробиологических препаратов («Деворойл», «Дестройл») и дождевых червей происходит существенная интенсификация процессов биодеградации нефти и углеводородов в почве. Комплексное использование методов спектроскопии ЯМР на ядрах 'Н и |3С, ИК- и УФ- спектроскопии, ГЖХ позволило установить изменения качественного и количественного состава доминирующих классов углеводородов нефти, происходящие в процессе их биотрансформации и установить структуры некоторых промежуточных продуктов.

На основании результатов спектроскопии ЯМР 'Н и |3С экстрактов почв, загрязнённых алифатическим углеводородом и обработанных нефтеокисляющим препаратом «Деворойл» (раздельно и совместно с червями), доказано образование ненасыщенных триглицеридов, определены некоторые детальные особенности их строения (длина углеродной цепи кислотных остатков и местоположение двойных связей).

Установлены динамика количественных и качественных изменений, происходящих при трансформации циклических углеводородов под воздействием микробиологического препарата «Деворойл». Впервые экспериментально установлена структура промежуточных продуктов биотрансформации декалина и тетралина, на основании чего была предложена обобщённая схема их биотрансформации.

Практическая значимость работы. На основе проведённых исследований предложен принципиально новый биотехнологический высокоэкологичный метод очистки и рекультивации углеводород- и нефтезагрязнённых почв с использованием бинарной системы биодеструкторов (дождевые черви - нефтеокисляющие микробиологические препараты) и определены возможности его практического использования. Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (Гранты № 99-04-49612, № 02-04-49976, № 05-04-97237 и Научно-технической программы

Минобразования России - проект 477).

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на Международном симпозиуме: «Россия -Германия: история, культура, наука» (Иркутск, 1999), Международной, научно-практической конференции «Экология речных бассейнов» (Владимир, 1999), конференции «Проблемы экологии» (Иркутск, 2000), Всероссийском научно-практическом молодёжном симпозиуме «Экология Байкала и Прибайкалья» (Иркутск, 2000), межрегиональном рабочем совещании «Проблемы биоремедиации в XXI веке» (Красноярск, 2002), IV и V Межд. конференциях «Химия нефти и газа» (Томск, 2000 и 2003).

Публикации. Результаты исследований опубликованы в 13 печатных работах (в том числе 3 статьи).

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 таблицами и 13 рисунками. Работа состоит из введения, 3 глав, выводов и списка цитируемой литературы включающего 183 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность исследования, сформулированы цель и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе представлен обзор литературы, в котором обобщены результаты по изучению влиянию углеводородного и нефтяного загрязнения на почвенные экосистемы, проведена оценка эффективности различных способов очистки почв от углеводородов и нефтепродуктов, представлены основные механизмы биодеградации нефти и нефтяных углеводородов, а также сравнительные характеристики методов определения качественного и количественного состава нефтяного загрязнения.

Во второй главе описаны объекты, материалы и методы исследований.

В работе использованы:

- микробиологический препарат «Деворойл», разработанный институтом Микробиологии АН России и НПП «Биотехинвест». В составе препарата -штаммы культур родов Rhodococcus, Pseudomonas и Yarowia.

- микробиологический препарат «Дестройл», производимый Бердским заводом биопрепаратов, полученный на основе культуры Acinetobacter sp.

- красный калифорнийский червь Eisenia andrei (Bouché, 1972) (многими авторами трактуется как подвид Eisenia fétida andrei).

Для получения модельного углеводородного загрязнения в лабораторных условиях в подготовленные образцы почвы вносили определенное количество углеводородов; для получения нефтяного загрязнения - нефть Марковского месторождения Иркутской области.

Для всех экспериментов проведены контрольные опыты (без внесения биодеструкторов).

Пробы экстрагировали хлороформом по методу Грефе. Количественный компонентный состав экстрактов, полученных из образцов углеводород-

загрязнённой почвы анализировали методом газожидкостной хроматографии.

Количественное содержание нефти в экстрактах нефтезагрязнённой почвы оценивали методом УФ-спектрофотометрии.

Структурно-групповой состав экстрактов определяли методом ИК-спектроскопии.

Определение количественного фрагментного состава экстрактов проводили на основе результатов их изучения методом спектроскопии ЯМР на ядрах 'Н и !3С (Vanan VXR-500S).

Для биотестирования в качестве тест-объектов использовали семена редиса. Критерием токсичности служили численность проросших семян и длина проростка. Для статистической обработки полученных данных пользовались общепринятыми методами.

В 3 главе приведены полученные экспериментальные результаты и их обсуждение.

Токсичность различных классов углеводородов и нефтепродуктов для дождевых червей

Проведена оценка влияния различных концентраций нефти, нефтепродуктов и их индивидуальных ингредиентов на дождевых червей: красного калифорнийского гибрида дождевого червя и дождевого червя Eisenia fétida. Критерием токсичности служила выживаемость.

Для исследуемых олигохет составлены ряды токсичности для товарных нефтепродуктов (8 наименований) и индивидуальных углеводородов (23 наименования). Согласно полученным данным олигохеты показали невысокую резистентность к нефтепродуктам. Минимально действующая концентрация товарных нефтепродуктов колебалась в пределах от 1 мл/кг (авиационный керосин ТС-1) до 80 мл/кг (мазут), а для углеводородов от 0,28; 0,26; 0,24 моль/кг (нонан, декан, ундекан, соответственно) до 0,00001 моль/кг (нафталин).

Несмотря на то, что абсолютные значения данных токсикометрии для красного калифорнийского гибрида и дождевого червя для некоторых углеводородов и товарных нефтепродуктов несколько варьировались, соотношение их величин оставалось постоянным. Исходя из этого, далее для всех экспериментов по модельной биодеградации углеводородов и нефти использовали красный калифорнийский гибрид дождевого червя.

Трансформация алифатических углеводородов.

Среди различных классов углеводородов алифатические углеводороды наиболее легко подвергаются биотрансформации. В тоже время именно гексадекан чаще всего используется при изучении биотрансформации углеводородов, поскольку является типичным компонентом углеводородного загрязнения большинства почвенных зон.

Количественные характеристики процесса биотрансформации гексадекана красным калифорнийским гибридом и биопрепаратом

В лабораторных условиях изучена трансформация гексадекана (ГД) в почве при внесении микробиологического препарата «Деворойл» и дождевых червей,

а также проведена количественная оценка трансформации вггесённого в почву гексадекана, обусловленной действием аборигенной микрофлоры (контрольный опыт). Результаты приведены на рис. 1. Исходное содержание гексадекана - 0,14 моль/кг почвы.

При внесении дождевых червей снижение содержания ГД в почве (время экспозиции 15 суток) практически соизмеримо с контролем, и составило не более 34,4% (рис. 1).

Процесс трансформации ГД в почве и уменьшение его содержания при внесении микробиологического препарата «Деворойл» происходил значительно быстрее и эффективнее, чем в контрольном опыте (рис. 1). При этом скорость превращения углеводорода в исследуемых образцах в значительной степени зависела от концентрации вносимого препарата.

При использовании 64-1010 кл/кг препарата на 5 сутки экспозиции отмечалось снижение количества гексадекана только на 22%, в то время как уменьшение концентрации более чем на 90% от исходного отмечено лишь на 15-е сутки эксперимента

Внесение биопрепарата в количестве 96-1010 и 128-1010 кл/кг способствовало значительному снижению содержания ГД в образцах почвы на 91% уже на 5 сутки.

время экспозиции, сутки

-*-1 -т-2 --3 -"-4 -*- 5 -*-6

Рис. 1. Изменение содержания ГД при раздельном внесении биодеструкторов (влажность 30%) (1- контрольный образец, без внесения биодеструкторов; 2- дождевые черви; 3- микробиологический препарат «Деворойл» 32-Ю10 кл/кг; 4- «Деворойл» 64-Ю10 кл/кг; 5- «Деворойл» 96*10 кл/кг; 6- «Деворойл» 128-Ю10 кл/кг).

Дальнейшее увеличение времени эксперимента не приводило к заметному увеличению степени биотрансформации гексадекана при внесении этих количества препарата.

Изменение содержания гексадекана в почве при внесении комплекса биодеструкторов, состоящего из нефтеокисляющих микроорганизмов и дождевых червей при различной влажности представлены на рис. 2 и 3.

Интенсификация процесса биотрансформации ГД на 5 сутки при совместном использовании дождевых червей и различных концентраций микробиологического препарата наиболее значительна при относительно низких концентрациях биопрепарата на начальной стадии эксперимента. Наибольший синергический эффект проявляется для опытов 3, 4 (рис. 2) на начальной стадии эксперимента, достигая 17% и 8% на 5 и 10 сутки при концентрации «Деворойл» 321010 и 64-Ю10 кл/кг, соответственно. Синергический эффект уменьшается с увеличением концентрации биопрепарата и полностью нивелируется при увеличении времени экспозиции.

Максимальная активность биологического препарата «Деворойл» в отношении ГД отмечена на 15 сутки эксперимента, при этом достигалось снижение концентрации ГД на 95% при концентрации препарата 64-1010 кл/кг. При комплексном использовании биопрепарата и червей снижение концентрации ГД более чем на 85% достигалось уже на 10 сутки эксперимента при всех испытанных концентрациях биопрепарата.

-•-1 -ш-2 -*-3 -*-4 -*- 5

Рис. 2. Изменение содержания ГД при совместном внесении биодеструкторов (влажность 30%). (1- контрольный образец; 2-микробиологический препарат «Деворойл» 32'1010 кл/кг+ дождевые черви; 3- «Деворойл» 64-1010 кл/кг + дождевые черви; 4- «Деворойл» 96-1010 кл/кг + дождевые черви; 5- «Деворойл» 128'10>0 кл/кг + дождевые черви)

При влажности 50% (рис. 3) для комплекса биодеструкторов максимум углеводородокисляющей активности достигался на 15 сутки эксперимента. Дождевые черви интенсифицируют трансформацию гексадекана при концентрации Деворойла 32-Ю10 кл/кг и 64-10 кл/кг. Повышение влажности почвы способствует более эффективной трансформации ГД только на 5 сутки эксперимента, т.е. можно отметить, что изменение влажности (в изученных пределах 30-50%) не оказывает существенного влияния на эффективность биологической трансформации гексадекана под воздействием комплекса биодеструкторов м икробиологический препарат «Деворойл» - дождевые черви.

