Алкоксилипиды органического мира: химия и биология тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГб од

На правах рукописи

Дембицкий Валерий Михайлович

АЛКОКСИЛИПИДЫ ОРГАНИЧЕСКОГО МИРА: ХИМИЯ И БИОЛОГИЯ

(02.00.10 Биоорганичосхая химия, химия природных и физиологически активных веществ)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

МОСКВА -1996

Работа завершена в докторантуре кафедры Биотехнология, Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им. М.В.Ломоносова

Научный консультант: Член-корреспондент РАМН, профессор, доктор химических наук Виталий Иванович Швец

Официальные оппоненты:

Профессор, доктор химических наук *

Элл а В л адимиро внаДятловицка я

Профессор, доктор химических наук Галина Андреевна Серебренникова

Профессор, доктор химических наук С т а н и с л а в Г р и г о р ь е в и ч Б а т р а к о в

Ведущая организация: Научно-Производственный Центр Медицинской Биотехнологии Минздрава Российской Федерации

Защита состоится " декабря 1896 года в " /Ь " часов на заседании

диссертационного совета Д 063.41.01 в Московской Государственной Академии Тонкой Химической Технологии им. М.В.Ломоносова (117571, Москва проспект Вернадского 86).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Академии (119831, Москаа ул. М.Пирогреосая, д. 1).

•Л:

Автореферат разослан " '7 * ноября 1996 года

Ученый секретарь специализированного

совета, кандидат химических наук А- л А.И.Лютик

ЬЩай характеристика работы

Актуальность проблемы. Алкоксилипиды или простые эфиры глицерина (или других полиолов, например этиленгликопя или тетридов - полиолов содержащих четыре гидрокси-льныэ группы) известны в природе в виде двух типов простых эфиров: 1). алкиловые (1-0-елкил-5/7-глицериды). в которых гексадецильные, октадецильные и ф-Э-октадеценильные алифатические цепи соединены простой эфирной связью в положении -sn-1 глицерина; 2). алкен-1-илсвые (плазмалогены) (1-0-алкен-1'-ил-зл-глицериды) эЛиры глицерина с цис-конфигурацией двойной связи, в которых алифатические цепи также соединены простой эфирной связью в положении -sn-1 глицерина.

Область биоорганической химии и, химии природных веществ, которая занимается исследованием глицеролипидов с простой эфирной связью, в последние два десятилетия переживает значительный подъём. Если до 1980 г. в мире была опубликована только одна единственная монография, по химии и биологии алкоксилипидов: Ether Lipids: Chen: s'ry and Biology (Snyder, 1972), то в последующее десятилетие было опубликовано семь монографий: Ether Lipids: Biochemical and Biomedical Aspects (Mangold and Paltauf, 19S3); Platelet Activating Factor and Structurally Related Ether Lipids (Benveniste and Arnoux, 1983); PAF and Leukotriens (Braquet and Clostre, 1985); New Horizonts in Platelet Activating Factor Research (Window and Lee, 1987); Platelet Activating Factor and Related Lipid Mediators (Snyder, 1987); Biologically Active Ether Uplds (Braquet et a!., 1988); Platelet-Activating Factor and Structurally Alkyl Ether Uplds (Baumann et at., 1991). Новой группе растительных бетаиновых эфир-содержащих липидов было посвящено два недавно вышедших обзора: Betalne Uplds (Sato, 1992) и Betalne Ether-linked Glycerollpids: Chemistry and Biology (Dembiisky, 1996).

В отечественной научной литературе это направление освещалось недостаточно. В 1981 году была опубликована монография Липиды Клеточных Мембран (Крепе, 1981), в которой были рассмотрены адаптационные функции плазмалогенных и диацильных липидов. В 1983 году вышла в свет монография Химия Липидов (Евстигнеева и co&'jt, 1983), где синтезу

Сокращения: ФХ, фосфатидилхолин; ДПГС. диацилглицерилтриметилгомосерин; ДГТА, диацилглицерил-гидроксиметилтриметил-Р-аланин; ФЭ. фосфатидилэтаноламин; ОС, фосфатидилсерин; ФГ. фосфатидил-глицерин; ФЛ, фосфолипиды; TCX, тонко-слойная хроматография; ВЭЖХ, высоко-эффективная жидкостная хроматография; ГЖХ, газо-жидкосгная хроматография.

алоксилипидов посвящена одна из глав. Также были опубликованы несколько обзоров по химии и биологии, алкоксилилидо? (Василенко и Евстигнеева, 1984,1986; Гордеев и соавт., 1984; Дембицкий, 1985, 1989, 1991).

Начало работ по исследованию химии липидов с простой эфирной связью в СССР было положено профессором Н.А.Преображенским в 60-е годы и продолжено ? последующие годы учеными-липидрлогами: Л.ДБергельсоном, Р.П.Еестигнеевой, Г.А.Серебренниковой, В.И.Швецом, ЕН.Звонковой, И.В.Василенко, С.Г.Батраковым, В.В.Васьковскцм и др.

Чем вызван столь огромный интерес к алкоксилипидам? Прежде всего их большой терапевтической, активностью по отношению к различным видам раковых образований: они подавляют рост асцитных клеток Эрлиха, метастаз Льюира и многих других разновидностей злокачественных новообразований. Кроме того, алкокснрилиды. обладают значительными радиопротекторными свойствами, стимулируют нервно-мышечную активность, обладают, бактериостатическими свойствами, противогрибковым действием, стимулируют, образование красных кровяных телец, являются мощными стимуляторами гладкой мышцы.,желудочно-кишечного трарта, способствуют снижению холестерина в крови и печени.

Алкоксиглицерофосфатиды являются ключевыми медиаторами в процессе обмене арахидоновой кислоты - предшественниками простагландинов, тромбоксанов и лейкотрие-нов. ФАТ, фактор активации тромбоцитов (1-0-алкил-2-ацетил-фосфохолин), является в настоящее время наиболее мощным из известных тромбоцит-агрегирующих агентов, обладает сильным бронхо-расщиряющим действием, используется для профилактики астмы, проявляет антигиде[>тензивное действие. ФАТ инициирует хемокинезис и хемотаксис ней-трофилов и мняго^рцр 1}^|рцктрв. увеличивает сцепление нейтрофилов, вызывает их агрегацию и.детощщ^ секрецию. их лизосомных ферментов, продуцирование перо-ксид-анионози .р^щ^щ^т^огав другие регуляторные ф.удоуи»{,в о^внизм«! (Iztff^ii, end Shimizu, 1Э95), •

Хотя биосинтезу ад^скщщо^ п^еящн^ мн,о|;очиспенуые, o^af , до,

настоящего времени н$т единого ДНвЩ, Г^д^^ванный путь, в ^нце бО^х.-го^ов, бис*

синтеза апкоксилипидов Кеннеди, согАйбЙб 'tioVip'b1)^ ЧЩ&ёт 'кислота в дигидроксиацетон-фосфате замещается жирным спиртом'не'йШеп'Йбд^вёрЩёНия во многих работах Goldfine (1992). Kates (1993) недавно высказал мнение, '4% 'С простой эфирной связью, по

крайней мере у архебактерий, синтезируются в юпеУках, минуй путь Кеннеди, т.е. жирные и/или изопреноидные спирты присоединяются непйслредственно к дигидроксигцетонфос-фату или дигидроксиацетону, образуя тем самым алкоксилйпиды.

Какова же биологическая роль апкоксилипидов в мембранах живых организмов? Однозначного ответа на этот вопрос до настоящего времени нет. Однако, суммируя опубликованные данные можно констатировать, что структура эфйр-'бддё^жашйх липидов, в отличие от липидов со сложно-эфирной связью, наделяет MeM6£aViY ШШйЮой стабильностью в широких пределах рН (от 1 до 12); насыщенные алифатический '(ЙЙЙ ^ОЛреноидные) цепи спиртов наделены способностью противодействовать окислительным г)р6цессам и выдерживать значительное повышение температуры. Кроме того, ьфи^-СОд'ержаЩиэ .^ пиды препядтствуют действию липолитических ферментов, в частности, фосфолипаз.

Теоретическая и практическая значимость апкоксилипидов, обнаруженная мировой наукой в последние годы, поставила перед исследователями задачу их лолуйё'нйя в препаративных количествах как синтетическими методами, так и с привлечение^ ^¿¿'личного биологического материала. Сведения о количественном составе апкоксилипидов У различных представителей органического мира, к началу нашего исследования, были вегйМа ограничены и противоречивы. Практически отсутствовали методические приемы химического анализа этих соединений. По мера развития тонких химических и физических методов увеличивается объем сведений о распространении и детальном строении новых эфир-содержащих липидов у представителей различных групп и царств органического мира.

Подводя итог, можно заключить, что расширение наших знаний об алкоксилипидах, их химической структуре, свойствах имеет большой научный и практический смысл, а использование их в качестве химических маркеров позволит понять процессы химической и биологической эволюции, а также происхождение первичных мембрак и живых организмов.

Завершающий этап диссертации выполнялся по .теме НИР. кафедры, родные и синтетические амфйфильные вещества как инструмент моделирования мембранных биологических процессов".

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей рабо.ы было, используя современные аналитические физико-химические методы, а также оригинальные хроматрграфические методы провести широкий качественный и количественный анализ алкоксилипидов и их производных в основных таксономических группах живых организмах. Выяснить картин/ распределения эфир-содержащих липидов в органическом мире и их возможную функциональную и адаптивную природу.

Во время выполнения работы были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Усовершенствовать хроматографичвские методы качественного и количественного анализа алкил-ацильных, алкенил-ацильных и диацильных форм полярных липидов.

2. Выделить ряд полярных и ^ейтрал^ных лиридов из представителей царства бактерий и изучить их структуру.

3. Выделить и изучить липидный, согтав представителей свободно-живущих инфузорий. Определить количественное соотношение эфир-содержащих форм в основных классах полярных липидов.

4. Выделить и исследовать липидный состав.царства растений от морских, пресноводных и солоноватых водорослей до высших растений. Осуществить поиск растительных эфир-содержащих пипидов и изучить их структуру.

5. Изучить липидный состав представителей царству грибов. Выделить и охарактеризовать ряд нейтральных и полярных липидов,

6. Лровеси широко-масштабное исследование состава алкоксилипидов у представителей царства животных от примищнод морских и пресноводных губок до высших животных. Изучить, распределение, а^1^де|)жащих липидов в различных органах и

тканях. Выделить и исследовать структуру ряда неидеитифицированных р'.нее природных липидов.

7. Изучить состав липидных компонентов морских отложений и определить их структурное разнообразие и возможное биогеохимическое значение.

