Вторичное изучение биологически активных объектов при импульсно-периодическом лазерном возбуждении тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

1 3 ■;

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ФИЗИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ИМ. П.Н.ЛЕБЕДЕВА

На правах рукописи УДК 535.361

КОЗУЛИН ЕВГЕНИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ВТОРИЧНОЕ ИЗЛУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ-АКТИВНЫХ ОБЪЕКТОВ ПРИ ИМПУЛЬСНО-ПЕРИОДИЧЕСКОМ ЛАЗЕРНОМ ВОЗБУЖДЕНИИ

Специальность 01.04.05 - оптика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук.

Москаа - 1994г.

Работа выполнена в Физическом институте Российской Академии наук им. П.Н.Лебедева.

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук

профессор В.С.Горелик

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Акципетров О,А.

доктор физико-математических наук Пащенко В.З.

Ведущее предприятие - Московский физико-технический институт,

[-.Долгопрудный

в часов на

Защита состоится " 1995г. в ^

заседании специализированного совета К 002.39.01 при Физическом институте Российской Академии наук им. П.Н.Лебедева. Адрес: Москва, Ленинский пр.,53.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Физического института Российской Академии наук им. П.Н.Лебедева. Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета.

кандидат физико-математических наук Чуенков В.А.

Актуальность темы: Для понимания процессов, происходящих в биологических системах, необходимо знание энергетического спектра важнейших биологических молекул. Такая информация может быть получена из эксперимента на основе спектральных методов исследования. К таким методам можно отнести спектроскопию комбинационного рассеяния света, адсорбционную спектроскопию, различные виды люминесцентного анализа и др.В связи с этим новые возможности при проведении спектрального анализа в биологических объектах возникают при использовании в качестве источников возбуждающего излучения лазеров на парах металлов. Такие лазеры характеризуются генерацией а видимой (зеленая, желтая, красная) области спектра. Кроме того, такие лазеры работают в режиме коротких импульсов (10 3с) сравнительно малой энергии (10_3Дж). При этом они характеризуются большой частотой следования импульсов генерации <Ю4Гц). Такой режим работы лазеров на парах меди обеспечивает как высокую эффективность возбуждения различного вида спектров, так и отсутствие существенных разрушений структуры анализируемых молекул. Разделенные во времени процессы возбуждения молекул и флуоресценции с помощью специальных методик регистрации в ряде случаев значительно улучшают чувствительность спектральных методов. Кроме того, достаточно высокая интенсивность возбуждающего излучения увеличивает вероятность многофотонных процессов. Это позволяет исследовать биологические и органические вещества с помощью нелинейно-оптических аналогов известных спектральных процессов: гиперкомбинационного рассеяния света, и двухфотонно-возбуждаемой люминесценции. В ряде случаев такие виды спектрального анализа позволяют дополнить информацию об энергетической структуре органических молекул. Кроме того, в случае двухфотонных процессов имеется ряд приемуществ, связанных с

разнесением спектрального диапазона, в котором наблюдается вторичное и возбуждающее излучения. Другое преимущество двухфотонного возбуждения образца заключается в том, что в случае молекулярных кристаллов возбуждающее излучение часто не попадает в полосу поглощения объекта. При этом в процессах флуоресценции могут участвовать внутренние слои вещества, и полученные спектры несут информацию об объемной энергетической структуре исследуемого молекулярного кристалла.

Цели работы состояли в следующем:

1. Получение спектров вторичного излучения органических молекулярных кристаллов и фармацевтических объектов в антистоксовой области спектра на основе использования импульсно-периодического лазера на парах меди.

2. Исследование вторичного излучения биологических объектов при импульсно-периодическом лазерном возбуждении в широком спектральном диапазоне.

3. Изучение спектров комбинационного рассеяния света при импульсно-периодическом лазерном .возбуждении на внешних колебаниях поликристаллических аминокислот.

4. Изучение спектров вторичного излучения зеркальных изомеров аминокислот в стоксовой и антистоксовой областях.

