Жирные кислоты липидов рогатковидных рыб озера Байкал и создание на их основе наноносителей лекарственных субстанций тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

005012950

Попов Дмитрий Витальевич

Жирные кислоты липидов рогатковидных рыб озера Байкал и создание на их основе наноносителей лекарственных субстанций

02.00.10. Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 9 мдр т

Москва - 2012

005012950

Работа выполнена в Федеральном бюджетном государственном учреждении науки Байкальском институте природопользования Сибирского Отделения РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Раднаева Лариса Доржиевна

доктор химических наук, профессор

Ямсков Игорь Александрович

доктор химических наук, профессор, Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН (зав. лабораторией физиологически активных биополимеров)

Сорокоумова Галина Моисеевна

кандидат химических наук, доцент, Московский государственный университет тонких химических технологий

им. М.В. Ломоносова

(доцент кафедры биотехнологии и бионанотехнологии)

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева

Защита диссертации состоится «23» апреля 2012 г. в 15.00 часов на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, проспект Вернадского, д. 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mon.gov.ru

Автореферат разослан «20» марта 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук, старший научный сотрудник

А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Ихтиофауна .озера Байкал развивается с третичного периода, она уникальна и характеризуется большим видовым разнообразием и высокой степенью эндемизма (в Байкале насчитывается 33 вида эндемичных рыб (Сиделева, 2001).

Рогатковидные рыбы (подотряд Cottoideí) - одна из наиболее интересных групп в ихтиофауне озера Байкал. Возникшая в результате «взрывообразной» эволюции, группа за относительно короткий промежуток времени освоила различные экологические ниши водоема. В ее составе присутствуют современные близкородственные виды, находящиеся на разных стадиях эволюционных преобразований, а также единицы более высокого таксономического ранга, каковыми являются семейства (Талиев, 1955).

Оценку степени благополучия особей видов можно проводить при помощи физиолого-биохимической индикации с использованием липидных показателей, в частности жирнокислотного (ЖК)1 состава, при этом важно знать, как меняется ЖК-состав в зависимости от вида, типа исследуемой ткани, условий обитания. Известно, что состав липидов тканей ряда эндемичных рыб оз. Байкал характеризуется высокими уровнями длинноцепных полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), что типично для морских видов (Henderson и Tocher, 1987). Обнаружены высокие уровни п-3 ЖК в отдельных видах байкальских Cottoideí (Козлова и Хотимченко, 1993, 2000; Козлова, 1997; Grahl-Nielsen, 2005, 2011), но систематического исследования ЖК-состава рогатковидных рыб Байкала не проводилось.

С другой стороны, повышенное содержание ценных ПНЖК в голомянках Comephoriis dybowski и Comephorus baicalensis, обладающих большой биомассой в озере, делает их перспективным и возобновляемым природным источником этих компонентов, находящих широкое применение в фармацевтической и пищевой промышленности. Известно, что длинноцепные п-3 ПНЖК оказывают положительное воздействие на липидный профиль крови, оказывают противовоспалительное и иммуномодулирующие воздействие. Использование природных п-3 ПНЖК при разработке систем целенаправленной доставки лекарственных субстанций (ЛС) дает возможность дополнительного повышения их эффективности, особенно при использовании таких систем для доставки

1 Список сокращений: ЖК - жирные кислоты,' НЖК - насыщенные ЖК; МНЖК -мононенасыщенные ЖК; ПНЖК - полиненасыщенные ЖК; ГХ/МС - газовая хроматография/масс-спектрометрия; ЛС - лекарственная субстанция; ГОА - глубоководный обитаемый аппарат; ТЛН - твердые липидные наночастицы; ПАВ - поверхностно-активное вещество; Р-ЦД - р-циклодекстрин; ДМФА - диметилформамид; ТПП 4-тиоуреидоиминопиридиний перхлорат, ГК - главные компоненты; МГК - метод главных компонент; ДП - дзета-потенциал

лекарственных субстанций, действие которых направлено против внутриклеточных микроорганизмов, например, возбудителя туберкулеза.

Таким образом, исследование жирнокислотного состава рогатковидных рыб озера Байкал и разработка наноносителей противотуберкулезной ЛС (4-тиоуреидоиминопиридиний перхлората (ТПП)) на основе природного возобновляемого сырья являются актуальными.

Цель работы. Исследование жирнокислотных профилей байкальских рогатковидных рыб и разработка наноносителей противотуберкулезной ЛС - 4-тиоуреидоиминопиридиний перхлората на основе жирных кислот, полученных при переработке природного сырья. Задачи:

1. Изучить жирнокислотный состав рыб подотряда СоПогйеь озера Байкал и установить влияющие на него факторы;

2. Получить наноносители лекарственных субстанций на основе жирных кислот природного происхождения Байкальского региона;

3. Синтезировать и исследовать амфифильные Р-циклодекстрины (Р-ЦЦ), замещенные ацильными остатками ненасыщенных жирных кислот (в т. ч., полученных из концентрата ПНЖК из тканей СотерНогиз ЬтсаЫтгв, СотерИогш с1уЬо\\>зИу,

4. Изучить размерные характеристики, степень загрузки полученных наноносителей.

Научная новизна

- Впервые проведено систематическое исследование жирнокислотного состава рыб подотряда СоПо\йе1 озера Байкал. Обнаружена вариабельность жирнокислотного состава в зависимости от вида, типа ткани, экологической характеристики;

- Получены твердые липидные наночастицы на основе концентрата ПНЖК жира голомянки;

- Синтезированы амфифильные Р-циклодекстрины на основе концентрата ПНЖК, выделенных из природного сырья;

- Обнаружена способность амфифильных р-циклодекстринов, замещенных остатками ненасыщенных жирных кислот, к образованию наночастиц -носителей лекарственных субстанций.

Практическая значимость. Полученные данные о вариациях уровней жирных кислот в различных тканях эндемичных рыб озера Байкал в зависимости от различных факторов могут использоваться при мониторинге экологического состояния озера Байкал.

Некоторые виды байкальских рогатковидных рыб могут быть использованы в качестве источника ценных эссенциальных жирных кислот для получения носителей ЛС на примере ТПП.

Предложена схема получения наноносителей лекарственных субстанций из природного возобновляемого сырья, обладающих

возможностями направленной доставки активных агентов в меньших терапевтических дозах (при снижении побочных воздействий).

Наночастицы на основе Р-ЦД, содержащие ТПП, являются новой лекарственной формой этой субстанции, использование которой возможно при лечении туберкулеза.

Основные положения, выносимые на защиту

• Особенности жирнокислотных профилей байкальских рогатковидных рыб в зависимости от различных факторов;

• Свойства наноносителей ЛС на примере ТПП;

• Синтез и исследование амфифильных производных Р-циклодекстрина на основе ненасыщенных жирных кислот;

• Получение и исследование свойств наноносителей лекарственных средств.

Об актуальности работы свидетельствует поддержка данных исследований грантами:

1. Программа Президиума РАН № 20 «Фундаментальные проблемы океанологии: физика, геология, биология, экология». Подпрограмма «Глубоководные исследования озера Байкал», проект № 9 «Комплексные исследования зон активных разгрузок глубинных флюидов на озере Байкал с помощью автономных необитаемых аппаратов, обитаемых аппаратов «МИР», а также дистанционных пробоотборников» (2009-2011 гг.);

2. РФФИ № 08-05-98029-р_сибирь_а «Формирование и трансформация липидов гидробионтов оз. Байкал в зависимости от эколого-биологических факторов» (2008-2010 гг.);

3. Грант Роснауки 2006-РИ-19.0/001/383 «Исследование механизма формирования состава липидов эндемиков озера Байкал» (2006 г.).

4. Международный совместный проект СО РАН и Монгольской академии наук «Получение новых липо- и наносомальных форм лекарственных средств с использованием природного сырья», 20112013 гг.;

5. Международная экспедиция ««Миры» на Байкале» при поддержке Фонда содействия сохранению озера Байкал (2008-2010 гг.). Апробация работы. Результаты диссертационного исследования

докладывались на XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), X Международной конференции по химии и физикохимии олигомеров (Волгоград, 2009), Региональной молодежной научно-практической конференции с международным участием «Экологобезопасные и ресурсосберегающие технологии и материалы» (Улан-Удэ, 2010), Международной научной конференции «Дельты Евразии: происхождение, эволюция, экология и хозяйственное освоение» (Улан-Удэ, 2010), I

Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока» (Улан-Удэ, 2010), Всероссийской молодежной научно-практической конференции с международным участием «Экологобезопасные и ресурсосберегающие технологии и материалы» (Улан-Удэ, 2011).

Публикации. По результатам диссертационной работы опубликована 21 работа, из них 3 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 227 библиографических ссылок. Диссертационная работа содержит 20 таблиц, 35 рисунков.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Исследование жирнокислотного состава рогатковидных рыб и его изменчивости в зависимости от различных факторов

Для изучения закономерностей изменения жирнокислотного состава рогатковидных рыб использовали органы и ткани (сердечная, белые мышцы) 15 видов байкальских рыб, принадлежащих к трем семействам (Cottidae, Abyssocottidae и Comephoridae) подотряда Cottoidei. Рыб отлавливали в различных районах озера Байкал в 2009-2010 гг. как с помощью глубоководного траления, так и при помощи глубоководных обитаемых аппаратов (ГОА) «Мир» в ходе Международной научно-исследовательской экспедиции ««Миры» на Байкале» 2008-2010 гг.

