Влияние простагландинов на структуру и проницаемость липидных мембран тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.05 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ ЭЛЕКТРОХИМИИ им.А."Н.ФРУМКИНА

На правах рукописи ЯЙЛЕНКО Татьяна Леонидовна

ВЛИЯНИЕ П РОСТА ГЛА НДИНОВ НА СТРУКТУРУ И ПРОНИЦАЕМОСТЬ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАН-

02.00.05 -Электрохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-1991

Работа выполнена в Отдела биоэлектрохимии мембран Института электрохимии им.А.Н.Фрумкина АН СССР совместно с Лабораторией эволюционной и радиационной биохимии Института биохимии им.А.Н.Баха АН СССР.

.Научные руководители! доктор химических наук, профессор А.И.Богуславский; доктор химических наук, И.Г.Абидор.

Официальные оппоненты: доктор химических наук В.С.Гевод°, доктор биологических наук А.С.Капрельянц.

Ведущая организация: Кафедра биофизики Московского государственного университета им.М.В.Ломоно сова.

Защита состоится «■ / » О^&^М- 1991 г> в (О часов на заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата наук при Институте электрохимии им.А.Н.Фрумкина АН СССР по адресу. 117071, Москва, Ленинский проспект, 31, ИЭЛАК СССР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института электрохимии им.А.Н.Фрумкина АН СССР.

Автореферат разослан » 31 » иЛО^ЬЛ 1991 г.

Ученый секоетарь Специализированного совета кандидат химических наук / ^—Г.И.Корначеба

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы. К сфере интересов современней биоэлектрохимии принадлежит вопрос исследования физико-химических факторов, лежащих в основе взаимодействия биологически активных веществ с липиднкми мембранами. К числу таких веществ относят простагландины, которые еыполняют роль внутриклеточных и тканевых гормонов в организмах большинства животных и человека.

Многообразные эффекты, вызываете простагландинами на уровне организма, органов, тканей, детально исследованы медиками и физиологами. Простагландины и их синтетические аналоги применяют в качестве фармакологических препаратов. Расширяющееся использование простагландинов в медицине делает актуальным исследование механизмов их взаимодействия с разными компонентами биомембран.

Молекулярные осноеы регуляторкого действия простагландинов не известны. Предполагают, и для некоторых простагландинов подтверждено существование белковых рецепторов. Исследованию ЕзаимодейстЕия простагландинов с лжидами биомембран уделяли меньше внимания, хотя регуляторное действие простагландинов может быть обусловлено и их взаимодействием с липидным компонентом биологических мембран. Так, согласно существующим данным, в присутствии простагландинов увеличивается проницаемость клеточных и модельных мембран для некоторых катионов, меняются деформируемость и структура эритроцитарных мембран.

Природные мембраны сложны и одновременно участвуют во множестве процессов. Поэтому исследовать взаимодействие простагландинов с липидами нативных мембран трудно/ Для решения этой задачи целесообразно использовать различные модельные липидные системы.

Целью работы было исследование влиязшя некоторых природных и

синтетических простагландинов на структурные, электростатические, механические и барьерные свойства модельных мембран (монослоев и липосом) из фосфатидилхолина - одного из наиболее распространенных, липидных компонентов биомембран.

В работе.поставлены следуюсдае задачи:

1. Исследовать взаимодействие простагландинов с фосфатидил-холином в смешанных монослоях на границе раздела фаз вода/воздух.

2. Исследовать влияние простагландинов на проницаемость однослойных липосом для протонов и для глюкозы. Последняя рассматривается как индикатор изменения проницаемости мембраны, обусловленной наличием различных дефектов в ее структуре.

3. Про .нализировать влияние простагландинов на структуру двойного электрического слоя у липидных поверхностей.

4. Выяснить корреляцию между проницаемостью мембран и изменением их электрохимических и механических сбойств в присутствии простагландинов.

Научная новизна. В работе впервые исследовано влияние простагландинов на протонную проницаемость липидных мембран. Установлена корреляция изменения катионной проницаемости липидных мембран с влиянием простагландинов на структуру двойного электрического слоя в мембранных системах. Обнаружений изменение пассивной проницаемости липосом в присутствии простагландинов, которое объясняется влиянием простагландинов на мехашчекяе свойства лшшдной мембраны.