Методика исследований. В качестве источника возбуждающего излучения использовался малогабаритный импульсный газоразрядный лазер на парах меди типа "Фемта" с воздушным охлаждением. Использованный лазер на парах меди имел две линии генерации 510,бнм и 578,2нм. Частота повторения импульсов составляла ЮкГц, средняя мощность излучения - около 3Вт. Длительность импульса генерации составляла 12нс, а пиковая мощность

излучения - 50кВт. Диаметр лазерного пучка на выходе из трубки составлял 12ми.

Регистрация спектров вторичного излучения осуществлялась с использованием монохроматоров МСД-2 или ДФС-24.

Объекты исследования.Для проведения исследований использовались паспортизованные порошки фирмы "РеапаГ (Венгрия) органических веществ с размерами частиц 10-Ю0мкм. Количество примесей по паспорту таких образцов не превышало 0,2 Порошки некоторых веществ, таких как етильбен, антрацен, были получены в лабораторных условиях из монокристаллов соответствующих веществ. Размеры частиц таких образцов были выдержаны в рамках 10-100мш. Сложные биологические вещества, такие как азотистые основания, твердотельная ДНК, белки - лизоцим, суинсулин были изготовлены фармацевтическими предприятиями России.

Научная новизна. Оригинальные научные результаты данной работы состоят в следующем:

1. В спектрах антистоксова вторичного излучения органических веществ с элементами ароматической структуры присутствуют полосы в ближней ультрафиолетовой и фиолетовой областях спектра. Форма и характер таких полос чувствительны к структуре и фазовому состоянию данных объектов. Интенсивность таких полос в спектрах фармацевтических веществ и аминокислотах на порядок ниже интенсивности аналогичных полос в спектрах ароматических поликристаллов и на порядок выше интенсивности аналогичных полос в спектрах белкоз и нуклеиновых кислот.

2. Обнаружено различие а форме спектров антистоксова вторичного излучения при двухфотонном возбуждении для зеркальных изомеров триптофана в поликристаллической фазе.

3. В спектрах комбинационного рассеяния на внешних колебаниях кристаллических аминокислот обнаруживаются интенсивные частоты, относящиеся к либрационным модам. Интенсивность полос, относящихся к либрациям оказывается на порядок выше интенсивности полос относящихся к трансляционным колебаниям.

4. В спектрах стоксова вторичного излучения поликристаллических органических веществ при импульсно-периодическом возбуждении присутствует широкая полоса, интенсивность которой обычно на порядок выше интенсивности полос двухфотонно-возбуждаемого антистоксова вторичного излучения тех же веществ.

Практическая ценность. Полученные данные могут быть использованы для изучения энергетической структуры молекулярных кристаллов и сложных биологических молекул, а также для расчета параметров экситонов Френкеля в молекулярных кристаллах. Разработанная методика применима для реализации новых способов количественного и качественного анализа гетерогенных молекулярных объектов.

Апробация работы. По полученным результатам проводились семинары в Оптическом отделе ФИАН. Материалы были представлены на международной конференции Европейского Биоэлектромагнитного Общества, Е.В.Е.А., Словения, ноябрь 1993г.

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 7 работ.

Объем работы. Диссертация состоит из четырех глав, введения, заключения и списка литературы. Объем диссертации составляет 141 страницу, включая 54 рисунка и 5 таблиц. Список литературы включает 104 наименования.

Содержание работы. Во введении дана общая характеристика работы. Ставится цель исследования, обосновывается актуальность проблемы, практическая ценность, научная новизна работы.

В первой главе описываются процессы происходящие при возбуждении органических молекулярных веществ лазерным источником. Исследованные в работе молекулярные кристаллы характеризовались достаточно широкой запрещенной зоной и были прозрачны для фотонов возбуждающего излучения. При большой пиковой интенсивности возбуждающего излучения, использовавшегося в экспериментах, повышалась вероятность двухфотонного поглощения в образце. Исследованное вторичное излучение в основном было обусловлено двухфотонным поглощением вещества. При поглощении двух фотонов возбуждающего излучения с частотой \'0 кристалл переходит в

возбужденное состояние. Роль возбужденных состояний могут играть экситонно-колебательные уровни, электронно-дырочная плазма, а также биэкситонные состояния. Биэкситонные состояния, как правило, являются короткоживущими (Ю-11 - 10"12с). Из этих состояний система достаточно быстро переходит в более низкое возбужденное состояние Ее, соответствующее в молекулярных кристаллах метастабильным

