Высокоэффективный электрокатализ гидрогеназами для конверсии органических отходов в электричество тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

На правах рукописи

41255

ВОРОНИН Олег Геннадьевич

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ ЭЛЕКТРОКАТАЛИЗ ГИДРОГЕНАЗАМИ ДЛЯ КОНВЕРСИИ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ В ЭЛЕКТРИЧЕСТВО

Специальности: 02.00.15 - кинетика и катализ 03.01.06 — биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва, 2010

4841255

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор

Карякин Аркадий Аркадьевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор

Решетилов Анатолий Николаевич

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. ГХСкрябина РАН;

доктор химических наук, профессор

Ярополов Александр Иванович Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля

Защита состоится «8» февраля 2011 года в 16 часов 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, Кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «30» декабря 2010 года Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 501.001.59

кандидат химических наук / ÛLsC^-, Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Поиск возобновляемых источников энергии и развитие методов переработки накопленных отходов - одни из ключевых задач, стоящих перед человечеством в начале XXI века.

Водород рассматривается многими исследователями как перспективный вид вторичного топлива. Однако на сегодняшний день, несмотря на огромные затраты, не существует ни одного коммерчески эффективного применения технологий водородной энергетики. До сих пор не решены проблемы, связанные с получением, транспортировкой и утилизацией водорода. Узкоспециализированные мелкосерийные агрегаты для таких отраслей, как военная и космическая промышленности, учитывать не корректно, т.к. к ним понятие «коммерческой эффективности» неприменимо.

Вместе с тем сегодня активно развиваются методы микробиологического получения водорода из органических соединений, в том числе отходов. Выделяемый микроорганизмами биоводород обладает низкой себестоимостью, однако значительно загрязнен побочными продуктами метаболизма. Использование его в традиционных платиновых топливных элементах или сжигание без дополнительной дорогостоящей очистки невозможно.

Ранее в нашей лаборатории была показана принципиальная возможность поглощения водорода из среды действия микроорганизмов при помощи ферментных топливных элементов на основе гидрогеназ. Цель данной работы состояла в разработке новых высокоактивных электродов на основе гидрогеназ, исследовании их характеристик и создании на их основе системы непрерывной конверсии органических соединений в электричество через промежуточное образование биоводорода. Для достижения указанной цели решались следующие задачи:

- разработка новых методов иммобилизации гидрогеназ на поверхности углеродных электродов с использованием различных соединений, содержащих аналоги субстрата гидрогеназы, для достижения высокоэффективного биоэлектрокатализа;

- анализ электрокаталитических характеристик создаваемых электродов;

- исследование активности электродов в различных условиях (рН, температура, содержание водорода и кислорода);

- вовлечение в биоэлектрокатализ гидрогеназ различного строения и из различных источников;

- объединение топливного элемента (ТЭ) на основе ферментов и биореактора с микробными продуцентами водорода;

- повышение стабильности ферментных электродов в культуральной жидкости.

Научная новизна.

На основании предложенного подхода иммобилизации гидрогеназ поверх полимеров, содержащих аналога субстрата, разработаны новые гидрогеназные электроды, превосходящие известные аналоги по электрокаталитическим параметрам и стабильные в широком диапазоне потенциалов и температур. На основании расчета электрокаталитических параметров продемонстрировано, что наблюдаемые плотности тока окисления водорода являются теоретически максимальными для однослойных гидрогеназных электродов.

В работе впервые продемонстрирован высокоэффективный прямой биоэлектрокатализ четырех субъединичной КАО-завксимой гидрогеназой (источник Ругососсих/ипозш). Интерес к подобным гидрогеназам вызван не только перспективами их использования в ТЭ, но и потенциальной возможностью применения для биоэлеетросинтеза различных молекул.

Впервые успешно продемонстрирована возможность объединения биореактора с продуцентами водорода водородного топливного элемента на основе гидрогеназ. Практическая значимость работы.

Разработанные ферментные электроды были успешно применены для поглощения водорода из среды действия фото- и гетеротрофных продуцентов. В работе предложена установка, объединяющая топливный элемент и биореакгор с бактериями, выделяющими водород, и позволяющая проводить непрерывную конверсию целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию без дополнительных стадий накапливання и очистки водорода. Описаний аналогичных установок полного цикла в литературе не встречается. Предложенный в работе биореакторный топливный элемент может найти широкое применение для утилизации органических отходов. Положения, выносимые на защиту:

1. методы иммобилизации гидрогеназ на поверхности углеродных электродов с использованием различных полимеров, содержащих аналоги субстрата гидрогеназы;

2. результаты исследований электрокаталитических характеристик электродов и их зависимости от таких параметров, как температура, рН, состав газовой смеси;

3. биоэлектрокатализ N АО-зависимой гидрогеназой;

4. установка для непрерывной конверсии целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию.

Работа выполнена при финансовой поддержке фондов ЖТАБ, «Глобальная энергия», Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере, Российского Фонда Фундаментальных Исследований, Федерального агентства по науке и инновациям, программы Президиума РАН №26 «Водородная энергетика».

Публикации и апробация работы. По материалам диссертационной работы опубликовано 32 работы, в том числе 6 статей в российских и зарубежных научных журналах и 26 тезисов докладов, представленных на международных и всероссийских научных конференциях.

Основные результаты работы представлены на конференциях: Всероссийский симпозиум «Биотехнология микробов» (Москва, 2005 г.), Всероссийская конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2005 г.), конференции «Ломоносов» (Москва, 2005 и 2006 гг.), 18-й Международный Симпозиум по Биоэлектрохимии и Биоэнергетике (Куимбра, Португалия, 2005 г.), Международный форум «Водородные технологии для производства энергии» (Москва, 2006 г.), Международная школа-конференция молодых ученых в рамках Междупародпого Симпозиума «ЕС-Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной Программе» (Санкт-Петербург, 2006 г.), Вторая всероссийская конференция по аналитической химии «Аналитика России» (Краснодар, 2007 г.), Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2008, 2009, 2010 гг.), VI Всероссийская Каргинская конференция "Наука о полимерах 21-му веку" (Москва, 2007 г.), XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии (Москва, 2007 г.), X International conference Hydrogen materials science and chemistry of carbon materials (Киев, 2007 г.), П научно-практическая конференция «Перспективы развития инноваций в биологии» (Москва, 2008 г.), 59 Meeting of International Society of Electrochemistry (Севилья, Испания, 2008 г.), Международный Форум по нанотехнологиям (Москва, 2008 и 2009 гг.), The 12th International and the first Sino-Japan bilateral symposium on Electroanalytical Chemistry (Китай, 2009 г.), 7th Spring Meeting of International Society of Electrochemistry (Польша, 2009 г.), XIX Менделеевская конференция молодых ученых (Санкт-Петербург, 2009 г.), И Международный конгресс "ЕвразияБио-2010" (Москва, 2010 г.), The 9th International Hydrogenase Conference (Швеция, 2010 г.), Electrochemistry 2010: From microscopic understanding to global impact (Германия, 2010 г.).

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 135 страницах машинописного текста, иллюстрирована 55 рисунками, 4 таблицами и I фотографией. Список цитируемой литературы содержит 178 наименований. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Кратко обоснована актуальность темы и цель представленной работы, показаны научная новизна и практическая значимость исследования.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 2.1. посвящена строению, свойствам и классификации гидрогеназ. Содержит современные взгляды на механизм катализа, строение активного центра и переходы между различными состояниями последнего. Описаны различия между тремя основными группами гидрогеназ и их роль in vivo.

В главе 2.2. рассмотрены медиаторный и прямой биоэлектрокатализы ферментами. Обсуждаются методы повышения их эффективности.

В главе 2.3. представлены описанные в литературе биологические топливные элементы на основе как ферментов, так и целых микробных клеток. Сравниваются достоинства и недостатки таких систем с другими источниками энергии.

Глава 2.4. содержит описание современных способов получения биоводорода фото- и гетеротрофными микроорганизмами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В данной главе описаны использованные материалы и методы. В работе использованы препараты [NiFej-гидрогеназ из Thiocapsa roseopersicina и Lamprobacter modestohalophilus, [NiFeSeJ-гидрогеназы из Desulfomicrobium baculatum и четырехсубьединичной NAD-зависимой [NiFeJ-гидрогсназы из Pyrococcus furiosus.

Для иммобилизации ферментов использовали углеродные ткани различных типов, модифицированные различными соединениями, углеродные нанотрубки, лапонит, слоистые анионообменные глины состава Zn2Cr(OH)6. Электрохимические исследования ферментных электродов проводились в трехэлектродной ячейке с разделенным пространством всех электродов. В качестве электрода сравнения использовались платина, покрытая платиновой чернью, в атмосфере водорода в том же растворе (обратимый водородный электрод, ОВЭ) и хлорсеребряный электрод в 1 М КС1 (х.с.э.). В качестве вспомогательного - стеклоуглеродный электрод большой площади. Для экспериментов по поглощению водорода, продуцируемого микроорганизмами, была разработаны специальные установки, объединяющие биореактор и ферментный топливный элемент. Описания установок приведены ниже.

Все исследования проводились в следующих условиях: 0,05 М КН2РО4, 0,1 М КС1, рН 7,0,25°С, если иное не указано особо.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОЕСУЖДЕНИЕ 4.1. Кинетические характеристики катализа гадрогеназами, предельные токи

При помещении электрода с иммобилизованной гидрогеназой в продуваемую водородом электрохимическую ячейку, наблюдается постепенное снижение потенциала разомкнутой цепи до нуля относительно ОВЭ, обусловленное переходом фермента из неактивной формы в активную. При этом вне зависимости от выбранного метода иммобилизации мы наблюдаем волну (рис. 1), разделяющую этот процесс да три этапа: два медленных (с 0 по 40 секунды и с 60 секунды) и быстрый (с 40 по 60 секунды). Это явление объясняется с позиции теории о неактивных формах №-А и N¡-8. Подтверждением этого предположения может служить отсутствие волны при медленной активации (первые часы) в микробных культурах (см. гл. 4.5.2). В этом случае постепенная активация протекает быстрее, чем растет концентрация водорода.

Ранее в нашей лаборатории в работе [1] был разработан метод получения высокоактивных гидрогеназных электродов на основе углеродной ткани, модифицированной виологен содержащим производным полипиррола, с использованием гидрогеназ из Т. гозеорептпа и О. Ъасгйс&ит. При положительных перенапряжениях в атмосфере водорода наблюдались значительные токи окнсления водорода. Было показано, что при перенапряжениях, превышающих 200 мВ, наблюдается снижение активности электродов, предположительно, из-за окислителыюй инактивации. Поэтому, если не указано особо, за максимальный ток принимали значение при перенапряжении 200 мВ.

Известно, что ферменты, выполняющие одни те же функции, но выделенные из разных микроорганизмов, могут разительно отличаться друг от друга по своим свойствам. Поэтому использование гидрогеназ из различных источников является одним из путей улучшения характеристик ферментных электродов.

Гидрогеназа из ЬатргоЬаЯег тоскхгоШорЫЫ была впервые выделена в 2003 году сотрудниками НИИ Фундаментальных проблем биологии (г. Пущино). Для исследования использовались два препарата фермента, отличающиеся степенью очистки. Т.н. гомогенный препарат гидрогеназы был дополнительно очищен при помощи электрофореза. При этом удаляется слабо связанный с белком цитохром С3, закрывающий дистальный (приповерхностный) железосерный кластер.

Рис. I. Активация электродов на основе ткани ЛШГ с иммобилизованной гидрогеназой из Т. гохеорегхшпа в атмосфере водорода.