Пробоподготовку осуществляли с помощью кислотного метанолиза. Анализ проводили методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии (ГХ-МС). Обнаружили до 42 жирных кислот. Обработку результатов выполняли с помощью мультивариационного статистического анализа с использованием метода главных компонент, реализуемого в ПО Sirius 7.0 (Pattern Recognition Systems).

1.1 Исследование жирнокислотного состава мышечных тканей

Семейство Abyssocottidae. Среди исследованных образцов к семейству Abyssocottidae принадлежат 9 видов, относящихся к двум экологическим группам - бентосным абиссальным и бентосным эврибатным организмам (табл. 1), обитающих преимущественно на больших глубинах. Среднегодовая температура в открытом озере составляет 3,1-3,5°С. Низкая температура обусловливает пониженное содержание насыщенных жирных кислот (НЖК), которое колеблется, в среднем, в диапазоне 20.2-24.5 % (в то время как у тропических рыб может достигать 45 % (Nair, 1978). Основной насыщенной кислотой является пальмитиновая (16:0), ее содержание у рыб, принадлежащих к родам Abyssocottus и Neocottus близко - 14.0-15.0 %, у Cottinella - 13.0 %. Рыбы, принадлежащие к родам Asprocottus, Cyphocottus, Limnocottus содержат

кислоту 16:0 в большем количестве - 17.3-20.3 %. В меньших количествах во всех рыбах этого семейства обнаружена стеариновая кислота (18:0) -1.6-7.3 %.

Для полиненасыщенных кислот наблюдается обратная тенденция: у видов Cottinella boulengeri, Neocottus thermalis, Abyssocottus korotneffi, Abyssocottm gibbosus, составляющих группу абиссальных видов, уровни ПНЖК лежат в интервале 25.2-37.9 %, для бентосных эврибатных видов этого семейства значения выше - 37.0-58.9 %.

Соотношение общего количества n-З к п-6 ПНЖК обычно имеет меньшие значения для пресноводных видов (1-3) и большие для морских 8-18, указывая на повышенное содержание в пище 18:2п6 и 18:3п6, чем 18:3n3 (Henderson и Tocher, 1987). У абиссальных видов семейства Abyssocottidae содержание ПНЖК группы n-З составляло 16.3-26.6%, а у эврибатных существенно выше - 38.1-42.0%. Содержание ПНЖК группы п-6 для всех изученных рыб Abyssocottidae находилось в пределах 8.213.2 %. Соотношение п-З/п-6 составляли 2.4-3.4 для эврибатных видов, 1.92.2 для абиссальных, значение для Abyssocottus korotneffi составляло 3.2 и было ближе к первой группе.

Семейство Cottidae (подсемейство Cottocomephorinae). К подсемейству Cottocomephorinae среди исследованных рыб относилось 4 вида, которые подразделялись на три экологические группы (бентосный, эврибатный; бентосный, абиссальный; бентопелагический). Бентопелагические виды приспособлены к обитанию как вблизи дна, так и в толще воды. В общем ЖК-составе рыб значения группы насыщенных кислот находятся в относительно небольшом диапазоне - ] 9.9 % для абиссального вида Batrachocottus nikolskii; 25.3 % для эврибатного Batrachocottus multiradiatus, 24.2-24.9 % для бентопелагических видов рода Cottocomephorus. Содержания МНЖК для Batrachocottus nikolskii составляло почти половину общих ЖК - 47.4 %, для Batrachocottus multiradiatus содержание составило вдвое меньше - 26.4 %, значения для бентопелагических видов отличались не так значительно - 12.0 % для Cottocomephorus grewingkii и 18.5 % для Cottocomephorus inermis.

Наиболее низкое содержание ПНЖК наблюдалось в абиссальном виде Batrachocottus nikolskii - 32.4 %, в эврибатном Batrachocottus multiradiatus - 48.3 %, высокие значения - 56.6-63.8 % - для бентопелагических видов.

Содержание n-З ПНЖК в абиссальном виде было 22.6 %, в эврибатном 35.6 %, в бентопелагическом - 49.9-58.4 % (различие можно объяснить разной кормовой базой, бентоса и пелагиали, а также отличиями в плавательном поведении).

Количество п-6 ПНЖК в бентопелагических видах рода Cottocomephorus составляло 5.3-6.3 %, тогда как в эврибатном виде Batrachocottus midtiradiatus - 12.5%, а в абиссальном Batrachocottus

nikolskii - 9.7 %. Соотношение n-3/n-6 составляло 2.3 для Batrachocottus nikolskii; 2.8 - для Batrachocottus multiradiatus; 7.9 - для Cottocomephorns inermis, 10.9 - Cottocomephorus grewingkii.

Семейство Comephoridae. В семейство Comephoridae входят большая и малая голомянки (Comephorus baicalensis и Comephorus dybowski), оба вида являются вторично пелагическими. Содержание насыщенных кислот составляло 29.7 и 25.4 % соответственно, МНЖК -35.1 и 14.6 %, ПНЖК - 34.0 и 58.8 %. ПНЖК n-З типа - 11.7 и 9.9 %; п-6 -9.9-11.7%, соотношение п-З/п-6 составляло 4.9 для малой голомянки, 1.9 для большой голомянки. Рыбы семейства Comephoridae содержали сравнительно высокие пропорции НЖК (25.4 %; 29.7 % - большие, чем у бентопелагических видов), малая голомянка содержала очень низкое количество МНЖК (14.6 %) и высокое (58.8 %) количество ПНЖК.

Наряду с мышечными тканями были исследованы ткани сердца. Главная особенность сердечных тканей исследованных видов трех семейств заключается в том, что они содержали меньшие количества ПНЖК по сравнению с мышцами и повышенные количества НЖК. Так, были обнаружены: 20:4п6 - в мышечных тканях до 11.0 %, в сердечных -до 8.6 %; 20:5пЗ - до 20.7 % и 12.0 % соответственно; 22:6пЗ - до 4.7 и 29.9 % соответственно. В то же время содержание основной насыщенной кислоты (пальмитиновой) в мышечных тканях достигало 20.3 %, а в сердечной - 43.6%. В сердечных тканях найдены сравнительно низкие уровни линоленовой кислоты (до 2.2 %) (ср. в мышечных - до 4.6 % (Brenner, 1963)). В то же время, ЖК-состав сердечных тканей заметно варьировал для рыб, принадлежащих к разным родам, и был близок внутри рода. Для видов, принадлежащих к роду Cottocomephorus, НЖК - 29.731.9 %, МНЖК - 19.4-21.9 %, ПНЖК - 48.3-48.6 %; для Limnocottus НЖК -25.9-27.0%, МНЖК - 24.2-30.7%, ПНЖК - 43.0-48.7%. ЖК состав сердечных тканей не отражал явной взаимосвязи с экологической характеристикой, как для мышечных тканей.

На рис. 1 изображен ГК-график, на котором прослеживается описанная выше разница в ЖК-составе в зависимости от рода, причем представители разных видов рода Limnocottus расположены близко, свидетельствуя о наличии сходства (близких значений для основных групп ЖК).

ЖК-состав является специфичным для различных тканей (вид Batrachocottus multiradiatus) (рис. 2), это объясняется различными функциями тканей. Например, в икре содержится больше ненасыщенных ЖК 20:4п6, 20:5пЗ, 18:2п6 (5.7; 14.7; 28.0% соотв.), чем в других тканях. ЖК запасены в икре наряду с другими питательными веществами, необходимыми эмбриону для развития из оплодотворенной яйцеклетки. ПНЖК используются эмбрионом как для построения клеточных мембран, так и в качестве источника энергии.

Таким образом, уровни ПНЖК в мышечных тканях для бентосных абиссальных видов, в основном, находились в диапазоне 25.2-37.9%, для бентосных эврибатных - 37.0-58.9%, бентопелагических - 56.6-63.8 %, наконец, вторично пелагические виды (род Comephorus) - 49.1-58.8%. Повышенные содержания ПНЖК, которые являются важными субстратами энергетического обмена (Crockett, Sidell, 1992), можно объяснить активным плавательным поведением, большими энергетическими затратами эврибатных и пелагических видов при перемещении на различных глубинах.