экситонам (Ю-3 - 10"7с). Такой переход может произойти как в результате излучения, так и через безизлучательную релаксацию. При переходе кристалла из возбужденного состояния Ее на колебательные уровни

основного состояния возникает флуоресцентное излучение, характеризующее энергетическую структуру кристалла. Кроме этого, в кристалле могут идти процессы гиперрелеевского рассеяния света, когда возникают фотоны удвоенной частоты 2у0. Возможны также процессы

гиперкомбинационного рассеяния света, в результате которых возникают фотоны с энергией Е" ~ Иг' = 2Иу0 - Ев , а кристалл оказывается на

низшем возбужденном уровне Ев. В дальнейшем это возбужденное состояние может участвовать в процессах флуоресценции. При двухфотонном возбуждении существует также вероятность возникновения четырехфотонных процессов, при которых возникают одновременно два кванта с энергиями Е' и Е" = Ее - hvf, где hv? -

энергия возбужденного фонона.

Во второй главе описывается методика лазерного возбуждения молекулярных кристаллов на основе двухфотонного поглощения. Описывается принцип работы используемого лазера на парах меди с воздушным охлаждением типа "Фемта", а также методика регистрации спектров вторичного излучения с помощью монохроматоров МСД-2 и ДФС-24. Используя монохроматор ДФС-24, можно было получать спектры стоксова рассеяния в длинноволновой области вплоть до 850нм. С другой стороны использование монохроматора МСД-2 позволяло получать спектры антистоксова рассеяния в коротковолновой области вплоть до 200нм. В этой главе приведены также оценки ошибок экспериментальных данных.

В третьей главе, описываются спектры вторичного излучения биологически-активных веществ при импульсно-периодическом лазерном возбуждении в антистоксовой области. Показано, что главный вклад в спектры антистоксова вторичного излучения (АВИ) вносит двухфотонно-возбуждаемая люминесценция , характер которой определял форму спектров АВИ во всех исследуемых веществах. На рис.1 представлены спектры АВИ для веществ из первой группы: бензойной кислоты, нафталина.стильбена. На рис.2 приведены спектры АВИ веществ из второй группы ( фармацевтические объекты ): ацетилсалициловой кислоты и сульфадиметоксина. Рис.3 иллюстрирует спектры АВИ веществ из третьей группы : гуанина, тимина и тамидина. Все спектры приведенные на рисунках соответствуют комнатной температуре.

I—

200

~Т—

300

цоо

нп

500

Рис.!. Спектры антистоксова вторичного излучения некоторых ароматических веществ: | - бензойной кислоты, || -нафталина, ||| -стильбвна.

-50 Щ

15-

Ю-

5-

30 _|_

ю

20 I

10'

^оГ1

А

им

200 300 400 500 600

Рис. 2 Спектры антистоксова вторичного излучения фармацевтических объектов: | - ацетилсалициловой кислоты, 11 - сульфадиметоксина.

200 30о НОО 500 600

Рис. 3 Спектры антистоксова вторичного излучения биологически-активных ароматических веществ: | гуанина, || -тимина, ||| -тимидина.

Таблица 1. Сравнительные характеристики спектров АВИ для некоторых органических кристаллов. Е^ - энергия синглетного возбужденного уровня,

Уьтях~ положение максимума полосы, А Аг •

"гпах"1 положение максимума полосы относительная пиковая интенсивность.

ширина линии

. ъ -

N Вещество Е^ , нм "А , нм А % , нм 10 , отн.ед.

1. Тимин 285 л 340 63 14

2. Бензойная 290 310 60 200

кислота

3. Ацетилсалици- 300 350 62 19

ловая кислота

4. Тимидин , 310 345 55 21

5. Гуанин 325 360 48 18

6. - ; Нафталин, / > 1 $25 , (ч „ 340 . * 1 ' 43 , ■ 115

7. Стиль бен ! 360 со С*Ч 40 140

- Н . 1 '

Масштаб по шкале интенсивности на рис.2 и рис.3 уменьшен в 10 раз по сравнению с рис.1. Некоторые параметры наблюдаемых спектров АВИ показаны в таблице 1.