Гидрогеназа была иммобилизована на поверхности гидрофилизованной ткани ТВЩ и ткани ЛШГ, модифицированной полипиррол-виологеном. Для всех типов электродов использование фермента с удаленным цитохромом приводит к увеличению электроактивности примерно на 30%. Максимальный ток окисления водорода составил 1250 мкА/см2.

Гидрогеназа из О. ЬасиШит является цитоплазматическим белком и не связана прочно с цитохромом С3, что позволяет отделять цитохром от фермента даже при помощи хроматографических методов очистки. В то же время гидрогеназа из Т. гояеорегзкта - мембрансвязанный фермент, так же как и гидрогеназа из Ь. тоЫе5ЮИа1орИИш. Они прочно связаны с цитохромом, который блокирует туннелирование электрона от дистального железо-серного кластера на электрод. В работе показано увеличение активности ферментных электродов при удапении цитохрома при помощи электрофореза. Оптимальной концентрацией фермента в адсорбционном растворе для гомогенных препаратов Т. го5еорегжта и Ь. тос1е11ока1орЫ1из является 0,75-1 мг/мл. Для £>. ЬасиШит оптимальной концентрацией является 1,5 мг/мл.

Поляризационные кривые для ферментных электродов с различными гидрогеназами при оптимальных условиях представлены на рис. 2. Ток в катодной области обусловлен обратной реахцией - выделения водорода.

В работе [1] предложено следующее уравнение для описания зависимости тока от перенапряжения:

ехр 2-17 - ехр -2^-—ц

i =: " КТ > V КТ ) "1 (аР \ I ( V

где г} - перенапряжение, уо1 и уо2 -плотности токов обмена первой и второй стадий соответственно. Полагая а = 0,5, провели анализ анодной ветви поляризационной кривой различных ферментных электродов методом множественной нелинейной регрессии.

Поляризационные кривые для ферментных элехтродов с гидрогеназами из Ь. то<1е$1ока1орЫ1и5 и Т. гозеорешста в диапазоне от 0 до 75 мВ описываются экспоненциальной функцией. Поляризационная кривая для электродов с О.ЬасиШит близка к прямой при небольших перенапряжениях, что свидетельствует о том, что скорость реакции лимитируется скоростью диффузии субстрата к поверхности электрода (т.н. диффузионный контроль).

Рис, 2. Поляризационные кривые электроокисления водорода на электроде из ткани ЛШГ, модифицированной палипиррол-виапогеном с иммобилизованными гидрогеназами из раыичных источников.

Для двустадийного электрохимического процесса при малых отклонениях от равновесного потенциала суммарный ток обмена составляет удвоенное значение тока обмена медленной стадии [2]. В таблице 1 для ферментных электродов приведены удвоенные значения токов обмена медленной стадии. Для сравнения приведен ток обмена на платане в сходных условиях [1]. Для всех ферментных электродов ток обмена по порядку величины совпадает с аналогичной величиной для платины, которая, как известно, является одним из лучших катализаторов реакций окисления водорода -восстановления протонов [3]. Также в таблице приведено значение тока обмена на молекулу катализатора. Для платины количество атомов на единицу поверхности рассчитали из величины равновесной адсорбции водорода, составляющей 220 мкКл/см2

[3].

Таблица 1. Электрокаталитические свойства водородных ферментных электродов с

иммобилизованными гидрогеназами.

Электрод/фермент Адсорбция фермента, пмоль/см2 } макс., мА/см2 к эл.-хим., с-' к кин., с"1 Ток обмена, мкА/см2 Ток обмена на молекулу катализатора, А 10+".

Графитовая ткань ТВШ/ Т. гоБеорегзтпа 22±3 0.7±0.1 160±15 120 [4] 40±4 30±5

ЛШГ + полипиррол-виологен / Т. теорегзШпа 45±4 1.4±0.2 160±6 120 [4] 72±3 26±3

ЛШГ + ПОЛИПИррОЛ- виологен/ Л тос1е&оИа1ор11Ииз. 42+4 1.2±0.2 150±3 100 [5] 62±1 24±1

ЛШГ + полипиррол-виологен/ В. ЬасиШит. 40±4 1.7±0.2 220±30 450 [4] 130±20 53±8

Р1 (рН 7,0) <10 <0,1

Ток обмена на молекулу фермента меньше всего для электродов с ферментом, непосредственно адсорбированным на углеродную ткань. При переходе к электродам,

модифицированным полипиррол-виологеном, ток обмена на молекулу фермента возрастает одновременно с увеличением адсорбции фермента. При переходе к более активным ферментам величина тока обмена на молекулу фермента продолжает увеличиваться и для электрода на основе гидрогеназы из О. ЬасиШит в два раза превосходит величину, полученную для электродов с ферментом из Т. гохеорегзкта и Ь. пимкзюИаЬрЬНиз. Ток обмена па молекулу катализатора превосходит аналогичную величину для платины на два порядка.

Долю поверхности электрода, занятую ферментом, оценили исходя из значения минимальной поверхности, занимаемой одной молекулой гидрогеназы. Последнее было установлено в работе [6] на основе изотерм Лэнгмюра-Блоджет и составляет для гидрогеназы из Т. гозеоретста 32 нм2. Для ферментных электродов, исходя из геометрических размеров ткани и расчета количества иммобилизованного активного катализатора, площадь, занимаемая одной молекулой, составляет 3,3 нм2. Следовательно, фактическая площадь поверхности ткани должна быть в минимум в 10 раз выше, чем геометрическая. Это соответствует нижнему значению коэффициента шероховатости для ЛШГ.

Поскольку фермент является диэлектриком, второй и последующий слои не могут участвовать в электрохимическом окислении водорода в отсутствии диффузионно подвижного медиатора. Следовательно, наблюдаемые плотности тока обусловлены только первым слоем катализатора. Исходя из данных максимального тока окисления водорода и количества иммобилизованного фермента, оценили электрохимическую константу реакции. Данные представлены в табл. 1. Дня сравнения приведены оценки максимального значения каталитической константы, полученные из гомогенной кинетики в [5] и [4]. Как видно из табл. 1, для гидрогеназ из Т. гохеорегзШпа и Ь. то<1гз1о1га1орЫ1ш наблюдается соответствие электрохимической и кинетической констант. Следовательно, при иммобилизации фермент занимает всю доступную поверхность, формируя монослой и полностью вовлекаясь в биоэлектрокатализ. Таким образом, разработанная методика иммобилизации катализатора и использование гидрогеназы с удаленным цитохромом позволяет добиться теоретически максимальных значений плотности тока для однослойных электродов на основе гидрогеназ из Т. гозеорепШпа и Ь. тоЛе^ока'.орЫЫБ.

Дня гидрогеназы из Д ЬасиШит электрохимическая константа почти в два раза меньше кинетической. При этом поляризационная кривая близка к прямой при небольших перенапряжениях, что характерно для диффузионно контролируемых реакций. Похожая зависимость наблюдается и для электродов на основе Т. гозеоретста при низких концентрациях водорода в системе.

Таким образом, приведенные расчеты показывают, что разработанная методика изготовления ферментных электродов с использованием виологен-содержащих производных пиррола позволяет достигнуть предельно допустимых токов окисления водорода для однослойных электродов на основе гидрогеназы. При этом активность ферментных электродов максимально близка к аналогичной характеристике для платиновых электродов, использующихся в низкотемпературных топливных элементах. 4.2. Повышение эффективности биоэлектрокатализа гидрогеназами 4.2.1. Ферментные электроды на основе поливиологена

При разработке ферментных электродов желательно максимально упростить методику их изготовления, в частности, исключив этап электрохимического синтеза. Для этого было предложено использовать виологен-содержащий полимер - олиго-параксшшлен-М,>1'-4,4'-дипиридил (далее поливиологен).

Наиболее активные электроды были получены при сорбции поливиологена из его раствора в ацетонитриле (5 мг/мл) перед иммобилизацией фермента. Для электродов на основе гидрогеназы из Т. roseopersicina ток окисления водорода достигает 1200 мкА/см2. На рисунке 3 представлены поляризационные кривые окисления водорода для электродов на основе поливиологена, полипиррол-виологена и электрода с гидрогеназой, иммобилизованной непосредственно на углеродную ткань. Во втором и третьем случаях при потенциалах выше 200 мВ, стационарные токи не устанавливаются -происходит постоянное снижение величины тока. Например, при потенциале 250 мВ ток снижается более чем на 20% за 10 минут. На электродах на основе поливиологена подобный эффект наблюдается при потенциалах более 550 мВ, что свидетельствует о большей стабильности электрода данного типа при высоких перенапряжениях. Электроды, модифицированные полипиррол-виологеном, уступают в активности при низких потенциалах до 80 мВ и менее стабильны при высоких перенапряжениях.

Таким образом, разработанный метод иммобилизации фермента поверх адсорбированного из ацетонитрила поливиологена позволяет получить высокоактивные водородные ферментные электроды. Несмотря на то, что ток окисления водорода при потенциале 200 мВ уступает электродам на основе полипиррол-виологена, диапазон потенциалов, в котором электрод остается стабильным, расширен до 550 мВ.

-поливиологен ткань без полимера —лолипиррол-внологеи

100 200 300 400 500 ООО Е мВ

Рис. 3. Поляризационная кривая окисления водорода в

атмосфере водорода для электродов на основе поливиологена, пачипиррап-виапогена и электрода с гидрогеназой. иммобилизованной непосредственно на углеродную ткань.

3 1 - -5-

4.2.2. Электротлимеризссанный нейтральный красный как промотор биозлектрокатализа гидрогеназами

Из литературы известно, что некоторые азины, являющиеся субстратами для гидрогеназы, способны полимеризоваться с образованием положительно заряженных слоев на поверхности электрода [7]. В работе был использован азиновый краситель нейтральный красный, который способен электрополимеризоваться на графитовых электродах с образованием положительно заряженного слоя полимера, поскольку он является субстратом гидрогеназы и область его электроактивности близка к равновесному водородному потенциалу. Кроме того, он является недорогим коммерчески доступным реактивом с низкой токсичностью.

На циклической вольтамперограмме (рис. 4а) при высоких анодных потенциалах виден пик необратимого окисления нейтрального красного, а в области потенциалов от -0.8 до 0.4 В видны две растущие пары пиков обратимых окислительно-

восстановительных процессов. Причем катодная пара пиков приходится на область потенциалов от -0.8 до -0.2 Б, в эту область попадает равновесный водородный потенциал (-0.635 В при рН 7,0).

Иммобилизацию фермента

проводили поверх

электрополимеризоваяного нейтрального красного. При этом толщина слоя последнего оказывает значительное влияние на плотность тока окисления водорода (рис. 46). Увеличение толщины слоя полимера за счет увеличения количества циклов от 5 до 25 приводит к значительному увеличению плотности тока окисления водорода на гидрогеназнсм электроде. Это, по-видимому, связанно с увеличением степени модификации поверхности электрода и увеличением

-1000 ЛХ -600 -400 -МО О 2СО «0

Е, ив

Гис.4а. Циклическая еольтамперограммароста электрсполимеризовттого нейтрального красного на ЛШГ-240, 50мВ/с (0,25 мМКН,РО,, 0,1 МЫсХО,, рН б, 25°С).

количество циклов

Рис. 46. Влияние толщины слоя электрополимеризоваяного нейтрапьного красного на плотность тока при потенциале 200 мВ на ферментных электродах от количества циклов электрополимершации

количества фермента, правильно

ориентированного на электроде. Последующее увеличение толщины слоя (более 25 циклов) приводит к увеличению сопротивления слоя полимера, и данный процесс начинает лимитировать скорость ферментативной реакции.