Таким образом, стимулирующее действие красного калифорнийского гибрида на элиминирование гексадекана проявлялось при внесении микробиологического препарата в концентрации 32-10 кл/кг и 64-1010 кл/кг, независимо от влажности среды. При дальнейшем увеличении содержания препарата этот эффект нивелировался, возможно, вследствие его токсичности для дождевых червей.

Рис. 3. Изменение содержания ГД при совместном внесении биодестукторов (влажность 50%). (1- контрольный образец, без внесения биодеструкторов; 2- микробиологический препарат «Деворойл» 32-Ю10 кл/кг+ дождевые черви; 3- «Деворойл» 64-Ю1 кл/кг + дождевые черви; 4-«Деворойл» 96,10|° кл/кг + дождевые черви; 5- «Деворойл» 128-Ю10 кл/кг + дождевые черви)

Качественные характеристики, идентификация и выявление структурных особенностей продуктов трансформации гексадекана

А. Трансформация гексадекана в почве под воздействием «Деворойл»

Для экстрактов образцов углеводородзагрязнённых почв получены количественные спектры 'Н и 13С ЯМР, на основании которых рассчитаны параметры фрагментного состава, характеризующие основные изменения, происходящие в процессе трансформации алифатических углеводородов.

При использовании биопрепарата «Деворойл» как раздельно, так и совместно с дождевыми червями, в спектрах ЯМР 'Н зафиксированы следующие характерные группы сигналов, большинство из которых принадлежит триглицеридам, содержащим различные ацильные остатки насыщенных и ненасыщенных карбоновых кислот (далее - кислотные остатки):

• 0,8 - 0,9 м.д. - протоны терминальных метальных групп в различных кислотных остатках и в исходном гексадекане (М);

• 1,2- 1,3 м.д. - протоны метиленовых групп исходного гексадекана, а также удалённые от двойных связей и сложноэфирного фрагмента на две и более метиленовые группы в различных кислотных остатках (Ь);

• 1,3 - 1,4 м.д. - протоны метиленовых групп при (3-углеродньгх атомах от двойных связей в ненасыщенных кислотных остатках (К);

• 1,6-1.8 м.д. - протоны метиленовых групп, находящихся при ¡3-углеродных атомах от карбоксильных фрагментов кислотных остатков (1);

• 2,0 - 2,1 м.д. - протоны метиленовых групп, находящихся при а-углеродных атомах к двойным связям в ненасыщенных кислотных остатках (О);

• 2,3 - 2,4 м.д. - протоны метиленовых групп, находящихся при а-углеродных атомах к карбоксильным фрагментам кислотных остатков (Р);

• 2,7 - 2,8 м.д. - протоны метиленовых групп, расположенных между двумя двойными связями в ненасыщенных кислотных остатков (Е);

• 4,1 - 4,3 м.д. - два дублета дублетов с ХС 4,29 и 4,14 м.д. и константой спин-спинового взаимодействия 4,4 Гц, 6,0 Гц, 11,9 Гц - попарно неэквивалентные протоны СН2-групп глицеринового фрагмента (С, О);

• 5,3 м.д. - мультиплет С-Н протон глицеринового фрагмента (В);

• 5,4 м.д. - сложный мультиплет протонов олефиновых фрагментов ненасыщенных кислотных остатков (А).

На рис. 4 приведена обобщённая структура триглицеридов и их модельный спектр ЯМР 'Н, в котором проведено отнесение химических сдвигов характеристичных сигналов.

Сигналы в В, С и О характерны для протонов глицеринового фрагмента. Мультиплетный сигнал в области 5,4 м.д. соответствует олефиновым фрагментам с эрЗ- гибридизованными заместителями, тогда как мультиплет 5,3 м.д. с характерной спиновой АА'ВВ' системой и два дублета дублетов (4,29 и 4,14 м.д.) на основе констант спин-спинового взаимодействия (4,4 Гц, 6,0 Гц, 11,9 Гц) и спектров модельных соединений отнесены к структуре глицеринового фрагмента.

Характеристичность протонных спектров для кислотных остатков триглицеридов заключается в проявлении неперекрывающихся мультиплетных сигналов -СН2 групп при а- и р~ уг леродных атомах к карбоксильной группе (Б и Д, соответственно), а присутствие в них ненасыщенных фрагментов подтверждается присутствием в спектрах сигналов протонов при двойных связях (А), а гакже протонов при а-углеродном атоме к двойной связи (в) и находящихся между двумя двойными связями (Е). Такая детальная информация

в принципе позволяет количественно оценить соотношение образующихся насыщенных и ненасыщенных кислотных остатков.

На основании изучения экстрактов почвы, загрязнённой гексадеканом и обработанной биопрепаратом «Деворойл», методом спектроскопии ЯМР 'Н, были рассчитаны некоторые наиболее характеристичные параметры фрагментного состава (таблица 1).

Как следует из приведённых в таблице результатов, с увеличением количества вносимого биопрепарата наряду с увеличением степени конверсии ГД происходит накопление триглицеридов (увеличение относительного содержания протонов В, С, Б).

I А] 1А1 1А1 1АI

101 О н н н н

Ы(Р) 1Л (Ы 1К) 10) I I 1Е1 I I 101 ПО Ш —СН^СН,—(СН,)т—СН,—СН,—С—С—СН2—С=С—СНг-СНз-СН,-

0 н н н н

IB) Н— !—О-0-(ОН,)7-[—=1—СН,—с=]!-¡СН,)Т-С«,

о н н н н

IC) Н—!—О-С-(СН,) —СН, -(СН, 1-СН,

101

(1.1 Ш1 ,—СН,—СН,

ррт

Рис. 4. Спектр ЯМР *Н и отнесение сигналов модельного триглицерида

Общее количество ненасыщенных кислотных остатков в составе экстрактов

увеличивается как с увеличением концентрации препарата, так и при увеличении длительности эксперимента, о чем свидетельствует увеличение относительного содержания протонов при двойных связях (А), находящихся при а-углеродном атоме к двойной связи (в) и между двумя двойными связями (Е).

В начальный период времени при сравнительно низких концентрациях биопрепарата преобладают моноеновые кислотные остатки. Значения величины отношений интенсивностей сигналов ((=-СН2-=)/(=СН)-(=-СН2-=)), характеризующее отношения диеновых и моноеновых фрагментов кислотных остатков минимальны (таблица 1). С увеличением времени эксперимента и концентрации биопрепарата относительное количество диеновых кислотных остатков увеличивается по сравнению с моноеновыми, достигая предельных значений 0,6-0,7.

Следует однако отметить, что с увеличением длительности эксперимента степень ненасыщенности кислотных остатков уменьшается при увеличении количества вносимого биопрепарата, поскольку увеличение относительного содержания фрагмента (СН2)аС=0 происходит значительно быстрее, чем накопление ненасыщенных фрагментов примерно в 1.5- 2.0 раза (соотношение величин =СН / (СН2)аС=0 уменьшается, таблица 1).

Детальная характеристика образующихся соединений проведена с использованием спектроскопии ЯМР 3С.

В спектре экстрактов почвы, загрязнённой ГД, обработанной микробиологическим препаратом «Деворойл» наблюдались следующие сигналы, характеристичные для триглицеридов с ацильными остатками насыщенных и ненасыщенных карбоновых кислот:

• 14,1 м.д. - сигналы атомов углерода метальных групп;

• 22,7 м.д. и группа сигналов в области 29,0 -31,0 м.д. - сигналы атомов углерода метиленовых линейных фрагментов, удалённых более чем на 2 связи от двойных связей и карбоксильных групп;

• 25,7 м.д. - сигналы атомов углерода СН2 групп, находящихся между двумя двойными связями;

• 32,6 м.д. - сигналы атомов углерода СН2 групп, находящихся в а-положении к двойным связям;

• 34,2 и 24,9 м.д. - сигналы атомов углерода СН2 групп в а- и р-положениях относительно карбоксильных групп, соответственно; 1

• 62,2 и 69,1 м.д. - сигналы атомов углерода СН2 и СН групп глицеринового фрагмента, соответственно (соотношение интенсивностей этих сигналов составляет 2:1);

• в области 127,5 - 131,5 м.д. - группа сигналов соответствующих атомам углерода двойных связей в различных ненасыщенных кислотных остатках;

• 172,8 и 173,2 м.д. - сигналы атомов углерода карбоксильных групп, находящихся при СН2 и СН группах глицеринового фрагмента, соответсвенно (соотношение интенсивностей этих сигналов составляет 2 : 1);

Таблица 1

Параметры фрагмектного состава и их соотношения из спектров ЯМР 'Н экстрактов почвы, загрязнённой гексадеканом, при внесении биологического препарата «Деворойл»

Хим ' Фрагментный состав, % отн. Содержание ГД, % от исходного О и о ^ (Ч а: о Й Т гч тч х ~ о д || ас

м.д. Образец X о и е; ж и к о II гч ж о и О II и ж и и и и ^ гч и О и О <ч ж о л £ о ас и

5,4 5,3 4,1-4,3 | 2,7-2,8 2,3-2.4 2,0 - 2,1 1,6- 1,8 1,2-1,3 0,8 - 0,9

5 сутки

32х1010 2.0 0.2 0.7 0.4 1.1 2.9 1.1 76.4 15.2 88.6 1.36 0.25

64x1010 3.8 0.6 2.3 1.4 3.5 4.8 3.5 65.3 14.8 78.9 1.08 0.59

96x10'° 6.3 0.9 3.6 2.0 5.3 8.8 5.3 54.9 12.9 72.2 1.00 0.48

10 сутки

32x10'° 3.0 0.3 1.1 0.8 1.6 1.8 1.6 74.5 15.3 73.6 1.25 0.36

64x10'° 3.9 0.4 1.5 1.6 3.3 4.8 3.3 66.2 15.0 51.2 1.18 0.71

96x10'° 6.8 0.7 2.7 2.7 6.7 8.8 4.7 54.2 12.7 37.7 0.87 0.67

15 сутки

32x1010 4.0 0.3 1.1 1.1 1.7 3.2 1.7 70.4 16.4 65.6 1.47 0.38

64x10'° 6.4 1.1 4.3 2.4 6.0 7.9 6.0 53.7 12.2 37.4 0.78 0.59

96x10'° 7.7 1.3 5.3 2.9 8.3 9.5 8.3 44.0 12.7 4.2 | 0.75 0.59

Независимо от природы диенового фрагмента сигналы карбоксильных групп и глицеринового фрагмента практически неизменны. Детальное отнесение сделано на основании различия химических сдвигов атомов углерода двойной связи.