8. На базе полученных результатов предложить гипотетическую модель образования и биотрансформации алкоксилипидов органического мира. Предложить теоретическое обоснование, на основе общих химических принципов, образования алкоксилипидов и возможных путей их абиотического синтеза и биотрансформации в процессе химической и биологической эволюции.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Результаты работы формируют новое направление, в задачу которого входит широкомасштабное исследование распределения эфир-содержащих липидов, и их произЕ , чых в различных царствах органического мира и на основании полученных результатов • рс рми-ровать новое представление об влкоксилипидах, как химических Маркерах в биогеохимических процессах, происходивших в прошлом, и эволюции этих процессов в будущем.

Разработаны оригинальные микрометоды Хроматографичбсдаго анализа плазмалоген-ных и алкил-ацильных глицерофосфолипидов. Предложены Иовыа хроМаТографические системы для разделения продуктов мягкого кислотного и щелочного гидролиза алкоксилипидов.

Впервые исследован липидный состав термофильных бактерий, выделенных из термальных источников. Идентифицирован ряд дифитанильных алкоксилипидов из бактерий-гапофилов.

Впервые изучен ЛйПМДМыЙ состав представителей одноклеточных эукариотов - свободно-живущих инфузорий, в которых найдены фосфоновые аналоги эфир-содержащих липидов. Показано, что индивидуальные полярные липиды инфузорий содержат высокий процент алкилыных форм.

Впервые проведены широко-масштабиые исследования липидного состава пресноводных, солоноватых и морских водорослей и трав (исследовано, более 130; видов). Среди морских макрофитов уделено значительное внимание красным, бурым- и зеленым, водорослям. У представителей большинства зеленых водорослей,идентифицирован бетаиновый эфир-содержащий полярный липид, ДГТС (диацилглицерилтриметилгомосарин). Бурые водоросли напротив содержат изомер ДГТС, названный ДГТА- (диацилглицерилгидрокси-метиптриметил-р-аланин). Красные водоросли содержат, ч небольших количествах ДГТС, ДГТА, а также пока ещё не идентифицированный неомыляегиый .полярный липид.

Впервые исследован липидный состав бриофитов (более 50 видов), Идентифицирован у всех видов бетаиновый липид ДГТС. Среди высших-жирных кислот найдены новые ацетиленовые кислоты и их структура была установлена,

Впервые проведен количественный анализ: липидов у представителей, царства фибоа (более 60 видов). Все исследованные симбиотические фибы (лишайники) содержат ДГТС как один из основных липидных компонентов. Высшие грибы как и симбиотические содержат ДГТС. Найдено более 12 новых гидрокси-содержащих. кислот и их. структура была установлена.

Впервые изучено количественное распределение. 1-0-алкенип-2.ац|;и> и 1-0-алкил-2-ацил- глицерофосфолипидов в примитивныхмногркпеточных. животных. - пресноводных и морских губках. Выделены и установлена химическая структура более 22 новых изопре-ноидных кислот, Идентицирован ряд,ноеых. демоспонгиеаых-кислот; с числом углеродных атомов более 26.

Определена картина расяределенидапкоксилипидойболеечем в 250 видах морских, пресноводных и наземных беспозвоночных. Выявлены эволюционные закономерности в распределении плазмалогенов и глицериловых эфироа. Показано, что фосфатидилэтанол-амин, практически у всех иэученых видов, находится преимущественно в плазмалогенной форме, а фосфатидилхолин в алкил-ацильной форме-.

'■бйяелвнм Зб(циа закономерности распределения апкоксипипидов и их составных фрагментов: алкиловых эфйров, жирных альдегидов, жирных кислот, фосфо- и фосфонолипи-дов, ботаиновых липидОв в'.различных видах, классах, типах и царствах органического мира на примере более чем '500 видов живых организмов.

Исследован состав ПйпИдных и других компонентов морских отложений Большого Барьерного Рифа й сделанй предварительные выводы о процессах происходящих с 'биолипидами' и их возможную трансфомацию в 'геолипиды'.

На основе полученных экспериментальных результатов, предложена модель образования и биотрансформации алкоксилипидов в различных царствах органического мира. Экспери-: ментальные результаты, попученые при исследовании алкоксилипидов представителей различных царств органического мира, послужили основой для развития новых представлений о структурной динамике эфир-содержащих липидов и их важности для эволюционных процессов и медицинских исследований.

Несомненое практическое значение имеют методические разработки для копи ..т. венного и качественного анализа эфир-содержащих липидов в различных биологических объектах. Данные методы нашли широкое применение в биохимических лабораториях России, стран ближнего зарубежья, а также за рубежом; они представдяют большой практический интерес и для клинической биохимии, в частности, для тестирсвагМй уровня алкоксилипидов в различных злокачественных клетках при изучении динаййки роста неоплазм.

Полученные результаты имеют как фундаментальный так й прикладной аспекты. Предложенная концепция позволяет объяснить Такой феной'ен органического мира, как наличие алкоксилипидов в биомембрайах, ИХ появление и биотрансформацию в жйвых организмах в процессе эволюции. Проведенные исследования дают возможность целенаправлено использовать определенные организмы для изучения метаболизма и препаративного выделения биологически активных соединений для целей медико-биологической науки, клинической медицины, фармакологии и биотехнологии.

Личный вклад диссертанта включает: а), определение и постановку стратегической цели и тактический задач; б), проведение экспериментальных исследований; в).написание статей и обзоров; г), участив в конференциях; д). стажировки за рубежом.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Метод выделения и идентификации липидов включающий комплексный подход к оптимизации последовательности стадий: пробоподготовка, реакционная и распределительная хроматография; установление структуры новых классов липидов с использованием спектральных методов '3С, 1Н, 31Р-ЯМР, ИК-, масс и хромато-масс спектрометрии.

- Сравнительный анализ алкоксилипидов проведенный на основе комплексного метода. Установление закономерностей распределения алкоксилипидов в различных царствах органического мира: от бактерий до высших растений, грибов и животных.

- Модель образования и биотрансформации алкоксилипидов, основанная на полученных экспериментальных данных.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены и докладывались на: 2 Всесоюзном симпозиуме Структура, биосинтез и превращение липидов е организме животного и человека, Ленинград, 1075; на 1 Всесоюзном симпозиуме Липиды биологических мембран, Львов, 1978; на 5 Всесоюзной конференции Методы получения и анализа биохимических реактивов, Рига, 1087; на 3 Всесоюзном совещании по Лососевидным рыбам, Тольятти, 1988; на 18 конференции ФЕБО (18 FEBS Meeting), Любляна, Югославия, 1987; на 3 Всесоюзной конференции по морской биологии, Севастополь, 1988; на 2 и 3 Всесоюзных конференцг "х Современные проблемы эволюционной биохимии и происхождения жизни, Петрозаводск, 1984; Твпавч, 1988; на 2 Всесоюзной школе-семинаре Физико-химическая

биология и проблемы регуляции метаболизма, Тольятти, 1988; на 2 Международной конференции Жиры Будущего-2 (International Conference Fats for the Future-2), Окленд, Новая Зеландия, 1989; на 6 Международной конференции Союза по изучению происхождения жизни и на 9 Международной конференции по происхождению жизни (The Sixth International Society for the Study of the Origin of Life and The Ninth Conference on the Origine of Life), Прага, Чехословакия, 1989; на заседании Тольяттинского отделения Всесоюзного Биохимического Общества АН СССР, 1988,1989; в Институте Микробиологии Чехословацкой Академии Наук, Прага, 1989; на 3 Семинаре Структура и свойства модельных и биологических мембран, Дубна, 1989; на 5 Международной конференции ЮПАК по химии и биотехнологии биологически активных природных продуктов (5 International Conference on Chemistry and Biotechnology of Biologically Active Natural Products) Варна, Болгария, 1989; в Институте Органической Химии Болгарской Академии Наук, София, 1990; в Депар юнте Биохимии и Органической Химии Оклендского Университета (Department of Blochem and Organic Chemistry) Окленд, Новая Зеландия, 1990; в Департаменте Прикладной Химии Массейского Университета (Department of Applied Chemistry), Палмерстон Норт, Новая Зеландия, 1990; на 2 Всесоюзной конференции Экологические и социально-экономические проблемы региона Самарской Луки, Куйбышев, 1930; на Международном Симпозиуме Симуляция Систем в Биологии и Медицине (The International Symposium Simulation of Systems in Biology and Medicine), Прага, 1990; на Международной конференции Научное Компьютеризирование и Автоматизация (Scientific Computing and Alternation (Europe) Conference) Маастрихт, Голландия, 1990; на Международной конференции Экология и Химические полютанты Черного моря (The International Conference Ecology and Chemical Pollutions of the Black Sea), Варна, Болгария, VÖ91; в Департаменте Биохимии Брисбенского Университета (Department of Biochemistry), Брисбен, Австралия, 1991; в Департаменте Органической Химии Национального Университета Австралии (Department of Organic Chemistry) Канбера, Австралия, 1991; в Департаменте Органической Химии Мельбурнского Университета (Department of Organic Chemistry), Мельбурн, Австралия, 1991; на Между-

народной конференции Биотехнология природных продуктов Красного моря (The International Conference of Biotechnology of Natural Products of the Red Sea), Эйлат, 1993; на Международной конференции Экологические Проблоум Бассейнов крупных рок, Тольятти, 1993; на 9 Совещании по Растительным Липидам (9th Workshop on Plant Lipids), Карлсруе, Германия, 1993; на Международном Микробиологическом Конгрессе (The International Microbiological Congress) Прага, 1994; на 85 Юбилейной конференции Американского Химического Общества Жиров (85th American Oil Chemísts's Society Annual Meeting and Expo), Атланта, CUJA, 1994; на заседании отдела Биохимии Тель-Авивского Университета, Тель-Авив, 1994, 1995; на заседании отдела Биотехнологии, Института по Исследованию Пустынь, Беер-Шевского Университета, Сде Бокер, 1993, 1994; на Международной конференции по Морской Фармакологии (The International Conference on Marina Pharmacology), Эйлат, 1994; на заседании Департамента Фармакологии Еврейского Университета, Иерусалим, 1994, 1995; на заседании Департаментов Органической и Прикладной Химии Еврейского Университета, Иерусалим, 1S94, 1995, 199S.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 58 статей в отечественной и зарубежной печати, включая 9 обзоров.

Объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов исследования, обсуждения результатов, выводов и литературы. Работа изложена на 332 стр., содержит 57 рисунков и 121 таблицу.