Значение максимальной плотности тока окисления водорода для электрода, модифицированного нейтральным красным (25 циклов), превосходит аналогичное для электродов с непредобработанной поверхностью в 4-5 раз во всей области потенциалов. Таким образом, использование нейтрального красного для дизайна поверхности электрода позволяет получать высокоактивные водородные ферментные элекгрокатализаторы окисления водорода. Максимальный ток окисления водорода достигается при толщине слоя, соответствующем 25 циклам электрополимеризации нейтрального красного, и составляет 850 мкА/см2 при потенциале 200 мВ. 4.2.3. Дизайн поверхности электрода с использованием метода пограничной полимеризации

Описанные выше методы модификации поверхности углеродных электродов элекгрополимеризацией различных мономеров, несмотря на получение хорошо воспроизводимой поверхности, имеют ключевой недостаток - наличие электрохимической стадии, требующей специального оборудования и затрудняющей получение электродов больших размеров. В то же время метод сорбции полимера занимает значительное количество времени - часы и сутки по сравнению с десятками минут электрохимических методов. Для преодоления указанных недостатков было предложено использовать метод пограничной полимеризации анилина и его производных, разработанный в лаборатории проводящих полимеров Института нефтехимического синтеза им. Топчиева РАН [8]. В оптимальных условиях он позволяет получать в ходе синтеза полианилин, имеющий бездефектную структуру, обеспечивающую высокий уровень электропроводности. При этом нет ограничений по размерам или форме твердых субстратов. Пример вольтамперной кривой полученных электродов представлен на рис. 5.

Поскольку гидрогеназа теряет активность при иммобилизации на поверхности, обладающие значением pH ниже нейтрального, перед нанесением фермента образцы обрабатывались водой либо аммиаком до нейтральной реакции.

Бив

Рис. 5. Циклическая вольтачперограмма для образца:

сополимер РШИСА^ипиридт-САнЫНРН и метаниловой кислоты, ткань ЛШГ-240 в 0,5 М серной кисчоте.

При этом образцы, при нейтрализации которых использовалась вода, в целом продемонстрировали более высокую активность, чем аналогичные образцы, нейтрализованные аммиаком. Образцы на основе различных тканей демонстрируют, как правило, близкие значения птотиостей тока. Это объясняется тем, что пленка полимера, образуемая на поверхности материала, имеет значительную толщину, нивелирующую разницу между реальными размерами тканей.

Наибольшую активность продемонстрировал образец, полученный при гомополимеризации дианилин-виологена (РЬКНСЗШО-дкпиридил-СЗШОМП'п) на поверхности ткани ТВШ-300М, содержание мономера в исходном растворе 0,05 моль/л, соотношение окислитель/мономер = 0,5. На рис. 6 представлено сравнение поляризационной кривой данного образца с электродами на основе полипиррол-виологена и

немодифицированной полимерами ткани.

Таким образом, показана возможность использования метода пограничной полимеризации виологен-содержащих производных анилина для создания гидрогеназных электродов. Максимальная плотность тока окисления водорода составила 650 мкА/см2. 4.2.4. Композитные электроды

Одним из способов повышения плотности тока окисления водорода на ферментных электродах является создание многослойных электродов. Для этой цели использовались лапонит (глина состава [SisMg5 5Lili50M(0H)4]07' (Na,,-^, nH20), синтетический аналог минерала гекторита), сульфоантрахиноновая глина, углеродные сажи и нанотрубки.

В водном растворе фермента лапонит образует коллоид, который при высыхании захватывает фермент внутрь образующихся пор, образуя фермент содержащую плёнку. Лапонит не обладает электронной проводимостью, поэтому при иммобилизации гидрогеназы в лапонит использовали виологен-содержащий медиатор. Значительных стационарных токов окисления водорода при использовании лапонита наблюдать не удалось.

Способность углеродных наночастиц образовывать при иммобилизации проводящие поверхности с высоким коэффициентом шероховатости открыла путь к использованию их для иммобилизации ферментов при создании ТЭ и биосенсоров. В данной работе были разработаны и исследованы характеристики электродов на основе

Е. мб

Рис. 6. Сравнение поляризационных кривых в атмосфере водорода для электродов на основе полипиррол-виологена (А.), дианилин-виологена. полученного методом пограничной полимеризации, (ш) и немодифицированной полимерами ткани (*).

различных углеродных частиц. Использовались углеродные сажи Vulkan ХС 72 и ХС 72х (220-250 м2/г), повсеместно применяющиеся для создания низкотемпературных ТЭ на основе металлов платиновой группы, одно- и многостенные нанотрубки. Наиболее активные электроды удалось получить для сажи Vulkan ХС72, распыленной на пирографите. В отсутствии полквиологена ток составил 200мкА/см2. При добавлении последнего ток достигает 750-800 мкАУсм2, потенциал разомкнутой цепи - 1-5 мВ. Добавление нафиона в раствор сажи при распылении стабилизирует электрод, но его активность резко падает. Также электроды данного типа отличаются невысокой стабильностью (при хранении теряют 50% активности в течение 48 часов) и крайне низкой воспроизводимостью.

Одним из их главных достоинств слоистых анион-обмекных глин состава Zn2Cr(OH)6 (в англоязычно литературе принято обозначение подобных соединении layered double hydroxide, LDH) является способность захватывать различные отрицательно заряженные молекулы, в частности медиаторы, например, такие как антрахинон [9] и ABTS [10]. Это свойство широко применяется для создания ферментных электродов на основе лакказы [11], лероксидазы [10], каталазы [12], щелочной фосфатазы [13] и др. В работе была использована глина Zn2Cr(OH)6 с медиатором сульфоантрахиноном, поскольку его потенциал полуволны лежит в требуемом для гидрогеназы диапазоне [9].

На электроды наносили несколько слоев смеси фермента (1мг/мл) с глиной (2 мг/мл) в разных соотношениях. Для стабилизации поверхности использовали глутаровый альдегид. Плотность тока окисления водорода достигает максимума для 4-х слокных электродов и составляет 320 мкА/см2.

Таким образом, в данной работе не удалось разработать метод создания многослойных композитных электродов, превосходящих по своей активности и стабильности электроды, разработанные нами ранее. Наилучшим соотношением активности и стабильности обладали электроды на основе сажи Vulkan ХС72. 4 J. Бноэлектрокатализ NAD-зависимой гидрогеназой

Вовлечение в бноэлектрокатализ гидрогеназ различных типов - один из путей создания новых электродов для биоТЭ. NAD(P)-3aBHCKMbie гидрогеназы -четырехсубъединичные ферменты, обладающие NAiXPf-редуктазной активностью. Структура гидрогеназного димера аналогична строению [NiFej-гидрогеназ, однако, перенос электрона осуществляется не к поверхности фермента, а к NAD(P)+-восстанавливающему центру двух других субъединиц. Интерес к подобным гидрогеназам вызван не только перспективами их использования в ТЭ, но и потенциальной возможностью их примеиения для биоэлектросинтеза. В данной работе

- 25 *С -75 'С

\

\

~Т5И"—

* (сек!

Рис. 7. Изменения потенциала разомкнутой цепи в атмосфере водорода на электроде с иммобилизованной гидрогеназой из Ругососсиз

/

Г

мы исследовали биоэлектокатализ КАИР-зависимой гидрогеназой из термофильной археобакгерии Ругососсиз /ипотз.

Иммобилизацию фермента проводили на поверхности углеродной ткани,

модифицированной полипиррол-виологеном. При оптимальной для данного фермента температуре 75°С полная активация происходит менее, чем за 350 сек (рис. 7). При этом с точностью до нескольких мВ достигается значение потенциала ОВЭ.

При положительных перенапряжениях наблюдаются значительные токи окисления водорода (рис. 8). Максимальный ток окисления водорода составляет 400 мкА/см2, что всего в несколько раз меньше аналогичных значений для двухсубъединичных гидрогеназ Т. пкеорегзкта и О. Ьаси1аШт, которые значительно меньше по своим размерам. Таким образом, в работе впервые продемонстрирован высокоэффективный прямой биоэлектрокатализ гидрогеназой из Ругососик АтозиБ. 4.4. Технологические характеристики

При создании топливных элементов большое значение имеет влияние рН рабочего раствора на характеристики электродов. Были исследованы рН-зависимости для электродов с

гидрогеназой из Т. говеоретста, иммобилизованной на гидрофилизованную ткань ТВШ и на ткань ЛШГ, модифицированную полипиррол-виологеном. Зависимости имеют колоколообразный вид с максимумом в диапазоне рН от 6,0 до 7,0. При рН 5,0 оба типа электродов сохраняют около 70% активности, но при возвращении рН к семи электроды на основе гидрофилизованной ткани демонстрируют 85% начальной активности, а электроды, модифицированные полипиррол-виологеном - 100% начальной активности. Похожая закономерность наблюдается и при переходе рН 7-8-7. Электроды без полимера сохраняют около 60% активности, электроды с полимером - 95-100% активности. Объяснением является, по-видимому, большая десорбция гидрогеназы с поверхности электродов без полимеров.

е. ту

Рис. 8. Зависимость стационарных токов окисления водорода от перенапряжения для электрода с иммобилизованной гидрогеназой из Ругососсиз/игюзиз в атмосфере водорода {•), атмосфере аргона (и) и в отсутствие активного фермента (к).

В низкотемпературных водород-кислородных топливных элементах не удаётся избежать взаимопроникновения газов между катодным и анодным отсеками, разделенными протон проницаемой мембраной. Несмотря на то, что гидрогеназа не способна катализировать реакции превращения кислорода, этот газ является

Рис. 9. Влияние содержания воздуха в смеси водород-воздух на активность электродов с гидрогеназой из Т. говеореЫста (счева: (и)- кислород, (Л) - аргон.) и й.ЬасиЫит (справа).

ингибитором фермента. Для [№Ре]-гидрогеназ, как правило, это обратимый процесс, но

влияние кислорода является одной из важнейших проблем, препятствующих

практическому применению гидрогеназ.

При замене водорода смесью водород-кислород наблюдается смешение потенциала разомкнутой цепи в положительную область и уменьшение величины анодных токов. Зависимости тока окисления водорода на ферментных электродах от соотношения воздух:водород в газовой смеси для различных гидрогеназ представлены на рис. 9.

Дчя обоих ферментов наблюдается линейное уменьшение анодных токов при увеличении содержания кислорода. При этом его значение стабильно во всех точках. Гидрогеназа из Д ЬасиШит необратимо инакгивируется кислородом - при концентрации кислорода 5% электроды необратимо теряют 50% своей активности. Для гидрогеназы из Т. гозеорешс'та наблюдается обратимое ингибирование при концентрации кислорода до 5%.

В растворе гидрогеназа из Т. го$еорег$1ста необратимо теряет 100% активности в присутствии 1 % кислорода из-за окисления активного центра. Однако, как показано выше, при иммобилизации на поверхности электрода, ее стабильность увеличивается. Объяснением этого явления может служить реактивация катализатора электронами, предоставленными электродом. При этом часть восстановительных эквивалентов водорода должны расходоваться на этот процесс. В этом случае снижение анодных токов в присутствии кислорода должно превышать аналогичные значения в присутствии инертного газа, что подтверждается экспериментальными данными (см. рис. 9).

Большинство водородпродуцируклцих бактерий

культивируются при температурах от 30 до 90°С, поэтому была исследована стабильность ферментных электродов в указанном диапазоне. Данные представлены на рис. 10. Каждая точка, если не указано особо, соответствует инкубации при указанной температуре в течение не менее, чем 20 минут.

При повышении температуры наблюдается постепенное повышение активности ферментных электродов. При этом иммобилизация приводит к значительному расширению температурного диапазона гидрогеназы из Д Ъаси1ашт. В растворе этот фермент теряет 100 % активности при 50°С в течение примерно 10 минут.

Наибольшая активность гидрогеназы из Т. говеорегяюпа наблюдается при 80°С. При данной температуре электроды сохраняют более 80% начальной активности в течение минимум 8 часов.