В области двойных связей проявлялась широкая гамма сигналов со значениями ХС, соответствующих как одиночным двойным связям, так и диеновым фрагментам- 127,81; 128,04; 128,14; 128,26; 128,35; 128,46; 128,62; 128,77; 128,88; 129,26; 129,54; 129,77; 129,80; 130,0; 130,13; 130,24 и 130,52 м.д.

Установлено, что длина цепи и положение двойных связей в кислотных остатках различны:

- в моноеновых фрагментах двойные связи находятся в 6,7,8,9,10 и 11 положениях и длина цепи кислотного остатка - С11(6,7), С 12(6), С 14(8), С 16(7,10), С 18(6,7,8,9,10,11);

- в диеновых фрагментах остатков ненасыщенных кислот предполагается наличие двойных связей в следующих положениях 5-8, 9-12, 13-16, 6-10, 8-12, 10-14, 9-13, 7-10, 11-14, 5-9, 7-11, длина кислотного остатка - С14(5-8), С16(7-10), С 18(5-9, 6-10, 7-11, 8-12, 9-12, 9-13, 10-14), С20(11-14) и С22(13-16), преобладают двойные связи в цис-конфигурации.

Длина цепи идентифицированных кислотных остатков составляла С11-С22 атома углерода, с преобладанием кислотных остатков с числом атомов углерода в цепи С18, однако их суммарное относительное количество незначительно и существенно меньше, чем кислотных остатков с числом атомов углерода С16. Преобладают кислотные остатки с чётным числом атомов углерода, положение двойных связей носит стохастический характер, но все они удалены от карбоксильной группы более чем на 4 атома углерода.

Накопление триглицеридов в процессе трансформации ГД при внесении микробиологического препарата «Деворойл» также подтверждено результатами ИК-спектроскопии.

Б. Трансформация гексадекана в почве под воздействием дождевых червей

В спектрах 'Н ЯМР экстрактов углеводород- загрязнённой почвы при внесении дождевых червей и червей совместно с биопрепаратом «Деворойл» зафиксирован ряд сигналов со значениями ХС. 3,9 и 3,5 м.д., которые очевидно соответствуют метиленовой группе в а-положении к кислороду карбоксильной группы сложного эфира и метиленовой группе в а-положении к гидроксильной группе спирта (3,5 м.д.)

Следует отметить, что максимальное накопление продуктов трансформации, образующихся под воздействием олигохет и извлекаемых хлороформом составляет не более 3,1% на 20 сутки эксперимента.

В. Трансформация гексадекана в почве под воздействием комплекса «Деворойл» - дождевые черви

Наряду с группами сигналов, отмеченных ранее при оценке трансформации гексадекана биологическим препаратом «Деворойл» (протоны, характеризующие глицериновый фрагмент и кислотные остатки триглицеридов, в спектрах 'Н ЯМР экстрактов углеводород- загрязнённой почвы при внесении комплекса биодеструкторов микробиологический

препарат «Деворойл» - дождевые черви , зафиксирован также ряд уширенных сигналов со значениями ХС. 3,5 и 3,9 м.д., наблюдавшихся при внесении червей, которые очевидно соответствуют метиленовой группе в а-положении к кислороду карбоксильной группы сложного эфира (3,9 м.д.) и метиленовой группе в а-положении к кислороду I идроксильной группы (3,5 м.д.).

С увеличением количества вносимого биопрепарата при комплексном внесении биодеструкторов наряду с увеличением степени конверсии ГД происходит накопление триглицеридов (увеличение относительного содержания протонов В, С, Б). Однако, накопление триглицеридов в сравнении с одиночным использованием биопрепарата (при равном количестве последнего) происходит менее эффективно. При примерно равной степени превращения гексадекана количество зафиксированных триглицеридов (по соотношению сигналов СН2гл/СН3) значительно меньше.

Г. Изменения фитотоксических свойств почв, загрязнённых гексадеканом под воздействием микробиологического препарата «Деворойл» и дождевых червей

Результаты, полученные при изучении фитотоксичности образцов почв, загрязнённых гексадеканом при внесении микробиологического препарата и дождевых червей позволяют судить о положительном эффекте внесения биодеструкторов на восстановление агротехнических свойств углеводородзагрязённной почвы.

При внесении гексадекана в почву рост семян подавляется, по сравнению с контрольным опытом, причём уменьшается как длина проростка, так и количество проросших семян (длина проростка составила 26,9%, а количество проросших семян составило 11,8% от контрольного опыта). На 15 сутки при использовании различных концентраций биопрепарата значения длины проростка и количества проросших семян значительно меньше в сравнении с образцами, в которые вносили дождевых червей. Наилучшие показатели отмечались при совместном использовании биодеструкторов, при этом происходило значительное увеличение длины проростка (соответствующее значение на 40,8-43,0% больше, чем в контрольном опыте). Показатель численности проросших семян оказался в данном случае менее чувствительным.

Д. Трансформация органического вещества почвы под воздействием биодеструкторов

Так как все эксперименты, представленные в этой работе, проводились с использованием почвы, которая является сложной динамической системой, оказывающей существенное влияние на процессы жизнедеятельности почвенных организмов, были изучено влияние использованных биодеструкторов на органическое вещество почвы. Суммарный выход веществ, экстрагируемых хлороформом, составлял не более 0,05% (вес). Изменения параметров фрагментного состава из спектров ЯМР !Н органического вещества почвы под воздействием дождевых червей и микробиологического препарата «Деворойл» соизмеримы с контрольным опытом, и в дальнейшем не рассматривались.

Биодеградация бицитическихуглеводородов

Экспериментально полученные значения максимально недействующих концентрации бициклических углеводородов (5,2 *10"3 моль/кг декалина, 7,3 * 10"4 моль/кг тетралина, 1 * 10"5 моль/кг нафталина) позволяют считать эти соединения высокотоксичными для дождевых червей. Данное обстоятельство ограничивает возможность применения олигохет для восстановления почв, загрязнённых циклическими углеводородами. В дальнейшем детально рассмотрен процесс трансформации декалина и тетралина с применением коммерческого микробиологического препарата «Деворойл». Для тетралина и декалина использовались концентрации 0,14 моль/кг почвы.

Количественные характеристики процесса биотрансформации нафтеновых углеводородов биопрепаратом «Деворойл»

В спектрах ЯМР'Н экстрактов почв, загрязнённой декалином, и обработанных микробиологическим препаратом «Деворойл» на 5 сутки экспозиции наряду с сигналами остаточного декалина наблюдались сигналы продуктов его трансформации: 1,2-дегидродекалина и тетралина, образующегося очевидно, вследствие его последовательного дегидрирования (табл.2). При более длительном культивировании (20 суток) происходило дальнейшее дегидрирование (образование нафталина и образование кислородсодержащих продуктов: а-окситетралина и тетралона-1. При этом в почве оставались следы исходного декалина (не более 2%Хтаблица 2).

Продуктов непосредственного окисления (гидроксилирования) декалина (окси-декалинов и декалинонов) не обнаружено. Очевидно, это может быть обусловлено специфичностью действия ферментативных систем микроорганизмов, входящих в состав биопрепарата «Деворойл», так и тем, что перечисленные промежуточные продукты не накапливаются вследствие высокой склонности к последующим превращениям.

Количественные характеристики процесса биотрансформации нафтеново-ароматическихуглеводородов биопрепаратом «Деворойл»

Анализ данных ЯМР-спектроскопии и ГЖХ позволил установить, что биотрансформация тетралина под действием микробиологического препарата «Деворойл» сопровождается накоплением следующих соединений: а-окситетралина, тетралона-1 и нафталина.

Важно отметить, что тетралин подвергался процессам трансформации под воздействием аборигенной микрофлоры почвы (без внесения биопрепарата). Процесс превращения составляет 10 и 64% за 5 и 20 сутки эксперимента, соответственно. Однако, при внесении биологического препарата «Деворойл» отмечалась существенная интенсификация процесса трансформации тетралина, превращение которого на 5 сутки эксперимента составляло более 79% (табл. 3).

Качественные характеристики полученных продуктов по спектрам ЯМР 'Н, аналогичны приведённым в таблице 2.

Таблица 2

Количественный состав и качественные характеристики (из спектров ЯМР *Н) продуктов биотрансформации декалина_

Соединение Формула Характеристичный хим. Сдвиг Содержание, %

1 .Декалин, биопрепарат (5 сутки) (остаточный декалин -95%)

1,2-дегидродекалин 5,1 м.д.(Н„) 5,4 м.д.(Нв) 3%

тетралин 2,8 М.Д. (На) 1,6 м.д. (Не) <1%

2. Декалин, биопрепарат (20 сутки) (остаточный декалин ~2%)

1,2-дегидродекалин 5,2 М.Д.(На), 5,4 м д.(Нв) <1%

тетралин 2,9 М.Д. (На) 1,6 м.д. (Не) 60%

а-окситетралин 4,8 м.д. (Н„), 7,3 м.д. (Н„) 4%

тетралон-1 Цг 2,9 м.д.(На) 2,5 м.д (Ну) 18%

нафталин Но. Но. 7,7 м.д. (Н„) 7,3 м.д. (Не) 15%

Согласно полученным результатам накопление а-окситетралина практически не происходит, поскольку очевидно, что его окисление (дегидрирование), как вторичного спирта, происходит значительно быстрее, чем тетралина и тетралона. Тетралон, вследствие своей более стабильной структуры, накапливается в среде культивирования в значительных количествах.