Материалы и методы исследования

Биологический материал. Морские и пресноводные беспозвоночные, водоросли и травы были собраны в различных регионах мира: в Японском, Белом, Черном, Средиземном, Каспийском и Красном морях; в озере Байкал, озере Иссык-Куль, озерах Самарской и Ульяновской областей и в озерах Палестины. Бриофиты, лишайники, грибы и папоротники были собраны в Ленинградской, Иркутской, Самарской и Ульяновской областях. Архебактерии были выделены из Мёртвого моря и получены из Биогеохимического центра Еврейского Университета.

В работа использовались хроматографическив -стеклянные пластинки размером 6x6, 6x10, 10x10, 20x20см со слоем силикагеля КСК от 0.1 до 0.5мм и 10% гипса. Также использовались пластинки производства Эстония со слоем силиказоля, фирмы Mark с сили-кагелем G и Н, Хвмапол 5/40. Для колоночной хроматографии испольэооалм силикагели Хемапол L с величиной зёрен 40/100, 60/120 и 100/160 мкм, а также ДЭАЭ-целлюлозу. Для очистки липидов использовали сефадекс G-25. При выделении плазмалогенных липидов в качестве антиоксиданта использовали ионол (0.01-0.1%). Для разделения нейтральных, глико- и полярных липидов использовали катриджи SEP-PAK Cartrige (Waters, США).

Для разделения полярных липидов, еыделеных из тканей животных, использовали стандартные системы растворителей. Для разделения растительных липидов использовали хроматографическив системы Poih et al. (1970), и Eichenberger et al. (1994). Для разделения насыщенных и ненасыщенных аналогов жирных кислот, альдегидов или спиртов использовали импрегнированные пластинки с 5-10% азотнокислого серебра.

Для обнаружения различных липидов на микро-ТСХ использовали реагенты; 10% и теор серной кислоты в метаноле, иод и недеструктивный реагент на основе фуксина с добавкой борной кислоты; реактив для обнаружения фосфолипидов на основе молибдата натрия; реактив для обнаружения неорганического фосфора на основе малахитового зеленого (Vaskovsky et al. 1975); нингидриновый реагент для свободных аминогрупп (Kates, 1972); реактив Драгендорфа - на холиновые липиды; орциновый реагент Хонегера - на гликолипи-ды; реактив Шиффа - для плазмалогенных липидов; 2,4-динитрофенилгидразин для обнаружения жирных альдегидов и кетонов.

Количественное определение пяазмапогенных, алкил-ацильных и диацилькых аналогов фосфолипидов проводили реакционной микро-ТСХ Dembiisky (1988). Количественное определение растительных бетаиновых липидов проводили по методу Kabara & Chen (1976). Количественное опредление гликолипидов проводили бензидиновым методом (Bancher et al. 1964). Оптическую плотность различных растворов проводили с использованием спектрофотометров; Specol-11, Specol-211 и Specol-221.

Для ферментативной деструкции липидов использовали фосфолипазы А, С или Д, которые были получены из Sigma (США).

Для выделения и разделения индивидуальных липидов и жирных кислот использовали полупрепаративную градиентную ВЭЖХ на приборе Gradient-LC System G-1 (Shlmadzu, Япония) с двойной помпой LC-6A, контролером SCL-6A и ультрафиолетовым детектором SPD и инжектором впрыскивания SIL-1A, процессором C-R3A, аналитической колонкой 250 х 4 мм с носителем SGX-K.

ИК-спектры снимали в CCU на приборах: Specord-80M, Shimadzu-IR 435, (Япония), PerWn-Elmer модель 1310 (США) в области от 400 до 4000 см-1 .

Анализ метиловых эфиров жирных кислот, оксазалиновых или пинаколиновых производных, диметилацеталей, изопропилиденовых производных алкиловых эфиров или ТМС-производных проводили на хроматографах Chrom-5 (ЧССР), Руе-104 (Англия), Hewlett-Pacard-5890 (США) на набивные или капилярных колонках на полярных и неполярных носителях. Использовали пламенно-ионизационные детекторы.

Хромато-масс спектрометрию, проводили на приборе Finnlgan МАТ 1020В (США) на капилярной колонке Supelcowax-10 (60 м х 0.25 мм, 0.25 цм), газ-носитель - водород (гелий или азот). Все масс спектры сканировали в интервале m/z 70-750.

Спектроскопия ЯМР. Съемку спектров 13С-ЯМР (76 МГц) и 1Н-ЯМР (300 МГц) проводили на приборе Bruker AM 300 (Германия) в cdci3. Съемку спектров 31р-ЯМР (36 МГц) проводили, на приборе Bruker HFX-5 (90 МГц), в качестве стандарта использовали 85% ортофосфорную кислоту.

РЕЗУЛЬТАТЫ И..Р6С»К§рНИН

1. Методы ащдадаалркс^лиомдо^, 1.1. Микро-тонкослойная хроматография, алкоксилиридов. Несмотря, на большие успехи в

разработке методов количественного изучения алкоксилипидов,. едавд?- последних представляет довольно трудоёмкий процесс. Существующ^^^вщ^н^^^^снованы, как пра-

вило, на химической или ферментативной деструкции отдельных фрагметов фосфо-, глико-, и других сложных липидов и анализе последних. До начала наших исследований не было приемлемого метода одновременного определения всех трех форм сложных липидов без предварительного их выделения. Изучив все возможные варианты разделения алкоксили-пидов, мы пришли к выводу, что необходима комбинация методов для успешного их разделения. Наиболее простой и перспективной техникой количественного определения различных форм елкоксилипидов (алкил-ацильной, алкенил-ацильной и диацильной), найденых в царстве животных является реакционная микро-ТСХ в сочетании с другими видами хроматографии и/или физико-химическими методами. Принцип её заключается в разделении смеси липидов в тонком слое силикагеля в системе растворителей в первом направлении; избирательном гидролизе связей виниловых эфиров и отделении лизо-фосфатидов, образовавшихся из альдегидогенных полярных липидов от апкил-ацильных и диацильных форм тех же липидов хроматографией во втором направлении. Хромато-граммы микро-ТСХ представлены на Рис. 1. Новый класс растительных бетаиновых эфир-содержащих гпи. аро-липидов был открыт более 20 лет назад, и только недавно их список пополнился ещё двумя. Разделение и идентификация бетаиновых липидов описана нами недавно (ОотЬИэку, 1996). На Рис. 2 показано распределение бетаиновых и других полярных липидов в морских зеленых водорослях.

Разделение алкил-ацильных, алкенил-ацильных и диацильных липидов проводили с использованием высоко-эффективной жидкостной хроматографией в виде бензоидных производных дирадилглицериновых фрагментов, полученных из ФЭ (Рис. 3). После разделения сложных липидных смесей и выделения индивидуальных липидов с использованием колоночной хроматографии, препаративной ТСХ и/или ВЭЖХ, идентификация липидов проводилась с использованием физических методов, такими как ПК-, ЯМР и масс спектрометрия.

1.2. ИК-спектроттрия. ИК-слектрометрия, которая широко применялась при изучении

ФЗ

/Vh ф*

CM

Рис. 1. Хроматограмма общего пипидного экстракта сердечной, мышцы быка (А). Гидролиз виниловых эфиров проводили 2 N соляной кислотой на хроматофафической пластинке. Идентификация фосфоли-пидов проводилась с использованием специфических реагентов и стандатных ФЛ, а также с помощью физико-химических методов. (Б) Хроматограмма общего липидного экстракта сердца Быка после омыления сложно-эфирных связей и гидролиза виниловых эфиров в пробирке.

ш ■

НА

ГАГ

Аггс

. фг «^Э

Рис. 2. Хроматограмма распределения бетаиновых и полярных липидоа морской зеленой водоросли Ша $р. на пластинке с силикагелем КСК. Сокращения: ДГТС; МГДГ, моногалакто-зил диацилглицерин; ДГДГ, дигалакто-зилдиацилглицерин.

too'

^Jj

LAvjuX

Рис. 3. Хроматограмма HPLC разделения различных форм «Невыделенного из морской звезды Chriaster granulosus. Колонка Supelcosil LC-Si (Sigma). Растворитель 0.35% изопропанол в гексане.

алкоксилмпид'ов, ."д^ёт Чувственную информацию о наличии или отсутствии простой (С-О-С), вийМЬйЙой' (С-0-СН=СН-К) и/или сложно-эфирной связи (С-ОСО-Я). Для алкил-содержащих липидов полоса поглощения простой эфирной связи в алкоксилипидах находится в пределах от 1140 до'1060 см-1 . Плазмалогенные (1-0-алкен-1-ил) липиды, содержащие цис-двойную сйязь:в (х,р-положении к кислороду в -элИ положении глицерина, характеризуются одиночной полосой поглощения при '1667 см-1 и отсутствием поглощения при:930 см*1 (трэн'с-двойная связь). С)1сЯйно-эфирная связь в диацильных липи-дах характеризуется поглощением в облает^ НУйЬ-^ТЗО см-1 (карбонильная группа). На

Рие. 4. ИК-спектры алкокеилипидов и диацильных липидов. (А) Октадецил'овый спирт, выделенный из Paramecium caudatum, (Б) 1,2-диэцил-глицерин, выделеный из яичного ФХ, (В) 2,3-дифитанилглицерин.

1.3. ЯМР-спекгпроскопия алкоксипипидоз. ЯМР спектрометрия широко применялась при изучении природных липидоа. На Рис. 5 показаны ПМР-спектры алкил-глицерина -И диацильных липидов. Для алкил-глицерина сигнал протона СН-О-С наблюдался при S 3;8-3.3 м.д. (т). Для плазмалогенов в ПМР-спеетрах сигнал протона при циг-двойной связй наблюдался при 5 5.9 м.д. (д). Для диацильных липидов сигнал протона при сложно-эфирной группе (-СН2-СОО-) наблюдался При 5 2.2 м.д.

1.4. КомбинированаЯ 'РКХ-Масс-слектрйМетрия. Хромато-масс сЙШрбметрия апкок-силипидов и их фрагметов, получаемых посла мягкого щелочного йШ'Шйлйтного'гидролиза дает существенную информацию при исследовании химической йфуктуры липидов. Приведём, для "Примера, использование этого метода при идентификации алкил- и алкенил- содержащих липидов и их фрагментов: жирных альдегидоб (Рйс.''В-$).

16

А

-с-«

Я

.. а

Б

Ü J-

С CH^CNj-C-O*

-c-fc-c-» ей

J

Рис. 5. ПМР-спеетры 1-О-г^садецилоеого спирта, «ыделеного из ФЭ (А), и диацил-глицерима, аыделеного из ФГ (Б) морской губки Graella cyalhophora.

я»

г"

ГгИ

си^сн^Шса»,

I

ни

ü-r-

Рис. 6. Хромато-маг.с спектрометрия диметилащталей жирных альдегидов, выделенных из ФЭ морской заезды Choriaster grsnulosus (показан масс-спеетр основного жирного альдегида С1в;0 - MB « 28i).