Практическая ценность. В работе установлен ряд физико-химических факторов, которые могут определять биологическое и фармакологическое действие простагландинов. Установлена корреляция между влиянием простагландинов на проницаемость липидных мембран и изменением электрохимических и механических свойств липидных мембран в присутствии простагландинов. Поскольку простаглаи-

- з -

дики образуются из фосфолипидов бисмембран, изменение механических и барьерных свойств мембран в районе синтеза простагландинов может существенно влиять на функции этих мембран. В работе показана возможность эффективного сочетания разных модельных систем (монослоев и липосом) для исследования физико-химических основ активности биологически активных веществ. Развитые в работе подхода могут быть полезны для выяснения механизмов действия и других мембрано-активных веществ и соединений.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Всесоюзной конференции "Выделение, очистка и анализ биологически активных соединений" (Сухуми, 1987), Всесоюзной конференции по проблемам происхождения жизни (Телави, IS8S), TV Международном Фрумкинсксм симпозиуме (по биоэлектрохимии) (Суздаль, 1983), Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1939), VI Международной конференции "Происхождение жизни" (Прага, 1939), IV Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран" (Черноголовка, 1989), на конференциях молодых ученых Института электрохимии им.А.Н.Фрумккна (1987,1989).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных забот, список которых приведен в конце автореферата.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора гатературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка датируемой литературы. Работа изложена на 136 страницах тшинописного текста, содержит 3S рисунков и Таблицу.' Список итературы содержит 120 наименований. ,

л

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Для формирования монослоев и липосом использовали: фосфати-илхолин (PC) Харьковского завода бактериальных препаратов, про-

стагландины (pg): pge1, синтезированный биохимически в Институте химии Ali Зет.ССР; его синтетический аналог - п-гидроксифениловый эфир 11-дезокси PG31 (PGE^a) и простагландин PQ?^. синтезированные в Институте органического синтеза Латв.ССР Структурные формулы исследованных простагландинов представлены на рис.1.

3 г j соси

Рис.1,

pge,

Я ß 13 20 ■■

Udo

PGE^-a

PGP

2ß

Монослои формировали на поверхности раствора 0,1 М KCl, рн=7,3 в тефлоновой кювете Лэнгмюра. Поверхностное натяжение (а) измеряли методом Вильгельми с точностью 0,2 мН/м. Изменение мбжфазного потенциала (<р) измеряли методом вибрирующего электрод« с точностью 0,5 мВ. Результаты измерений представляли в виде изотерм сжатия a(S) и <p(S), где s - средняя площадь, приходящая« на одну молекулу монослоя. Работа установки в режиме поддержат/ постоянного о позволяла контролировать растворимость исследуема: монослоев.

Электронные микрофотографии поверхности смешанных монослое] получали перенесением монослоя на специальный гиброфобизованнм о'бъектодержатель с последующей фиксацией фосфорновольфрамово:

кислотой и натенением металлом для выявления рельефа поверхности. Электронную микрофотографию проводила А.М.Тонгур (Ии-т биохимии им.А.Н.Баха АН СССР).

Приготовление липосом. Липосомы для проведения экспериментов по определению проницаемости мембраны для протонов готовили методом обращения фаз (Смирнов, 1984) из РС и из смесей РС с РвЕ1 и с рое.,-а состава РС:РС = 40:1. Состав фонового раствора: 0,1 М КС1, 20 мМ морб, рН = 6,э. В качестве рН-индикат~ра использовали флуоресцентный краситель пиранкн (0,5 мМ), не сорбирующийся на исследуемых мембранах. От красителя в наружной среде полученные липосомы отмывали путем трехкратного центрифугирования (30 мин., 15.000 об/мин.) с заменой надосадочной жидкости на фонорнй раствор.

Размер (диаметр) полученных липосом, определенный методом динамического светорассеяния на приборе "Маьуенгг ю.а.Ермаковым,

и подтвержденный данными электронной микроскопии, составлял: для

02

липосом из РС - юоо а , для л;:посом из смеси РС с рсз. - 1500 02 о2 1

а , для липосом из смеси РС с РСЕ^-а - 2000 а .

Для проведения экспериментов по определению проницаемости мембраны для глюкозы большие однослойные липосомы готовили эфирным методом (Веа/пег, Вап^Ьал, 1976) из РС, смесей РС с рое1 состава РС:РС = 125:1 и смесей РС с рсе.,-« в соотношениях 125:1, 1250:1, 12500:1. Состав водного раствора: 14 мМ глюкозы (или сахарозы), 20 мМ Трис-НС1. Разделение липосом и невклзочившейся в та глюкозы прводили хроматографически на колонке с Сефарозой 6В (20x1,6 см). Размер полученных липосом контролировали методом динамического светорассеяния (данные представлены в Таблице).