Поджелудочная

Рис. 1. Метод главных компонент. ЖК- Рис. 2. Метод главных компонент. ЖК-состав образцов тканей сердца в состав образцов в зависимости от типа зависимости от вида. 1 - Limnocottus griseus; ткани (Balrachocottus multiradiatus) 2 - Limnocotus Pallidas', 3 - Asprocottus sp.; 4 - Abyssocottus gibbosus; 5 - Cyphocottus species; 6 - Cottocomephorus inermis; 7- Comephorus dybowski

Содержания НЖК изменялись аналогично, но в меньших пределах: 19.9-21.9 % для бентосных абиссальных видов, для всех остальных -23.129.7 %. В то же время уровни МНЖК обнаруживали обратную тенденцию - наибольшие значения 40.1-50.1 % были характерны для типично абиссальных видов, другие группы видов характеризовались меньшими значениями 12.0-38.4 %. Виды, приспособленные к обитанию на больших глубинах содержат наибольшие количества МНЖК, в то время как обитающие на различных глубинах - характеризуются повышенными уровнями ПНЖК и НЖК. Общая степень ненасыщенности всех жирных кислот, входящих в состав различных липидов, может быть охарактеризована отношением суммы ПНЖК и МНЖК к сумме насыщенных кислот. Для различных типов эти значения были следующими: бентосные абиссальные виды 3.4-4.0; бентосные эврибатные 2.5-3.0; бентопелагические 3.0-3.1; вторично пелагические 2.3-2.9. На рис. 3 наблюдаются различия в ЖК-составе абиссальных, пелагических и

Таблица 1. Сравнительное содержание различных типов ЖК в мышечных и сердечных тканях рыб (мол. %)

Семейство / Подсемейство Вид Глубины встречав мости, м Экологическая характеристика мышцы СЕРДЦЕ

Е НЖК £ МНЖК ЕПНЖК пЗ пб пЗ/пб Степ, ненас-Tlf 2 НЖК £ МНЖК I ПНЖК лЗ пб оЗ/пб

Cottidae)! Cottocomephori пае Cottocomephorus grewingkii 0.5-400 Бентопелаги-ческий 24.2±8.3 12.0*2.3 63.8*17.3 58.4±15.0 5.3*1.0 10.9 3.1 31.9*5.5 19.4*5.9 48.6*15.0 42.4*15.1 5.9*1.0 7.2

Cottocomephorus inermis 20-1200 Бентопелаги-ческий 24.9*6.5 18.5±6.0 56.6*15.9 49.9*12.2 6.3*0.5 7.9 3 29.7*4.9 21.9*5.4 48.3*14.3 43.6*12.5 4.7*0.9 9.4

Batrachocottus multiradiatus 50-900 Бедаоенкй. мрибатяый 25.3*5.2 26.4*7.2 48.3±10.3 35.6*7.8 12.5±1.9 2.8 3 - - -

Batrachocottus nikolskii 100-1400 19.9±7.6 47.4±12.3 32.4±6.5 22.6±3.9 9.7±2.0 2.3 4 ■ - - - -

Abyssocottidae Abyssocottus korotneffi 200-1600 т Беатфсный, ' абиссальный 21.6*10.2 42.6±15.3 35.7*11.9 26.6±5.8 8.2*1.3 3.2 3.6 32.7*10.0 36.5*11.7 30.9±6.2 24.0*5.6 6.9*1.2 3.5

Abyssocottus gibbosus 400-1600 : "Еентосмый, 21.9*4.3 40.1*16.2 37.9*9.5 25.9*4.3 Н .9*2.7 2.2 3.6 27.4*7.2 30.6*12.5 42.0*8.2 30.3*7.4 11.6*1.5 2.6

Asprocottus abyssalis 150-1400 Беятосяый. гнившим 24.8*4.8 38.1*9.5 37.0±14.2 26.0*4.8 10.9±0.5 2.4 3 52.3*17.2 35.2*5.0 12.5*2.3 10.5*1.2 1.9*0.2 5.4

Cyphocottus sp. 30-600 Кстасный, акрн&тный 24.5*6.8 16.6*3.2 58.9±12.2 45.5±9.0 13.2±3.3 3.4 3.1 58.5*12.3 17.8*2.3 23.6*8.2 19.0*2.7 4.6*0.4 4.1

Limnocottus bergianus 100-1000 bctre-iftfi рнбатн^й 28.6*7.0 16.6*4.3 54.8*14.9 42.0*4.2 12.8*1.3 3.3 2.5 -

Limnocottus pallidus 100-1000 V EetfrbcHbiu. 'врибатный .i БеагоснвЙ, ispwSa-raái; 24.5*6.9 25.1*8.0 50.3*11.6 38.7*5.8 11.6*4.0 3.4 3.1 27.0*10.1 24.2*1.2 48.7*13.2 37.1*9.4 11.4*2.3 3.2

Limnocottus griseus 200-1300 23.1*9.9 25.8±7.54 51.0±15.4 38.1*5.3 12.8*2.7 3 3.3 25.9*9.1 30.7*5.5 43.0*11.0 28.4*3.9 14.2*1.9 2

Cottinella boulengeri 400-1600 20.2*4.3 50.1*14.5 29.6±5.8 19.9±2.2 9.6±2.1 2.1 3.9 31.3*6.2 35.0*7.4 33.8*11.7 24.9*1.8 8.9*0.5 2.8

Neocottus thermalis 400-480 Фролиха b-lj[.> "."И1. . абиссальный 20.3±5.7 44.1*13.2 25.2*4.5 16.3*3.0 8.4*4.0 1.9 3.4 - - - - -

Comephoridae Comephorus baicaiensis До 1600 Вторично пелагический 29.7*10.0 35.1*11.2 34.0*7.1 21.8±1.0 11.7*2.0 1.9 2.3 - - - - -

Comephorus dybowsh До 1600 Вторично пелагический 25.4*5.5 14.6±5.9 58.8*11.9 48.7±4.0 9.9*1.4 4.9 2.9 41.0*10.5 27.3*9.1 31.7*12.5 25.0*4.2 6.7*1.2 3.7

Примечание: Степень ненасыщенности - (£ ПНЖК+1 МНЖК) / Е НЖК

бентопелагических видов, обнаруженные при помощи МГК. В тканях мышц многих видов были обнаружены высокие пропорции длинноцепных п-3 ПНЖК. Эта особенность характерна для морских рыб. Соотношение п-З/п-6 ПНЖК находилось в диапазоне 1.9-4.7.

Большое содержание ПНЖК у байкальских рыб может быть связано с низкой температурой в озере, обусловливающей высокую степень ненасыщенности мембранных ЖК. Так, голомянки в больших количествах содержат эйкозапентаеновую и докозагексаеновую кислоты (рис. 4).

j Бентопелагические *

Si

Пелагические 7

А] Ал, ж . •) Л • • : у

Л" / • •

d • /'Абиссальные

ГК I (54,5'«)

f* 1й

• к • * \\ А А \ А * ▲ к..............1

\ • Comephoridc • • / • у 9 е Ainssocoitidae

ГК 1 (69,0%.)

Рис. 3. Метод главных компонент. Распределение образцов в зависимости от экологической характеристики вида (абиссальные; пелагические; бентопелагические)

Рис. 4. Метод главных компонент. Распределение образцов в зависимости от таксономического положения (бычки, семейство АЬузэосоШйае, голомянки, семейство Сотер/юпЛае)

Таким образом, типично абиссальные виды рогатковидных рыб Байкала характеризуются повышенным содержанием ненасыщенных кислот по сравнению с эврибатными и пелагическими. Соотношение п-З/п-6 ПНЖК в мышечных тканях большинства исследованных видов рогатковидных байкальских рыб было характерным для пресноводных рыб, а для некоторых видов - имело промежуточное значение между пресноводными и морскими рыбами.

2. Получение твердых липидных наночастиц (TJIH) на основе концентрата ПНЖК голомянок

Голомянки (С. dybowski и С. baicalensis) являются многочисленными, но непромысловыми видами, несмотря на то, что при надлежащей организации лова, с успехом могли бы использоваться в качестве объекта промысла. На потенциальное промысловое значение голомянки указывал Д.Н. Талиев, 1955. При использовании специальных средств добычи возможно увеличить ее продуктивность (патент РФ №2169466. Способ лова голомянок / Мамонтов A.M., опубл. 27.06.2001). Более того, голомянки часто являются попутной добычей при лове омуля.

Вместе с тем, высокое содержание эссенциальных жирных кислот делают голомянок привлекательным восполняемым биоресурсом для фармацевтической промышленности.

ПНЖК обладают противовоспалительными свойствами и высокой биологической активностью. Они могут входить в состав наноносителя как в неизменном виде (ТЛН), так и в химически связанном, для придания амфифильных свойств гидрофильным молекулам (ацил-р-ЦД, фосфолипиды). Находясь в носителях, сами ПНЖК сохраняются от преждевременного окисления (известно, что при пероральном приеме в традиционных формах ПНЖК демонстрируют низкую биодоступность, в т. ч. из-за окисления в желудочно-кишечном тракте (Cansell, 2003)). Более того, в ряде случаев используется химическое связывание ПНЖК с молекулами самих JIC, обеспечивая повышенную терапевтическую эффективность (Wang, 2012).

Нами были получены ТЛН на основе концентрата ПНЖК из жира голомянок с использованием различных (ПАВ) в разных концентрациях. Водные дисперсии ТЛН, состоящие из 10 % по весу липидной фазы получали с использованием гомогенизации при высоком давлении (Muller, 2000). Смесь твердого Dynasan 118 (триглицерид стеариновой кислоты) и жидкого (концентрат ПНЖК жира голомянок) липидов расплавляли при температуре 85е С (приблизительно на 10°С выше точки плавления Dynasan 118) в соотношении 1:1 по массе. Затем липидную фазу диспергировали и добавляли в горячий раствор ПАВ (при 85°С) с использованием Ultra-Turrax Т25. В качестве поверхностно-активных веществ были использованы Poloxamer 188 (1.2% по массе) и Tween 80 (1.2 % по массе).

сн2о -с о

I II

сно-с

■СН2(СН2)1вСНз

-CH2(CH2)leCH¡

СН-,0

С-СН2(СНг),еСНз Dynasan 118

a+b+c+d = 20 Tween 80

Полученные преэмульсии последовательно гомогенизировали при той же температуре с помощью гомогенизатора высокого давления в двух циклах при давлении 8* 107 Па с использованием APV Micron Lab 40 (GEA Niro Soavi, Германия). Полученную горячую масляно-водяную эмульсию охлаждали до комнатной температуры, для достижения рекристаллизации липидной фазы с формированием ТЛН.