2. F определение алкоксилипидов в природе 2.1. Ал коксилипиды прокариотов

В настоящее время царство прокариотов делят на два подцарства - эубактерий и архебактерий (Kandier, 1993; Margulis, 1996), которые существенно различаются по организации мембран и липидному составу. Наиболее существенное место в липидах эубактерий занимают фосфолипиды, содержащие в положениях sn-1 и sn-2 глицерина жирные кислоты, присоединённые сложно-эфирными связями. Алкоксилипиды эубактерий представлены плазмалогенными и алкил-содержащИми липидами.

Для эубактерий алкоксилипиды найдены только у анаэробов, для других представителей этого подцарства: аэробов, факультативных анаэробов, микроаэрофипов, основны-

16

JOS НС-О-ГП* JOS 105

LQ3

lt\ tL,i

mln tj 5 ¿0 »л КО "О зов «pu ;оа

Рис. 7. Хромато-масс сгеироввгрия стандартного 1-0-гексадецил-ТМС производив* <А) il ЙШювЫХ эфиров глицерина а виде ТМС-лроизгодных <В): Масс-спектр 2,3-ТМС-1-0-элкил-глице'рйдоё (Й), бьй'еШ-ных из морской губки Grayella cyathophora. (А) - Стандарт; (В) Пики компонентов на хр'оматвгр ». M соответствуют: 1-14:0; 2 -14:1; S - 15:0; 6 - изо-16:0; 7- антеизо-16:0; 8 -16:0 (основной гексадецил >эь й спирт); 9-16:1; 10-изо-17:0; 11 -антеизо-17:0; 15-18:0. 15и 17-18:1-позиционны®изомеры, 18-20:0. А - стандарт 2,3-ТМС-1-0ч етеэдецилчлицерида. В - масс спектр алкмпоаы* эфиров глицерина.

ia-T-m

"Я

ЛЯ

Ml K-ff-lî*

1«

I

< , I

19 гз I, I »1 II, 1

с U 1

X» il »я Л1 1 i 1 . 1

Рис. 8. Хромато-масс спектрометр«* '(-<5-ап>«ж-'1Чт-2,Э-ТМС глицеридов^ыдел.нных из ОЭ сердечной мышцы быка (А), из морской звезды 'Chdrtaster granulosus (В) и из моллюска Nucutoma tenuis (С). Даны масс-спектры основного компонента 1-0-гексадвц«И'чиу-глицерирд (Пик 8, МВ»458).

ми являются диаципьные глицеролипиды (Goldfine, 1980). Липидный состав мембран про-кариотических клеток может значительно изменяться в зависимости от рН среды, температуры, содержания фосфора или магния или обоих этих компонентов на стадии роста культур (Khuller and Goldfine, 1974). Липиды Methylococcus thermofllus, относящийся к обли-гатным метанотрофным эубактериям, были изучены. M.thermofilus культивировался'при температурах 45 и 5S С. Четыре ФЛ были найдены: ФЭ, ФГ. ДФГ, и ФХ. Главными ФЛ были ФЭ и ДФГ (более 80%). / лкоксилипиды были найдены и их содержание увеличивалось с возрастанием температуры культивирования более чем на 30%. Хромато-масс спектральный анализ показал, что содержание изо- и антеизо- жирных кислот возрасло на 22%.

Архобактерии отличаются от эубактерий и всех эукариотических клеток тем, что их мембраны содержат уникальные алкоксипипиды, свойственные только этим организмам. Архе-бактериальные липиды представляют собой глицеролипиды с простой эфирной связью, у которых в положениях -sn-2 и sn-З глицерина вместо радикалов жирного альдегида, жирной кислоты или жирного спирта находятся изопреноидные, гидроизолреноидные или иэолра-нильныэ спирты. В силу особенностей оптической активности, характерной для среднего (второго) атома углерода глицерина, соединения этого класса представляют собой зеркальные изомеры обычных фосфолипидов.

Липиды десяти видов экстремальных галофильных архебактерий, выделенных из Мертвого моря, были изучены, В природе эти архебактерии растут при рН=6.0-6.3 и концентрации солой от 230 до 280 г/л. Липиды были разделены на фракции. Среди полярных лилидов было найдено три ФЛ и два гликолипида их структура была подтверждена ИК-, ЯМР спектроскопией. Количественное распределение ФЛ показано в Таблице 1.

Структура ФГ, найденного во всех изученных видах была установлена. ИК-спектр неомы-ляемого лигчда имел сильную полосу поглощения в области (см-1): 1110-1115 (С-О-С), полосу изопропила (дуплет) 1365-1385, 2920, 2850 и 1460 (жирные цепи), 3300 (ОН),

Таблица 1. Количественное распределение дифитанильных аналогов фосфолипидов в галофильных архебактериях Мертвого моря.

Штаммы бактерий ФГ ФГФ ФГС

Hataamila martsmortuf (ATCC 43049) 21.0 63.0 11.0

Haloarcula vallismortls (ATCC 29715) 17.0 71.5 11.5

Halobacterium halokium (R1) 28.6 65.2 8.2

Halobacierium salinarium (Str.5) 10.3 84.2 5.5

Hatobacfarium sacchamvorum (3tr13) 12.1 77.4 10.5

Halobacierium scdomense (ATCC 33755) 14.0 80.3 5.7

Halobactarium gomorrensa (DSM 9227) 10.9 70.1 19.0

Haloferax volcanil (ATCC 29605) . 30.2 89.8 -

Haloferax mediterrane! (ATCC 35300) 33.3 60.7 -

Haloferax denrtrfflcans (ATCC 31016) 36.1 63.9

Сокращения: ФГ, фосфатидилглицерин; ФГФ, фосфатидйлглицерофосфат; ФГС, фосфатидилглицеросульфят.

фосфатная группа (Р=0, 1260-Ш0), 1060-1090 (Р-О-С). Отсутствовала полоса поглощения характерная для карбонильной группы (С=0,1720-1730).

Таким образом, согласно нашим данным (Дембицкмй, 1939; Dambitsky, 1S89), а так«э данным других авторов (Kates, 1978, 1992, 1993), галофильныэ грхзбаетерии содержат исключительно диалкильные фосфо- и гликолипиды.

2.2. Алиоксилипиды простейшие Простейшие, а настоящее время, все больше привлекают внимаю?» исследователей как модельные объекты при изучении метаболизма и функции гяетм-садгржгщик липи-доз. Кроме тсго, важным аспектом является выявление филогенетических взаимосвязей, используя в качестве химических маркёров - апкохсктпиды.

Информация об алкоксилипидах простейших весьма ограничена, пожалуй, только у двух родов липиды изучены достаточно Полно, это представители Teirshysnens i-

Paramecium (Kaneshiro, 1987; Smith, 1993). Для изучения, как правило, использовали лабораторные виды. Нами были выделены из природных водоемов свободно-живущие ининфуэории: Paramecium aurella, Paramecium caudatum и Colpoda ер.. В Таблице 2 приведен состав полярных лилидов трех видов простейших. Эфир-содержащие и фос-фоновые аналоги были найдены и у других представителей простейших, относящихся к различным родам Paramecium, Tetrahymena, Lelahmcnla, Trypanosoma, Acanthamoeba (Kaneda et a/., 1988). ГЖХ анализ ТМС-производных ажсиловых эфирое общих липидных экстрактов Paramecium aurella и P.caudatum показал^ что они содержат два основных спирта: гексадециловый (16:0) - 72.3% и 57.9%, и перамециловый (18:1(п-9)) - 25.7% и 41.3%, соответственно. Основной жирный кислотой- у изученых видов была арахидоновая кислота, её содержание варьировало от 23.3%. у- P.caudatum, 28% у Р.аигеЧа до 76% у Colpoda sp. При детальном анализе, ФЯ состава инфузории Colpoda sp. с использованием химических методов деструкции» модификацией метода Pugh et al. (1977), нами был выделен неомыляемый фосфор содержащий липид по хроматографическому поведению близкий к ФЭ, но идущий выше. Этот липид был выделен с помощью колоночной и препаративной хроматографии. ИК-спекгр этого- лмлида показал отсутствие полос поглощения в области 1720-1740 см-1 (область потащен, .я сложной-эфирной группы); также отсутствовали полосы поглощения в области 3100-3300 см-1 , характерные для гидроксильной группы. Наиболее сильным был пик в области 1115 см-1, соответствующий простой эфирной связи (С-О-С). Дополнительный анализ показал, что этот липид был 1,2-ди-алкил-глицеро-ФЭ. Недавно Adosraku et al. (1996) нашли аналогичный липид в Tetrahymena thermophlla, который составлял 29.6% от суммы фосфолипидов.

Согласно полученым результатам и литературным данным можно сделать вывод, что все изученные простейшие, относящиеся к типу СШорЬога содержат в высоких концентрациях алкил-содержащие фосфолилиды.

Таблице 2. фосфолипидный состав инфузорий (процент от суммы фосфолипидов).

Классы фосфолипидов P.aunlia' P.caudalum' Colpoda sp.

1-0-Алкил-2-ацил-глицерофосфоэтаноламин 4.5 8.7 40.1* 42.1"

1,2-Диацил-глицерофосфоэтаноламин 18.9 17.9 8.4 5.1

1 -0-Алкенил-2-ацил-глицерофосфоатаноламин - - 2.3 1.5

1-0-Алкил-2-ацил-глицеро-3-(2-аминоэтил)фосфонат 23.2 19.8 8.1 9.8

1,2-Дияцил-глицеро-3-{2-амино»тил)фосфонат) 3.7 2.2 1.4 1.4

Церамид-(2-аминоэтил)фосфонат 5.4 8.2 4.9 5.1

1-0-Алкил-2-ецил-глицерофосфосерик 1.1 2.5 4.9 4.5

1,2-Дивцил-глицерофосфосернк 3.8 3.1 1.2 1.2

1 -0-Алкил-2-ацил-глицерофоефоино»ит 3.8 1.6 О.в 0.7

1,2-Диацил-глицерофосфоиноэит S.1 З.Э 1.0 1.1

1-0-АлаШ'2-ацилчлицерофосф>холин З.в 3.6 7.0 7.5

1,2-Диацил-«1мцерофосфохояш 13.8 14.4 4-1 3.3

Другие липиды 7.2 11.1 18.0 18.7

•Активно-живущие клетки. **Цисты.