Измерение кинетики выхода протонов из липосом. Для индикации изменения рН внутри липосом использовали максимум возбуждения Флуоресценции протонпрованной формы пирашша \ - 405 нм»

регистрировали кинетику убывания флуоресценции в максимуме испускания \ = 51 о нм. Измерения проводили на флуориметре "HITACHI" дифференциальным методом. Для создания градиента рН (ДрН) на мембране липосом добавляли необходимое количество 0,05 М раствора КОН в наружную среду.

Измерение кинетики выхода глюкозы из липосом. Через определенные промежутки времени (1/2, 1, 3. 6, 3,4 часа) после помещения полученной суспензии липосом в термостат (37°с) проводили рехроматографию образцов (при 20°С). Количество глюкозы во фракциях, где выходят липосомы, и во фракциях, где выходит свободная (вышедшая из липосом за время инкубации) глюкоза, определяли ( жол-серным методом (Dubois et al., 1956).

. . Определение коэффициента проницаемости липосом. Коэффициент проницаемости липосом для глюкозы Кр определяли по формуле:

v 1 У'АС 1 = а ' ~ЗТ~ • •

где ¿со- создаваемый градиент концентраций глюкозы по обе стороны

мембраны, dC/St определяли по наклону начального участка

кинетической кривой, когда ACQ максимален, v и А - объем и

площ-дь поверхности липосом, вычисляемые, исходя из данных о

диаметре полученных липосом.

Коэффициент проницаемости мембраны для протонов К^ определяли по формуле:

к х _ п 1 У-до 1

V ~ в 1 А ' "W ' '

где В - поправка на буферные свойства фонового раствора.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Поведение простагландинов на границе раздела фаз электролит/воздух.

Все три исследованных простагландина поверхностно-активны и

образуют монослои на поверхности электролита. Монослои из FGE., и из PGE1-a растворимы в субфазе при о > 12 мН/м и о > 15 мН/м соответственно. Нерастворимые в субфазе монослои из pgf2«j удается сжимать до о = 49,5 мК/м, где происходит коллапс монослоя. Изотерма сжатия ст(s) монослоя из PGFgp характеризуется наличием язлома при о = 15 мН/м, что свидетельствует о переходе молекул ?с?2р в другое конформационное состояние при повышении а из-за Зольшей жесткости a-цепи в молекуле PGF2p (обусловленной двойной 3=С связью) по сравнению с pge1.

Определенные из кзотеш сжатия a(s) значения площади на

02 02 юлекулу составляют: для PGF0„ - 18,5 А , для PCE. - 18 А и для

о2 1

'ge.-а - 21 а . Разница в площадях на молекулу для рое., и дня

'GE1 -а, близкая к разнице площадей, занимаемых на поверхности

5енольной и карбокси- группами, свидетельствует о том, что

юкцезая группа а-цега в молекуле pg, как и циклопентаноЕое

:ольцо с полярными группами, находится в еодной фазе. Проведенная

: помощью молекулярных моделей оценка площадей, занимаемых

галекулами PG на поверхности, дала значения s, близкие к

юлученнкм экспериментально.

Смешанные монослои из PC и pg.

На рис.2 представлены изотермы сжатия o(s) монослоев, формированных из PGE^-а (кривая 1), PC (кривая 5) и из их смесей азного состава (кривые 2,3,4).

Изотермы сжатия о(s) смешанных монослоев из PC и всех сследозанных PG имеют ряд общих черт. 1. При малых о изотермы катия смешанных монослоев идут более полого, чем изотерма o(s)

N

онослоя из PC - смешанные монослои менее конденсированны. 2. При остижении значений о, близких к максимально достижимым значениям для монослоев из PGE1 и из РОЕ,-а и к значению а, при котором

а,мН/м

so

но

30

ю

Рис.2. Изотермы сжатия o(S) монослоев из: 1 -2 -

3 -

4 -

5 - PC.

PGE1-а;

смеси ?GE1-ift'.:PC=85:15¡ смеси PGE^-а :РС=75:25; смеси PGE1~a :PC=60:40s

m i о jo чо sa $ ¿г

наблюдается излом на изотерме сжатия о(s) монослоя из на

изотермах o(S) смешанных монослоев появляются плато: при о = 22 мН/м для смешанных монослоев из PC и PGE^a, при о = 12,5 мН/м для смешанных монослоев из PC и pge1 и при о = 16,5 мН/м'для смешанных монослоев из PC и FGí1^. 3. При дальнейшем сжатии (выше области плато) свойства монослоя меняются - он становится более конденсированным - наклон кривой о(S) увеличивается. 4. Давление коллапса ок смешаных монослоев оказывается выше, чем для монослоя из PC и составляет: ок = 44,5 мН/м для смешанных монослоев из К и PGE1, ок в 46 • мН/м для смешанных монослоев из PC и PCE, -аио( - 47,5 мК/м для смешанзшх монослоев из PC и PGF'2p.