Таблица 3

Количественный состав продуктов биотрансформации тетралина

Соединение

Контрольный опыт

5 сутки

Биопрепарат «Деворойл»

20 сутки

Контрольный опыт

Биопрепарат «Деворойл»

тетралин

90%

21%

36%

н/о

тетралон-1

66%

48%

н/о

а-окситетралин нафталин

4% 8,7%

6% 10%

н/о н/о

Качественные характеристики трансформации циклических соединений

На основании полученных результатов, может быть предложена общая схема биотрансформации декалина и тетралина, поскольку последний является одним из основных промежуточных продуктов в процессе трансформации декалина (рис. 5).

В соответствии со схемой, которая подтверждается наличием в спектрах ЯМР 'Н характеристичных сигналов промежуточных продуктов (табл. можно отметить следующие основные этапы процесса.

1. Дегидрирование декалина с образованием 1,2-дегидродекалина (1,9-, 2,3- и 9,10 - дегидродекалины в спектрах ЯМР 'Н не обнаружены). В дальнейшем также протекают процессы дегидрирования (очевидно через промежуточный продукт 1,2,3,4-тетрадегидродекалин, который в спектрах не обнаружен, очевидно, вследствие того, что его последующее дегидрирование протекает со значительно большей скоростью, чем дегидрирование самого декалина и 1,2 дегидродекалина) с образованием тетралина. Следует особо отметить, что на данном этапе не образуются продукты окисления, как самого декалина, так и промежуточных соединений.

Рис. 5. Общая схема биотрансформации декалина и тетралина под воздействием микробиологического препарата «Деворойл»

2. Дальнейшая трансформация тетралина происходит по двум направлениям: дегидрирование и окисление. При этом в результате дегидрирования образуется исключительно продукт 1,2-дегидротетралин, который в дальнейшем превращается в нафталин.

3. Образование 1-окситетралина возможно как в результате прямого окисления

тетралина (реакция идет исключительно по Са к ароматическому кольцу), так и в результате гидратации 1,2-дегидротетралина. В последующем 1-окситетралин окисляется до тетралона-1. Причем накопления продукта 1-окситетралина не происходит (его содержание всегда менее 10%), вследствие легкости его дальнейшего окисления.

Деградация нефти при внесении микробиологического препарата «Дестройл» и дождевых червей

В опытах для изучения модельной биодеградации использовалась нефть Марковского месторождения (скв. 8). Нефть характерного для месторождений Иркутской области состава - метано-нафтеновая (содержание метано-нафтеновых углеводородов - 69.6%, нафтеново-ароматических - 27.5%, смол -2,88%, асфальтены не обнаружены).

Как видно результатов, приведённых на рис. 6 добавление в загрязненную нефтью почву червей, и в большей степени микробиологического препарата активизировало процессы превращения и элиминирования нефти в исследуемых почвах. По мере увеличения продолжительности экспериментов наблюдали значительное снижение содержания нефти при совместном действии красного калифорнийского червя и препарата "Дестройл" по сравнению с действием биодеструкторов порознь. Особенно чётко это проявлялось на 40 сутки эксперимента, когда наблюдали заметное снижение влияния отдельно внесенных дождевых червей и микробиологического препарата.

В экспериментах с внесением червей отмечали повышение структурированности почвы, ее скважности. Это, без сомнения, должно благоприятствовать аэрации и улучшать водный режим почвы, тем самым способствовать физико-химическим и микробиологическим процессам разрушения нефти. Подобное заключение, а также интенсификация переработки нефтезагрязненных почв при внесении наряду с препаратом "Дестройл" дождевых червей, подтверждается и увеличением толщины слоя копролитов - комочков земли пропущенных через кишечник червя. Отмечено также значительное увеличение коэффициента структурности и содержания агрономически ценных фракций почвы (3 - 0,5 мм ) при внесении комплекса биодеструкторов, без сомнения, определяет эффективность восстановления агрофизических свойств почвы (в частности её водный и воздушный режим).

Воздействие на нефтезагрязненные почвы бинарной системы, представленной организмами двух трофических уровней, способствует и ее рекультивации.

При совместном влиянии микробиологического препарата и красного калифорнийского червя, более эффективно происходило снижение фитотоксичности водных вытяжек из почвы, в которую добавляли нефть, в сравнении с результатами контрольных опытов (без внесения био деструкторов).

Таким образом, проведенные исследования показали, что комплекс биодеструкторов, состоящий из представителей двух трофических уровней -

нефтеокисляющего микробиологического препарата "Дестройл" и дождевых червей, способствовал более эффективной трансформации нефти и рекультивации нефтезагрязнённой почвы, при максимально эффективном снижении её фитотоксичности.

—♦—дождевые черви —"Дестройл"

—л— "Дестройл" + дождевые черви

—и—контроль (почва, загрязнённая нефтью, без внесения биодеструкторов)

Рис 6. Изменение содержания нефти при внесении биодеструкторов различных трофических уровней (исходная концентрация - 25 г/кг)

ВЫВОДЫ

1. Трансформация нефти и индивидуальных углеводородов (гексадекана) нефтеокисляющими микробиологическими препаратами существенно интенсифицируется под воздействием дождевых червей.

2. Трансформация гексадекана под воздействием микробиологического препарата «Деворойл» сопряжена с образованием ненасыщенных триглицеридов переменного строения. Длина цепи кислотного остатка триглицеридов варьирует в пределах С1ГС22 атомов углерода, при этом количественно преобладают кислотные остатки с числом атомов углерода в цепи С |6. Положение двойных связей носит стохастический характер, но все они удалены от карбоксильной группы более чем на 4 атома углерода.

3. Образующиеся под воздействием микробиологического препарата

продукты трансформации нафтенового углеводорода- декалина и нафтеново-ароматического углеводорода- тетралина экспериментально зарегистрированы и охарактеризованы методами ЯМР Н и ГЖХ. Предложена схема трансформации декалина и тетралина под действием нефтеокисляющего микробиологического препарата «Деворойл».

4. Установлены оптимальные параметры процесса биотрансформации гексадекана под действием системы «Деворойл» и дождевых червей. Увеличение количества вносимого биопрепарата «Деворойл» при комплексном воздействии приводит к нивелированию стимулирующего действия дождевых червей на процессы трансформации углеводородов и снижению фитотоксичности исследуемых образцов.

5. Деградация нефти, снижение фитотоксичности и улучшение агрофизических свойств почв (содержание агрономически ценных фракций почвы, значение фактора структурности) в системе «Дестройл» -дождевые черви происходили более эффективно, по сравнению с внесением только нефтеокисляющего препарата или дождевых червей.

6. По токсичности для дождевых червей испытанные углеводороды образуют следующий ряд (в порядке возрастания): нафталин > тетралин > мета-ксилол > орто-ксилол > толуол > стирол > антрацен > мезигилен > псевдокумол > декалин > циклогексан > бензол > гептан > пара-ксилол > октан > гексан > пентан > изооктан > гексадекан > додекан > ундекан > декан> нонан.

7. Предложен принципиально новый экономичный и экологичный биотехнологический метод биоремедиации нефтеза1рязнённых субстратов с помощью комплекса, состоящего из нефтеокисляющих микроорганизмов и дождевых червей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Стом Д.И, Потапов Д.С., Балаян А.Э., Матвеева О.Н. Трансформация нефти в почве микробиологическим препаратом и дождевыми червями» // Почвоведение. 2003. Т. 36, №. 3. С. 359-361.

2. Матвеева О.Н., Неретина О.В., Велик H.A., Баранская В.К., Пройдаков А.Г., Стом Д.И., Кушнарёв Д.Ф. Изучение процесса трансформации гексадекана организмами разных трофических уровней // Нефтехимия 2003. Т. 43, № 5 . С. 396-400.

3. Матвеева О.Н., Пройдаков А.Г., Кушнарёв Д.Ф., Потапов Д.С., Стом Д.И. Новая биотехнология очистки углеводородзагрязнённых почв // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2003. №7. С. 110-111.

4. Стом Д.И., Потапов Д.С., Баранская В.К., Матвеева О.Н., Балаян А.Э. Элиминирование нефти и нефтепродуктов в бинарной системе // Россия -Германия: история, культура, наука: Сборник материалов межд. симпозиума. Иркутск, 1999. С. 81 - 83.

5. Стом Д.И., Потапов Д.С., Баранская В.К., Матвеева О.Н., Балаян А.Э. Биодеструкция нефти и рекультивация почв в модельных биоценозах //

Экология речных бассейнов: Сборник материалов Междунар. науч. -практ. конф. Владимир. Владимиринформэкспоцентр, 1999. С. 79-80.

6. Матвеева О.Н., Неретина О.В., Баранская В.К., Кушнарёв Д.Ф., Стом Д.И. Возможность биотрансформации алифатических углеводородов нефти в модельных экосистемах // Проблемы экологии: Материалы конференции. Иркутск.: Изд. ИГУ, 2000. С. 62-64.

7. Стом Д.И., Потапов Д.С., Балаян А.Э., Матвеева О.Н., Баранская В.К. Трансформация нефти в простейшей трофической цепи // Проблемы систематики, экологии и токсикологии беспозвоночных. Иркутск.: Изд. ИГУ. 2000, С. 90 - 95.

8. Капустина H.A., Матвеева О.Н., Стом Д.И., Кушнарёв Д.Ф. Биотрансформация бензиновых фракций в простейшей трофической цепи // Экология Байкала и Прибайкалья: Материалы всероссийского научно-практического молодёжного симпозиума. Иркутск.: Изд. ИГУ, 2000. С. 42.

9. Неретина О.В., Матвеева О.Н., Стом Д.И., Кушнарёв Д.Ф. Биотрансформация гексадекана организмами различных трофических уровней // Экология Байкала и Прибайкалья: Материалы всероссийского научно-практического молодёжного симпозиума. Иркутск.: Изд. ИГУ, 2000. С. 46.