2.3. Алкоксмлилиды Царства Растений Поиски алкоксипипидоа а растениях были предприняты ещё № 40-х годах корифеями липидной химии: Feulgen R., Kauftnann Н.Р. и Mangold H.tC. Мм удало®» иайти плазма-логены в следовых количествах в некоторых видая высших растений. Однако, последующие интенсивные поиски ке увенчались успехом. Недавно проведенные Исследования в лаборатории проф. Spiteller G. (1994) показали, что высшие растения не синтезируют 1-0-апкил- и/или 1-0-алхэнил- глмцеролипиды, однако, они содержат необходимый набор ферментов, способных превращать экзогенные алкилглуцериды в алкоксилйпиды (Mangold et al. 1988). В этой связи, интерес представляет изучение лмпидоз морских и пресноводных водорослей и траз, некоторые из которых содержат бетаиноЕые липиды.

2.3.1. Липиды зеленых водорослей и vpss Одним из главных полярных лмпидоа морских зеленых водорослей является ДГТС.

21

Впервые он был выделен из микроводоросли-Ochromonas danlca (Brown & Elovson, 1974), более 20 лет назад. ДГТС характеризуется тем,. что в положении -sn-З глицерина содержит прос тую эфирную связь (С-О-С), При.исследовании одноклеточной микроводоросли Nephro-chloris sa//na :(отдел„>^1)я9р^у}а) ,, выделеншжиз бентоса Японского моря, нами был выделен лдаидХ, по хроматографическому положению близкий к ДГТС. Его структура была установлена с использованием физико-химических методов (Рис. 9). ДГТС был выделен в достаточных количествах и в дальнейшей работе использовался, как стандартный бетаиновый липид. Чтобы иметь достаточно полное представление о распределении ДГТС и других полярных липидов, включая фосфолипиды, мы провели исследование липидного состава около 100 видов морских, пресноводных и солоноватоводных водорослей и трав.

Как показали исследования, зеленые макрофиты можно разделить на шесть групп по содержанию ДГТС (Таблица 3). Группы 1-3 являются морскими видами. Первую группу составляют виды относящиеся к классу Slphonophyceae, указаные виды содержат ДГТС (его содержание варьиру&т от вида к виду от 5 до 40%) и.ФХ (от 2 др,,30$>&)ВО вторую группу вошли виды,.которые содержат.И «а содержат.ФХ (t/foöieftep/iyceae). Группа 3 включает,мс^да^др^ы^Гру^п^ оддодо. представителей солоноватоводных водорослей. Пресуоводныееиды-.объединеныв 5 и 6 группы. В пятой группе - пресноводные водоросли, а в шестой г пресноводные травы, не содержащие ДГТС. Используя полярные липиды, как химические, маркёры при.хемотаксономических построениях, можно получить объективную картину, эволюционных -взаимосвязей представителей любых групп организмов, в частности, зеленых макрофртаеи*

Состав жирных кислот зеленых макрофитоа также представляет большой-интерес. Отличительной особенностью морсхих водорослей является присутствие высоких концентраций полиненасыщенных кислот, таких как 16:4(п-3) и18:4(п-3), содержание кото«-рых, у нак торых видов, может превышать 50% от суммы жирных кислот. Для морских и пресноводных трав состав жирных кислот очень похож: основными жирными кислотами 1

Рис. 9.1(3),2-Див1^ЛГпицеро-3(^1?^'-(ННЛ''(РИмвт^)гом01:еРин был выделен из морской микроводераслиKtfptúacUlórfc salina. Поизан спектр ПМР ДГТС.

Таблица 3. Распределение ДГТС и"фв^фолипидов в 70 видах зеленых макрофитов

Виды макрофитов ДГТС ФХ <6Г ФЭ ©С ФИ ДФГ '

Морские виды

Водоросли

Группа 1

5|рИопорЬусеае 18 19 35 11 7 8 4

Группа 2

ШоМсЬорЬусеае 47 0 26 12 7 7 i

Морские травы

Группа 3 0 43 16 24 3 12 г

Солоноватые виды

Водоросли

Группа 4 8 40 10 14 7 12 i

Пресноводные виды

Водоросли

Группа 5 11 16 35 19 12 7 ё

Пресноводные травы

Группа 6 0 44 16 21 6 9 i

являю+СЙ 18:3(л-3), 18:2(п-6) и 18:1.

Как показал опыт работы с липидами бактерий, алкоксилипиды ассоциируются с поли-иэопреноидами. В царстве растений полипренолы найдены в различных тканях, и длина цепей изолренолов, как правило, варьирует от Сзо до Ceo (Lindgren, 1965). Анализ нейтральных липидов зеленых водорослей, бриофитов и лишайников показал, что практически все изученью виды содержат изопренолы. Впервые нами были выделены изопрено-лы с длиной цепи от Сго до Сие (Рис.10).

Рис. 10. Структура полииэолраноидных спирте«, аыдаленых и> авламых водорослей, бриофитов и лишайников. (Х«7, У»1 для бетулапрвнолоа С60; Х=8, для финал реполов СТО).

Проведенные исследования показали, что характерной особенностью зеленых морских, солоноватое одных и пресноводных водорослей является наличие одного из основ* ных полярных липидов - бетаинового зфир-содержащего лилида - ДГТС. Морские и пресноводные травы, относящиеся к высшим растениям, этот липид не содержат.

2.3.2. Липиды красных водорослей

Липиды красных водорослей представляют большой практический интерес, т.к. большинство видов содержат высокие концентрации арахидоноаой и зйкозапентаеновой кислот. Как показали многочисленные исследования, содержание этих кислот в сумме может достигать более 75%. Проведеный нами анализ жирных кислот показал, что содержание арахидоновый кислоты изменялось от 2 до 33%, а зйкозапентаеновой кислоты - от 5 до 57%, у изученых видов.

Полярные липиды красных водорослей изучены сравнительно мало. Проведенный нами анализ полярных липидов 15, видов показал, что основным ФЛ является ФХ, уровень которого вменяется от вида, к виду (60-80% от суммы полярных липидов). Вторым иг главных липидов, является ФГ (10-29%). Практически у всех видов был найден неидюь

тифицированный Х-липид, содержание которого варьировало от.З до 10%. Тест на присутствие бетаиновых липидов ДГТС и/или ДГТА похазал, что большинство видов их не содержит, хотя были обнаружены виды, содержащие бетаиновые липиды ДПТС и ДГТА в следовых количествах.

2.3.3. Липиды бурых водорослей Бурые водоросли, по количеству неизвестных полярных липидов, заметно отличаются от зеленых и красных. Впервые, в бурой водоросла ОВорЬиз /авс/о 1а (Ат)со е! а1. 1977) был выделен 1 -0-герани л-зп-глицерид с изопреноидной цепью, а из шест видов бурых водорослей, относящихся к роду вагдазит, был выделен диглицерид, у которого в первом положении глицерина находится остаток метакриловой кислоты, соединенный с глицерином простой эфирной связью (С-О-С) (Хизит) е1 а|. 1981). Полярные липиды 30 видов бурых водорослей, относящихся к основным отделам были исследованы. Все бурые водоросли делятся на два основых класса: Е<Яосагра1ев и Риса1ев. Причем, двенадцать отделов входят в ключевой класс Ейосафа1ев. Проведенные предварительные иссявдования показали, что изученыв виды содержат как минимум, два неизвестных раме полярных липида, причем один из них является основным полярным липидом (ОвтЬЛзку е* а1., 1990), например, у водоросли 0/с<уо(а й/сЛоК>та (указанный липид составлял 99.8% от суммы полярных липидов, Рис. 11)

Я-1-0-СН»

'н 4.12 4.2 5.19 1! 3.« 343 333 19 14 4.1 Г.Я

"с т.» т. 93 62.50 70.11 69.00 «100 173.10 «9.90 53.69

Рис. 11. Структура и дайны* ЯМР-спмгросхопми афир-седаржащаго бвтаимоаого липида, 1(3),2-

дищ;илглицаро-3(1)-0-У-(гидро|а11ШтигИ^Ч^трмц«г>и1)^алаиииа (ДГТА), тдаламоге и» бурой аодо-росли 0*ос(уо<а сйс/ю(ота( поюиана.

Количественный анализ ДПТА и фосфолипидов бурых водорослей показал, что виды относящиеся к отделам Dlctyotales и Rúcales не содержат ФХ, а содержат в качестве основного полярного липида ДГТА. Согласно полученным данным все исследованные бурые водоросли условно можно разделить на три группы: к первой группе относятся те отделы водорослей, в которых обнаружен только ФХ, Lamlnariales, Dictyosiphonales, и Некоторые другие. Это указывает на то, что виды водорослей входящих в эту группу не содержат механизма биосинтеза ДГТА, или же указаний механизм существует, 'но ш 'работает в зависимости от температуры воды иливегетативногопариода; >ко;второй группе относятся отделы, в которых найден только ДГТА, но .не .найден'ФХ, iCDictyotalos, ¡Bucales. У этих видов водорослей механизм биосинтеза $ПГ.А .ярко .выражен; ьи третья '.(рулпа объединяет отделы, в которых найдены как ФХ 'Так и ДПГА, «го щреище «всего -отдел Ectocarpus и ещё два отдела.

Как указывалось выше род Ectocarpus содержал ещё один полярный фосфор-содер-жаший липид XI. Его содержание в изученых видах варьировало от 1.3% у Ectocarpus' arblcus до 6.1% у Ectocarpus sp. (Dembitsky et al. 1990). Этот липид был выделен из бурой водоросли Ectocarpus slüculosus и его структура была установлена (Schmld 1994).

Жирные кислоты бурых водорослей имеют высокое содержание полиненасыщенных кислот таких как: 18:4(п-3) и 20:5(п-3). Максимальное содержание кислоты 18:4(п-3) найдено в водоросле Scytoslphon fomentaría - 29.6%, а максимальное значение эйкозапентаеновой кислоты - 32.6% в водоросле Ectocarpus arablcus'.

Таким образом, отличительной особенностью бурых водорослей является высокое содержание эфир-содержащего липида ДГТА, и для рода Ectocarpus необычного фос-фолипида N-{1 -карбокси-3-аминр-лропип-3)-ФЗ.

2.S.4. Липиды бриофитов Бриофиты или мохообразные - представляют собой довольно крупный отдел растительного царства; интересны прежде всего тем, что подавляющее число .видов содержат как

бетаиновые липиды, так и ацетиленовые и полиненасыщенные жирные кислоты. Отличаясь рядом особенностей от низших растений, бриофиты стоят особняком среди высших растений « эволюционном тупиковом ответвлении. Проведеный нами анализ бетаиновых и ФЛ, более чем в 40 видах бриофйтов-(ВетЫ18ку, 1993), показал, что ДГТС является основным липидным'компонеитомч(Тйб}тоца 4). Согласно данным, получеиых нами, а также рядом других -авторов^аЬ;' 19'92);> бриофиты ближе к водорослям, чем к высшим растениям. Обсцие-липиды бриофито'вхмдержат; как правило, от 1 до 10% ацетиленовых

Таблица 4. Количественное распреяепенив'ДПТЙ; оеиьеивй'фвсф&лилидоа (процент от суммы полярных липидов) и ацетиленовых кислот (свдержаня«'« ев4<и* липидных экстрактах) ■ основных футах Бриофитов (ОешЬКвку,1993ГО«пЬ«в1^»яЛШпй1**,»1Й^.'