, Смешанные монослои из PC, и PG нерастворимы в субфазе ни до, ни после области плато на изотермах сжатия a(s).

- 9 -Кривые смешения. Информация о взаимодействии молекул РС и pg в смешанном монослое может быть получена путем анализа зависимостей средней площади на молекулу в монослое s от мольного состава смеси х при постоянном о. В случае идеального смешения, когда составляющие монослой молекулы не взаимодействуют и площадь на молекулу каждого из компонентов остается преяней, выполняется закон идеального смешения: s = s^x, + где s. и s0 - площади на

I I с с. 1 с.

молекулу 1-го и 2-го компонентов смеси, ^ и. х2 - мольные доли i-го и 2-го компонентов в смеси. В этом случае зависимость s(x)a имеет вид прямой, соединяющей точки s1 и s2.

В случае смешения РС со всеми тремя исследованными простагландинами наблюдалось положительное отклонение эксперимек- ' тальных значений s от линии идеального смещения. Менее конденсированное состояние смешанного липид-простагландинового монослоя по сравнению с монослоями из РС и из pg свидетельствует о взаимном отталкивании разнородных молекул в смешанном монослое. Латеральная несмешиваемость молекул РС и pg должна приводить при сжатии монослоя к образованию доменов, обогащенных преимущественно молекулами одного типа. Процесс образования доменов сопровождается появлением плато на изотермах o(S) смешанных монослоев. Элекгронномикроскопическое исследование поверхности смешанных монослоев при содержании в них pg от 1 до 50 моль?»

показало наличие на поверхности монослоя фазовообособленных

о

участков диаметром не менее 200 а, подтвердив предположение об образовании доменов в монослое при повышении о .

Распределение электрического потенциала на поверхности лшшдного монослоя, модифицированного простагландинами. На рис.з схематически представлен профиль электрического

потенциала у поверхности липидного монослоя. Полное изменение потенциала на границе раздела монослой/раствор электролита будем называть граничным потенциалом монослоя ср. Он состоит из дипольной ср4 (изменение потенциала в области полярных головок лилидных молекул) и поверхностной срБ (изменение потенциала в диффузной части двойного электрического слоя у поверхности монослоя) составляющих. Следует отметить, ьчто ни граничный потенциал, ни его составляющие не могут быть измерены эксперименталь-

бозёух . I . . £ода

к©

Рис.3. Профиль граничного потенциала у поверхности монослоя: ср- граничный потенциал; срй- ди-польный потенциал; ср - поверхностный потенциал; ь- гидрофобная область монослоя; в- полярный, слой.

Чл

¡ю. На практике возможно измерение только изменения граничного потенциала, т. е. Дер. Однако в дальнейшем для простоты, как и большинство авторов, мы будем использовать термин "потенциал" вместо "изменение потенциала".

Граничный потенциал ср монослоев ра положителен и растет по мере сжатия монослоя. Его максимальная величина составляет: для монослоя из рсе1 - 410 мВ, из рсе.,-а - 305 мВ, из рср2р - 290 мВ. Поскольку .молекула ро имеет на конце а-цепи ионизуемую группу (рКа« 4,7), следовательно, поверхность монослоя, содержащего простагландины, в условиях проведения эксперимента (рН= 7,3) оказывается заряженной положительно, и измеряемая величина ср опреде-

ляется суммой диполыюго и поворхностного фе потенциалов.

Для вычисления <рв использовали обобщенную модель Гуи-Штерна, описывающую протонно-адсорбционное равновесие на поверхности мембраны. В рамках модели поверхность считается однородной и эквипотенциальной, содержащей определенное число кислых и основных групп, которые являются центрами адсорбции. В общем Случае система входящих в модель уравнений не имеет аналитического решения, поэтому все расчеты проводили на ЭВМ.