Физическая стабильность и размерные характеристики

Для прогнозирования стабильности коллоидных водных дисперсий используется величина дзета-потенциала (ДП) (Komatsu et.al, 1995). Обычно агрегация частиц почти не происходит в случае, когда их ДП<30мВ благодаря электрическому отталкиванию (Levy, 1994), но при использовании неионогенных поверхностно-активных веществ (ПАВ) стерические затруднения являются дополнительным эффектом, увеличивающим стабильность коллоидных дисперсий (Lim et al. 2002).

Определение величины ДП выполняли в водных дисперсиях TJIH, хранившихся при комнатной температуре. Полученные данные показали, что во время хранения липидных наночастиц ДП дисперсий изменялся незначительно (табл. 2). Кроме того, величины ДП для полученных композиций зависели от типа использованного ПАВ, с меньшими значениями (-32.5 -38.7) мВ при использовании Tween, и большими (-20.225.1) мВ при использовании Poloxamer 188. Полученные композиции хранили при пониженной (4 °С), при комнатной (20 °С) и при повышенной температуре 40 °С (для изучения их физической стабильности). Размер частиц изучали с помощью фотон-корреляционной спектроскопии и лазерной дифрактометрии на 1, 14 и 28 день.

Таблица 2. Средний дзета-потенциал ТЛН, измеренный при 20°С на 1, 14, 28 день после получения______

ПАВ ДП, мВ

1 день 14 день 28 день

Poloxamer 188 -20.2±3.6 -23.0±1.5 -25.Ш.2

Tween 80 -38.7±2.6 -34.3±1.9 -32.5±1.1

Данные, полученные с помощью фотон-корреляционной спектроскопии для композиции, стабилизированной с помощью Tween 80, хранившегося в течение 1 дня при комнатной температуре, указывают на средний размер частиц 370 нм. ТЛН, стабилизированные Poloxamer 188 при 20°С имели размер 197 нм. Средний размер частиц незначительно изменялся к 14 и 28 дню хранения. Так, после 14 дней хранения при комнатной температуре средний размер частиц составлял 381 нм для композиции с Tween 80 (табл. 3).

Таблица 3. Размер частиц ТЛН (нм) при различной температуре хранения на 1, 14 и 28 день после получения ____

ПАВ Время хранения, дней Температура

4 20 40

Poloxamer 188 1 208 197 195

14 200 191 193

28 199 190 189

Tween 80 1 341 370 354

14 317 381 352

28 315 384 397

Анатаз данных фотон-корреляционной спектроскопии, а также лазерной дифрактометрии (табл. 4) позволил выявить зависимость размера

частиц от типа использованного ПАВ. Интересно, что размер частиц ТЛН, полученных с использованием Poloxamer 188 существенно меньше по сравнению с дисперсиями, стабилизированными Tween 80.

Таблица 4. Диаметры (с!50 %, ¿90 %, d95 %) частиц ТЛН при различном времени хранения, полученные с помощью лазерной дифрактометрии_

ПАВ T хранения, °С Диаметр, мкм*

1 день 14 день 28 день

d50 % d90 % d95 % d50 % d90 % d95 % d50 % d90 % d95 %

Poloxamer 188 4 0.2 0.3 0.3 0.2 0.3 0.3 0.2 0.3 0.3

20 0.2 0.2 0.3 0.2 0.2 0.3 0.2 0.2 0.3

40 0.2 0.2 0.3 0.2 0.2 0.3 0.2 0.2 0.3

Tween 80 4 0.3 4.3 7.5 0.3 3.3 6.8 0.3 3.8 6.9

20 0.3 0.7 0.9 0.3 0.8 3.6 0.3 0.8 3.2

40 0.3 0.6 0.7 0.3 0.6 0.7 0.3 0.6 0.7

* Стандартное отклонение: ±0,001-0,005 мкм

Кроме того, композиции с Poloxamer 188 имели распределение по размерам с d50 % (d50 % - распределение по размерам, показывающее, что 50 % частиц меньше приведенной величины) около 200 нм и с d95 % до 300 нм в течение всего периода хранения при различных температурах. В композициях, стабилизированных Tween 80, первые агломераты наблюдались уже к 1 дню после получения при хранении при комнатной температуре и при 4°С. Полученные данные о присутствии агломератов частиц ТЛН в исследованных образцах подтверждены при помощи световой микроскопии (рис. 5).

• ............* • -Г -.....' г-.'" .

I * * • , , *

• ' . ■ ' ' ■ .

Ж--ь • ■ ШШЁЩ*

■ ' : '"". î ~

•- »Омр.

- • .

Рис. 5. Агломераты ТЛН, полученных на основе концентрата ПНЖК жира голомянки, твердого липида (Dynasan 118) и ПАВ: Poloxamer 188 (слева), Tween 80 (справа) через 28 дней после получения

Отсутствие агломератов при 40°С можно объяснить высокой адсорбцией неионогенных ПАВ при повышенных температурах (Holmberg et al. 2003). Агломераты могут формироваться из-за неполного покрытия молекулами ПАВ вновь образованных поверхностей во время процедуры гомогенизации. Это покрытие зависит от свойств ПАВ, таких как скорость диффузии и сродство к поверхностям ТЛН (Muller et al. 2002).

Химическая стабильность

Хранение дисперсий ТЛН при различных температурах и воздействие кислорода воздуха может вызывать разрушение пЗ ЖК в зависимости от времени воздействия (Ко1ако\узка, й а1. 2006). Длинноцепные ПНЖК очень чувствительны к воздействию кислорода и температуры из-за наличия сопряженных двойных связей. Мы изучали ЖК состав полученных ТЛН после 3 месяцев хранения при различных температурах (табл. 5). Уровни ПНЖК и пЗ ЖК незначительно уменьшались после 3 месяцев хранения. Наименьшие изменения наблюдались в композициях, хранившихся при 4°С: 81 % ПНЖК и 53 % пЗ, в сравнении с 88% и 57% соответственно в начальном составе концентрата. В общем, изменения в ЖК составе были более заметны для

композиций, хранившихся при 40°С.

Таблица 5. Относительный ЖК состав (мол. %) полученных ТЛН на основе ПНЖК

Класс ЖК Концентрат 4°С 20°С 40°С

ЕНЖК 0.54±0.05 0.61±0.12 0.9б±0.14 1.05±0.24

1МНЖК ll.08il.21 17.69±1.84 20.58±1.70 20.45±1.94

S ПНЖК 88.15±3.59 81.09±4.30 77.94±4.48 77.79±4.41

1пЗ 57.1U3.05 52.60±3.77 49.60±3.94 50.63±3.84

Таким образом, композиции на основе ПНЖК рыб, стабилизированные Poloxamer 188 показали лучшую стабильность. Значения дзета-потенциала полученных дисперсий мало изменяются при хранении и остаются меньше -30 мВ для композиций с Tween 80, и меньше -20 мВ для Poloxamer 188, что свидетельствует о их стабильности. Дополнительная стабилизация достигается за счет стерических затруднений, связанных с молекулами ПАВ. Размеры полученных частиц TJIH составляли 200 - 300 нм и мало зависели от условий и времени хранения.

3. Синтез и свойства ацил-р-циклодексгринов на основе ненасыщенных жирных кислот

Также были получены носители другого типа, включающие химическое связывание молекул ПНЖК с гидрофильными молекулами р-циклодекстрина, способные к образованию мицеллоподобных частиц.

Были синтезированы частично замещенные (обладающие амфифильными свойствами) ацил-р-ЦД на основе стеариновой, миристиновой, линолевой, линоленовой кислот (марки «хч», Acras Organics), а также концентрата ПНЖК, выделенных из жира голомянки (табл. 6). Соединения были получены при реакции Р-ЦД с хлорангидридами жирных кислот.

Прямой способ получения хлорангидридов жирных кислот с помощью тионилхорида предусматривает нагревание, нежелательное в

Таблица б. Состав концентрата ПНЖК, выделенных из жира голомянки

ЖК Содержание, мол. % ЖК Содержание, мол. %

14:0 0.23±0.02 18:2п6 2.11±0.б6

¡15 0.17±0.03 18:ЗпЗ 1.72±0.50

15:0 0.15±0.11 18:4пЗ 0.36±0.17

16:0 1.88±0.17 20:4п6 8.72±1.10

16:1п7 2.3Ш.22 20:5пЗ 16.37±3.11

16:3п4 0.33±0.05 21:5пЗ 2.31 ±1.02

18:0 1.12±0.06 22:5п6 0.83±0.31

18:1п9 8.70±1.43 22:6пЗ 34.12±3.32

случае с ненасыщенными кислотами, поэтому он был применен лишь с насыщенными кислотами - миристиновой и стеариновой. Хлорангидриды насыщенных кислот были получены напрямую одностадийной реакцией: RCOOH + SOCl2 -> RCOC1 + S02 + НС1 (1)

В случае с ненасыщенными кислотами применяли двухстадийный синтез, проводимый при комнатной температуре. Первая стадия -получение силильного производного ЖК:

RCOOH + (CH3)3SiCl RCOOSi(CH3)3 + НС1 (2)

Вторая - взаимодействие с хлорирующим агентом:

RCOOSi(CH3)3 + SOCl2 —> RCOC1 + S02 + (CHi^SiCl (3) Выбор способа получения хлорангидридов обусловлен отсутствием нежелательных побочных реакций по двойным связям (патент US 5912371. Method for preparing fatty acid chlorides / Nakanishi K. et. al, publ. 27.10.1997).