Группы Бриофитоя . ДГТС ФЭ-> А^вТижМо&ьКг Кислоты ОЛ" ТАГ

Нппмны» виды-

МХи (МввеЦ'ч

АтЫув»е9)аеввв1*' 23-28 ' 20-25 12-18 13-17 2-7

Аи1а№тШае*ае-о 11-15 " 35-43 16-17 14-18 0-2

Вй ЬвпЫМе* 20^25 в-1в 22-28 18-22 0-3

Вгуаемвк 20-30 8-22 21-28 14-18 0-3

СВтасястгав" 10-15 41-59 8-14 8-12 0-2

НеЮ^всвав/' И-16' 22-28 15-20 20-28 4-9

ММаеме«' 13-18 11-31 12-20 22-31 0-3

19-29 18-35 10-15 12-18 0-4

ЭрНвэпесевв" ПМмутммииЁМ ЗЗОв" 7-12 15-22 20-25 2-в

(Н*|эайеае>"' 15^2"? 171ИГ(! 10118" 9-17 8-22

ВддкнтеидЫ

20-26 2£ЙГ» 16120'' 24-28 2-14 7-83

Печеночники 35-40 18-21 в-11 13-18 8-20 50-80

ОЛ, общие липиды-, ТАГ, триглицериды. Первая цифр* означает минимальное содерлеЛиёГ*-вторая цифра - максимальное содержание.

кислот. Наибольшие концентрации ацетиленовых кислот найдены в триацилглицеридах (до 80%). Среди моноеновых кислот найдены: 6а-18:1, 9а-18:1 и 12а-18:1. Диеновые кислоты представлены тремя изомерами: 6а,9-18:2, 9,12а-18:2 и 9а,12-18:2. Только четыре ацетиленовые кислоты были найдены среди лолиеновых кислот: 6а,9,12-18:3, 8а,11,14-20:3, 6а,9,12,15-18:4 и 5а,8,11,14-20:4. Распределение ацетиленовых кислот " среди бриофитоа имеет хемотаксономическое значение.

Бриофиты характеризуются наличием одного из главных эфир-содержащих липидов ДГГС, ФХ и ацетиленовых жирных кислот.

2.3.5. Липиды сосудистых растений. Согласно многочисленным исследованиям, проведенным в последние 20 лет, можно констатировать, что бетаиновые липиды весьма широко распространены у низших растений. Эти данные обобщены нами недавно (Dembitsky, 1996). Поиски бетаиновых липидов у сосудистых растений начались в начале 80-х годов (Sato, 1983). ДГТС обнаружен ¡¡ различных видов папоротниковых (Pteridophytes). Мы исследовали шесть видов папоротников, относящихся к отделу Filicales. Все изученные виды содержали ДГТС (от 6 до 11%) и ФХ (от 40 до 55%). Анализ липидов цветковых растений показал, что эти растения не содержат ботаиновых липидов.

Исследование сосудистых растений показало, что все изученые виды не содержат растительных эфир-содержащих липидов, исключение составляют только папоротниковые.

3. Алкоксилипиды Царства грибов Липиды грибов привлекают внимание исследователей большим разнообразием. Wood (1980) обобщил результаты работ по изучению липидов и других метаболитов, проведенных до 1980 года. Первые упоминания о присутствии апкоксилипидов в грибах относятся к 70-м годам. Так, в Physarvm polycephalum были найдены плазмалогенные (до 24%) и алкил-ацильные (до 12%) ФЛ (Puolos el al., 1971). Наибольшее содержание алкоксили-пидоа найдено в патогенном грибке Lagenidium giganteum, относящегося к Oomycetes, до

80% в ФХ, и до 79% в фосфоинозите (Kerwin et al. 1994). Мы провел» анагчла полярных пипидов более чем в 50 видах высших грибов (Dembitsky et al. 1'993)v относящихся к классам: Базидиальные (Basidiomycetes) и сумчатые (Ascomycetes). Мы ые нашли классических форм алкоксилипидов у высших грибов, однако был обнаружен ДЛС (от 2 до 10%). Согласно данным Васьковского и сотр. (1990), и нашим (Dembitsky, ÍS9&X ДГТС в больших количествах найден только в Болетовых (Boletaceae) фибах (более 20%),

Чрезвычайно интересным оказался состав жирных кислот высших грибоа. Более 30 гидроксикислот были идентифицированы, некоторые из которых найдены впервые в природе. Ниже представлены наиболее редко встречающиеся гидроксикислоты как в Аскоми-цетах, так и в Базидиомицетах: шо-12:0-ОН, внтвизо-13'.О-ОН, иэо-14:0-0н, ентвизо-15:Q-OH, антешо-17:0-ОН, ан/пеизо-19'.О-ОН, из0-2О:О-ОН, изо-22:0-(ЭН, изо-16:1(п-9)-ОН, амтеизо-17:1(п-8)-ОН, антеизо-21:1 (п-12)-ОН, изо-22:1(п-13)-ОН, изо-24:1(п-15)-ОН, 25:1(п-16)-ОН, изо-26:1(п-17)-ОН w кислота 28И-ОН.

" Содержание гидроксикислот, в различных видах, варьировало от 3 до 15%. При анализе индивидуальных жирных кислот, посяе препаративного выделения ВЭЖХ, газовой хроматографии, ЯМР, ИК и масс. была, идентифицирована новая кислота, и в® структура была определена, как;. ц(/с-7чУ1дрокси-8,14-диметил-гвксадецен-9-овая (Рис. 12), а также три гомолога: цыс-7-гидрокси-8,16-диметил-октадецен-9-овая кислота; цис-7-гидрохси-8,18-диметил-эйкозен-9-овая кислота и цие-7-гидроксй-8,20-диметил-докоэен-9-овая.

Рис. 12. Жирная кислота была выделена из лилндоа высших грибоа и ей структура установлена юис цис-7-одрохсЫМ^ДИмвти1н«1<садвцв»-9-овая «жлота.

3.1. Симбиотичвские грибы. Лишайники представляют особую фуппу симбионтов, где основными компонентами выступают фибы (Асхомицеты), а второстепенными - микроводоросли. Жизненые циклы фико- и микобионтов взаимосвязаны, а существование, отдель-

но обоих симбионтов практически невозможно. Поэтому изучение пипидов представлялось весьма интересным и необходимым, чтобы выяснить какой-же вклад в липидный состав вносят каждый из симбионтов, так как известно, что микроводоросли и грибы содержат бетаиновый липид ДГТС.

К началу наших исследований, липиды лишайников практически не были изучены, за исключением каротеноидов. Ничего не было известно и о полярных пипидах этой группы лихенизированных грибов. Анализ полярных липидов более чем 60 видов пишайников ' проведёных нами показал, что наряду с классическими ФЛ, характерными для грибов и растений, был обнаружен один из главных полярных липидов ДГТС РегпЬ^ку, 1992). Содержание бетаинового пипида ДГТС и ФЛ в различных группах лишайников существенно варьирует. Например, эпифитные лишайники относящиеся к роду С1ас1оп1а, содержат сравнительное низкое количество ДГТС (от 2 до 10%) и высокое ФХ (от 30 до 70%), напротив эпифитные лишайники содержат более высокий процент ДГТС (от 15 до 25%) и сподоватепьно низкий процент ФХ (от 20 до 40%) (ОетЬКвку е( а1. 1994).

Характерной особенностью липидов высших и симбиотических грибов является содержание бетаинового липида ДГТС и большая гамма гидроксикислот.

4. Алкоксилипиды Царства животных

Начало исследований плазмапогенов беспозвоночных относится к первой половине 60-х годов. Отсутствие методических разработок для количественного определения плазмало-генов не позволяло провести их количественный анализ. Поэтому, методики рассмотренные выше, были разработаны нами и успешно использованы для проведения количественного определения плазмалогенных и алкил-ацильных глицеролипидов. Нами были проведены наибопее широко-масштабные исследования среди морских, пресноводных И солоноватых беспозвоночных. В общей сложности бып изучен состав пипидов более чем 250 видов беспозвоночных.

4.1. Липиды морских беспозвоночных. Впервые количественное определение плазмапогенов в основных липидных классах морских беспозвоночных, ,-шопьзуя усовер-

30

шенствованый нами метод определения ллазмалогенов, было проведено нами около 20 лет назад. Последующие работы в этой области, проведеные нами и другими авторами, принципиально подтвердили наши данные, и в последующем только детализировали по отдельным группам беспозвоночных. В Таблице 5 приведено сравнительное распределение ллазмалогенов в основных липидных классах морских беспозвоночных.

Полученные результаты привлекают внимание к морским беспозвоночным как к потенциальным моделям для изучения обмена ллазмалогенов и алкилглицеридоз. В качестве конкретных объектов можно взять, в первую очередь, губок, моллюсков и морских звезд.

Основываясь на результатах, полученых нами по исследованию ллазмалогенов в беспозвоночных (Таблица 5), а также литературных данных, можно заключить, что одной и» важнейших функций ллазмалогенгов является адаптационная. Так, низкая температура обитания ведет к повышению относительного содержания диацильной формы и снижению плазМалогенной, при повышении температуры отмечен обратный процесс. Кроме того, нами обнаружена определенная зависимость состава алкоксилилидов от эволюционного развития организмов. Чем ниже по уровню развития находится организм, тем выше содержание алкил-ацильных форм.

4.1.1. Липиды губок. В настоящее время, сложилось определенное мнение в отношении уникальности губок. Они являются самыми примитивными многоклеточными животными. Губок можно считать живыми ископаемыми современного живс ного мира, т.к. они практически не претерпели никакого эволюционного прогресса, т.е. их современные виды, вероятно, остались на уровне развития далеких предков.

Наиболее детально нами был исследован липидный состав губок, собранных в различных регионах мира (Таблица в). Таким образом, из Таблицы 6 можно сделать следующие выводы, что губки содержат высокий уровень алкильиых форм в ФЭ и ФХ, сравнимый со свободно-живущими инфузориями.