Таким образом, проведено исследование активности ферментных электродов в широком диапазопе температур, рН и концентраций кислорода в смеси с водородом. Показано, что электроды на основе гидрогеназы из Т. гозеореыста подходят для создания топливных элементов, т.к. сохраняют высокую активность при непрерывном окислении водорода в различных условиях в течение длительного времени. 4.5. Применение ферментных электродов для создания водородного биосеисора

В работе была исследована зависимость активности ферментных электродов с гидрогеназами из Т.го$гореЫсхпа и Д. Ъаси'.сйит от концентрации водорода в газовой смеси водород-аргон для создания водородного биосснсора в потенцио- и амперометрических режимах (рис. 11).

В амперометрическом режиме полученная зависимость для обоих ферментов имеет нелинейный характер и описывается гиперболическим уравнением, что характерно для гетерогенных процессов. Такой же вид зависимости был получен для плагины при рН 7. Для платины при рН 1 зависимость линейная. При концентрациях водорода менее 30% ток окисления водорода на электродах с Д ЬасиШит практически не уступает току окисления на платине при рН 7 (отличие составляет менее 5%) и превышает ток окисления на платине при рН 1,

температура, "С

Рис. 10. Стабильность ферментных электродов при различных температурах.

Отличие зависимости стандартного потенциала от теоретической прямой с углом наклона - 29 мВ в потенциометрическом режиме объясняется падением токов обмена для

Рис. И. Зависимость стандартного потенциала (слева) и максимального тока окиспения (справа) от концентрации водорода для ферментных и пчатиновых электродов.

реакции окисления водорода при понижении концентрации последнего. При этом растет вклад фоновых токов окисления кислорода. Как видно из рисунка, отклонения характерны как для ферментных электродов, так и для платиновых. При низких концентрациях водорода (менее 3 %) стандартный потенциал на платине не устанавливался в течение 300 секунд, в то время как на ферментных электродах он устанавливался менее, чем за 100 секунд. Таким образом, показана применимость гидрогеназных топливных электродов, модифицированных полипиррол-виологеном, с гидрогеназами из Т. гонореЫапа и £>. ЬасиШит для определения концентрации водорода.

4.6. Поглощение водорода, продуцируемого микроорганизмами

Биологический водород возможно получать при помощи как фото- так и гетеротрофных микроорганизмов. При этом вне зависимости от типа используемых микроорганизмов встаёт проблема удаления водорода из биореакторов для уменьшения эффекта автоингибирования без нарушения условий культивирования. В связи с этим, по мнению автора, наиболее перспективным представляется получение на выходе из биореактора непосредственно электроэнергии, а не промежуточных трудно хранимых интермедиатов, одним из которых, по сути, является водород. Лучшим решением этой проблемы является совмещение з одном пространстве водородного топливного элемента с реактором, в котором культивируются водород синтезирующие микроорганизмы. 4.6.1. Фототрофныемикроорганизмы

Для объединения ферментного электрода и фотобиореакгора была разработана установка, в которой культуральная жидкость прокачивалась перистальтическим насосом через ячейку с электродом с иммобилизованной гидрогеназой из Т.гозеореЫапа. В работе использовалась пурпурная несерная бактерия Ююс^оЬас/ег сарЫаШя. Скорость продукции водорода составляла 0,5 мл в час на литр среды. При наполнении ячейки

культуральной жидкостью изучали изменение тока во времени при перенапряжении 200 мВ относительно потенциала разомкнутой цепи. Показано, что ферментный электрод сохраняет более 60% первоначальной активности в течение 26 суток при поглощении водорода из фотобиореактора без какой-либо предобработки. 4.6.2. Гетеротрофные микроорганизмы

В работе был использован консорциум анаэробных гетеротрофных микроорганизмов, выделенный из химуса толстого кишечника крупного рогатого скота. Скорость производства водорода используемым консорциумом при периодическом культивировании составляла: на целлюлозе 13 мМ Н2/л среды за 168 часов культивирования, на глюкозе 27 мМ Н2/л среды за 12 часов культивирования. Температура культивирования составляла 60°С. Концентрация водорода в газовой фазе достигала 21-24%.

Была разработана установка, объединяющая биореактор и ферментный ТЭ, схема которой представлена на рис. 12. В качестве кислородного электрода использовалась платина.

Рис 12. Схема и фото разработанной установки, совмещающей биореактор и ферментный топливный элемент (1 — контакт ферментного электрода, 2 - кислородный электрод, 3 — воздушный шланг, 4 - мембрана для отбора проб в процессе эксперимента, 5 - система сброса избыточного давления, 6 —

ферментный электрод).

Культивация проводилась в стационарном режиме в течение от 3 (при использовании в качестве источника углерода глюкозы) до 7 (при использовании бумаги) дней. После посева и удаления кислорода проводили измерение потенциала разомкнутой цепи. Снижение этого значения является показателем появления в среде водорода. Заметное падение потенциала наблюдается при содержании водорода в газовой фазе менее 0,1 %. Практически полная активация наблюдается в среднем через 12-16 часов после посева. Содержание водорода в газовой фазе через указанный промежуток времени составляет от 10 до 24 % в зависимости от условий.

Вольтамперная характеристика для электрода, погруженного в среду культивирования микроорганизмов, при максимальной продукции водорода представлена на рис. 13. Отличие потенциала разомкнутой цепи от теоретического

2.0

объясняется снижением рН бактериальной среды до 5, что приводит к снижению активности гидрогеназы, относительно низкой активностью платины в реакции восстановления кислорода при рН 5 и использованием для продувки кислородного электрода воздуха, а не чистого кислорода. Максимальная мощность составила 200 мкВт. Зависимость мощности от потенциала представлена на рис. 14.

-1Ш -ею -.оо -аоо

Е.мВ

Рис. 13. Вояыпамперная характеристика водород- Рис. 14. Зависимость мощности от

кислородного ТЭ, совмещенного с биореактором с перенапряжения водород-кислородного ТЭ,

гетеротрофным консорциумом совмещенного с биореактором с гетеротрофным

консорциумом

Для снижения влияния бактерий и протеолитических экзоферментов на гидрогеназу в работе было предложено использовать углеродный войлок вместо традиционных тканей. Этот материал имеет толщину 2-3 мм, при этом значительная часгь фермента при иммобилизации оказывается погруженной в объем материала. Электрохимические

характеристики ферментных электродов на основе войлока при пересчете на геометрическую площадь аналогичны электродам на основе ЛШГ. При инкубировании в реакторе электроды на основе войлока демонстрируют аналогичную динамику падения активности, но нижний предел более чем на 30% выше, чем для тканевых электродов.

На рис. 15 представлены данные непрерывного измерения электрохимической активности электродов при постоянной нагрузке после максимальной активации ферментного электрода (примерно через 15 часов после посева) в течение 70 часов. Нагрузка была подобрана таким образом, чтобы перенапряжение достигало 200 мВ

8 ~ I »0

£ 70

0 Л10'5»25 30 Д5« 45 50 55 «065 70 75вг ЧАСЫ

Рис. 15. Стабильность ферментного ТЭ при поглощении водорода, продуцируемого микроорганизмами в течение 70 часов (15-95 чдсы после посева, содержание водорода в газовой фазе 21,5%, температура 6(?С, электродный материач -углеродный войлок).

относительно потенциала разомкнутой цепи. Данные снимались в непрерывном режиме каждые 0,1 сек., на графике представлены усредненные данные за каждые два часа.

Падение до активности 70% от начального значения в течение первых 10 часов обусловлено, предположительно, снижением рН, удалением плохо связанного и легко доступного для разрушения фермента с поверхности электрода. К десятому часу значение тока стабилизируется и остаётся практически без изменений. Небольшие колебания в районе 25-30 и 50 часов объясняются снижением окружающей температуры, поскольку раз в сутки реактор изымался из термостата для проведения процедур контроля рН, газовой фазы, пространства кислородного электрода и т.д.

Таким образом, показано, что разработанный ферментный электрод на основе гидрогеназ может быть успешно использован для поглощения водорода из среды действия фото- и гетеротрофных микроорганизмов. Максимальная мощность составила 200 мкВт/см2. Топливный элемент сохраняет не менее 70 % первоначальной активности в течение не менее чем 70 часов (95 часов с момента посева).

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны новые высокоактивные гидрогеназные электроды путем иммобилизации ферментов поверх элекгроакгивных полимеров, содержащих аналоги их субстратов. Кроме повышения электрокаталитической активности, достигнуты расширение диапазона потенциалов ферментных электродов (с 200 до 550 мВ) и стабильность в широком диапазоне температур (до 90°С). На основании расчета соотношения каталитических констант и количества адсорбируемого фермента показано, что наблюдаемые значения плотностей тока окисления водорода являются предельно возможными для прямого биоэлектрокатализа гидрогеназами.

2. На основе ферментных электродов создан биосенсор на водород, функционирующий как в потенцио-, так и амперометрическом режимах в диапазоне концентраций от 0,5 до 100%. При концентрации водорода менее 10% наблюдаемые на ферментных электродах плотности тока практически не уступают аналогичным значениям для платиновых электродов низкотемпературных топливных элементов.

3. Впервые реализован биоэлектрокатализ NAD-зaвиcимoй гидрогеназой. Максимальная активность электродов наблюдалась при 75°С, рН 5. Плотность тока окисления водорода при этих условиях составила 0,4 мА/смг.

4. Показана возможность функционирования ферментных электродов в среде действия фото- и гетеротрофных микроорганизмов в течение не менее 600 часов для фото- и не менее 168 часов для гетеротрофов.

5. Разработан лабораторный прототип установки, включающий топливный элемент и биореактор с гетеротрофными микроорганизмами, продуцирующими водород при

переработке бумажных отходов. Мощность установки составила 0,2 мВт/смг, время непрерывного функционирования - более 70 часов.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Морозов, C.B., Водородный топливный электрод на основе ферментов. Дисс. канд. хим. каук. 2003, Москва: МГУ. 159.

2. Дамаскин, Б.Б., et al., Введение в электрохимическую кинетику. 1983, М.: Высш. школа. 400.

3. Феттер, К., Электрохимическая кинетика. 1967, М.: Химия. 856.

4. Gu, Z.J., et al., J. Am. Chem. Soc., 1996.118 (45): p. 11155.

5. Задворный, O.A., et al., Биохимия, 2004.69(2): p. 204.

6. Noda, К., et al., Thin Solid Films, 1998.327-329: p. 639

7. Karyakin, A.A., et al., Eiectroanalysis, 1999.11(8): p. 553.

8. Orlov, A.V., et al., Polymer Science, Ser. A, 2008.50: p. 1021.

9. Mousty, C., et ai., J. Electroanal. Chem., 1994.374: p. 63.

10. Shan, D„ et al., Biosens. Bioelectron., 2004.20: p. 390.

11. Ding, S.-N., et al., Journal of Power Sources, 2010.195: p. 4714.

12. Chen, H., et al., Materials Science and Engineering: C, 2008.28: p. 726.

13. Mousty, C., et al., Sensors and Actuators В: Chemical, 2008.133: p. 442.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Morozov S.V., Voronin O.G., Karyakina E.E., Zorin N.A., Cosnier S., A.A. Karvakin. Tolerance to oxygen of hydrogen enzyme electrodes. // Electrochemistry Communications, 8, 2006, 851-854.

2. Морозов C.B., Воронин О.Г., Карякина E.E., Карякин А.А. Водородные топливные электроды на основе ферментов. Нано- и микросистемпая техника, 2006, 5,9-13.