Измеренные показатели преломления полученных соединений соответствовали справочным данным. Реакции ацшшрования Р-ЦЦ для насыщенных кислот проводили различными способами (рис. 6) - в присутствии акцептора хлороводорода (пиридин), и без акцептора (в диметилформамиде, ДМФА).

Рис. 6. Схема реакции ацилирования (3-11Д (1Г= Я(СО) или Н; Ру-пиридин)

Методика получения амфифильного (3-ЦЦ, предусматривающая удаление ДМФА с помощью роторного испарителя, имеет существенный недостаток - продукт реакции при осаждении гексаном выделяется в виде маслянистой жидкости на дне сосуда, затрудняя дальнейшее формирование осадка. С учетом высокой температуры кипения ДМФА (153°С), а также неудобств, связанных с выделением продукта, продукт реакции осаждали

из концентрированного раствора с помощью равного объема ацетона (50 мл) с добавлением 2 мл воды. Такой способ позволил избежать нагревания и излишних потерь вещества при отмывании растворителя (табл. 7).

Ацил-р-ЦД Выход, % (в ДМФА) Выход, % (в пиридине)

Миристоил-Р-ЦЦ 90 86

Стеароил-Р-ЦД 95 89

Линолеоил-Р-ЦЦ 88

Линоленоил-Р-ЦЦ - 92

Ацил-Р-ЦЦ на основе ПНЖК - 90

У^И^^/Л^ЛЧ/!1\_/} ни »"-М-"'-'--*-- —-------- \---------/

можно объяснить сравнительно высоким количеством атомов в углеродной цепи заместителя и одновременно небольшим различием в их длине.

^^Растворитель Соединени&-\^ Вода Этиловый спирт Ацетон Этил-ацетат ДМФА дмсо ДМАА ТГФ Диоксан

Миристоил-Р-ЦД чр/н нр чр нр Р Р Р чр чр/н

Стеароил-р-ЦД нр нр чр нр Р Р Р чр нр

Линолеоил-р-ЦД нр нр чр нр Р Р Р чр нр

Линоленоил-Р- ЦД нр нр чр нр Р р Р чр нр

Ацил-р-ЦД на основе ПНЖК чр/н нр чр нр Р р Р чр нр

нагревании; нр - не растворим

В ИК спектрах ацил-р-ЦД присутствовали характерные сигналы: при 3382 см"1 - широкая полоса -ОН группы, характерной для полимеров, при 2923 см"1 - асимметричные валентные колебания метиленовой группы возле -ОН группы; полоса 1340 см"1 соответствовала метановому фрагменту. В области 1081-1158 см'1 располагались три полосы асимметричных валентных колебаний СОС группировки. Широкая полоса при 1028 см"1, а также серия малых сигналов соответствовали колебаниям макрокольца и колец О-глюкопиранозы. Также наблюдали полосы 2917 и 2849 см"1 группы -СН2-, 1472 см"1 - ножничные колебания -СН2-, полосы 1430-1437 см'1 - метальная группа, 1735 см'1 - полоса поглощения карбонильной группы характерная для сложноэфирной связи.

Полученные данные элементного анализа производных Р-ЦД соотнесены с предварительно рассчитанными теоретическими значениями для различных возможных степеней замещения ЖК-остатками (табл. 9).

Таблица 9. Элементный анализ и расчет средней степени замещения ацил-)3-ЦД

м, г/моль Степень замещения, п Вычислено Определено

Стеароил-р-ЦД

С,% Н,% о,% С,% Н,% 0,% п

1134 0 44,44 6,17 49,38 В ДМФА

1400 1 51,43 7,43 41,14 51,98 7,53 40,49 1.1

1666 2 56,18 8,28 35,53 В пиридине

1932 3 59,63 8,90 31,47 55,36 8,13 36,51 1.8

Миристоил-Р-ЦД

1134 0 44.44 6.17 49.38 В ДМФА

1344 1 50.00 7.14 42.86 51.34 7.38 41.28 1.3

1554 2 54.05 7.85 38.10 В пиридине

1764 3 57.14 8.39 34.47 52.57 7.59 39.84 1.6

Линолеоил-р-ЦД

1134 0 44.44 6.17 49.38 В пиридине

1396 1 48.14 7.16 44.70

1658 2 50.66 7.84 41.50

1920 3 52.50 8.33 39.17 55.89 8.19 42.51 1.7

Линоленоил-Р-ЦД

1134 0 44.44 6.17 49.38 В пиридине

1394 1 51.19 7.41 46.02

1654 2 56.02 8.17 43.11

1914 3 59.16 8.28 42.78 55.70 8.03 42.10 1.9

4. Использование ПНЖК и амфнфильных соединений, полученных на их основе, для создания наноносителей противотуберкулезной субстанции

В Иркутском институте химии им. А.Е. Фаворского СО РАН совместно со специалистами-медиками Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ разработана новая высокоэффективная противотуберкулезная субстанция 4-тиоуреидоиминопиридиний перхлорат, обладающая более высокой эффективностью и меньшей токсичностью по сравнению с известными в настоящее время препаратами.

ны/ \— ch=n-nh-c-nh2 • сю®

^^ S

В результате проведенных исследований in vitro было показано, что ТПП обладает высокой противотуберкулезной активностью как в отношении чувствительных, так и полирезистентных культур микобактерий туберкулеза. Причем, по выраженности степени угнетения жизнеспособности чувствительных штаммов микобактерий туберкулеза ТПП не уступал изониазиду и рифампицину. Острая токсичность (LD50)

субстанции, определенная по стандартному методу в опытах на линейных белых мышах при внутрибрюшинном введении, рассчитанная по Беренсу, составляет 350 мг/кг. Было установлено, что по противотуберкулезной активности на штамм № 3714 препарат превосходит известные и широко применяемые туберкулостатики, такие как изониазид в 200 раз, стрептомицин в 400 раз, на штамм H37Rv его активность сопоставима с изониазидом, в 20-25 раз выше, чем у стрептомицина, в 40-45 раз выше, чем у тиоацетозона и в 500-600 раз выше, чем у пиразинамида. Минимальная ингибирующая концентрация ТПП по отношению к штамму H37R.V составляла 0.025-0.050 мкг/мл (патент РФ № 1621449. Перхлорат 4-тиоуреидоиминометилпирвдиния, обладающий туберкулостатической активностью / Елохина В.Н., Александрова А.Е., Нахманович A.C. и др., опубл. 25.10.1993).

Низкая растворимость ТПП в воде затрудняет его применение в терапевтической практике. Увеличить растворимость можно за счет образования наночастиц ТПП. Известно, что низкую растворимость лекарственных субстанций также можно повысить их совместным измельчением с ß-ЦД, при этом образуются микрочастицы, способствующие повышению растворимости субстанции, например, противоастматического препарата - пранлукаста (Wongmekiat, 2007). Указанный способ мы применили для ТПП. Согласно методике, препарат

бОчкм '".........20 чкм .......... 1 20 мкя

Рис. 7. Снимок сканирующего электронного микроскопа: 1 - перетертый ТПП в течение 10 мин, 2 - перетертый р-ЦД, 3 - поверхность образца после 10 мин перетирания ТПГ1 с гидратом р-ЦД (1:1)

В образце 3 наблюдается образование конгломератов размером менее 900 км. Таким образом, перетирание с р-ЦД эффективно для получения микрочастиц препарата за счет диспергирования последнего в матрице p-циклодекстрина, что повышает растворимость таких частиц в воде. В ИК-спектре образца 3 проявляется полоса поглощения 3384 см" , характерная для водородной связи, но не присутствующая в исходных веществах. Микрочастицы препарата, полученные таким способом, конечно же, не имеют ничего общего с мицеллярными наночастицами и не обладают полезными транспортными и другими свойствами, характерными

для наночастиц. Однако данный прием может быть использован для повышения растворимости ТПП.

С использованием различных типов наноносителей возможно также достичь направленный транспорт ТПП. При лечении туберкулеза, возбудитель которого находится в клетках макрофагов, за счет захвата ими чужеродных частиц-носителей из крови осуществляется целенаправленная доставка ТПП. Нами были получены два типа носителей - липосомы и частицы на основе ацил-Р-ЦЦ. Липосомы были приготовлены из фосфолипидов яичного желтка с добавлением ПНЖК, выделенного из околоплодной пленки кедрового ореха. В составе концентрата были обнаружены, в основном, те же ЖК с 16-22 атомов углерода (16:0 - 9.3 %, 18:0 - 4.9 %, 18:1п9 - 39.1 %, 18:2п6 - 38.2 %), что и в ПНЖК, выделенном из жира голомянки. Эффективность загрузки липосом ТПП была определена при помощи спектрофотометрии и составила 56%. Размер, определенный с помощью турбидиметрии, варьировался в диапазоне 100500 нм.