На рис.4 представлены полученная в ходе эксперимента изотерма сжатия ф(б) монослоя из рое.,-а (кривая 1) и рассчитанная зависимость Ф3(5) (кривая 2)'. Зависимость фЛ(Б) (рис.4, кривая э)

<ао

юи

' 330

■их

гт

т

■ -106

-У, «г

' Рис.4.Зависимости ф(в) (1),

Ф8(Б) (2) и фЛ(3) (3) ДЛЯ

монослоя рое.,-а.

ю го зо

- 12 -

была вычислена, исходя из того, что <р - cps.

Для смешанных монослоев из PC и ?GE1-a разного состава зависимости <pE(S) и <p4(s) были рассчитаны аналогично описанной выше процедуре. ч

Значения дипольного потенциала, отнесенного к одной молекуле <

монослоя <pd/n оказались близкими по величине для монослоев из PC и из PGE-j-а. По мере скатия монослоев из PC, из PGE1-a и из их смесей значение <pd/n уменьшается, при больших значениях о (вблизи коллапса) выходит на стационарный уровень. Уменьшение <pd/n при сжатии монослоя для нерастворимых монослоев из PC и из его смесей с PG по-видалому связано с изменением ориентации дентальных частиц при изменении плотности упаковки молекул на поверхности.

Для анализа электростатических взаимодействий pc и pg в смешанных монослоях строили зависимости граничного и дипольного потенциалов, отнесенных к одной молекуле смешаного монослоя, ср/п и (р^/п от состава монослоя при a=const. Получение экспериментально значения <р/п для смешанных монослоев из PC и pge1 и из PC и PGFgß и значения <Рй/п для смешанных монослоев из PC и PGE1 -а во всех случаях находятся выше линии идеального смешения, т.е. в смешанном монослое диполыше моменты молекул PC и pg не ориентированы протиЕоположнонаправленно, что могло бы способствовать стабилизации смешанного монослоя. Диполь-дипольше взаимодействия в смешанном лигшд-простагландановом монослое способствуют скорее расталкиванию разнородных молекул, что, по-видимому, и является причиной менее конденсированного состояния смешанных монослоев.

Коллапс смешанных монослоев.

Давление коллапса ок является одной из характеристик монослоя, отражающей взаимодействие молекул монослоя между собой и с молекулами еоды. Полученная экспериментально зависимость ок

<7к> мн/м

30

Рис.5. Зависимость поверхностного натяжения коллапса в смешанном мо-1/0 кослое ок от мольной доли РС (хм) в смешанном монослое из РС и РйЕ^.

30

го

смешанного монослоя из РС и PGE.j-a от мольной доли PG в смеси (хм) представлена сплошной линией на рис.5. Пунктирная линия представляет теоретическую зависимость oK(s), рассчитанную в предположении, что компоненты монослоя гомогенно смешиваются как в монослое, так и в коллапсировагаой фазе. В таком случае при достижении о„ и дальнейшем сжатии монослоя должно устанавливаться метастаОильное термодинамическое равновесие между монослоем и образующейся объемной фазой. В этом случав химические потенциалы компонентов в обеих фазах равны, и зависимость с»к(х) описывается уравнением:

d-x).exp[(oK-oB)-sB/M'] + x.exp[(aK-aA).sA/M] 1, где ок, Од и ов - поверхностное натяжение коллапса смешанного монослоя и монослоев компонентов А и В соответственноsA и s0 -

значения площадей на молекулу при коллапсе монослоев ■ А и В

>

соответственно; х - мольная доля компонента А в смешанном монослов. деленные значения переменных были получены из экспериментальных изотерм сжатия a(s) монослоев из РС и из гок^-а.

Экспериментальные значения ак существенно превышают рассчитанные теоретически для случая гомогенного смешения компонентов в монослое. Существует мнение (Тотоа1а-сог1ге1 ег а1., 1987) что причиной повышения о в смешанных монослоях может

V ^

быть образование ассоциатов или комплексов состава Апвт, причем состав смешанного монослоя в точке максимального отклонения экспериментальной кривой от теоретической зависит от величин п и т. Для смешанных монослоев из РС и РбЕ^ это отклонение максимально, когда на одну молекулу РС приходится 5-6 молекул рс, что, видимо, соответствует соотношению компонентов в образующихся в монослое доменах. Поскольку трудно предположить существование прочных сил связывания мевду гидрофобными частями молекул РС и рс, а электростатические взаимодействия, как было показано выше, не способствуют стабилизации монослоя, повышенную устойчивость к коллапсу смешанного липид-простагландинового монослоя мокно объяснить более сильным адгезионным взаимодействием смешанного монослоя с водой из-за присутствия в нем молекул рб.