3. Voronin O.G., van Haaster D.J., Karyakina E.E., Hagen W.R., Kaiyakin A.A.. Direct Bioelectrocatalysis by NADP-Reducing Hydrogenase from Pyrococcus furiosus. // Eiectroanalysis, 19,2007, No. 21,2264 - 2266.

4. Цыганков A.A., Минаков E А., Зорин НА., Гостева K.C., Воронин О.Г., Карякин А.А.. Об Измерении рН-Зависимости Активности Гидрогеназ. // Биохимия, 2007, том 72, вып. 9, с. 1189-1195.

5. Kaiyakin А.А., Morozov S.V., Voronin O.G., Zorin N.A., Karyakina E.E., Fateyev V.N., Cosnier S.. The Limiting Performance Characteristics in Bioelectrocatalysis of Hydrogenase Enzymes. // Angewandte Chemie, 2007, 119,7382-7384.

6. Нетрусов А.И., Карякин A.A., Тепляков B.B., Шалыгин М.Г., Воронин О.Г., Абрамов С.М., Садрадданова Э.Р., Митрофанова Т.И., Глазунова Е.В., Шестаков А.И. Основы технологии микробиологической конверсии органических целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию через промежуточное образование биоводорода. // «Катализ в промышленности», 2010,5,77-83.

7. О.Г. Воронин, C.B. Морозов, H.A. Зорин, A.A. Карякин, Гидрогеназный электрод для топливных элементов. Всероссийский симпозиум «Биотехнология микробов», Москва, 2005 г. (тезисы докладов стр. 17).

8. Цыганков A.A., Лауринавичсне Т.В., Зорин H.A., Морозов C.B., Воронин О.Г., Гостева К.С., A.A. Карякин. Новый топливный элемент для биоконверсии энергии возобновляемых источников через промежуточное образование водорода. Всероссийская конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе», Пущино, Россия, 2005 г. (тезисы докладов стр. 80).

9. Воронин О.Г., Морозов C.B., Карякин A.A. Применение поливиологенов для усовершенствования водородного ферментного электрода. Конференция «Ломоносов -2005», МГУ им. Ломоносова, Москва, 2005г. (тезисы докладов, том 1, стр. 67).

Ю.Воронин О.Г. Биосенсор на основе иммобилизованной гидрогеназы для детекции водорода. Конференция «Ломоносов - 2006», МГУ им. Ломоносова, Москва, 2006 г. (тезисы докладов, том 1, стр.14).

ll.Voronin O.G., Morozov S.V., Karyakina E.E., Katyakin A.A., Zorin N.A., Cosnier S.. Polyviologen for hydrogen enzyme electrodes development 18-й Международный Симпозиум по Биоэлектрохимии и Биоэнергетике, Куимбра (Cuimbra), Португалия, 2005 г. (тезисы докладов стр. 29).

П.Воронин О.Г., Морозов C.B., Зорин H.A., Карякин A.A.. Применение гидрогеназ из различных источников для создания водородного топливного электрода. Всероссийская конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе», Лущино, Россия, 2005 г. (тезисы докладов стр. 77).

13.Воронин О.Г. Возможные области применения водородного топливного электрода на основе ферментов гидрогеназ. Сборник «Работы молодых специалистов по конкурсу «Водородная энергетика», Москва, 2006 г.

14-Воронин О.Г., Морозов C.B., Григорьев С.А., Притуленко Е.Г., Самсонов Д.П., Вагин М.Ю., Карякин A.A., Фатеев В.Н.Ферментативный катализ в электрохимических системах с ТПЭ. Международный Форум «Водородные технологии для производства энергии», Москва 2006 г.

15. Воронин О.Г., Морозов C.B., Карякин A.A. Водородные топливные электроды на основе различных гидрогеназ. Международная школа-конференция молодых ученых в рамках Международного Симпозиума «ЕС-Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной Программе», Санкт-Петербург, 2006.

16. Воронин О.Г., Косньер С., Карякин A.A. Биосенсор для определения концентрации глюкозы на основе эяектрополимеризованного пиррола и берлинской лазури. Вторая всероссийская конференция по аналитической химии ((Аналитика России», Краснодар, 2007 (тезисы докладов, стр. 74).

П.Федотенков Ф.А., Воронин О.Г., Карякин А.А. Биоэлектрокатализ гидрогенгзами из различных источников. Четвертый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» Москва, 2008 (тезисы докладов, том 2, стр. 275-276).

18. Орлов А.В., Киселева С.Г., Воронин О.Г., Карякин А.А., Карпачева Г.П Виологенсодержащие полианилины: синтез, перспективы применения. VI Всероссийская Каргинская конференция "Наука о полимерах 21-му веку", Москва, МГУ, 29-2 февраля 2007 г., (тезисы устных и стендовых докладов, т. 2, с. 154).

19. Киселева С.Г., Федотенков Ф.А., Воронин О.Г., Орлов А.В., Карпачева ГЛ., Карякин А.А. Водородные ферментные электроды на основе виологенсодержащего полианилина XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Москва 2007. (тезисы докладов, т. 3. с. 186).

20. Karpacheva G.P., Voronin O.G., Karyakin А.А., Orlov A.V., Kiseleva S.G., Fedotenkov F.A. Hydrogen composite electrodes based on viologen containing polyaniline and enzyme hydrogenaze. Abstracts of X International conference Hydrogen materials science and chemistry of carbon materials AHEU, Kiev, 2007, (book of abstracts, p.920-921).

21. Воронин О.Г. Использование водородного электрода на основе ферментов для утилизации биоводорода, полученного при микробиологической переработке органических отходов. II научно-практическая конференция «Перспективы развития инноваций в биологии». Москва, МГУ, 5-6 ноября 2008 г.

22.Kaiyakin A.A., Voronin O.G., Fedotenkov F.A., Karyakina Е.Е. Hydrogen electrodes based on limiting characteristics of enzymes in bioelectrocatalysis. 59 Meeting of International Society of Electrochemistry (ISE Meeting), Seville, September, 7-12 (2008).

23. Воронин О.Г., Карякин А.А. Высокоактивные электроды для топливных элементов на основе нанослоев элекгроактивных полимеров и ферментов. Первый международный Форум по нанотехнологиям, Москва, 3-5 декабря, 2008.

24. Воронин О.Г., Абрамов С..М., Карякин А.А. Высокоактивные водородные ферментные электроды для утилизации биоводорода, полученного при микробиологической переработке органических отходов. Пятый Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2009 (сборник работ стр. 316-317). *

25. Vokhmyanina D.V., Fedotenkov F.A., Voronin O.G., Karyakin А.А. Bioelectrocatalysis by hydrogenase enzymes. Application of hydrogen enzyme electrodes for organic raw material conversion to energy. The Second International Competition of Scientific Papers in Nanotechnology for Young Researchers, Moscow, 2009 (abstracts, p. 677-679).

26. Karyakin A., Voronin O., Fedotenkov F., Vokhmyanina D., Trashin S., Karyakina E. Bioelectrocatalysis: Achievement of Limiting Enzyme Performance Characteristics in

Acceleration of Electrode Reactions. The 12th International and the first Sino-Japan bilateral symposium on Electroanalytical Chemistry, August 12-15, Changchun, China, 2009, (book of abstracts p. 53-54).

27. Karyakin A., Voronin 0., Fedotenkov F., Trashin S., Vinogradova D.V., Kaiyakina E. Limiting characteristics of enzymes in bioelectrocatalysis. 7th Spring Meeting of International Society of Electrochemistry. 22-25 March, Szczyrk, Poland, 2009, (book of abstracts, p.77).

28.Вохмяяива Д.В., Федотенков Ф.А., Воронин ОТ., Карякин А.А. Водородные ферментпые топливные электроды на основе виологенсодержащих полимеров. XIX Менделеевская конференция молодых ученых, Санкт-Петербург, 2009, (сборник работ, стр. 131).

29. Нетрусов А.И., Шестаков А.И., Воронин О.Г. Разработка технологии получения биотоплив из органического сырья и отходов. Московская международная научно-практическая конференция «Биотехнология: экология крупных городов», Москва, 2010 (сборник работ стр. 293-294).

30. Voronin О., Abramov S., Shestakov A., Fedotenkov F., Kaiyakin A. Bioconversion of cellulose containing waste into electricity through the intermediate microbial production of hydrogen. The 9th International Hydrogenase Conference, Uppsala, Sweden, 2010 (book of abstracts, p. 137).

31. Shastik E.S., Vokhmyanina D.V., Zorin N.A., Voronin O.G., Karyakin A.A., Tsygankov A. A. Combination of microbial hydrogen with its consumption by hydrogen electrode. The 9th International Hydrogenase Conference, Uppsala, Sweden, 2010 (book of abstracts, p. 130).

32. Voronin O., Abramov S., Shestakov A., Fedotenkov F., Karyakin A. Electrodes based on immobilized hydrogenase for oxidation of biohydrogen produced from cellulose containing waste. Electrochemistry 2010: From microscopic understanding to global impact, Bochum, Germany, 2010 (book of abstracts, p. 199).

Подписано в печать:

28.12.2010

Заказ № 4795 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-Й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 vmw.autoreferat.ru

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Строение и свойства гидрогеназ.

2.1.1. Классификация гидрогеназ.

2.1.2. Строение никель-железных гидрогеназ.

2.1.4. Различные типы состояний активного центра.

2.1.5. Инактивация гидрогеназ.

2.1.6. Каталитический цикл.

2.1.7. Роль [NiFe]-гидрогеназ in vivo. Классификация.

2.2. Биоэлектрокатализ ферментами.

2.2.1. Медиаторный биоэлектрокатализ.

2.2.2. Прямой биоэлектрокатализ.

2.2.3. Методы повышения эффективности биоэлектрокатализа.

2.3. Биологические топливные элементы.

2.3.1. Микробные топливные элементы.

2.3.2. Ферментные топливные элементы.

2.4. Методы получения биоводорода.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 Материалы.

3.2. Оборудование.

3.3. Методы.

3.3.1. Определение активности гидрогеназ.

3.3.2. Приготовление ферментных электродов.

3.3.3. Исследование электрохимической активности ферментных электродов.

3.3.4. Исследование операционной стабильности ферментных электродов.

3.3.5. Исследование влияния кислорода на электрохимическую активность гидрогеназных электродов.

3.3.7. Исследование зависимости характеристик ферментных электродов от парциального давления водорода.

3.3.8. Исследование процесса конверсии водорода, продуцируемого бактериями, в электричество.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Кинетические характеристики катализа гидрогеназами, предельные токи.

4.2. Повышение эффективности биоэлектрокатализа гидрогеназами из различных источников.

4.2.1. Ферментные электроды на основе поливиологена.

4.2.2. Электрополимеризованный нейтральный красный как промотор биоэлектрокатализа гидрогеназами.

4.2.3. Дизайн поверхности электрода с использованием метода пограничной полимеризации.

4.2.4. Композитные электроды.

4.3. Биоэлектрокатализ NAD-зависимой гидрогеназой.

4.4. Технологические характеристики.

4.4.1. Влияние рН рабочего раствора на характеристики электродов.

4.4.2. Влияние кислорода на характеристики ферментных электродов.

4.4.3. Термостабильность.

4.5. Применение ферментных электродов для создания водородного биосенсора.

4.6. Поглощение водорода, продуцируемого микроорганизмами.

4.6.1. Фототрофные микроорганизмы.

4.6.2. Гетеротрофные микроорганизмы.

5. ВЫВОДЫ.

Поиск возобновляемых источников энергии и развитие методов переработки накопленных отходов — одни из ключевых задач, стоящих перед человечеством в начале XXI века.