В настоящее время выделено большое число соединений, которые обладают противораковыми свойствами, причем основой этих соединений, в большинстве своем, являются

Таблица 5. Количественное распределение плазиалогенов а фосфолипидах морских беспозвоночных (Дембицкий и Васькоасмй, 1976; Дембицхий, 1979).

Тип, Класс Ф->таноламин Ф-холин Ф-серин

Porifara (Spongia)

Demospongiae 0.5-55.4 0.0-7.9 0.0-4.0

Coelenterata

Anthozoa 73.0-84.9 0.0-14.5

Scyphozoa 76.8-87.9 6.8-7.6

Annelida

Polychaeta 47.0-75.0 2.3-23.0

Arthropoda

Crustacea 29.0-68.4 0.0-12.3

Motluaca

loricata «9.0-77.4 3.0-8.2 39.0-45.3

Gastropoda 52.3-77.0 0.0-20.9 20.0-75.8

Bivalvie 19.4-86.7 0.0-13.5 20.0-77.2

Cephalopoda 6.5-32.1 0.6-2.0 0.0-0.5

Echlnodrarmata

Holothuraidea «9.7-78.8 5.4-10.7

Echinoidea »3.3-80.2 0.0-10.4

Asteroidaa «3.3-94.» 4.4-20.5

Ophiuroldea B2.3-99.5 9.9-23.9

Chordata

Aacidiacea 65.3-74.8 4.5-81.1

эфир-содержащие липиды. Нами впервые было проведено количественное определение трех основных форм в основных классах фосфолипидов: ФЭ, ФХ и ФС. Из морской губки Ес(уос1огух коуёшсигп был выделен и охарактеризован 1,2-ди-О-алкил-ФЭ (3.2%), а также его фосфоновый аналог 1,2-ди-0-алкил-глицеро-3-(2-аминозтил)-фосфонат (Рис. 13). ИК-спеюр фосфонового аналога показал наличие связи Р-С (680 см-1). Кроме того, связь Р-С была подтверждена 31Р-ЯМР спектроскопией. Гидролиз фосфонового аналога

Таблица 6. Количественное распределение алкенильных, алкип-ацильных и диацильных форм в основных классах фосфолипидов морских и пресноводных губок.

Виды Ф-зтамоламин Ф-холин Феерии

ПФ АФ До ПФ АФ ДФ ПФ АФ Дф

Морские виды

Oscars IIa

bbularla 31 46 23 14 18 68 2 8 90

Subtrüti sp. 34 66 - 18 18 88 - 11 89

Polymastla ap. 41 59 • 19 52 29 - 24 76

Hymadtsmla sp. 13 87 - 11 43 48 • 37 63

МухШаг р. 10 57 33 4 49 47 3 19 79

StphonochaUna

siphonalta 5 93 2 13 78 11 5 58 39

Graylla

cyathophora - 100 • '2 81 17 - 69 31

Пресноводные виды

EphydaUa syrlaea 1S 58 28 10 48 42 10 38 52

NudoapongiUa ep. 21 49 30 12 51 37 7 42 51

Cortlspongilla

ЬитоШ 19 53 28 14 57 29 12 46 42

ПФ, плазмалогенная форма (1-0-ялх-1'-енил-2-ацил-); АФ, алкил-ацильная форма (1-0-алкил-2-ацил-); ДФ. диацильмая форма (1,2-диацил-) соответствующего лигмда.

ФЭ 6N HCl приводит к высвобождению 2-аминоэтилфосфоновой кислоты. Связь Р-С имёла два сигнала +16.7 (1) и +18.1 (2) (ррт). Сигналы (3) соответствует мвтилендифос-фоновой кислоте (+16.1 ррт) и (4) ортофосфорной кислоте (+2).

i

H2C-0-CH2-R О

I HCl II

НС-О-СНг-R -> HO-P-CH2-CH2-NH2

I I

H2C-O-P-CH2-CH2-NH2 он

о'о ~г

ж

н, (»•)

Рис. 13. Структура фосфонового аналога фосфатидилэтаноламина выделеного из морской губки Ectyodoryx kovdabum и спектр 31Р-ЯМР 2-амино»тилфосфоновой кислоты.

Необычайно большой интерес проявляется к жирным кислотам губок. Более 100 новых жирных кислот было идентифицировано из губок. Согласно литературным и нашим собственным данным как морские, так и пресноводные виды содержат 'демоспонгиевые' кислоты (отСгз до Сза): гексакозатриеновая (цис-5, цис-9дас-19-26:3), гексакозадиеновая (цис-5,цис-9-26:2) и октакозатриеновая (цис-5,цис-9,цис-21-28:3). Их содержание в общих липидных экстрактах варьирует от 10 до 70%. Пресноводные губки из озера Байкал и озер Палестины содержат как основную жирную кислоту - цис-5,цйс-9,цис-17-26:3. В пресноводных губках озера Байкал Lubomirskia baicalensis, Baikalospongia bacilífera и B.lntermedia (семейство Lubomirskiidae, класс Demospongiae) было найдено более 160 жирных кислот, причем впервые были найдены циклопропановые (с-19-26:0), разветвленные - Ьг7-12-17:1. Ьгд-6-17:1, Ьг22-5,9-29:2. и редко встречающиеся кислоты: 15,18,21,24-30:4 и 15,18,21,24,27-30:5. Кроме указаных кислот было идентифицировано четырнадцать новых изопреноидных жирных кислот из байкальских губок 9,13,17-триметил-октадецен-5-овая, 11,15,19-триметип-эйкозен-5-овая, 11,15,19-триметил-эйкоза-5,9-диеновая, 11,15,19-триметил-эйкоза-5,9,17-триеновая, 9,13.17,21-тетраметил-докозен-5-овая, 13,17,21-триметил-докозен-5-овая, 13,17,21 -триметил-докоза-5,9-диеновая, 13,17,21-триметил-докоза-5,9,19-триеновая, 11,15, 19,23-тетраметил-тетракозен-5-овая, 11,15,19,23-тетраметил-тетракоза-5,9-диеновая, 11,15,19,'23-тетраметил-тетракоза-5,9,17-триеновая, 15,19,23-триметил-тетракоза-5,9,17-триеновая, 13,15,21,25-тетраметил-гексакозен-5-овая и 13,17,21,25-тетраметил-гексакоза-5,9-диеновая.

4.2. Липиды Кишечнополостных. Высокий уровень плазмалогенов был найден у этого типа беспозвоночных. Содержание их достигало 80-90% в ФЭ. Алкиловые эфиры в больших количествах были обнаружены в ФХ у сцифодных медуз Aurelia aurita и Cassiopea andromeda (Красное море), их количество варьировало от 60 до 72%. Сходные данные по количественному распредепению плазмалогенов и алкипоеых эфиров было получено и для семейства Gorgonians. Было изучеио четыре вида: Subergjrgia hicksoni, Aqabaria splendens, Aqabaria sp. и Jucella juncea. Необычным оказался состав жирных кислот. Были найдены

высокие концентрации попиненасыщэнных кислот: 24:5(л-6) и 24:6(п-3), которые являются характерной особенностью Gorgonians.

4.3. Липиды членистоногих. Более 24 видов морских и пресноводных видов членистоногих было проанализировано. Основные классы - ФЭ и ФХ содержали алкип-ацильные и плазмалогенные формы. Из всех исследованных видоа наибольший интерес представляют два вида, на которых мы остановимся более подробно.

Brandtia (Spinacanthus) parasitica является типичным представителем членистоногих ведущий паразитический образ жизни. Место его обитания является Байхальская пресноводная губка Lubomirskla balcalensis. Питается этот паразит только тканью этой губки. Анализ липидного состава этого паразита показал, что ФХ и ФЭ содержат алкоксилипиды сравнимые с таковыми в самой губке. Жирн'-числотный состав паразита практически не отличается от состава жирных кислот тканей губки. Так в паразите были найдены насыщенные жирные кислоты с длиной цепи С26-С32, и ряд новых кислот: 17,20-26:2, 19,22-26:2, 15,10,21,24-30:4 и 15,18,21,24,27-30:5.

Acanthogammaivs (Brachyuropus) grewlngkii - глубоководный членистоногий был пойман в озере Байкал на глубино 350-400 м. Используя ЯМР, ИК, масс, полупрепаративную ВЭЖХ и хромато-масс спектрометрию были идентифицированы восемь новых мононенасыщенных циклопропановых кислот: цис,цис-11,12-14,15-бис-метилен-эйкозен-5-овая, цис,цис-13,14-16,17-бис-метилен-докозен-5ч>вая, цис,цис-15,16-18,1 Э-бис-метилен-тетракоз., ч-5-овая, цис-11,12-метилен-эйкоэен-5-овая, цос-13,14-метилен-докозен-5-овая, цис-16,17-метилен-доко-зен-5-овая, цис-15,16-метилен-тетракоэен-5-овая и цис-18,19-метилен-тетракозен-5-овая. Жирные кислоты содержащнаболее чем одно цихлопропановов кольцо, чрезвычайно редки а природе, за. исключение»!микобактерий (Qureshi at el., 1960). ЕГ>настоящее время, считается (Christi6fi41S8?li.; что циклопропановые жирные кислоты у анаэробных-микроорга-низмов-выполнякятррль^ необычной двойной связи, которая препядтствует окислительным процессам и подергивает необходимую жидкостность мембраны.

Фракция нейтральных липидов Acanthogommarus grewlngkll содержала длинно-цепочечные метал-кетоны. Положение двойных связей было определено после их расщепления перманганат-периодатным методом. Моно- и дикарбоксильные кислоты анализировали хромато-масо-слектрометрией. Найдено 25 кетонов, причем 22 были впервые в природе. Шесть кетонов были основные: 6,10,28-37:3 (16.55%), 6,28-37:2 (19.05%), 28-37:1 (10.42%), ' 37:0 (5.46%), 6,10.14,30-39:4 (6.91%), 6,10,14,28-37:4 (7.02%). Во всех найденных кетонах кето-группа находится в положении 2. Длинно-цепочечные ненасыщенные метил- и этил' кетоны являются чрезвычайно редкими и найдены только в морских осадках различного возраста (Conte et at., 1992). Volkman (1980) высказал предположение, что каноны мо(ут образовываться из углеводородов и/или же трансформацией жирных кислот в кетоны.

Исследуя липидный состав членистоногих Каспийского моря были найдены ряд кислот : входящих в состав алкоксилипидов. Детальный анализ липидов краба Rhthropanopous hanisil и рака Astacus leptodatylus elchwaldl показал, что их липиды сожержат ряд фурановых кислот. Найдено 11 фурановых кислот, две из которых являлись ранее неизвестными. Основной жирной кислотой у всех изученных беспозвоночных была кислота F6, её содержание варьировало от 40 до 68% от суммы фурановых кислот. Новые фурановые кислоты F10 и F11 были найдены только у двустворчатого моллюска Mytilaster llneatus.