Также были получены наночастицы на основе амфифильных циклодекстринов с включением ТПП по методике сферической кристаллизации. Раствор амфифильного р-ЦД в органическом растворителе (ацетоне) добавляли в водную фазу, содержащую растворенный ПАВ при комнатной температуре при перемешивании магнитной мешалкой. Органический растворитель и часть воды удаляли в вакуумном испарителе до появления опалесценции. Микроскопическое исследование наночастиц выполнено с помощью электронного сканирующего микроскопа LEO 1430 UP (LEO Microscopy, Ltd.) в режимах съемки во вторичных, а также обратно-рассеянных электронах с предварительным выпариванием раствора и фиксацией наночастиц в матрице Synperonic. На фотографии, полученной с помощью сканирующего электронного микроскопа (рис. 8) отчетливо видны скопления образований размером около 150 нм. Выполнен элементный анализ образований с помощью энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (методика получения данных об элементном составе образца, основанная на анализе спектра испускаемого веществом рентгеновского излучения). В табл. 10 значения 14 (для сферических образований) ближе к содержанию углерода в производном циклодекстрина (51-52 %), значения 5-8 (масса полоксамера) ближе к содержанию углерода в сополимере (62 %).

Приготовление наночастиц, загруженных ТПП, выполняли аналогичным способом при растворении ТПП в ацетоне. Из литературных данных известно, что высвобождение загруженных препаратов (например, стероидов) из наночастиц ацил-р-ЦД может происходить в течение промежутка времени от 15 минут до 24 часов. Один из путей высвобождения - разрушение мицеллярной частицы (Е. Memisoglu-Bilensoy et al., 2006).

Таблица 10. Спектральный элементный анализ поверхности образца стеароил-Р-ЦД

Спектр С,% О, % Остаточный сигнал

1 52.65 41.96 13.39

2 51.59 39.21 18.20

3 51.47 39.12 13.41

4 53.73 40.71 15.56

5 61.72 32.95 9.33

6 64.59 31.59 6.82

7 64.66 29.38 6.96

8 62.09 31.67 6.24

Рис. 8. Микрофотография наночастиц стеароил-Р-ЦД в матрице Synperonic

Оценку эффективности включения ТПП в наночастицы выполнили с использованием разницы в значениях электропроводности растворов известной концентрации, содержащих пустые наночастицы и загруженные препаратом (Helle, 2008). Градуировочную кривую получили из нескольких измерений электропроводности растворов ТПП точной концентрации в диапазоне 100-750 мг/л, в которых также содержались незагруженные наночастицы для повышения точности измерений (увеличение вязкости раствора при добавлении а.мфифильного ß-ЦД приводит к уменьшению значений электропроводности, в соответствии с уравнением Онсагера).

Используемый участок кривой, отражающей зависимость электропроводности от массы ЛС (при постоянном объеме), являлся линейным. Также оказалось возможным использовать одну и ту же кривую для разных амфифильных производных, так как значения в этих случаях были достаточно близки, что связано, по-видимому, с близкими значениями вязкости суспензий (табл. 11).

Таблица 11. Оценка степени включения ГПП в наночастицы

Амфифильное производное р-ЦД Значение электропроводности, К, (См-м)хЮ"3 Определенная по графику масса препарата, мг Степень включения, (ггь-т,)/пъ * 100 %

Загруженные ТПП наночастицы «пустые» наночастицы + ТПП Загруженные ТПП наночастицы «пустые» наночастицы + ТПП

Миристоил-Р-ЦД 19.1 32.4 29.0 50.0 42.0

Стеароил-р-ЦД 17.8 32.4 27.0 50.0 46.0

Линолеоил-Р-ЦД 21.2 32.4 31.1 50.0 38.0

Линоленоил-Р-ЦД 20.1 32.4 29.5 50.0 41.0

Ацил-Р-ЦД на основе ПНЖК 18.0 32.4 26.5 50.0 47.0

Таким образом, в результате проделанных экспериментов были получены наночастицы на основе амфифильных ß-ЦД, изучены их размерные характеристики (в среднем, 150 нм), степень загрузки наночастиц 4-тиоуреидоиминопиридиний перхлоратом составляла 38-47 %.

Выводы

1. Впервые проведено систематическое изучение жирнокислотных профилей байкальских рогатковидных рыб, принадлежащих к различным экологическим группам. Обнаружена зависимость жирнокислотного состава мышечных тканей рыб от их экологической характеристики. Абиссальные виды рыб характеризуются большей степенью ненасыщенности жирнокислотного состава, чем приспособленные к обитанию в пелагиали. При этом у абиссальных видов найдены меньшие уровни полиненасыщенных жирных кислот (в том числе п-3 полиненасыщенных жирных кислот) и насыщенных жирных кислот, а у пелагических - большие уровни полиненасыщенных жирных кислот. Обнаружены видовые особенности ЖК-состава, а также меньшая степень ненасыщенности сердечных тканей по сравнению с мышечными.

2. На основе концентрата полиненасыщенных жирных кислот, выделенных из жира голомянок, были получены твердые липидные носители, размер полученных частиц составляет 200-300 нм, они обладают достаточной стабильностью (дзета-потенциал около -30mV).

3. Синтезированы амфифильные ß-циклодекстрины, модифицированные ацильными остатками миристиновой, стеариновой, линолевой, линоленовой кислот, а также смеси (концентрата полиненасыщенных жирных кислот, выделенных из жира голомянки). Состав производных подтвержден данными элементного анализа, а структура методами ИК- и ЯМР-Н'-спектроскопии.

4. Методом сферической кристаллизации при использовании в качестве исходных соединений ацил-р-циклодекстринов получены наноносители 4-тиоуреидоиминопиридиний перхлората, которые могут быть использованы в качестве систем целенаправленной доставки активного агента в различные органы и ткани. Размер полученных наночастиц составлял, в среднем 150 нм, степень загрузки лекарственной субстанцией составляла не менее 38 %.

Основные публикации по теме диссертации:

1. Averina, E.S. Physical and chemical stability of nanostructured lipid drug carriers (NLC) based on natural lipids from Baikal region (Siberia, Russia) / E.S. Averina, R.H. Müller, D.V. Popov. L.D. Radnaeva // Die Pharmazie. -2011. - Vol. 66. - № 5. - p. 348-356.

2. Averina, E.S. Nanostructured lipid carriers (NLC) on the basis of Siberian pine (Pinns sibirica) seed oil / E.S. Averina, G. Seewald, R.H. Müller, L.D. Radnaeva, D.V. Popov // Die Pharmazie. - 2010. - Vol. 65. - № 1. - p. 11-17.

3. Раднаева, Л.Д. Амфифильные производные ß-циклодекстрина как носители лекарственных препаратов. // Л.Д. Раднаева, Д.В. Попов, В.Н. Елохина // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2009. - Т. 2. - № 2. - С. 288-289.

4. Аверина, Е.С. Исследование механизма формирования состава липидов эндемиков оз. Байкал / Е.С. Аверина, Е.Ц. Пинтаева, И.В. Звонцов, Д.В. Попов, В.В. Тараскин // Отчет о научно-исследовательской работе, информационная карта по Гранту Роснауки 2006-РИ-19.0/001/3 83.

5. Попов. Д.В. Изучение состава липидов различных органов и тканей эндемичных рыб озера Байкал / Д.В. Попов // Материалы XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 11-14 апреля 2007, Москва. - Т. 2. - С. 450.

6. Аверина, Е.С. Изучение жирнокислотного состава различных тканей гидробионтов озера Байкал / Е.С. Аверина, Д.В. Попов // Научная конференция молодых ученых и талантливых студентов: «Водные ресурсы, экология и гидрологическая безопасность», секция «мониторинг и прогноз окружающей среды и природных катастроф», 5-7 декабря 2007, Москва, С. 57-58.

7. Попов. Д.В. Получение наночастиц препарата туберкулостатического действия / Д.В. Попов // Материалы XV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 8-12 апреля 2008, Москва, С. 290.

8. Раднаева, Л.Д. Амфифильные производные ß-циклодекстрина как носители лекарственных препаратов / Л.Д. Раднаева, Д.В. Попов. В.А. Васнев, О.Г. Гаркуша, Е.Ц. Пинтаева// Всероссийская конференция по макромолекулярной химии, 13-17 августа 2008 г., Улан-Удэ, С. 117-118.

9. Попов. Д.В. Амфифильные производные ß-циклодекстрина как носители лекарственных препаратов / Д.В. Попов // Материалы V школы-семинара молодых ученых России, 5-10 июня 2009 г., Улан-Удэ, С. 228230.

10. Раднаева, Л.Д. Амфифильные производные ß-циклодекстрина как носители лекарственных препаратов / Л.Д. Раднаева, Д.В. Попов, В.А. Васнев // Тезисы докладов X Международной конференции по химии и физикохимии олигомеров, 7-11 сентября 2009 г., Волгоград, С. 320.

11. Попов. Д.В. Замещенные ß-циклодекстрины в качестве носителей лекарственных препаратов / Д.В. Попов // Тезисы международной конференции «Ломоносов», 11-15 апрель 2009 г., Москва, С. 30.

12. Попов. Д.В. Нанокапсулы на основе ацил-Р-циклодекстринов: получение и характеристики / Д.В. Попов, Л.Д. Раднаева // Тезисы докладов Региональной молодежной научно-практической конференции с

международным участием «Экологобезопасные и ресурсосберегающие технологии и материалы», 13-15 мая 2010 г., Улан-Удэ, С. 42-43.