Влияние простагландинов на протонную проницаемость больших однослойных липосом.

На рис.6 представлены типичные кинетические кривые изменения флуоресценции I.• рН-индикатора пиранина во внутреннем объеме липосом после создания градиента рН на мембране:1- липосомы из смеси РС:РСЕ.,-а = 40:1, рН0=6,3, ДрН=+0,7; 2- липосомы из РС рН0=6,з, ДрН=+о,7; 3- липосомы из смеси РСсРбЕ^ = 40:1, рН0=6,3, ДрН=+3,0.

Для липосом из РС значение вычисленное при ДрН=+0,7,

составляло 1,7•ю~5см/сек, для липосом из смеси молекулярного состава РС.-роЕ^а = 40:1 = 9,ооо-5см/сек, т.е. проницаемость липосом в присутствии гс увеличивалась более, чем в 5 раз.

- 15 -

Рис.6.

присутствии ро исключает возможность объяснения увеличения протонной проницаемости дестабилизирующим действием ро на липидный бислой.

Согласно результатам проведенных монослойных исследований в присутствии простагландинов в липидной мембране образуются особые структуры типа доменов, в которых на одну молекулу РС приходится 5-6 молекул РО. В области таких доменов, состоящих преимущественно из молекул го, должна повышаться вероятность прохождения через мембрану положительно заряженных частиц вследствие того,- что граничный потенциал <р в области домена ниже, чем <р у поверхности фосфатидилхолинового бислоя. При молекулярном составе использованных в эксперименте липосом РС.'Рй = 40:1 домены занимают нз более 4% от общей площади поверхности мембраны. Если предположить, что измеряемая нами интегральная протонная 'проницаемость

- 16 - .

мембраны определяется вкладами проницаемостей липвдной матрицы и доменов соответственно долям занимаемых ими площадей, то вычисленный коэффициент протонной проницаемости для области домена составит = 180-ю~^см/сек, т.е. протонная проницаемость в области домена, обогащенного ро, на два порядка величины выше, чем проницаемость ^модифицированной мембраны из РС.

Разница граничных потенциалов у поверхности монослоя из РС и монослоя из рсе^-о, составляет Дф « юо мВ. Изменение проводимости мембраны 01/бо связано с изменением граничного потенциала Дф выражением Дф = ^г^ •1ё(с1/со). Согласно этому выражению, для увеличения с на два порядка необходимо понижение ф примерно на 120 мВ, что несколько Оольпе, чем Дф, полученное при монослойном исследовании.

Обсуждая возможный механизм протонофоркого действия простагландинов, следует отметить, что многие' авторы изначально предполагают функционирование этих веществ в качестве переносчиков. Имеются, однако, другие возможности влияния растворенных в мембране веществ на ее' проницаемость. Здесь следует особо выделить два фактора - структурный (образование комплексов или доменов - реорганизация бислоя) и электрохимический (изменение профиля граничного потенциала на поверхности мембраны), которые, по-видимому, и работают в случае модификации липидного бислоя молекулами простагландина. Функционирование Рб в качестве неспецифических переносчиков катионов нам представляется маловероятным, так как при больших ДрН в присутствии Рй сохраняется двухфазность кинетики изменения рН (Еторая, медленная фаза обусловлена развитием на мембране диффузионного потенциала), т.е. РС сам не может переносить как протон, так и ион К+ в обратном направлении для снятия диффузионного потенциала. То, что молекула РС имеет много поляршх групп и не'

проникает вглубь мембраны дальше глицеринового остова фосфолипидной молекулы (Викторов и др., 1984), также делает сомнительным функционирование PC в качестве истинных переносчиков. Существует мнете (Deamer, 1987, Gutknecht, 1987), что аномально высокая (по сравнению с другими катионами) проницаемость липидных мембран для протона обусловлена образованием в мембране цепочек сопряженных водородных связей, обеспечивающих специфический перекос протона. Возможно, в области обогащенного полярными группами простагландинового домена такие цепочки образуются с большей вероятностью.

Простагландикы как модификаторы пассивной проницаемости мембраны. ■ При введении PG в липосош из PC глюкозная проницаемость не повышается, как в случае протонной проницаемости, а, наоборот, понижается. Это фактически указывает на то, что б каждом из исследованных случаев проявляется действие различных факторов.

В Таблице представлены значения коэффициента проницаемости липосом для глюкозы Кг и результаты измерения диаметра литгасом при разном содержании PG в мембране.