Ю.Неретина О.В., Матвеева О.Н., Белик H.A., Кушнарёв Д.Ф., Стом Д.И. Изучение процесса трансформации нефтяных углеводородов в простейшей трофической цепи // Химия нефти и газа: Материалы IV Межд. конференции. Томск.: Изд.'^ГГ, 2000. Т.2. С. 429-431.

П.Матвеева О.Н. Возможные пути и продукты превращения нефтяных углеводородов под воздействием б ио деструкторов // «Проблемы биоремедиации в XXI веке»: Материалы межрегионального рабочего совещания. Красноярск, 2002. С. 42-43.

12.Матвеева О.Н., Кушнарёв Д.Ф., Пройдаков А.Г., Потапов Д.С., Стом Д.И. Возможность создания новой технологии биоремедиации нефтезагрязнённых почв с использованием комплекса биодеструкторов //Проблемы биоремедиации в XXI веке: Материалы межрегионального рабочего совещания. Красноярск, 2002. С. 41.

П.Матвеева О.Н., Кушнарёв Д. Ф., Пройдаков А.Г., Стом Д.И. Превращение углеводородов под воздействием биодеструкторов // Химия нефти и газа: Материалы V Межд. конференции. Томск.: Изд. Ин-та оптики атмосферы СО РАН, 2003. С. 530.

Отпечатано в ООО «Фрактал» г. Иркутск, ул. Лермонтова, 126. Тел.: 42-28-12. Тираж 100 экз. Заказ 356

Содержание диссертации автор исследовательской работы: кандидата химических наук, Матвеева, Ольга Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. Биологические методы восстановления нефтезагрязнённых почвенных экосистем. (Литературный обзор).

1.1. Влияние нефтепродуктов на почвенные экосистемы.

1-2. Методы очистки и рекультивации нефтезагрязненных почв.

1.2.1. Основные подходы и роль процессов биоремедиации в восстановлении нефтезагрязненных почв.

1.2.2. Биотрансформация нефти и нефтепродуктов.

1.2.3. Биотрансформация углеводородов различных классов.

1.2.3.1. Алифатические углеводороды.

1.2.3.2. Алициклические углеводороды.

1.2.3.3. Ароматические углеводороды. ч 1.3 Определение качественного и количественного состава нефтяного ч загрязнения почв.

2. Объекты, материалы и методы исследований, методика постановки эксперимента. 2.1. Используемые биологические объекты.

2.2. Методика постановки эксперимента.

2.3. Методы исследования.

3. Трансформация углеводородов в почве под действием биодеструкторов.

3.1. Токсичность углеводородов и нефтепродуктов для дождевых червей.

3.2. Трансформация алифатических углеводородов.

3.2.1. Количественные характеристики процесса биотрансформации гексадекана красным калифорнийским гибридом и биопрепаратом

3.2.2. Качественные характеристики, идентификация и выявление структурных особенностей продуктов трансформации гексадекана

3.3. Биотрансформация циклических углеводородов.

3.3.1. Количественные характеристики процесса биотрансформации нафтеновых углеводородов биопрепаратом «Деворойл».

3.3.2. Количественные характеристики процесса биотрансформации нафтеново-ароматических углеводородов биопрепаратом

- «Деворойл».

3.3.3. Качественные характеристики трансформации циклических соединений.

3.4. Биотрансформация нефти

ВЫВОДЫ.

Введение диссертация по химии, на тему "Трансформация углеводородного загрязнения в почве под действием биодеструкторов"

Нефть и продукты её переработки - основные источники загрязнения окружающей среды. Попадая в почву, нефтепродукты ухудшают общую экологическую обстановку, существенно изменяя агрофизические и агрохимические совйства почв [1]. В связи с этим, разработка способов очистки почвы от загрязнения углеводородами нефти - одна из важнейших задач при решении проблемы снижения антропогенного воздействия на окружающую среду [2].

В настоящее время наиболее перспективным методом для очистки нефтезагрязненных почв как в экономическом, так и в экологическом плане является биотехнологический подход, основанный на использовании различных групп микроорганизмов, обладающих повышенной способностью к биодеградации нефтей и продуктов её переработки [2, 3].

Изучение процессов биологической трансформации углеводородов нефти является фундаментальной основой для разработки теоретических основ и осуществления процессов биоремедиации нефтезагрязненных территорий. Биологическую трансформацию органических соединений можно рассматривать как ряд сложных химических реакций, общих для животного и растительного мира. Известно большое количество работ, посвященных трансформации углеводородов микроорганизмами, однако, результаты, полученные различными авторами, противоречивы и неоднозначны. Поэтому установление путей превращения доминирующих соединений при биологическом воздействии является весьма актуальным и представляет несомненный практический интерес.

Трансформация любых органических загрязнений в почве в природных условиях происходит под действием комплекса организмов, включающего представителей разных трофических уровней. Дождевые черви являются одним из важнейших компонентов агроценозов различных почвенных зон и важнейшим фактором, определяющим плодородие почв и формирование её агрофизических характеристик [5]. На основании известной высокой эффективности использования дождевых червей для переработки различных сельскохозяйственных и бытовых отходов целесообразно было изучить эффективность биотрансформации нефтепродуктов, восстановления плодородия почв и, прежде всего её агрофизических свойств, при совместном применении для биоремедиации нефтеразрушающих микробиологических препаратов и дождевых червей.

Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:

- определить токсичность углеводородов различных классов и товарных нефтепродуктов для олигохет;

- установить основные закономерности и возможные пути трансформации алифатических углеводородов в почве под воздействием дождевого червя и микробиологического препарата «Деворойл» при раздельном и совместном внесении;

- проанализировать динамику и установить возможные пути трансформации нафтеновых и нафтеново-ароматических углеводородов под воздействием коммерческого микробиологического препарата «Деворойл»;

- охарактеризовать количественные изменения содержания нефти, происходящие в процессе ее трансформации под воздействием дождевого червя и коммерческого микробиологического препарата «Дестройл» при раздельном и совместном внесении, и оценить происходящие при этом изменения токсичности и агрофизических свойств почв;

- оценить перспективы применения и возможную роль дождевых червей для трансформации углеводородного и нефтяного загрязнения и рекультивации почв, а также совместного использования коммерческих нефтеокисляющих препаратов и дождевых червей.

1 1Ч методов спектроскопии ЯМР на ядрах Ни С, ИК- и УФ- спектроскопии, ГЖХ позволило установить изменения качественного и количественного состава доминирующих классов углеводородов нефти, происходящие в процессе их биотрансформации и установить структуры некоторых промежуточных продуктов.

На основании результатов спектроскопии ЯМР 'Н и ,3С экстрактов почв, загрязнённых алифатическим углеводородом и обработанных нефтеокисляющим препаратом «Деворойл» (раздельно и совместно с червями), доказано образование ненасыщенных триглицеридов, определены некоторые детальные особенности их строения (длина углеродной цепи кислотных остатков и местоположение двойных связей).

Практическая значимость работы. На основе проведённых исследований разработаны теоретические основы и показана перспективность нового биотехнологического высокоэкологичного метода очистки и рекультивации углеводород- и нефтезагрязнённых почв с использованием бинарной системы биодеструкторов (дождевые черви -нефтеокисляющие микробиологические препараты) и определены возможности его практического использования. Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (Гранты № 99-04-49612, № 0204-49976, № 05-04-97237 и Научно-технической программы Минобразования России — проект 477).

Работа изложена на 110 страницах машинописного текста включая 20 таблиц, 13 рисунков и списка цитируемой литературы из 183 источников. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов и библиографии. Первая глава посвящена обзору литературных данных, где основное внимание уделено проблеме нефтяного загрязнения, а также известным способам очистки почв от нефтепродуктов; рассмотрены процессы, происходящие в почве при попадании нефти и нефтепродуктов, основные пути трансформации нефтяных углеводородов и роль различных представителей экосистем в процессах биодеструкции. Глава 2 содержит экспериментальную часть. Основные результаты работы представлены в 3 главе, посвященной изучению токсичности углеводородов и товарных нефтепродуктов для дождевых червей, изучению процесса биотрансформации углеводородов: алифатического, нафтенового и нафтеново-ароматического ряда, а также нефти Марковского месторождения.

Заключение диссертации по теме "Органическая химия"

ВЫВОДЫ

2. Трансформация гексадекана под воздействием микробиологического препарата «Деворойл» сопряжена с образованием ненасыщенных триглицеридов переменного строения. Длина цепи кислотного остатка триглицеридов варьирует в пределах Сц-С22 атомов углерода, при этом количественно преобладают кислотные остатки с числом атомов углерода в цепи Ci6. Положение двойных связей носит стохастический характер, но все они удалены от карбоксильной группы более чем на 4 атома углерода.

3. Образующиеся под воздействием микробиологического препарата продукты трансформации нафтенового углеводорода- декалина и нафтеново-ароматического углеводорода- тетралина экспериментально зарегистрированы и охарактеризованы методами ЯМР !Н и ГЖХ. Предложена схема трансформации декалина и тетралина под действием нефтеокисляющего микробиологического препарата «Деворойл».

Дестройл» - дождевые черви происходили более эффективно, по сравнению с внесением только нефтеокисляющего препарата или дождевых червей.

6. По токсичности для дождевых червей испытанные углеводороды образуют следующий ряд (в порядке возрастания): нафталин > тетралин > мета-ксилол > орто-ксилол > толуол > стирол > антрацен > мезитилен > псевдокумол > декалин > циклогексан > бензол > гептан > пара-ксилол > октан > гексан > пентан > изооктан > гексадекан > додекан > ундекан > декан> нонан.

7. Предложен принципиально новый экономичный и экологичный биотехнологический метод биоремедиации нефтезагрязнённых субстратов с помощью комплекса, состоящего из нефтеокисляющих микроорганизмов и дождевых червей.

Список источников диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Матвеева, Ольга Николаевна, Иркутск

1. Орлов Д.С., Бочарникова Е.А., Амосова Я.М. Изменение физико-химических свойств почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами // Экотоксикология и охрана природы: Тез. докл. республиканского семинара. Рига, 1988. С. 128-130.

2. Киреева Н.А. Использование биогумуса для ускорения деструкции нефти в почве // Биотехнология. 1995. № 5-6. С. 32-35.