Получены спектры двухфотонно-возбуждаемого антистоксова вторичного излучения в поликристаллических порошках триптофана, О-триптофана и рацемата 01_-триптофана, изображенные на рис.4. Полученные данные выявляют существенные отличия между формами и интенсивностями полос в спектрах вторичного антистоксова излучения для оптических изомеров триптофана.

В соответствий с теорией электронных состояний в органических кристаллах, исследованных в данной работе, электронные возбуждения в кристаллах такого типа относятся к экситонам Френкеля (экситонам малого радиуса). На основе полученных экспериментальных данных были определены некоторые параметры экситонов з исследуемых образцах (см. таблицу 2).

В четвертой главе описываются спектры вторичного излучения биологически-активных веществ при импульсно-периодическом лазерном возбуждении в стоксовой области. Приводятся спектры стоксова комбинационного рассеяния на решеточных модах для некоторых поликристаллических аминокислот, начиная с самой простой по структуре (глицина) и заканчивая спектрами ароматической аминокислоты - триптофана.

На рис.5 показаны полученные спектры вторичного излучения в стоксовой области для кристаллического стильбена, поликристаллического стильбена и антрацена. На рис.6 показаны спектры стоксова вторичного излучения (СВИ) для порошков триптофана, твердотельной ДНК и поликристаллической серы. Как видно из рис.5 и рис.6 в спектрах стоксова вторичного излучения органических поликристаллов обнаруживается присутствие широкой ,

Рис. 4 Спектры антмстоксова вторичного излучения триптофана: | -1_- триптофан, 11 - О- триптофан, 111 -- ОЬтригтгофан.

Таблица 2. Параметры экситонов Френкеля, вычислзнные на основа экспериментальных данных: £2о - частота длинноволнового края полосы АШ ) Птах - частота

коротковолнового края полосы АВИ ( Д . ширина полосы АВД ГП - эффективная масса зкситона, Э - максимальная скорость перемещения экситона, Л - средняя длина свободного пробега экситона, I. • максимальная длина: перемещения экситона.

Вещество По, с-1 Фтах,^1 А. с-1 ГП, г Э, см/с Л, см I., см

*1015 *1015 *1015 *10-2а *10® *1СИ

Ацетилсалициловая 4,54 5,98 1,44 1,3 1,9 1,9 1,9 кислота

Сульфадиметоксин 4,48 5,71 1,23 1,5 1,7 1,7 1.7

Стрептоцид 4,р8 г 5,71 ¡1,33 1,37 \ 1,8

1,8

1,8

500 600 700 800 900

Рис. 5 Спектры вторичного излучения в стоксовой области:

кристаллический стильбен, II - поликрисг&ллический стильбен, 111 -поликристаллический антрацен, ^ -положение возбуждающей.

20

1,0Й ЕД.

20 Н

15-^

10

5-

15

I

1

12 к Ю'

500 600

т

)

СМ

1

нм

800

900

Рис. б Спектры вторичного излучения в стохсовой области: | -поликристаллический триптофан , || - твердотельная ДНК, III - поликристаллическая сера, ' - положение возбуждающей .

интенсивной полосы, примыкающей к диапазону внутримолекулярных колебаний. Присутствие дополнительных полос в спектрах СВИ исследованных объектов объясняется участием поверхностных электронно-колебательных состояний в процессах поглощения света и вторичного излучения.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ ПО ДИССЕРТАЦИИ

1. Исследованы спектры вторичного излучения органических и биологически-активных веществ при импульсно-периодическом лазерном возбуждении. Полученные спектры исследованы в широком спектральном диапазоне: 200-800нм, Обнаружено, что в спектрах антистоксова вторичного излучения органических веществ с ароматическим строением присутствуют полосы в ближней ультрафиолетовой и фиолетовой областях спектра. Антистоксово вторичное излучение объясняется как процесс двухфотонно-возбуждаемой люминесценции. Форма и характер наблюдаемых полос чувствительны к структуре и фазовому состоянию исследованных объектов. Наибольшей интенсивностью спектров двухфотонно-возбуждаемой люминесценции характеризуются ароматические поликристаллы, такие как стильбен, антрацен, нафталин, флуорен и др. На порядок менее интенсивными оказались спектры двухфотонно-возбуждаемой люминесценции ароматических аминокислот и фармацевтических веществ, таких как стрептоцид, сульфадимезин, сульфадиметоксин и др. Еще на порядок менее интенсивны спектры двухфотонно-возбуждаемой люминесценции сложных биологически-активных веществ, таких как белки, нуклеиновые кислоты, азотистые основания нуклеиновых кислот.