Рсг^-а оказывает большее влияние на проницаемость, -чем PGE1. При соотношешш компонентов РС:Р0Е1-<х = 125:1 мембрана практически непроницаема для глюкозы. Уменьшение пассивной проницаемости наблюдается даже при составе липосом PC^GE^-a -• 12500:1. При таком молекулярном составе мембраны негомс.генное смешение компонентов и образование доменов маловероятно. Следовательно, пошшегаю пассивной проницаемости мембраны связано не с возникновением в ней новых структурных образований, а с изменением барьерных свойств самого липидного бислоя, модифицированного простагландиноми.

Таблица

Состав ^ Диаметр 0 Кг, см/сек Кг(РС)/Кг(РС+РО

липосом ., , липосом, А

РС 1000 12-Ю "10 1

Р0:Р0Е1 =125:1 1500 2,0а0"10 6,0

РС:Р0Е^-а =12500:1 2000 7,4 .Ю-10 1,62

РСгРОЕ^-а =1250:1 2750 6,3'Ю-10 1,71

РС:РСЕ,-а =125:1 2800 0.1М0"10 III

Пассивная проницаемость мембраны для глюкозы обусловлена образованием в ее структуре динамических дефектов типа сквозных пор, размер которых сопоставим с'размерами молекулы глюкозы (для молекул сахарозы, больших, чем молекула глюкозы, липосомы оказались практически непроницаемы). Количество и размер дефектов зависят от механических сеойств мембраны, поэтому уменьшение пассивной проницаемости мембраны мокет рассматриваться как свидетельство изменения этих свойств. Это заключение согласуется с данными о повышении устойчивости к коллапсу смешанных липид-проста-гландиновых монослоев и с данными об увеличении диаметра однослойных липосом при увеличении в них концентрации Рй (см. Таблицу).

Таким образом, простагландины, меняя механические свойства мембраны, уменьшают пассивную проницаемость липидной матрицы, в области же простагландкнового домена увеличивается вероятность прохождения через мембрану положительно заряженных частиц, в частности, протонов вследствие изменения профиля электрического потенциала у поверхности мембраны.

В заключение следует отметить, что использованию в наших экспериментах концентрации^ простагландкнов вше, чем физиологические концентрации этих веществ в тканях. Однако, поскольку такие концентрации простагландкнов могут реализоваться локально в месте непосредственного синтеза РС или при использовании этих веществ б виде лекарственных препаратов, модифицирующее влияние простагландкнов на ' барьерную функцию мембраны может иметь определенное физиологическое значение.

Возможно, этими свойствами простагландкнов обусловлено оказываемое ими регулирующее влияние ка деятельность почек (Еодно-солевой обмен), участие в передаче нервного импульса и модулирующее действие на синаптические процессы (Б. мед. энциклопедия, 1983).

ВЫВОДЫ

1. Исследовано поведение простагландина РбЕ1, его

синтетического аналога РСЕ1-а и простагландина PGF.jp на границе

раздела фаз электролит/воздух. Определены площади на молекулу в

02

монослоях исследованных веществ, составляющие 18 А для рсе„, 21 02 02 1 А для РвЕ^-а и 18,5 А для РС?2р.

2. Исследованы смешанные монослои из яичного фосфатидилхолина и простагландинов РС^р, РйЕ^а и РСЕ1 на границе раздела фаз электролит/воздух. Найдено, что смешанные монослои являются менее конденсированными по сравнению с липидными монослоями. Обнаружено возникновение . фазовой неоднородности смешанных монослоев при повышении (двумерного давления в монослое - разделение монослоя на обогащенные иростагландином домены и липидаую матрицу. ^ Электронно-лпсроскопическов исследование обращенной в электролит поверхности :мешанного монослоя при содержании в нем простагландина от 2 до '

~ го -

50 ксль% показало образование в монослое фазовообособленных

о

структур диаметром не менее 200 А.

-i'

3. Установлено повышение устойчивости фосфатидилхолинового

монослоя к коллапсу при введении в него молекул простагландина.

По максимуму зависимости давления коллапса от состава смешанного (

монослоя оценен молекулярный состав доменов, обогащенных простагландином: 5-6 молекул простагландина на I молекулу фосфатидилхолина. Ка изменение механических свойств липидной мембраны в присутствии простагландинов указывает также обнаруженное увеличение диаметра однослойных фосфатидилхолиновых липосом в присутствии простагландинов ряда 2.

4. Исследовано Елиякие простагландинов на структуру двойного электрического слоя у липидной поверхности. Показано, что причиной меньшей конденсированности смешанного монослоя являются диполь-диполькые взаимодействия между молекулами фосфатидилхолина и простагландина.