13. Грахл-Нильсен, О. Жирнокислотный состав глубоководных гидробионтов оз. Байкал / О. Грахл-Нильсен, Л.Д. Раднаева,

C.B. Базарсадуева, Д.В. Попов. Е.С. Аверина // Тезисы докладов Международной научной конференции «дельты Евразии: происхождение, эволюция, экология и хозяйственное освоение», 16-20 августа 2010 г., Улан-Удэ, С. 275-277.

14. Раднаева, Л.Д. Разработка носителей лекарственных средств на основе природных липидов Байкальского региона / Л.Д. Раднаева, Е.С. Аверина, И.А. Павлов, Д.В. Попов. R.H. Müller // тезисы I Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока», 26-30 сентября 2010 г., Улан-Удэ, С. 138-140.

15. Popov. D.V. Preparation and characterization of acyl-ß-cyclodextrin nanocapsules loading 4 - thioureidoiminomethylpyridinium Perchlorate /

D.V. Popov, L.D. Radnaeva, V.N. Elokhina, S.V. Amosova, B.A. Trofimov // Материалы конференции «Bionanotox congress», 1 - 8 мая 2011, Ираклион, Греция, р. 47.

16. Попов. Д.В. Исследование жирнокислотного состава коттоидных рыб озера Байкал / Д.В. Попов, Л.Д. Раднаева // Материалы Всероссийской молодежной научно-практической конференции с международным участием «Экологобезопасные и ресурсосберегающие технологии и материалы», 12-14 мая 2011 г., Улан-Удэ, С. 192-193.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю доктору химических наук, профессору Раднаевой Ларисе Доржиевне, коллективу лаборатории химии природных систем Байкальского института природопользования Сибирского отделения РАН за помощь при проведении исследований и обсуждении работы. А также Ханаеву Игорю Вениаминовичу, старшему научному сотруднику Лимнологического института Сибирского отделения РАН за предоставление образцов и обсуждение работы.

Подписано в печать 16.03.2012 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 1,5 печ. л. Тираж 100. Заказ № 49.

Отпечатано в типографии Изд-ва Федерального государственного бюджетного учреждения науки БНЦ СО РАН 670047 г. Улан-Удэ ул. Сахьяновой, 6.

61 12-2/424

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Байкальский институт природопользования Сибирского отделения Российской академии наук

На правах рукописи

Попов Дмитрий Витальевич

ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ ЛИПИДОВ РОГАТКОВИДНЫХ РЫБ ОЗЕРА БАЙКАЛ И СОЗДАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ НАНОНОСИТЕЛЕЙ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СУБСТАНЦИЙ

02.00.10. Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Раднаева Л.Д.

Москва-2012

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений...........................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................5

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР..........................................................................10

1.1 Жирные кислоты гидробионтов и их применение.............................10

1.2 Исследование жирнокислотных профилей рогатковидных рыб Байкала....................................................................................................16

1.3 Циклодекстрины и образование соединений включения..................21

1.4 Влияние производных (3-цикдодекстринов на свойства лекарственных препаратов...................................................................24

1.5 Нанокапсулированные формы лекарственных субстанций..............30

1.6 Транспортные свойства наноносителей..............................................35

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.............................................................39

2.1 Исследование жирнокислотных профилей рогатковидных рыб озера Байкал и их изменчивости в зависимости от различных факторов. 39

2.2 Получение твердых липидных наночастиц (ТЛН) на основе концентрата ПНЖК голомянок............................................................61

2.3 Синтез и свойства ацил-(3-циклодекстринов на основе ненасыщенных жирных кислот..............................................................66

2.4 Использование ПНЖК и амфифильных соединений, полученных на их основе, для создания наноносителей противотуберкулезной субстанции..............................................................................................80

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ...........................................................91

3.1 Объекты исследования..........................................................................91

3.2 Исходные реактивы...............................................................................91

3.2.1 Растворители.....................................................................................91

3.2.2 Материалы.........................................................................................92

3.2.3 Исходные вещества...........................................................................92

3.3 Материалы и методы.............................................................................93

3.3.1 Анализ жирнокислотного состава...................................................93

3.3.1.1 Получение метиловых эфиров жирных кислот....................93

3.3.1.2 Анализ метиловых эфиров жирных кислот..........................93

3.3.1.3 Обработка данных с помощью метода главных компонент ..........................................................................................................................94

3.3.2 Синтез амфифильных производных (3-циклодекстрина...............94

3.3.2.1 Получение свободных жирных кислот.................................94

3.3.2.2 Получение концентратов полиненасыщенных

жирных кислот.........................................................................95

3.3.2.3 Получение хлорангидридов насыщенных жирных кислот.96

3.3.2.4 Получение хлорангидридов ненасыщенных

жирных кислот.........................................................................96

3.3.2.5 Синтез ацил-Р-цикло декстринов на основе жирных кислот (миристиновая кислота), (способ без акцептора НС1)........97

3.3.2.6 Синтез ацил-(3-циклодекстринов на основе жирных кислот (миристиновая кислота), (способ с акцептором НС1)..........98

3.3.3 Определение эффективности включения ТПП в липосомы........98

3.3.4 Исследование структуры полученных соединений......................99

3.3.6 Получение наночастиц на основе амфифильных Р-циклодекстринов..........................................................................100

3.3.7 Подготовка образцов для сканирующей электронной микроскопии....................................................................................100

3.3.8 Получение твердых липидных наночастиц.................................100

ВЫВОДЫ........................................................................................................102

Список литературы........................................................................................103

Список сокращений

Р-ЦД - (3-циклодекстрин

АК - арахидоновая кислота

ГК - главные компоненты

ГОА - глубоководный обитаемый аппарат

ГП-Р-ЦД - гидроксипропил-(3-циклодекстрин

ГХ/МС - газовая хроматография/масс-спектрометрия

ДГК - докозагексаеновая кислота

ДМ-Р-ЦД - диметил- Р-циклодекстрин

ДМФА - диметилформамид

ДТТ - дзета-потенциал

ЖК - жирные кислоты

ЛС - лекарственная субстанция

МГК - метод главных компонент

МНЖК - мононенасыщенные ЖК

НЖК - насыщенные ЖК

ПАВ - поверхностно-активное вещество

ПНЖК - полиненасыщенные ЖК

ТЛН - твердые липидные наночастицы

ТПП - 4-тиоуреидоиминопиридиний перхлорат

ЭПК - эйкозапентаеновая кислота

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Ихтиофауна озера Байкал развивается с третичного периода, она уникальна и характеризуется большим видовым разнообразием и высокой степенью эндемизма (в Байкале насчитывается 33 вида эндемичных рыб [1].

Рогатковидные рыбы (подотряд СоНогЛег) - одна из наиболее интересных групп в ихтиофауне озера Байкал. Возникшая в результате «взрывообразной» эволюции, группа за относительно короткий промежуток времени освоила различные экологические ниши водоема. В ее составе присутствуют современные близкородственные виды, находящиеся на разных стадиях эволюционных преобразований, а также единицы более высокого таксономического ранга, каковыми являются семейства [2].

Оценку степени благополучия популяций можно проводить при помощи физиолого-биохимической индикации с использованием липидных показателей, в частности жирнокислотного состава; при этом важно знать, как меняется ЖК-состав в зависимости от вида, типа исследуемой ткани, условий обитания. Известно, что состав липидов тканей ряда эндемичных рыб оз. Байкал характеризуется высокими уровнями длинноцепных полиненасыщенных жирных кислот, что типично для морских видов [3]. Обнаружены высокие уровни п-3 ЖК в отдельных видах байкальских СоПо1с1е1 [4-8], но систематического исследования ЖК-состава рогатковидных рыб Байкала не проводилось.

С другой стороны, повышенное содержание ценных ПНЖК в голомянках Сотеркогт ¿уЪо^&Ы и Com.eph.orus Ьшса1ет18, обладающих большой биомассой в озере, делает их перспективным и возобновляемым природным источником этих компонентов, находящих широкое применение в фармацевтической и пищевой промышленности. Известно, что длинноцепные п-3 ПНЖК оказывают положительное воздействие на липидный профиль крови, оказывают противовоспалительное и иммуномодулирующие

воздействие. Использование природных п-3 ПНЖК при разработке систем целенаправленной доставки лекарственных субстанций (JIC) дает возможность дополнительного повышения их эффективности. Особенно актуальным является использование таких систем для доставки лекарственных субстанций, действие которых направлено против внутриклеточных микроорганизмов, например, возбудителя туберкулеза.

Таким образом, работа, направленная на исследование жирнокислотного состава рогатковидных рыб озера Байкал и разработку наноносителей противотуберкулезной J1C (4-тиоуреидоиминопиридиний перхлората (ТПП)) на основе природного возобновляемого сырья является актуальной.

Цель работы

Исследование жирнокислотных профилей байкальских рогатковидных рыб и разработка наноносителей противотуберкулезной JIC 4-тиоуреидоиминопиридиний перхлората на основе жирных кислот, полученных при переработке природного сырья.

Задачи

1. Изучить жирнокислотный состав рыб подотряда Cottoidei озера Байкал и установить влияющие на него факторы;

2. Получить наноносители лекарственных субстанций на основе жирных кислот природного происхождения Байкальского региона;

3. Синтезировать и исследовать амфифильные (3-циклодекстрины (р-ЦД), замещенные ацильными остатками ненасыщенных жирных кислот (в т.ч., полученных из концентрата ПНЖК из тканей Comephorus baicalensis, Comephorus dybowski);

4. Изучить размерные характеристики, степень загрузки полученных наноносителей.