Водород рассматривается многими исследователями как перспективный вид вторичного топлива. Однако на сегодняшний день, несмотря на огромные затраты, не существует ни одного коммерчески эффективного применения технологий водородной энергетики. До сих пор не решены проблемы, связанные с получением, транспортировкой и утилизацией водорода. Узкоспециализированные мелкосерийные агрегаты для таких отраслей, как военная и космическая промышленность, учитывать не корректно, т.к. к ним понятие «коммерческой эффективности» неприменимо.

Вместе с тем сегодня активно развиваются методы микробиологического получения водорода из органических соединений, в том числе отходов. Выделяемый микроорганизмами биоводород обладает низкой себестоимостью, однако значительно загрязнен побочными продуктами метаболизма. Использование его в традиционных платиновых топливных элементах или сжигание без дополнительной дорогостоящей очистки невозможно. Ранее в нашей лаборатории была показана принципиальная возможность поглощения водорода из среды действия микроорганизмов при помощи ферментных топливных элементов на основе гидрогеназ. В данной работе разработаны новые методы иммобилизации ферментов гидрогеназ на поверхности углеродных электродов для достижения высокоэффективного биоэлектрокатализа, а также предложена система, объединяющая ферментный топливный элемент и биореактор с водород продуцирующими микроорганизмами, позволяющая получать электрическую энергию из органических соединений через промежуточное образование водорода без дополнительных стадий.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

5. ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые высокоактивные гидрогеназные электроды путем иммобилизации ферментов поверх электроактивных полимеров, содержащих аналоги их субстратов. Кроме повышения электрокаталитической активности, достигнуты расширение диапазона потенциалов ферментных электродов (с 200 до 550 мВ) и стабильность в широком диапазоне температур (до 90°С). На основании расчета соотношения каталитических констант и количества адсорбируемого фермента показано, что наблюдаемые значения плотностей тока окисления водорода являются предельно возможными для прямого биоэлектрокатализа гидрогеназами.

2. На основе ферментных электродов создан биосенсор на водород, функционирующий как в потенцио-, так и амперометрическом режимах в диапазоне концентраций от 0,5 до 100%. При концентрации водорода менее 10% наблюдаемые на ферментных электродах плотности тока практически не уступают аналогичным значениям для платиновых электродов низкотемпературных топливных элементов.

3. Впервые реализован биоэлектрокатализ NAD-зависимой гидрогеназой. Максимальная активность электродов наблюдалась при 75°С, pH 5. Плотность тока окисления водорода л при этих условиях составила 0,4 мА/см .

4. Показана возможность функционирования ферментных электродов в среде действия фото- и гетеротрофных микроорганизмов в течение не менее 600 часов для фото- и не менее 168 часов для гетеротрофов.

5. Разработан лабораторный прототип установки, включающий топливный элемент и биореактор с гетеротрофными микроорганизмами, продуцирующими водород при переработке бумажных отходов. Мощность установки составила 0,2 мВт/см2, время непрерывного функционирования — более 70 часов.

1. E. Lyon, S. Shima, G. Buurman, S. Chowdhuri, A. Batschauer, K. Steinbach, R. Thauer. UV-A/blue-light inactivation of the 'metal-free' hydrogenase (Hmd) from methanogenic archaea. Eur JBiochem, 2004. 271: p. 195-204.

2. M. Korbas, S. Vogt, W. Meyer-Klaucke, E. Bill, EJ. Lyon, R.K. Thauer, S. Shima. The Iron-Sulfur Cluster-free Hydrogenase (Hmd) Is a Metalloenzyme with a Novel Iron Binding Motif. J. Biol. Chem., 2006. 281: p. 30804-30813.

3. P.M. Vignais ,B. Billoud. Occurrence, Classification, and Biological Function of Hydrogenases: An Overview. Chem. Rev., 2007.107: p. 4206-4272.

4. F.A. Armstrong. Hydrogenases: active site puzzles and progress. Current Opinion in Chemical Biology, 2004. 8: p. 133-140.

5. N. Wiberg, Inorganic Chemistry. 2001, London: Academic Press.

6. K.A. Vincent, A. Parkin, F.A. Armstrong. Investigating and Exploiting the Electrocatalytic Properties of Hydrogenases. Chem. Rev. , 2007. 107: p. 4366-4413.

7. M. Bruschi, G. Zampella, P. Fantucci, L. DeGioia. DFT investigations of models related to the active site of NiFe. and [Fe] hydrogenases. Coordination Chemistry Reviews, 2005. 249(15-16): p. 1620-1640.

8. S. Foerster, M. Stein, M. Brecht, H. Ogata, i.Y. Higuch, W. Lubitz. Single crystal EPR studies of the reduced active site of NiFe. hydrogenase from Desulfiovibrio vulgaris Miyazaki F. J Am Chem Soc, 2003. 125: p. 83-93.

9. A. Volbeda ,F.-C. J.C. The active site and catalytic mechanism of NiFe hydrogenases. Dalton Transactions, 2003: p. 4030-4038.

10. Y. Nicolet, C. Cavazza, J.C. Fontecilla-Camps. Fe-only hydrogenases: structure, function and evolution. Journal of Inorganic Biochemistry, 2002. 91: p. 1-8.

11. M.W.W. Adams. The Structure and Mechanism of Iron-Hydrogenases. Biochim. Biophys. Acta, 1990.1020(2): p. 115-145.

12. S.P.J. Albracht. Nickel hydrogenases: in search of the active site. Biochim. Biophys. Acta, 1994.1188: p. 167-204.

13. P.M. Vignais ,A. Colbeau. Molecular Biology of Microbial Hydrogenases. Curr. Issues Mol. Biol. , 2004. 6: p. 159-188.

14. E. Garcin, X. Vernede, E.C. Hatchikian, A. Volbeda, F. M., J.C. Fontecilla-Camps. The crystal structure of a reduced NiFeSe. hydrogenase provides an image of the activated catalytic center. Structure 1999. 7: p. 557-566.

15. A. Volbeda, Y. Montet, X. VenTede, E.C. Hatchikian, J.C. Fontecilla-Camps. Highresolution crystallographic analysis of Desulfovibrio fructosovorans NiFe. hydrogenase. Int. J. Hydrogen Energy, 2002. 27(11-12): p. 1449-1461.

16. A. Volbeda J.C. Fontecilla-Camps. Structure-function relationships of nickel-iron sites in hydrogenase and a comparison with the active sites of other nickel-iron enzymes. Coordination Chemistry Reviews, 2005. 249: p. 1609.

17. P.M. Vignais. H/D exchange reactions and mechanistic aspects of the hydrogenases. Coordination Chemistry Reviews, 2005.249: p. 1677.

18. T. Buhrke, O. Lenz, N. Krauss, B. Friedrich. Oxygen Tolerance of the H2-sensing NiFe. Hydrogenase from Ralstonia eutropha HI6 Is Based on Limited Access of Oxygen to the Active Site. J. Biol Chem. , 2005. 280: p. 23791-23796.

19. E. Garcin, X. Vernede, E.C. Hatchikian, A. Volbeda, M. Frey, J.C. Fonticilla-Camps. The crystal structure of a reduced NiFeSe. hydrogenase provides an image of the activated catalytic center. Structure, 1999. 7: p. 557-566.

20. C. Massanz ,B. Friedrich. Amino Acid Replacements at the H2-Activating Site of the NAD-Reducing Hydrogenase from Alcaligenes eutrophus. Biochemistry, 1999. 38: p. 14330-14337.

21. A. Volbeda, M.H. Charon, C. Piras, E.C. Hatchikian, M. Frey, J.C. Fontecilla-Camps. Crystal-Structure of the Nickel-Iron Hydrogenase From Desulfovibrio-Gigas. Nature, 1995. 373(6515): p. 580-587.

22. A.L. De Lacey, V.M. Fernandez, M. Rousset, R. Cammack. Activation and Inactivation of Hydrogenase Function and the Catalytic Cycle: Spectroelectrochemical Studies. Chem. Rev., 2007.107: p. 4304-4330.

23. C.B. Морозов, Водородный топливный электрод на основе ферментов. Дисс. канд. хим. наук. 2003, Москва: МГУ. 159.

24. A.L. De Lacey, E.C. Hatchikian, A. Volbeda, M. Frey, J.C. Fontecilla-Camps, V.M. Fernandez. J. Am. Chem. Soc., 1997.119: p. 7181.

25. А.А. Карякин ,С.Д. Варфоломеев. Каталитические свойства гидрогеназ. Yen. хим., 1986. 55(9): р. 1524-1549.

26. Y. Higuchi, Т. Yagi, N. Yasuoka. Structure, 1997. 5: p. 1671.

27. P.M. Matias, C.M. Soares, L.M. Saraiva, R. Coelho, J. Morais, J. Le Gall, M.A. Carrondo. J. Biol. Inorg. Chem., 2001. 6: p. 63.

28. E. Garcin, X. Vernede, E.C. Hatchikian, A. Volbeda, M. Frey, J.C. Fontecilla-Camps. Struct. Fold Des., 1999. 7: p. 557.

29. J.C. Fontecilla-Camps, A. Volbeda, C. Cavazza, Y. Nicolet. Structure/Function Relationships of NiFe.- and [FeFe]-Hydrogenases. Chem. Rev., 2007.107 p. 4273-4303.

30. J. Coremans, J.W. Vanderzwaan, S.P.J. Albracht. Distinct Redox Behavior of Prosthetic Groups in Ready and Unready Hydrogenase From Chromatium-Vinosum. Biochim. Biophys. Acta, 1992. 1119 (2): p. 157-168.

31. E.C. Hatchikian, N. Forget, V.M. Fernandez, R. Williams, R. Cammack. Eur. J. Biochem., 1992. 209: p. 357.

32. S.T. Stripp, G. Goldet, C. Brandmayr, O. Sanganas, K.A. Vincent, M. Haumann, F.A. Armstrong, T. Happe. How oxygen attacks FeFe. hydrogenases from photosynthetic organisms. PNAS, 2009.106: p. 17331-17336.

33. V.M. Fernandez, E.C. Hatchikian, R. Cammack. Biochim. Biophys. Acta, 1985. 832: p. 69.

34. R.M. Mege ,C. Bourdillon. Nickel controls the reversible anaerobic activation/inactivation of the Desulfovibrio gigas hydrogenase by the redox potential. J. Biol. Chem. , 1985. 260: p. 14701-14706.

35. A.L. De Lacey, A. Pardo, V.M. Fernandez, S. Dementin, G. Adryanczyk-Perrier, E.C. Hatchikian, M. Rousset. J. Biol. Inorg. Chem., 2004. 9: p. 636.

36. M.R. Hyman ,D. Arp. Kinetic analysis of the interaction of nitric oxide with the membrane-associated, nickel and iron-sulfur-containing hydrogenase from Azotobacter vinelandii. J. Biochim. Biophys. Acta 1991.1076: p. 165-172.

37. S.Q. Niu, L.M. Thomson, M.B. Hall. Theoretical Characterization of the Reaction Intermediates in a Model of the Nickel-Iron Hydrogenase of Desulfovibrio gigas. J. Am. Chem. Soc., 1999.121: p. 4000-4007.

38. S. Kurkin, S.J. George, R.N.F. Thorneley, S.P. Albracht. Hydrogen-Induced Activation of the NiFe.-Hydrogenase from Allochromatium vinosum as Studied by Stopped-Flow Infrared Spectroscopy. Biochemistry, 2004. 43: p. 6820-6831.

39. C. Leger, A.K. Jones, W. Roseboom, S.P.J. Albracht, F.A. Armstrong. Enzyme Electrokinetics: Hydrogen Evolution and Oxidation by Allochromatium vinosum NiFe.-Hydrogenase. Biochemistry, 2002. 41: p. 15736-15746.

40. A. Pardo, A.L. De Lacey, V.M. Fernandez, H.J. Fan, Y.B. Fan, M.B. Hall. Density functional study of the catalytic cycle of nickel-iron NiFe. hydrogenases and the involvement of high-spin nickel(II). J. Biol. Inorg. Chem. , 2006.11: p. 286-306.