3. Лысак Л.В., Лапыгина Е.В. Деструкция нефти монокультурами и природными ассоциациями почвенных бактерий // Вест. Моск. Ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 1994. №1. С.58-62.

4. Суржко Л.Ф., Финкельштейн З.И., Баскунов Б.П., Янкевич М.И., Яковлев

5. B.И., Головлева Л.А. Утилизация нефти в почве и воде микробными клетками // Микробиология. 1995. Т.64, №3. С.393-398.

6. Халимов Э.М., Левин С.В., Гузев B.C. Экологические и микробиологические аспекты повреждающего действия нефти на свойства почвы // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 1996. № 2. С. 59-64

7. Солнцева Н.П., Гусева О.А., Горячкин С.В. Моделирование процессов миграции нефти и нефтепродуктов в почвах тундры // Вестн. Моск. Ун-та, сер. 17. Почвоведение. 1996. №2. С. 10-17.

8. Глазковская М.А., Пиковский Ю.И. Скорость самоочищения почв от нефти в различных природных зонах // Природа. 1980. № 5. С. 118-119.

9. Хазиев Ф.Х., Тишкина Е.И., Киреева Н.А. Влияние нефтепродуктов на биологическую активность почвы // Биологические науки. 1988. №2.1. C.93-99

10. Ю.Левин С.В., Халимов Э.М., Гузев B.C. Эколого-микробиологическое нормирование содержания нефти в почве // Токсикол. Вестник. 1995. №1. С. 11-15.

11. Гузев B.C., Левин С.В., Селецкий Г.И. и др. Роль почвенной микробиоты в рекультивации нефтезагрязнённых почв // В кн.: Микроорганизмы и охрана почвы / Под ред. Д.Г. Звягинцева, М.: «Наука», С. 129 -150.

12. Восстановление нефтезагрязнённых почвенных экосистем / Под ред. М.А. Глазковской, М., 1988. 264 с.

13. Хазиев Ф.Х, Тишкина Е.И., Киреева Н.А., Кузяхметов Г.Г. Влияние нефтяного загрязнения на некоторые компоненты агроэкосистемы // Агрохимия. 1988. № 2. С.56-61.

14. Гриценко А.И., Акопова Г.С., Максимов В.М. Экология. Нефть и газ. М.: Наука, 1997. 557 с.

15. Рэуце К., Кырстя С. Борьба с загрязнением почвы. М.: ВО Агропромиздат.: 1986. 221 с.

16. Арене В.Ж., Гридин О.М., Яншин А.Л. Нефтяные загрязнения: как решить проблему // Экология и промышленность России. 1999.№9. С. 33-36.

17. Вельков В.В. Биоремедиация; принципы, проблемы, подходы // Биотехнология. 1995. № 3-4. С. 20-27.

18. Янкевич М.И., Квитко К.В. Биоремедиация нефтезагрязненных водоемов // Экология и промышленность России. 1998. №10. С.21-26.

19. Бояндин А.Н., Печуркин Н.С., Попова Л.Ю. Концепции развития и методологии биоремедиации: выбор методов и объектов. // Проблемы биоремедиации в XXI веке: Материалы межрегионального рабочего совещания. Красноярск, 2002. С. 94-98.

20. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. т. 32, № 6. С.579-585.

21. Method effective purification of soils contaminated with petroleum products // Japan Chemical Marketing. 1995. 36. N. 1822. p.l 1.

22. Алёхин В.Г., Фахрутдинов А.И., Малышкина JI.А., Ситников А.В., Емцев

23. B.Т., Хотянович А.В. Сравнительная эффективность деструкции нефтепродуктов разными биопрепаратами при разных уровняхзагрязнения торфогрунтов // Биологические ресурсы иприродопользование: Сб. научных трудов. Нижневартовск. 1999. № 3.1. C. 96-106.

24. Ермоленко З.М., Чугунов В.А., Герасименко В.Н. Влияние некоторых факторов окружающей среды на выживаемость внесённых бактерий, разрушающих нефтяные углеводороды // Биотехнология. 1997. № 5.

25. Шарубин С.А. Биоремедиация нефтезагрязнённых сайтов. Практический опыт работы // Проблемы биоремедиации в XXI веке: Материалы межрегионального рабочего совещания. Красноярск, 2002. С. 55-57.

26. Преобразование нефтей микроорганизмами / ред. Б.Г. Хотимский, А.И. Акопиан. //Труды Всесоюзного нефтяного НИ Геологоразведочного института, вып. 281. Ленинград. 1970. 220 с.

27. Сваровская Л.И., Алтунина Л.К., Туров Ю.П., Гузняева М.Ю. Микробная деструкция углеводородов нефти // В кн.: Теоретические и практические основы физико-химического регулирования свойств нефтяных дисперсных систем. 4.II. Томск, 1999. С. 16-22.

28. Квасников Е.И., Клюшникова Т.М. Микроорганизмы деструкторы нефти в водных бассейнах. Киев: Наукова Думка, 1981. 132 с.

29. Гусев М.В., Коронелли Т.В. Микробиологическое разрушение нефтяного загрязнения // Изв. АН СССР. Сер. Биол. 1981, №6. с. 835-844.

30. Билай В.И., Коваль Э.З. Рост грибов на углеводородных субстратах нефти. Киев: Наук. Думка. 1980. 340 с.

31. Халимов Э.М. Эколого-микробиологические основы рекультивации почв, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами: Дисс. канд. биол. наук. МГУ, 1996.

32. Floodgate G. The fate of petroleum in marine ecosystems // Petroleum microbiology / Ed. Atlas R.M. N.Y.: Macmillan Publishing Co. 1984. P.355-398.

33. Bossert I., Rartha R. The fate petroleum in soil ecosystems // Petroleum microbiology / Ed. Atlas R.M. N.Y.: Macmillan Publishing Co., 1984. p.434-476.

34. Киреева H.A. Микроскопические грибы биодеструкторы нефтяных углеводородов в почве // Ботанические исследования на Урале: Информационные материалы. Свердловск, 1990. С. 41.

35. Киреева Н.А., Галимзянова Н.Ф. Влияние загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами на численность и видовой состав микромицетов //

36. Почвоведение. 1995. №2. с.211-216.

37. Биотехнология / ред Егорова Н.С., Самуилова В.Д. М.: Высшая школа. 1987. 270 с.

38. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. М.: Мир, 1987, 411 с.

39. Coty V.F., Leavitt R.I. Microbial protein from hydrocarbons // Journal of industrial microbiology & biotechnology . 1999. №22 . P. 259-269.

40. Куличевская И.С., Гузев B.C., Паников H.C. Популяционная динамика углеводородокисляющих дрожжей, интродуцированных в нефтезагрязнённую почву // Микробиология. 1995. т. 64, №5. С. 668-673.

41. Гусев М.В., Коронелли Т.В., Максимов В.Н., Ильинский В.В., Захаров В.Т. Изучение микробиологического окисления дизельного топлива методом полного факторного эксперимента // Микробиология. 1980 б. т. 49, № 1.С. 25-28.

42. Химия нефти /Ред.Сюняев З.И.Л.:Химия. 1984.358 с.

43. Leachy J.G, Colwell R.R. Microbial degradation of hydrocarbon in the environment//Microbiol. Rev. 1990. №54. P. 305-315.

44. Prince R.C. Petroleum spill bioremediation in marine environments // Crit. Rev. Microbiology. 1993. №19. P.217-242.

45. Вассоевич Н.Б. Источник нефти- биогенное углеродистое вещество // Природа. 1971. №3. С. 58.

46. Ellis В., Balba M.T., Theile P. Bioremediation of Oil Contaminated Land // Environm. Technol. 1990. V. 11, № 5. P. 443-455.

47. Wang X., Bartha R. Effects of bioremediation on residues, activity and toxicityin soil contaminated by fuel spills // Soil. Bio. Biochem. 1990. V. 22, №4. P. 501-506.

48. Пиковский Ю. И. // Восстановление нефтезагрязнённых почвенных экосистем. М.: Наука, 1988. С. 7-12.

49. Uraizee F.A., Venosa A.D., Suidan М.Т. A model for diffusion controlled bioavailability of crude oil components // Biodegradation. 1998. № 8. P. 287296.

50. Vinas M., Grifoll M., Sabate J., Solanas A.M. Biodegradation of a crude oil by three microbial consortia of different origins and metabolic capabilities // Journal of industrial microbiology & biotechnology. 2002. №28. P. 252-260.

51. Davis J.B., Raymond R.L. Oxidation of alkyl substituted cyclic hydrocarbons by a Nocardia during growth on n-alkanes // Appl. Microbiol. 1961. № 9. P. 383-388.

52. Komukai-Nakamura S, К Sugiura, TH Yamauchi Inomata Y, К Venkateswaran, TH Yamamoto S and S Harayama. Construction of bacterial consortia that degrade Arabian light crude oil // J. Ferment. Bioeng. 1996. №82. P. 570-574.

53. Sugiura К, M Ishihara, and HS Shimauchi T. Physicochemical properties and biodegradability of crude oil // Environ. Sci. Technol. 1997. №31. P.45- 51.

54. Venkateswaran K, Hoaki KMR, Maruyama T. Microbial degradation of resins fractionated from Arabian light crude oil // Can J. Microbiol. 1995. №41. P. 418-424.

55. Leahy J.G., Colwell R.R. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment//Microbiol Rev. 1990. № 54. P. 305-315.

56. Foght J.M., Fedorak P.M., Westlake D.W.S. Mineralization of ,4C. hexadecane and [I4C]phenanthrene in crude oil: specificity among bacterial isolates // Can. J. Microbiol. 1990. №36. P. 169- 175.

57. Churchill S.A., Harper J.P., Churchill P.F. Isolation and characterization of a Mycobacterium species capable of degrading three and four - ring aromatic and aliphatic hydrocarbons // Appl Environ Microbiol. 1999.№ 65. P. 549552.

58. Gibson D.T. and V Subramanian. Microbial degradation of aromatic compounds. In: Microbial Degradation of Organic Compounds. 1984. Marcel Dekker, New York.