Научная новизна

-Впервые проведено систематическое исследование жирнокислотного состава рыб подотряда Cottoidei озера Байкал. Обнаружена вариабельность

жирнокислотного состава в зависимости от вида, типа ткани, экологической характеристики;

- Получены твердые липидные наночастицы на основе концентрата ПНЖК жира голомянки;

- Синтезированы амфифильные (3-циклодекстрины на основе концентрата ПНЖК, выделенных из природного сырья;

- Обнаружена способность амфифильных (3-циклодекстринов, замещенных остатками ненасыщенных жирных кислот, к образованию наночастиц - носителей лекарственных субстанций.

Практическая значимость.

• Полученные данные о вариациях уровней жирных кислот в различных тканях эндемичных рыб озера Байкал в зависимости от различных факторов могут использоваться при мониторинге экологического состояния озера Байкал.

• Некоторые виды байкальских рогатковидных рыб могут быть использованы в качестве источника ценных эссенциальных жирных кислот для получения носителей ЛС на примере ТПП.

• Предложена схема получения наноносителей лекарственных субстанций из природного возобновляемого сырья, обладающих возможностями направленной доставки активных агентов в меньших терапевтических дозах (при снижении побочных воздействий).

• Наночастицы на основе |3-ЦД, содержащие ТПП, являются новой лекарственной формой этой субстанции, использование которой возможно при лечении туберкулеза.

Основные положения, выносимые на защиту

• Особенности жирнокислотных профилей байкальских рогатковидных рыб в зависимости от различных факторов;

• Свойства наноносителей ЛС на примере ТПП;

• Синтез и исследование амфифильных производных [3-циклодекстрина на основе ненасыщенных жирных кислот;

• Получение и исследование свойств наноносителей лекарственных средств.

Об актуальности работы свидетельствует поддержка данных исследований грантами:

• Программа Президиума РАН № 20 «Фундаментальные проблемы океанологии: физика, геология, биология, экология». Подпрограмма «Глубоководные исследования озера Байкал», проект № 9«Комплексные исследования зон активных разгрузок глубинных флюидов на озере Байкал с помощью автономных необитаемых аппаратов, обитаемых аппаратов «МИР», а также дистанционных пробоотборников» (2009-2011 гг.);

• РФФИ № 08-05-98029-р_сибирь_а «Формирование и трансформация липидов гидробионтов оз. Байкал в зависимости от эколого-биологических факторов» (2008-2010 гг.);

• Грант Роснауки 2006-РИ-19.0/001/3 83 «Исследование механизма формирования состава липидов эндемиков озера Байкал» (2006 г.).

• Международный совместный проект СО РАН и Монгольской академии наук «Получение новых липо- и наносомальных форм лекарственных средств с использованием природного сырья», 20112013 гг.;

• Международная экспедиция ««Миры» на Байкале» при поддержке Фонда содействия сохранению озера Байкал (2008-2010 гг.).

Апробация работы. Результаты диссертационного исследования докладывались на XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), X Международной конференции по химии и физикохимии олигомеров (Волгоград, 2009), Региональной молодежной научно-практической конференции с

международным участием «Экологобезопасные и ресурсосберегающие технологии и материалы» (Улан-Удэ, 2010), Международной научной конференции «Дельты Евразии: происхождение, эволюция, экология и хозяйственное освоение» (Улан-Удэ, 2010), I Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока» (Улан-Удэ, 2010), Всероссийской молодежной научно-практической конференции с международным участием «Экологобезопасные и ресурсосберегающие технологии и материалы» (Улан-Удэ, 2011).

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

С учетом изложенных во введении целей и задач настоящей работы, целесообразно посвятить литературный обзор исследованиям распределения жирных кислот в гидробионтах, в т. ч. исследованиям жирнокислотного состава рогатковидных рыб озера Байкал, а также использования ПНЖК для человека. Кроме того, рассмотрению преимуществ использования некоторых типов наноносителей лекарственных средств, которые могут быть получены с использованием природных жирных кислот: амфифильных |3-циклодекстринов и твердых липидных наноносителей.

1.1 Жирные кислоты гидробиоитов и их применение

Температура является одним из основных факторов, который в ходе длительной эволюции формировал синтез клетками насыщенных ЖК. На начальных ступенях эволюции, когда пойкилотермные организмы обитали в воде при сравнительно низких температурах мирового океана (особенно в северных широтах) для сохранения функционирования биологических мембран им было необходимо поддерживать высокую степень ненасыщенности. Чем ниже температура, при которой живут те или иные представители фауны, тем более ненасыщенными являются углеродные цепи их ЖК. В процессе эволюции организмы, обитающие при повышенных температурах (обитатели мелководья, сухопутные животные), стали синтезировать, этерифицировать в фосфолипиды и встраивать в мембрану более насыщенные ЖК. Однако функционально идеальной плазматической мембраной клеток остается все-таки мембрана, фосфолипиды которой содержат наиболее ненасыщенные эссенциальные ЖК, которые клетки обычно не могут синтезировать самостоятельно [9]. Поэтому ферментные системы существующих сегодня рыб, с одной стороны, должны поддерживать определенную степень насыщенности ЖК в соответствии с температурой ареала обитания, а с другой стороны, синтезировать (и получать с пищей) достаточное количество ненасыщенных ЖК для функционирования клеточных мембран.

Спектр жирных кислот в организмах разнообразен, в нем особое положение занимает пальмитиновая (16:0) кислота, являющаяся первичным продуктом, образующимся под действием синтетазы жирных кислот, и исходным материалом для биосинтеза других кислот группы - стеариновой, лауриновой, миристиновой и т.п. [10].

Жирнокислотный состав рыб. Во многих исследованиях отмечалось, что ЖК-состав общих липидов различается для пресноводных и морских рыб. Липиды пресноводных рыб содержат большие пропорции насыщенных кислот и С18 ПНЖК, но меньшие уровни С20 и С22 ненасыщенных кислот, чем липиды морских рыб [11, 12]. Р. Акман [12] детально обсуждал эти различия, указывая на то, что в рыбах северных широт содержатся высокие пропорции С18 ПНЖК и меньшие уровни С20 и С22 ЖК, что типично для пресноводных рыб. Другая особенность пресноводных рыб - существенно более низкие соотношения пЗ/пб ПНЖК в общих липидах пресноводных рыб по сравнению с морскими видами. Другие исследования также подтверждали эти базовые различия в ЖК составе пресноводных и морских рыб [13-16].

Длинноцепные полиненасыщенные жирные кислоты пЗ-группы (20:5пЗ, 22:6пЗ) главным образом связаны с морскими организмами [17-21] и обычно не являются важнейшими компонентами пресноводной флоры и фауны [22-31]. Исключения составляют данные, в которых содержания 20:5 и 22:6 ЖК в рыбах Великих Озер достигали 6-14% [12]. Содержание ПНЖК используется как главный критерий отличия «морских» и «пресноводных» липидов в течение многих лет [12, 17, 18].

Промежуточное положение между ними занимают анадромные рыбы. Их состав липидов часто имеет «морской» тип, когда рыбы находятся в море, и «пресноводный» тип - после миграции к пресноводному месту обитания [3238].

Липиды рыб обычно богаты ненасыщенными ЖК, в то время как продуктами ЖК-синтетазы являются насыщенные ЖК. Несмотря на то, что рыбы включают ненасыщенные ЖК из пищи напрямую в собственные липиды,

они также модифицируют пищевые и эндогенно модифицированные ЖК путем десатурации и элонгации. Основные пути этих процессов, происходящих в тканях пресноводных рыб, приведены на рис. 1. Так же, как и другие позвоночные рыбы не имеют А12- и А15-десатураз, необходимых для синтеза 18:2п6 и 18:ЗпЗ ЖК соответственно, поэтому должны получать эти ЖК или длинноцепные производные с пищей [3].

Некоторые авторы изучали зависимость липидного состава от условий окружающей среды, но этот вопрос не был однозначно решен. Р. Акман [12] полагал, что пресноводные организмы, такие как рыбы, не нуждаются в длинноцепных ПНЖК, в то время как Т. Фаркас и др. [39] указывал на различия в питании.

Сннтетаза ЖК

Пищя 18:2 (п-6)

Пиша 18:314-3)

Десятурвзя 140"' 16:0

- I I

18:0

66

45

Д4

14:1 16:1-»18:1-- 20:1 18:1--20:1-►22:1—-24:1 18:2-»20:2-

II! II

18:2-►го-'г--222 18:3-- 20:3-

I I I

20:3--22:3 20:4-

I

22:4

-22:2

■ 22:3

18:3-

18:4-

. 22:4--24:4

- 20:3

I

-20:4

I

20:5

-В- ¿¿.Ч

I I

-22:5

I

I

22:5

22:6

(п-5) (п-7) (п-9) (п-6) (п-3)

Рис. 1. Возможные пути десатурации и элонгации жирных кислот пресноводных рыб. Рассмотрены лишь те ЖК, которые включаются в липиды в количествах >0,5%. Вертикальные и горизонтальные стрелки демонстрируют шаги десатурации и элонгации, соответственно [3].

Многие исследователи указывали на различия морских и пресноводных условий обитания, к примеру, разную соленость водоемов. Липиды мембран клеток ответственны за ионную регуляцию: требования к их жирнокисл