41. M. Stein ,W. Lubitz. The electronic structure of the catalytic intermediate Ni-C in NiFe. and [NiFeSe] hydrogenases. Phys. Chem. Chem. Phys., 2001. 3: p. 5115.

42. P.E.M. Siegbahn. Proton and electron transfers in NiFe. hydrogenase Adv. Inorg. Chem., 2004. 56: p. 101-125.

43. S. Foerster, M. van Gastel, M. Brecht, W. Lubitz. An orientation-selected ENDOR and HYSCORE study of the Ni-C active state of Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F hydrogenase. J. Biol. Inorg. Chem., 2005.10: p. 51-62.

44. L. De Gioia, P. Fantucci, B. Guigliarelli, P. Bertrand. Ab initio investigation of the structural and electronic differences between active-site models of NiFe. and [NiFeSe] hydrogenases. Int. J. Quantum Chem., 1999. 73: p. 187-195.

45. R.P. Happe, W. Roseboom, S.P.J. Albracht. Eur. J. Biochem., 1999. 259: p. 602-609.

46. C. Fichtner, M. van Gastel, W, Lubitz. Wavelength dependence of the photo-induced conversion of the Ni-C to the Ni-L redox state in the NiFe. hydrogenase of Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F. Phys. Chem. Chem. Phys., 2003. 5: p. 5507-5513.

47. J. Steuber, W. Krebs, M. Bott, P. Dimroth. A Membrane-Bound NAD(P)+-Reducing Hydrogenase Provides Reduced Pyridine Nucleotides during Citrate Fermentation by Klebsiella pneumoniae. J. Bacteriol., 1999.181: p. 241-245.

48. A. Stojanowic, G.J. Mander, E.C. Duin, R. Hedderich. Physiological role of the F 420-non-reducing hydrogenase (Mvh) from Methanothermobacter marburgensis. Arch. Microbiol., 2003.180: p. 194-203.

49. L. Cournac, G. Guedeney, G. Peltier, P.M. Vignais. Sustained Photoevolution of Molecular Hydrogen in a Mutant of Synechocystis sp. Strain PCC 6803 Deficient in the Type INADPH-Dehydrogenase Complex. J. Bacteriol., 2004. 186: p. 1737-1746.

50. I.A.C. Pereira, C.V. Romao, A.V. Xavier, J. Le Gall, M. Teixeira. Electron transfer between hydrogenases and mono- and multiheme cytochromes in Desulfovibrio ssp. J. Biol. Inorg. Chem., 1998.3: p. 494-498.

51. P.M. Vignais, B. Billoud, J. Meyer. Classification and phylogeny of hydrogenases. FEMS Microbiol. Rev., 2001. 25(4): p. 455-501.

52. P. Tamagnini, R. Axelsson, P. Lindberg, F. Oxelfelt, R. Wunschiers, P. Lindbland. Hydrogenase and hydrogen metabolism of Cyanobacteria. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2002. 66 (1): p. 1-20.

53. R.A. Bullen, T.C. Arnot, J.B. Lakemanc, F.C. Walsh. Biofiiel cells and their development Biosen. Bioel, 2006. 21: p. 2015-2045.

54. Y.F. Choo, J. Lee, I.S. Chang, B.H. Kim. Bacterial Communities in Microbial Fuel Cells Enriched with High Concentrations of Glucose and Glutamate. J. Microbiol. Biotechnol., 2006.16: p. 1481-1484.

55. D.R. Lovely. Microbial energizers: fuel cells that keep on going. Microbe, 2006. 1: p. 323-329.

56. И.В. Березин, B.A. Богдановская, С.Д. Варфоломеев, M.P. Тарасевич, А.И. Ярополов. Биоэлектрокатализ. Равновесный кислородный потенциал в присутствии лакказы. Докл. АН СССР, 1978. 240 (3): р. с. 615-617.

57. S. Barton, J. Gallaway, P. Atanassov. Enzymatic Biofuel Cells for Implantable and Microscale Devices. Chem. Rev., 2004.104: p. 4867-4886.

58. R.A. Marcus ,N. Sutin. Electron transfers in chemistry and biology. Biochim. Biophys. Acta, 1985. 811: p. 265-322.

59. Биосенсоры./ под ред. Э. Тернера, И. Краубе, Д. Уилсона. 1992: М.: Мир. 615с.

60. S. Tsujimura, M. Fujita, H. Tatsumi, К. Капо, T. Ikeda. Bioelectrocatalysis-based dihydrogen/dioxygen fuel cell operating at physiological pH. Phys.Chem., 2001. 3(7): p. 1331-1335.

61. A. Pizzariello, M. Stred'ansky, S. Miertus. A glucose/hydrogen peroxide biofuel cell that uses oxidase and peroxidase as catalysts by composite bulk-modified bioelectrodes based on a solid binding matrix. Bioelectrochemistry, 2002. 56(1-2): p. 99-105.

62. P.N. Bartlett ,K.F.E. Pratt. Theoretical treatment of diffusion and kinetics in amperometric immobilized enzyme electrodes Part I: Redox mediator entrapped within the film. J. Electroanal. Chem., 1995. 397(1-2): p. 61-78.

63. M. Bernhard, T. Buhrke, B. Bleijlevens, A.L.D. Lacey, V.M. Fernandez, S.P.J. Albracht, B. Friedrich. The H2 sensor of Ralstonia eutropha., 2001. 19: p. 15592-15597. J. Biolog. Chem., 2001.19: p. 15592-15597.

64. E. Katz, I. Willner, A.B. Kotlyar. A non-compartmentalized glucose 02 biofuel cell by bioengineered electrode surfaces. J. Electroanal. Chem., 1999. 479(1): p. 64-68.

65. E. Katz, A.N. Shipway, I. Willner, Handbook of Fuel Cells Fundamentals, Technology and Applications. Vol. 1. 2003, London: John Wiley and Sons, Ltd. 355.

66. A.A. Karyakin, E.E. Karyakina, W. Schuhmann, H.L. Schmidt. Electropolymerized Azines: Part II. In a Search of the Best Electrocatalyst of NADH Oxidation. Electroanalysis, 1999. 11(8): p. 553-557.

67. F. Mao, N. Mano, A. Heller. Long Tethers Binding Redox Centers to Polymer Backbones Enhance Electron Transport in Enzyme "Wiring" Hydrogels. J. Am. Chem. Soc., 2003. 125(16): p. 4951-4957.

68. T. Chen, S. Calabrese Barton, G. Binyamin, Z. Gao, Y. Zhang, H.-H. Kim, A. Heller. A Miniature Biofuel Cell. J. Am. Chem. Soc., 2001.123(35): p. 8630-8631.

69. T. Yagi, M. Goto, K. Nakano, K. Kimura, H. Inokuchi. New Assay Method For Hydrogenase Based On an Enzymic Electrode-Reaction Enzymic Electric Cell Method. J. Biochem., 1975. 78(3): p. 443-454.

70. T. Ikeda, K. Takagi, H. Tatsumi, K. Kano. Electrochemical control of hydrogenase action of Desulfovibrio vulgaris (Hildenborough). Chem. Lett., 1997. 3: p. 5-6.

71. G. Tayhas, G.T.R. Palmore, H.-H.Kim. Electro-enzymatic reduction of dioxygen to water in the cathode compartment of a biofuel cell. J. Electroanal.Chem., 1999. 464: p. 110117.

72. M.J. Cooney, V. Svoboda, C. Lau, G. Martina, S.D. Minteer. Enzyme catalysed biofuel cells. Energy Environ. Sci., 2008.1: p. 320-337.

73. F.A. Armstrong, H.A.O. Hill, N.J. Walton. Direct electrochemistry of redox proteins. Acc. Chem. Res., 1988. 21: p. 407.

74. L. Gorton, A. Lindgren, T. Larsson, F.D. Munteanu, T. Ruzgas, I. Gazaryan. Direct electron transfer between heme-containing enzymes and electrodes as basis for third generation biosensors. Anal. Chim. Acta, 1999. 400: p. 91-108.

75. D. Ivnitski ,P. Atanassov. Electrochemical Studies of Intramolecular Electron Transfer in Laccase from Trametes versicolor. Electroanalysis, 2007.19: p. 2307-2313.

76. S. Riva. Laccases: blue enzymes for green chemistry. TRENDS in Biotechnology, 2006. 24: p. 219-226.

77. S. Shleev, A.E. Kasmi, T. Ruzgas, L. Gorton. Direct heterogeneous electron transfer reactions of bilirubin oxidase at a spectrographic graphite electrode. Electrochem. Commun., 2004. 6: p. 934-939.

78. S. Shleev, J. Tkac, A. Christenson, T. Ruzgas, A.I. Yaropolov, J.W. Whittaker, L. Gorton. Direct electron transfer between copper-containing proteins and electrodes. Biosens. Bioelectron., 2005 20: p. 2517-2554.

79. E. Kjeanga, N. Djilali, D. Sintona. Microfluidic fuel cells: A review. J. Power Sour., 2009.186: p. 353-369.

80. K. Martinek, N.L. Klyachko, A.V. Levashov, I.V. Berezin. Dokl. Akad. Nauk. USSR, 1983.263: p. 491.• 93. K. Martinek, A.V. Pshezhetskii, S. Merker, G.S. Pepanyan, N.L. Klyachko, A.V. Levashov. Biokhimiya, 1988. 53: p. 1013.

81. C.M. Moore, N.L. Akers, A.D. Hill, Z.C. Johnson, S.D. Minteer. Improving the Environment for Immobilized Dehydrogenase Enzymes by Modifying Nafion with Tetraalkylammonium Bromides. Biomacromolecules, 2004. 5: p. 1241-1247.

82. J.E. Frew ,H.A.O. Hill. Direct and indirect electron transfer between electrodes and redox proteins. European J. Biochem., 1988.172: p. 261-269.

83. F.A. Armstrong ,G.S. Wilson. Recent developments in faradaic bioelectrochemistry. Electrochim. Acta, 2000. 45: p. 2623-2645.

84. L.H. Guo ,H.A.O. Hill. Direct electrochemistry of proteins and enzymes. Adv. Inorg. Chem., 1991.36: p. 341-375.

85. D. Tantillo, J. Chen, K. Houk. Theozymes and compuzymes: theoretical models for biological catalysis. Curr. Opin. Chem. Biol., 1998. 2(6): p. 743-750.

86. I. Willner, V. Heleg-Shabtai, R. Blonder, E. Katz, G. Tao, A.F. Buckmann, A. Heller. Electrical Wiring of Glucose Oxidase by Reconstitution of FAD-Modified Monolayers Assembled onto Au-Electrodes. J. Am. Chem. Soc., 1996.118: p. 10321-10322.

87. I. Willner. Biomaterials for Sensors, Fuel Cells, and Circuitry. Science, 2002. 298: p. 2407-2408.

88. K. Habermuller, M. Mosbach, W.F. Schuhmann. Electron-transfer mechanisms in amperometric biosensors. J. Anal. Chem., 2000.366: p. 560-568.

89. P. Bianco ,J. Haladjian. Electrocatalytic Hydrogen-Evolution At the Pyrolytic-Graphite Electrode in the Presence of Hydrogenase. J. Electrochem. Soc., 1992. 139(9): p. 24282432.

90. C. Leger, A.K. Jones, S.P.J. Albracht, F.A. Armstrong. Effect of a dispersion of interfacial electron transfer rates on steady state catalytic electron transport in NiFe.-hydrogenase and other enzymes. J. Phys. Chem., 2002.106(50): p. 13058-13063.