59. Gilewicz M, Ni'matuzahroh N.T., Budzinski H., Doumenq P., Michotey V., Bertrand J.C. Isolation and characterization of a marine bacterium capable of utilizing 2 — methylphenanthrene// Appl Microbiol Biotechnol. 1997. No. 48. P. 528-533.

60. Sabate' J., Grifoll M., Vin~as M. and Solanas A.M. Isolation and characterization of a 2 methylphenanthrene utilizing bacterium: identification of ring cleavage metabolites// Appl Microbiol Biotechnol. 1999. No. 52. P. 704-712.

61. Casellas M, Grifoll M., Sabate' J., Solanas AM. Isolation and characterization of a 9- fluorenoned degrading bacterial strain and its role in synergistic degradation of fluorene by a consortium // Can J Microbiol. 1998. No. 44. P. 734- 742.

62. Walker J.D., Petrakis L. & Colwell R.R. Comparison of biodegradability of crude and fuel oils // Can. J. of Microbiol. 1976. No. 22. P. 598- 602

63. MulkinsPhillips G.J., Stewart J.E. Effect of four dispersants on biodegradation and growth of bacteria on crude oil //App. Microbiol. 1974 b. No. 28. P. 547552

64. WestlakeDWS, Jobson A, PhillippeR&CookFD Biodegradability and crude oil composition. //Can. J. of Microbiol. 1974. No. 20. P. 915-928.

65. Коваль Э.З. Микрофлора почв, заливаемых нефтепродуктами / В кн.: Систематика, экология и физиология почвенных грибов. Киев: Наук. Думка, 1975. С. 64-65.

66. Loveley D.R., Chappelle F.H. Deep subsurfase microbial process // Rev. Geophys. 1995. No. 33. P. 365-381.

67. Финкелыитейн З.И., Баскунов Б.П., Алиева P.M., Головлев Е.Л., Головлева Л.А. Микробная деградация нефти и нефтепродуктов // Биотехнол. защиты окруж. среды.: тез. докл. конф. Пущино. 1994. С.5-6.

68. Marques-Rocha F.J., Hernandes-Rodrigues V., Lamela Ма.Т. Biodegradation of diesel oil in soil by a microbial consortium // Water, Air and soil pollution. 2001. No. 128. P. 313-320.

69. Mohn W.W. Indirect bioremediation: biodegradation of hydrocarbons on a commercial sorbent//Biodegradation. 1997. No. 8. P. 15-19.

70. Alexander M. Biodegradation and bioremediation, Academic Press, San Diego, 1994.

71. Goswami P., Singh H.D. Different modes of hydrocarbon uptake by two Pseudomonas species // Biotechnol. Bioeng. 1991. No. 37. P. 1-11.

72. Bouchez M., Blanchet D., Vandecasteele J.P. Substrate availability in phenanthrene biodegradation: transfer mechanism and influence on metabolism //Appl. Microbiol. Biotech. 1995. No. 43. P. 952-960.

73. Grimberg S.J., Stringellow W.T., Aitken M.D. Quantifying the biodegradation of phenantrene by Pseudomonas stuzeri P16 in the presence of a nonionic surfactant // Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62,2387-2392.

74. Mulder H., Breure A.M., Andel J.G.V., Grotenhuis J.T.S., Rulkens W.H. Influence of hydrodynamic conditions on naphthalene dissolution and subsequent biodegradation // Biotechnol. Bioeng. 1998. No. 57. P. 145-154.

75. Bouchez M., Rakatozafy H., Marchal R., Leveau J.Y, Vandecasteele J.P. Diversity of bacterial strains degrading hexadecane in relation to the mode of substrate uptake // J. Appl. Microbiol. 1999. No. 86. P. 421-428.

76. Choi D.H., Hori K., Tanji Y., Unno H. Microbial degradation kinetics of solid alkane dissolved in nondegradable oil phase // Biochem. Eng. J. 1999. No. 3. P. 71-78.

77. Efroymson R.A., Alexander M. Biodegradation by an Arthrobacter species of hydrocarbons partitioned into an organic solvent // Appl. Environ. Microbiol. 1991. No. 57. P. 1441-1447.

78. Goma G. Hydrocarbon fermentation: kinetics of microbial cell growth // Biotech. Bioeng. 1978. No. 20. P. 1723-1734.

79. Erikson L.E., Humphrey A.E., Prokop A. Growth models of cultures with two liquid phases. I. Substrate dissolved in dispersed phase // Biotechnol. Bioeng. 1969. No. 11. P. 449-466.

80. Wang D.I.C., Ochoa A. Measurements on the interfacial areas of hydrocarbon in yeast fermentations and relationships to specific growth rates // Biotechnol. Bioeng. 1972. No. 14. P. 345-360.

81. Moo-Young M., Shimizu T. Hydrocarbon fermentation using Candida lipolytica. II: A model for cell growth kinetics // Biotechnol. Bioeng. 1971. No. 13. P. 761-778.

82. Roy P.K., Singh H.D., Bhagat S.D., Baruah J.N. Characterization of hydrocarbon emulsification and solubilization occurring during the growth of Endomycopsis lipolytica in hydrocarbons // Biotechnol. Bioeng. 1979. No. 21. P. 955-974.

83. Shreve G.S., Inguva S., Gunnam S. Rhamnolipid biosurfactant enhancement of hexadecane biodegradation by Pseudomonas aeruginosa // Mol. Mar. Biol. Biotechnol., 1995, 4,331-337.

84. Yoshida F., Yamane T. Hydrocarbon uptake by microorganisms a supplementary study//Biotechnol. Bioeng. 1971. No. 13. P. 691-695.

85. Liu D., Maguire R.J, Pacepavicius G.J, Nagy E. Microbial degradation of polycyclic aromatichydrocarbons and polycyclic aromatic nitrogen heterocyclics // Envir. Toxicol. Water Qual. 1992. No. 7(4). P. 355-372.

86. Middaugh D.P., Pesnick S.M., Lantz S.E., Heard C.S., Mueller J.G. Toxicological assessment of biodegraded phentachlorphenil: MicrotoxTM and fish embryos // Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1993. No. 24. P. 165-172.

87. Burback B.L., Perry J.J Biodegradation and biotransformation of groundwater pollutant mixtures by Mycobacterium vaccae // Appl. Environ. Microbiol. 1993. No. 59(4). P. 1025-1029.

88. Beam H.W., Perry J.J Microbial degradation of cicloparaffinic hydrocarbons via co-metabolism and commensalisms // J. Gen. Micro. 1974. No. 82, P. 163169.

89. Рачинский B.B., Давидова Е.Г., Лапотышкина А.И. Механизм транспорта н-парафинов в клетки дрожжей // Доклады АН СССР. 1971. № 201. С. 717.

90. Klug M.J., Markovetz A.J. Utilization of aliphatic hydrocarbons by microorganisms// Adv. Microbial. Physiol. 1971. No. 5. P. 1.

91. Auliffe Mc. Solubility in water of normal C9 and Cj0 alkane hydrocarbons // Science. 1969. No. 163. P. 478.

92. Mc Lee A.G., Davies S.L. Linear growth of a Torulopsis sp. on n-alkanes // Canad. J. Microbiol. 1972. No. 18. P. 315.

93. Charkavarty M., Amin P.M., Singh H.D., Baruach J.N., Ijengar M.S. A kinetic model for microbial growth on solid hydrocarbons // Biotechnol. and bioengng. 1972. No. 14. P. 61.

94. Корчемная Ц.Б., Беликов В.М., Федосова А.В. Потенциометрическое определение растворимых жирных кислот при микробиологическом окислении углеводородов // Прикладная биохимия и микробиология. 1966. Том. 2, Вып. 2. С. 213-215.

95. Warhurst AM & Fewson СА. Biotransformations catalyzed by the genus Rhodococcus // Crit. Rev. Biotechnol. 1994. No. 14. P. 29- 73.

96. Broadway N.M., Dickinson FM & Ratledge C. The enzymology of dicarboxylic acid formation by Corynebacterium sp. strain 7E1C grown on n-alkanes//J. Gen. Microbiol. 1993.No. 139. P. 1337-1344.

97. Ludwig B, Akundi, A & Kendall K. A long-chain secondary alcohol dehydrogenase from Rhodococcus erythropolis ATCC 4277 // Appl. Environ. Microbiol. 1995. No. 61. P. 3729-3733.

98. Woods NR & Murrell JC. The metabolism of propane in Rhodococcus rhodochrous PNKbl //J. Gen. Microbiol. 1989. No. 135. P. 2335-2344.

99. Klug M.J., Markovetz A.J. Utilization of aliphatic hydrocarbons by microorganisms// Adv. Microbial. Physiol., 1971, 5, p. 1.

100. Lebeault J.M., Azolay E. Metabolism of alkane by yeast // Lipids. 1971. No. 6. p. 441-444.

101. Iizuka H., Iida M., Unami Y., Hoshio Y. n-Decan dehydrogenation by a cell-freee extract of Candida rugosa// Z. Allgem. Microbial. 1968. No. 8. P. 145.

102. Leadbetter E.R., Foster J. M. Bacterial oxidation of gaseous alkanes // Arch. Microbiol. 1960. No. 35. P. 92.

103. Фонкен Г., Джонсон P. Микробиологическое окисление. М.: Мир, 1976. 240 с.

104. Литвиненко С.Н. Защита нефтепродуктов от действия микроорганизмов. М.: Химия, 1977. 143 с.

105. May S.W., Abbot B.J. Enzymic epoxidation. II. Comparison between the epoxidation and hydroxylation reactions, catalized by the to-hydroxylation system of Pseudomonas oleovorans // J. Biol. Chem. 1973. No. 248. P. 1725.

106. Benton, P.M.C., Christiansen, J., Dean, D.R., Seefeldt, L.C. Stereospeci.city of acetylene reduction catalyzed by nitrogenase // J. Am. Chem. Soc. 2001. No. 123. P. 1822-1827.

107. Rosner, B.M., Rainey, F.A., Kroppenstedt, R.M., Schink, B. Acetylene degradation by new isolates of aerobic bacteria and comparison of acetylene hydratase enzymes //FEMS Microbiol. Lett. 1997. No. 148. P. 175-180.