2. Исследованы спектры антистоксова вторичного излучения при двухфотонном возбуждении ароматических аминокислот в различных фазовых состояниях. Обнаружено различие в форме спектров

антистоксова вторичного излучения при двухфотонном возбуждении для зеркальных изомеров поликристаллического триптофана.

3. Для ряда аминокислот в кристаллической фазе получены спектры комбинационного рассеяния света на внешних колебаниях при разных температурах. Интенсивности полос, относящихся к либрациям, оказываются на порядок выше интенсивностей полос, относящихся к трансляционным колебаниям. Показано, что наиболее интенсивные компоненты в либрационных дублетах принадлежат типу симметрии Вд.

4. Обнаружено, что в спектрах стоксова вторичного излучения поликристаллических стильбена, антрацена и серы присутствует широкая интенсивная полоса, примыкающая к диапазону внутримолекулярных колебаний со стороны высоких частот. Установлено, что интенсивность стоксова вторичного излучения существенно выше (в 5-10раз) интенсивности антистоксова вторичного излучения тех же веществ. Высказывается гипотеза о преимущественном влиянии поверхности для объяснения возникновения дополнительных полос в Спектрах стоксова вторичного излучения поликристаллических объектов.

5. На основе полученных экспериментальных данных определены параметры экситонов Френкеля в , исследованных кристаллических образцах: эффективная масса, длина свободного пробега и др. Эффективная масса экситона Френкеля в изученных объектах оказалась сравнима с массой электрона, а максимальная скорость движения близка к скорости звука в кристаллах. Средняя величина свободного пробега экситона Френкеля оказалась на порядок больше постоянной решетки. На основе рассмотренной модели сделан вывод о существовании механизма экситонного переноса энергии в фармацевтических и биологически-активных веществах.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Горелик B.C., Злобина Л.И., Козулин Е.А. "Комбинационное рассеяние света на решеточных модах а-глицина", Краткие сообщения по физике ФИАН, 1992, №1-2, с.20-23.

2. Горелик B.C., Козулин Е.А. "Двухфотонно-возбуждаемая люминесценция в органических кристаллах", Краткие сообщения по физике ФИАН, 1992, №7-8,с.66-70.

3. Горелик B.C., Асанов А.И., Злобина Л.П., Козулин Е.А., Козулин А.Т. "Электронные спектры пропускания водных растворов зеркальных изомеров триптофана", Краткие сообщения по физике ФИАН, 1992, №11-12,0.39-42.

4. Горелик B.C., Козулин Е.А. "Двухфотонно-возбуждаемая люминесценция в оптических изомерах триптофана", краткие сообщения по физике ФИАН, 1993, №3-4, с,8.

5. Горелик B.C., Козулин Е.А. "Двухфотонно-возбуждаемая люминесценция в биологически-активных твердотельных структурах", Квантовая электроника, 1994, т.21, №4, с.21.

6. Гаряев П.П., Горелик B.C., Козулин Е.А., Щеглов В.А. "Двухфотонно-возбуждаемая люминесценция в. твердотельной фазе ДНК", Квантовая электроника, 1994, т.21, №5, с.32.

7. Горелик B.C., Козулин Е.А. "Вторичное излучение в органических поликристаллах при возбуждении лазером на парах меди", Журнал прикладной спектроскопии, 1994, т.61, №5-6, с.35.

Подписано в печачь 19 января 1995 года Заказ № 14. Тираж 100 экз. П.д. 1.4.

Отпечатано в ШИС ФИАН

Москва, В-333, Ленинский проспект, 53.