91. M. Gerard, A. Chaubey, B.D. Malhotra. Application of conducting polymers to biosensors. Biosens. Bioelectron., 2002.17: p. 345-359.

92. W. Schuhmann. Conducting polymer based amperometric enzyme electrodes. Microchim. Acta, 1995.121: p. 1-29.

93. A. Heller. Electrical wiring of redox enzymes. Acc. Chem. Res., 1990. 23: p. 128-134.

94. L. Coche-Guerente, S. Cosnier, P. Labbe. Sol-Gel Derived Composite Materials for the Construction of Oxidase/Peroxidase Mediatorless Biosensors. Chem. Mater., 1997. 9: p. 1348-1352.

95. C.G.J. Koopal, A.A.C.M. Bos, R.J.M. Nolte. Third-generation glucose biosensor incorporated in a conducting printing ink. Sens. Actuators B, 1994.18: p. 166.

96. G. Wang, N.M. Thai, S.-T. Yau. Electrochem. Commun., 2006. 8: p. 987.

97. Y. Lin, S. Taylor, H. Li, K.A.S. Fernando, W.W. L. Qu, L. Gu, B. Zhou, Y.-P. Sun. Advances toward bioapplications of carbon nanotubes. J. Mater. Chem., 2004. 14: p. 527-541.

98. A. Guiseppi-Elie, C. Lei, R.H. Baughman. Direct electron transfer of glucose oxidase on carbon nanotubes. Nanotechnology, 2002.13: p. 559.

99. D. Ivnitski, B. Branch, P. Atanassov, C. Apblett. Glucose oxidase anode for biofuel cell based on direct electron transfer. Electrochem. Commun., 2006. 8: p. 1204-1210.

100. J. Wang ,M. Musameh. Anal. Chim. Acta, 2005. 539: p. 209.119.120.121.122.123.124.125,126,127,128129130131132133134135136

101. Z. Du, H. Li, T. Gu. A state of the art review on microbial fuel cells: A promising technology for wastewater treatment and bioenergy. Biotechnology Advances, 2007. 25: p. 464-482.

102. F. Davis ,S.P.J. Higson. Biofuel cells—Recent advances and applications. 2007. 22: p. 1224-1235.

103. F. Scholz ,U. Schroder. Bacterial batteries. Nat. Biotechnol., 2003. 21(1151-1152).

104. D. Prasad, T.K. Sivaram, S. Berchmans, V. Yegnaraman. Microbial fuel cell constructed with a micro-organism isolated from sugar industry effluent. J. Power Sources, 2006. 160: p. 991-996.

105. D.C. Holzman. Microbe power. Environ. Health Persp., 2005.113(A): p. 754-757.

106. A.T. Yahiro, S.M. Lee, D.O. Kimble. Bioelectrochemistry: I. Enzyme utilizing bio-fuel cell studies. Biochim. Biophys. Acta, 1964. 88: p. 375-383.

107. G.T.R. Palmore, H. Bertschy, S.H. Bergens, G.M. Whitesides. J. Electroanal. Chem., 1998. 443: p. 155.

108. E. Katz ,1. Willner. J. Am. Chem. Soc., 2003.125: p. 6803.

109. N. Yuhashi, M. Tomiyama, J. Okuda, S. Igarashi, K. Ikebukuro, K. Sode. Biosens. Bioelectron., 2005. 20: p. 2145.

110. A.A. Tsygankov, Y. Hirata, M. Miyake, Y. Asada, J. Miyake. Photobioreactor with photosynthetic bacteria immobilized on porous glass for hydrogen photoproduction. J. Ferment. Bioeng., 1994. 77: p. 575-578.

111. D. Dasa ,T.N. Veziroglu. Advances in biological hydrogen production processes. Int. J. Hydrogen Energy, 2008. 33: p. 6046 6057.

112. K. Nath ,D. Das. Hydrogen production by Rhodobacter sphaeroides strain O.U. 001 using spent media of Enterobacter cloacae strain DM11. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2005. 68: p. 533-541.

113. Y.-K. Oh, E.-H. Seol, E. Yeol Lee, S. Park. Fermentative hydrogen production by a new chemolithotrophic bacterium Rhodopseudomonas palustris P4. Int. J. Hydrogen Energy, 2002. 27: p. 1373-1379.

114. H.A. Зорин ,И.Н. Гоготов. Стабильность гидрогеназы из пурпурной серобактерии Thiocapsa roseopersicina. Биохимия, 1982. 47(5): р. 827-833.

115. O.A. Задворный, H.A. Зорин, И.Н. Гоготов, В.М. Горленко. Свойства стабильной гидрогеназы пупурной серной бактерии Lamprobacter modestohalophilus. Биохимия, 2004. 69(2): р. 204-210.

116. М.Б. Шерман, Е.В. Орлова, Е.А. Смирнова, H.A. Зорин, И.В. Тагунова, И.П. Куранова, И.Н. Гоготов. Структура микрокристаллов гидрогеназы из Thiocapsa roseopersicina Биофизика, 1987. 295(2): р. 509-512.

117. P.J. Silva, В. de Castro, W.R. Hagen. On the prosthetic groups of the NiFe sulfhydrogenase from Pyrococcus furiosus: topology, structure, and temperature-dependent redox chemistry. JBIC, 1999. 4: p. 284-291.

118. H.A. Зорин. Ингибирование гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina различными соединениями. Биохимия, 1986. 51(5): p. 770-774.

119. R. Thornele. Convenient Electrochemical Preparation of Reduced Methyl Viologen and a Kinetic Study of Reaction With Oxygen Using an Anaerobic Stopped-Flow Apparatus. Biochim. Biophys. Acta, 1974. 333 (3): p. 487-496.

120. АЛ. Yaropolov, A.A. Karyakin, S.D. Varfolomeyev, I.V. Berezin. Mechanism of H2-electrooxidation with immobilized hydrogenase. Bioelectrochem. Bioenerg., 1984. 12 (34): p. 267-277.

121. А.А. Карякин ,А.И. Ярополов. Электрохимическая кинетика действия гидрогеназы из Thiocapsa roseopersicina Химическая физика, 1990. 9 (9): р. 1237-1243.

122. Б.Б. Дамаскин ,О.А. Петрий, Введение в электрохимическую кинетику. 1983, М.: Высш. школа. 400.

123. К. Феттер, Электрохимическая кинетика. 1967, М.: Химия. 856.

124. К. Noda, N.A. Zorin, С. Nakamura, I.N. Gogotov, Y. Asada, H. Akutsu, J. Miyake. Langmuir—Blodgett film of hydrogenase for electrochemical hydrogen productioa Thin Solid Films, 1998. 327-329: p. 639 642.

125. O.A. Задворный, H.A. Зорин, И.Н. Гоготов, B.M. Горленко. Свойства стабильной гидрогеназы пупурной серной бактерии Lamprobacter modestohalophilus. Биохимия, 2004. 69(2): р. 204-210.

126. A.G. MacDiarmid ,A.J. Epstein. Polyanilines: a novel class of conducting polymers. Faraday Discuss. Chem. Soc., 1989. 88: p. 317-332.

127. A.V. Orlov, S.G. Kiseleva, G.P. Karpacheva. Borderline Polymerization of Aniline: Interpretation in the Context of the Electrical Double Layer Model. Polymer Science, Ser. A, 2008. 50: p. 1021-1027.

128. S. Cosnier, C. Mousty, C. Gondran, A. Lepellec. Entrapment of enzyme within organic and inorganic materials for biosensor applications: Comparative study. Materials Science and Engineering C, 2006. 26: p. 442-447.

129. D. Shan, J. Zhang, H.-G. Xue, S.-N. Ding, S. Cosnier. Colloidal laponite nanoparticles: Extended application in direct electrochemistry of glucose oxidase and reagentless glucose biosensing. Biosens. Bioelectron., 2010. 25,: p. 1427-1433.

130. P. Labbe ,G. Reverdy. Adsorption characteristics of poly cyclic aromatic compounds on clay: pyrene as a photophysical probe on laponite. Langmuir, 1988. 4: p. 419-425.

131. B. Brahimi, P. Labbe, G. Reverdy. Study of the adsorption of cationic surfactants on aqueous laponite clay suspensions and laponite clay modified electrodes. Langmuir, 1992.8: p. 1908.

132. P. Labb, B. Brahimi, G. Reverdy, C. Mousty, R. Blankespoor, A. Gautier, C. Degrand. Possible analytical application of laponite clay modified electrodes. J. Electroanal. Chem., 1994.379: p. 103-110.

133. C. Mousty, S. Therias, C. Forano, J.-P. Besse. Anion-exchanging clay-modified electrodes: synthetic layered double hydroxides intercalated with electroactive organic anions. J. Electroanal. Chem., 1994.374: p. 63-69.

134. D. Shan, S. Cosnier, C. Mousty. Biosens. Bioelectron., 2004.20: p. 390-396.

135. H. Chen, C. Mousty, L. Chen, S. Cosnier. A new approach for nitrite determination based on a HRP/catalase biosensor. Materials Science and Engineering: C, 2008. 28: p. 726730.

136. C. Mousty, O. Kaftan, V. Prevot, C. Forano. Sensors and Actuators B: Chemical, 2008. 133: p. 442-448.

137. J. Cantet, A. Bergel, M. Comtat. Coupling of the electroenzymatic reduction of NAD+with a synthesis reactioa Enz. Microb. Technol., 1996.18: p. 72-79.

138. K. Delecouls, P. Saint-Aguet, C. Zaborosch, A. Bergel. Mechanism of the catalysis by Alcaligenes eutrophus HI6 hydrogenase of direct electrochemical reduction of NAD+. J. Electroanal Chem., 1999. 468: p. 139-149.

139. S. Da Silva, R. Basseguy, A. Bergel. Electron transfer between hydrogenase and 316L stainless steel: identification of a hydrogenase-catalyzed cathodic reaction in anaerobic mic. Journal of Electroanalytical Chemistry, 2004. 561: p. 93-102.

140. P. Gros, C. Zaborosch, H.G. Schlegel, A. Bergel. Direct electrochemistry of Rhodococcus opacus hydrogenase for the catalysis of NAD+ reduction J. Electroanal. Chem., 1996. 405: p. 189-195.

141. D.D. Schlereth, V.M. Fernandez, M. Sanchezcruz, V.O. Popov. Direct electron transfer between Alcaligenes eutrophus Z-l hydrogenase and glassy carbon electrodes. Bioelectrochem. Bioenerg., 1992. 28: p. 473-482.

142. H. Ogata, S. Hirota, A. Nakahara, H. Komori, N. Shibata, T. Kato, K. Kano, Y. Higuchi. Structure, 2005.13: p. 1635.

143. A. Volbeda, L. Martin, C. Cavazza, M. Matho, B.W. Faber, W. Roseboom, S.P. Albracht, E. Garcin, M. Rousset, J.C. Fontecilla-Camps. J. Biol. Inorg. Chem., 2005.10: p. 239.

144. A.Y. Okunev, V.V. Teplyakov, N.I. Laguntsov. New research and developments in gas/vapor separation by membrane contactor systems. Desalination, 2006. 200(1-3): p. 432.

145. U. Schroder, J. Niessen, F. Scholz. A generation of microbial fuel cells with current outputs boosted by more than one order of magnitude. Angew. Chem. Int. Ed., 2003. 42: p. 2880-2883.

146. B. Min ,B. Logan. Continuous Electricity Generation from Domestic Wastewater and Organic Substrates in a Flat Plate Microbial Fuel Cell. Environ. Sci. Technol., 2004. 38: p. 5809-5814.

147. H. Liu, R. Ramnarayanan, B. Logan. Production of Electricity during Wastewater Treatment Using a Single Chamber Microbial Fuel Cell. Environ. Sci. Technol., 2004. 38: p. 2281-2285.