108. Marcotte, P., Walsh, C. Sequence of reactions which follow enzymic oxidation of propargylglycine // Biochemistry. 1978. No. 17. P.5613-5619.

109. Miesowicz, F.M. & Bloch, K. Puri.cation of hog liver isomerase. Mechanism of isomerization of 3-alkenyl and 3-alkynyl thioesters // J. Biol. Chem. 1979. No. 254. P.5868-5877.

110. Yamada, E.W. & Jakoby, W.B. Enzymatic utilization of acetylenic compounds-I. An enzyme converting acetylenedicarboxylic acid to pyruvate // J. Biol. Chem. 1958. No. 233. P. 706-711.

111. Yamada, E.W. & Jakoby, W.B. Enzymatic utilization of acetylenic compounds II. Acetylenemonocarboxylic acid hydrase // J. Biol. Chem. 1958. No. 233. P. 941-945.

112. Ooyama J., Foster J.W. Bacterial oxidation of cycloparaffinic hydrocarbons //Antonie van Leeuwenhoek. J. Microbiol, and Serol. 1965. No. 31. P. 45.

113. Norris D.B., Trudgill P.W. The purification and properties of cyclohexanone oxygenase from Nocardia globerula // Biochem. J. 1972. No. 130. P. 30.

114. Griffin M., Trudgill P.W. The metabolism of cyclopentanol by Pseudomonas NCIB 9872 // Biochem. J. 1972. No. 129. P. 595.

115. Shumacher J.D., Fakoussa R.M. Degradation of alicyclic molecules by Rhodococcus rubber CD4 // Applied microbiology & biotechnology. 1999. No. 52. P. 85-90.

116. Shaw R. Microbiological oxidation of cyclic ketones // Nature. 1966. No. 5030. P. 1369.

117. Hasegawa Y, Segawa T, Obata H, Tokuyama T (1983) Metabolism of cycloheptanone by Nocardia sp.// Nippon Nogeikagaku Kaishi. 1983. No. 57. P. 129-134

118. Gibson D.T., Wood J.M., Chapmann P.J., Dagley S. Bacteriial degradation of aromatic compounds // Biotechnol. and bioeng. 1967. No. 9. P. 33.

119. Catteral F.A., Williams P.A., Some properties of naphthalene-oxygenase from Pseudomonas sp. NCIB 9816.- J. Can. Microbiol., 1971, 67, p. 117.

120. Griffits E., Evans W.C. A cell-free perhydroxylase system from soil pseudomonas, with activity on aromatic hydrocarbons // Biochem. J. 1965. No. 95.P.51.

121. Adachi K., Iwayama Y., Tanioka H., Takeda Y. Purification and properties of homogentisate oxygenase from Pseudomonas fluorescens // Biochim. Et biophys . acta. 1966. No. 118. P. 88.

122. Розанова Е.П., Кузнецов С.И. Микрофлора нефтяных месторождений. М.: Наука, 1974. 197 с.

123. Энциклопедия экометрия. Серия «Экометрия»/ под ред. Исаева. С.-Пб.: Крисмас+, 1998. 896 с.

124. Современные методы мсследования нефтей / ред. Богомолов А.И. М.: Недра, 1984. 431 с.

125. Карякин А.В., Грибовская И.Ф. Методы оптической спектроскопии и люминисценции в анализе природных и сточных вод. М.: Химия. 1987. 304 с.

126. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М.: Химия, 1984. 302 с.

127. Дмитриев М.Т., Кознина Н.И., Пинигина Н.А. Санитарно-химический анализ загрязняющих веществ в окружающей среде. М.: Химия, 1989. 287с.

128. Петров С.И., Тюлягина Т.Н., Василенко П.А. Определение нефтепродуктов в объектах окружающей среды // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. 1999. том. 65, №9. С. 3-19.

129. Бродский Е.С., Савчук С.А. Определение нефтепродуктов в объектах окружающей среды // Ж. Аналитической химии. 1998. том 53, №12. С. 1238-1251.

130. Инструкция по идентификации источника загрязнения водного объекта нефтью. 1994. Утверждено приказом №241 от 24.08.94 (Министерство охраны окружающей среды и природных ресурсов РФ)

131. Проскуряков В.А. Химия нефти и газа. С-Пб.: Химия. 1995. 448 с.

132. Люминесцентные методы анализа следовых количеств загрязнителей / Сб. материалов НПФ АП «Люмэкс». С-Пб.: Люмэкс. 1996.

133. Другов Ю.С., Роднин А.А. Газохроматографическая идентификация загрязнений воздуха, воды и почвы. Практическое руководство. С-Пб.: Теза. 1999. 622 с.

134. Орлова Д.С., Васильевская В.Д. Почвенно-экологический мониторинг и охрана почв. М.: МГУ, 1994. 272 с.

135. Герасимов И.П., Глазковская М.А. Основы почвоведения и географии почв. М.: Географгиз, 1960. 485 с.

136. ГОСТ 7.1.4.01-80. Общие требования к определению нефтепродуктов в природных и сточных водах. М.: Госстандарт, 1983. 8 с.

137. Серёгина И.Ф., Окина О.И., Кистанов А.А. Спектрофотометрическое определение нефтепродуктов в почвах // Ж. Аналитической химии. 1999. том 54, №4. С. 434-440.

138. Эрнестова Л.С., Тарасова Л.А. // Труды Института экспериментальной метеорологии. Моск. Отд. Гидрометеоиздата. 1980. Вып. 10(86). 98 с.

139. Аммосова Я.М., Бочарникова Е.А. Физические и химические методы исследования почв // В кн.: Сб. ст. МГУ им М.В. Ломоносова. Фак. Почвоведения. М.: Ид. МГУ, 1994. 69 с.

140. Справочник. Технологии восстановления почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. -М.: РЭФИА, НИА-Природа, 2001. 185 с.

141. Buzov В.А., Poljanskaja L.M, Thanh Vu Nguyen // Acta. Zool. Fenn. 1995. № 196. p. 376 - 379. Роль дрожжей как стимуляторов роста для Eisenia foetida в системах вермикомпостирования.

142. Binet F., Fayolle L., Pussard M. Significance of earthworms in similating soil microbial activity // Biol. Fertil. Soil. 1998. № 27. P. 79 84.

143. Тиунов А.В. Вермикомпост, вермикомпостирование и компостные черви: направление научных исследований в последнее десятилетие / Дождевые черви и плодородие почв. Тез. 2-ой Международной научно-практической конференции. Владимир. 2004 г. С. 3.

144. Калабин Г.А., Каницкая JI.B., Кушнарев Д.Ф. Количественная спектроскопия ЯМР природного органического сырья и продуктов его переработки. М.: Химия, 2000. 407 с.

145. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам / Под ред. О. Микеша. М.: Мир, 1982. Ч. II. 381 с.

146. Наканси К. Инфракрасные спектры и строение органических соединений, практическое руководство. М.: Мир. 1965. 209 с.

147. Стом Д.И., Саксонов М.Н., Балаян А.Э., Потапов Д.С., Лозовой Д.В., Бархатова О.А., Горбунов В.В., Агапова А.В. Разработка новых методов биотестирования нефтепродуктов // Тез. Доклада на 1 съезд токсикологов России. Москва. 1998. С.320.

148. Stom D.I. Effect of polyphenols on shoot and root growth and on seed germination//Biologia Plantarum. 1982. vol.24. N. l.P. 1-6.

149. Практикум по почвоведению /под ред. Кауричева И.С. М.: Агропроиздат, 1986. 336 с.

150. Вадюнина А.Ф., Корчагина З.А. Методы исследования физических свойств почв. М.: Агропромиздат, 1986. 416 с.

151. Артемьева Т.И., Жеребцов А.К., Борисович Т.М. Влияние загрязнения нефтью и нефтепромысловыми сточными водами на комплекс почвенных животных / В кн. Восстановление нефтезагрязнённых экосистем. М.: Наука, 1988. с. 82-99.

152. Артемьева Т. И. Комплексы почвенных животных и вопросы рекультивации техногенных территорий. М.: Наука, 1989. 109 с.

153. Гузев B.C., Левин С.В., Селецкий Г.И. и др. Роль почвенной микробиоты в рекультивации нефтезагрязнённых почв // В кн.: Микроорганизмы и охрана почв. Гл. 4. М.: Наука, 1989. .С.129-150.

154. Чекановская О.В. Дождевые черви и почвообразование. М.: Академия наук СССР, 1960.-205 с.

155. Edwards С.A., Bater J.E. The use of earthworms in environmental management//Soil Biol. Biochem. 1992. Vol. 24: No. 12. P. 1638-1689.

156. Соромотин А.В. Влияние нефтяного загрязнения на почвенных беспозвоночных (мезофауну) в таёжных лесах Среднего Приобъя // Сибирский экологический журнал. 1995. № 6. С.549-552.

157. Shin К.Н., Kim K.W. Ecotoxicity monitoring of hydrocarbon-contaminated soil using earthworm (Eisenia foetida) // Environmental monitoring and assessment. 2001. No. 70. P. 93-103.

158. RistorA. I, Dagaut P., Cathonnet M. The oxidation of n-hexadecane: experimental and detailed kinetic modeling // Combustion and flame. 2001. No. 125. P.l 128-1137.

159. Atlas, R. M. Microbial Degradation of Petroleum Hydrocarbons: An Environmental Perspective// Microbiology Review. 1981. Vol 45. P. 180-209.

160. Bus J., Sies I., Marsel S.F., Lie Ken Jie ,3C-NMR of Double and triple bond carbon atoms of unsaturated fatty acid methyl esters // Chemistry and Physics of Lipids.1977. №18. P. 130-144.

161. Мерзлая Г.Е., Лежнина A.A., Зябкина Г.А., Нестерович И.А. Агроэкологическая оценка биогумуса // Химия в сельском хозяйстве. 1994. №4. С. 12.

162. Городний Н.М. Биоконверсия органических отходов и применение биогумуса в сельском хозяйстве // Международный агропромышленный журнал. 1991. №5. С. 98-100.