'5. Спектральными методами исследовано влияние простагландинов на протонную проницаемость больших однослойных липосом. Определен коэффициент протонной проницаемости: для фосфатидилхолинового бислоя 1,7'10 см/с; для липосом,

сформированных из смеси РС : РСЕ^а =40:1 Кн+= 9,0 см/с, т.е. интегральная проницаемость модифицированных липидных мембран в пять раз больше, чем проницаемость немодифицированной фосфатидилхолиновой мембраны. Оценка проницаемости мембраны в области простагландиноЕого домена дала значения. К^- , на два порядка величины большие, чем для липидной мембраны. Увеличение протонной проницаемости липидной мембраны в присутствии простагландинов объясняется появлением на поверхности мембраны значительного отрицательного заряда в области простагландиновых доменов.

в. Найдено, что пассивная проницаемость лишдных оислоев для глюкозы не возрастает, как в случае протонной проницаемости, а, наоборот, убывавет. По сравнению с pge1 его синтетический аналог оказывает большее влияние на проницаемость мембраны для глюкозы, вызывая „заметное уменьшение даже при соотношении рс : ро ' = ю5. Уменьшение' пассивной проницаемости липидного бислоя в присутствии простагландинов объясняется изменением его механических свойств.

Основные результаты опубликованы в следующих работах:

1. Сорокина А.Д., Богуславский Л.И., Яйленко Т.Л., Фрейманис Я.Ф.С Соколов Г.П., Деборин Г.А. Протонная проницаемость лкпосом, обусловленная взаимодействием фосфатидилхолина с простагландином Ej и его аналогом// Доклады АН СССР.- 1988.- т. 229.- к 3.-C. 751-754.

2. Sorokina a.D.» Yanopolskaya N.D., Deborin G.A., Yailenko Ï.L., Hcsuclavci^" L.I., Divas I. Change xa sLruoture and permeability of phosphatidyleholine membranes stimulated by prostaglandins// Bioeleotrochem. Bioenerg.- 1990.- v.23.- N 3--p.271-284.

3. Сорокина A.Д., Янопольская H.Д., Бивас M.M., Яйленко T.Л., Богуславский Л.И. Исследование зависимости проницаемости фосфатидилхолиновых липосом для глюкозы от содержания в них простагландина// Биохимия.- 1991.- т.'56.- вып. 4.- с.747-752.

4. Яйленко Т.Л., Сорокина А.Д., Соколов Г,П. .'лализ поверхностных свойств простагландина £j и его аналога// Тез. докл.Бсес. конференции "Выделение, очистка и анализ биологически активных соединений": Сухуми, 1987,- с.62-63.

5. Sorokina A.D., Yailenlco T.L. Formation of- pbaee hteterogenety in phosphatidylohôline membrane» nuimd by

introduction of prostaglandins E.,// International symposium

"Molecular organization of biological structure". Abstract book:

Moboow, 1989.- p.68.

6. Soroleina A.D., Yailenlco T.L., Boguslavsky L.I. Formation • СГ"

of olasters ^nriohed by prostaglandins as a way of regulation of the primitive membrane permeability// The Sixth ISSOL Meeting and the IX International'Conference: Prague, 1989.- p.93.

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА:

1. Смирнов А.А. Бюлл. эксп. Оиол. мед., 1984, N 8, с.240-252.

2. Deamer D., Bangham A.D. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v. 443, p. 629-634.

3. Dubois M. et al. Anal. Chem., 195b, v. 23, p.350-356.

4. Tomoaia-Cotisel M. et al. Biochem.J., 1987, v. 248, p.877-882.

5. Викторов А.В. к др. Биол. мембр., 1984, т. I, с.478-486.

6. Deamer D. Bioenerg. Biomembr., 1987, v. 19, p.457-479.

7. Gutknecht J.^ Biochim. Biophys. Acta, 1987, v. 898, p.97-108.

8. В. мед. энциклопедия, т.21// Иод. ред. Б.В.Петровского. 3-е изд..- М.: Сов. энциклопедия, 1983, с.162-165.

Подписано в печать 2.07.91. 60x84.1/16. Ротапринт. Усл.-печ.л. 1,5. Уч.-изд.л.1,25. 3.608 T.I02. Цена

Производственно-издательский отдел МолдНШТсМ.Тел.ь<:-34-;гУ. Адрес: 277054,Кишинев, ул.И.Крянгэ,45.