4.3. Липиды Моллюсков. Тип моллюски включает в себя четыре основных класса: Loricate, Gastropoda, BivsMa и Cephalopoda, которые значительно отличаются как по морфологии, так и по липидному составу. Распределение плазмалогенов в основных ФЛ в различных классах моллюсков приведен в Таблице 5. Алкил-содержащие липиды в ФХ варьируют от 10 до 50%, в ФЭ - от 7 до 15%. Наибольшее содержание этих липидов было найдено в классе Cephalopoda, в ФЭ - до 40%, в ФХ - до 65%.

В основном исследования проводились на целых организмах. Интересно Было выяснить распределение плазмалогенных форм в различных органах и тканях. Для этих целей нами был выбран головоногий моллюск Octopus sp. Показано, что основным альдегидо-

генным классом был ФЭ. Ппазмалогенный ФС был найден только а сердце и жабрах. Известно, что морские моллюски, в частности, двустворчатые и брюхоногие содержат высокие концентрации неметиленразделённых жирных кислот, таких как 5,11-20:2; 5,1320:2; 7,13-22:2 и 7,15-22:2, уровень которых может достигать 20% и более. Данных о присутствии этих кислот в пресноводных видах не было. Анализ жирных кислот десяти видов • брюхоногих и восьми видов двустворчатых пресноводных моллюсков показал, что уровень этих кислот варьирует от 0.5 до 3.5%. Анализ морских видов, собранных в Красном и Средиземном морях показал, что морские виды также содержат не высокие концентрации этих кислот.

4.5. Липиды иглокожих. Тип иглокожих включает в себя четыре основных класса, которые были изучены: класс НоЫЬигойеа (голотурии4 класс Ав1его1<1еа (морские звезды), класс ЕсЫпоИеа (морские ежы) и класс ОрЫигоИеа (офиуры). Как уже отмечалось ранее (см. Таблицу 5) все иглокожие содержат высокие концентрации плазмапогенов в ФЭ. Наши данные, полученные почти 20 лет назад, были недавно полностью подтверждены работами ЭидЫга е! а>. (1992). Анализ алкил-ацильных форм в ФЭ и ФХ показал, что эти формы варьируют в ФЭ от 6 до 29%, а в ФХ от 19 до 30%. Анализ жирных кислот в индивидуальных классах липидов показал, что как ФЭ, так и ФХ содержат высокий уровень арахидоновой (до 42% и эйкозапентаеновой (до 49%) кислот. При анализе алкиловых эфиров морских звезд, было найдено четыре основых спирта: 16:0 (27-40%), 18:0 (18-42%), 18:1 (12-28%) и 20:1 (2-10%). Анализ жирных альдегидов, выделенных из плазмалогенного ФЭ показал, что главным был найден гексадециловый альдегид.

При анализе жирнокислотного состава морской звезды Нщпг1с1в бц. Выло установлено, что ей липиды содержат высокий уровень демослонгиевых кисооТг характерны)« для морских губок. Морская звезда Непг1с1а ер. питается исключительно, тканям* морски* губок, была выбрана для детального анализа. Для изучения были, взяты пищеварительные органы, гонады и общий липидный экстракт. Был проведен! анализ жирных кислот, алкиловых эфиров и жирных альдегидов в ФЭ и ФХ.

Полученые результаты демонстрируют, что пищеварительные органы содержат демос-понгиевые кислоты в основном в ФЭ (42%), в меньшей степени в ФХ (6%). Гонады содержат эти кислоты в 4-6 раз меньше.

Липидный состав шести видов офиур был изучен, представители этого класса содержали самый высокий процент алкенильных форм в ФЭ (от 82 до 99.5%) и практически не содержали диацильных форм. Уровень плазмалогенов в ФХ был значительно ниже и не превышал 23%. Апкиловые эфиры варьировали в этом лилидном классе от 2 до 14%. Анализ жирных кислот, жирных альдегидов и алкиловых эфиров глицерина не отличался значительно от состава'этих компонентов в морских звёздах.

4.6. Алкоксилипиды позвоночных. Нами было изучено количественное распределение алкоксилипидов в различных органах и тканей тринадцати видов млекопитающих. Наиболее интересные данные получены при изучении сердечной мышцы и мозга животных. Показано, что плазмапогены в ФЭ сердечной мышцы составляют до 50%; ФХ содержал эквивалентные количества плазмалогенов. Это самое высокое содержание плазмалогенов в ФХ най-деное среди всех изученых органов. При детальном изучении лилидов мозга семи видов животных среди гликолипидов были найдены эфир-содаржащие 'липиды, такие как 1-0-алкил-2-ацил-3-0-р-0-галактозил-глицерид и 1 -0-алкил-2-ацил-3-0-р-0-(3'-сульфо-(галакто-зил)-глицерид. Их количество варьировало у разных видов от 0.63 до 3.39 мг/г общих липи-дов. Физиологическая роль этих липидов до настоящего времени не ясна. Хотя есть предположения, что эти липиды выполняют защитную функцию от действия фосфолипазы А1 и участвуют в процессе миелинизации (81от!апу е1 е1., 1987),

5. Анализ лнпидных компонентов отложений Большого Барьерного Рифа

Исследование органических компонентов седиментов Большого Барьерного Рифа было начато в середина 60-х годов в Мельбурнском Университете. Были найдены угле-

водороды, стерины, жирные кислоты и спирты и некоторые другие органические соединения (Currie & Johns, 1989). В начале 90-х годов нами было проведено изучоние липидных компонентов поверхностных осадков из проб взятых в 14 точках на траверзе бухта Calms и Arlington Reef. Содержание общих липидов варьировало от 220 до 2210 цг/г сухого веса. Среди жирных кислот были найдены преимущественно насыщенные (С12-С20), изо-, антеизо- (С15-С18) и моноеновые (С12-С20) (Johns et al., 1994). Среди других липидов были идентифицированы дифитанильные алкоксилипиды, насыщенные и изсипреноидные апканы, бразистеролы и диностеролы и пентациклические тритерпеноидные спирты. Среди полярных липидов были найдены четыре липида, которые имели положительную реакцию на фосфор. Найдены нейтральные эфир-содержащие липиды, которые, по-видимому, имеют ерхебактериапьное происхождение.

Изучение липидных и других органических компонентов морских отложений, также как нефти и осадочных пород, дает чрезвычайно интересную и полезную информацию о происходящих биогеохимических процессах. В настоящее время найдено большое разнообразие основных классов изопентеноидов в отложениях и множество из них как полагают (Brassell, 1994), были синтезированы живыми организмами, однако найден ряд органических соединений, получивших название 'геолипиды', которые вероятно, являются продуктами происходящих геохимических процессов (Brasseil et al., 1983).

Основываясь на этих предположениях, а также значительном экспериментальном геохимическом материале (Schopf, 1983) нами предложена модель образования и трансформации алкоксилипидов (Dembltsky, 1989).

6. Образование и трансформация алкоксилипидов Сравнительный анализ палеотемператур земной поверхности (Мухин, 1978) показал, что температура изменялась от 400 до 287.8 К (настоящее время). При большой вулканической активности и отсутствии свободного кислорода возникли простые органически© соединения такие как: аминокислоты, углеводы, углеводороды. Сравнивая химическую стабильность в ряду: углеводы -> аминокислоты -> каротеноиды -> углеводороды, она

39 '

увеличивается слева на право. Так, при химическом анализе нефти и осадочных пород было определено, что самые устойчивые химические соединения - это углеводороды и их производные и, в частности, изопреноидные алканы (пристан и фитан). Такая химическая стабильность углеводородов обеспечивается высокой энергией разрыва связи С-С (ДН=66.5 ккал). По данным Кальвина (1969), время жизни углеводородов при 300 град К составляет 102' лет, а при 400 = 10"-5.Согласно этим данным, углеводороды являются единственной группой химических соединений, сохранившихся в течение 2.5-3.8 млрд лет.

Основываясь на данных, полученных в ходе нашей работы, а также на данных литературы, мы предложили новую концепцию образования и трансформации эфир-содер-жащих липидов в процессе эволюции (Рис. 14). На Рис. 15 приведено эволюционное древо распределения алкоксилипидов в различных царствах органического мира. Предложенная концепция позволяет понять и объяснить появление алкоксилипидов и их эволюцию, использование данных о составе полярных эфир-содержащих липидов различных царств позволяет предположить, что изменение фосфолипидного состава в процессе эволюции у живых организмов вызвано, прежде всего, необходимостью смены температуры фазовых переходов (Тф) ФЛ и других полярных эфир-содержащих липидов в биомембранах и создания устойчивой структуры последних. Дополнительным фактором, по-видимому, является дифференцирование тканей, которое предполагает унификацию и специализацию состава полярных липидов соответствующих биомембран. Для фотосинтезирующих организмов решающим явилось окисление алкоксилипидов эндогенным кислородом. Основными внешний факторами, вызывающими изменение в составе полярных алкоксилипидов, явились температура, (концентрация кислорода и рН морской воды; все эти факторы изменялись на Земле на ЩзйИйЖёНйй всего времени эволюции. Изменение температуры вызывало замену изопреноидных цепей липидов на алифатические радикалы; изменение концентрации кислорода в морской воде способствовало изменению типов химических связей: простая эфирная связь (С-О-С) была заменена на

(К>| (И)

Н1С-С11-СИ-СИ-СН1 I»

нон

' <т о н<

о НО

\ (—П (III 1 ОН он

У-11,0

гO'vwvv^л К)—X —У п«

1—I от он он он ■

\-1Н,0 гО

о^Г^Г

|-Н,0

1 (И) он он .он он

\-!Н,0

Ьо-н

10-н • (»1

0-х-У 0«

(«я II

ии+ио

*°1 *

Сч\лллл/л х 0 01)

01

Л-? « п,

ГО^ДЛАЛАА^ Ь1

> т?

'«> * и .......

IV.

ой

у-т-сн,-ен1-нн, -сн,-сн,-мисн, -сн1-сн,-н(сп)), 14» »-'И-ое"|е|нише11|0-* -сн.-сн^сн,),

0

1

ОСМ,-С11(0И1СП,-0-1 - о

о

Рис. 14. Гипотетическая схема образования алкоксилипидов и их биотрансформвция i процессе эволюции.

РАСТЕНИЯ

ГРИБЫ

ЖИВОТНЫЕ

г.-

\\ л\

©

ЛчЬирспоорЬт (31) \ МгюрЬгедЛя» 01)

/ \ \ ■/ " « СгоЛорЬ/и 01) у \ Виакивдгеои 01)

— СпешрЬуи 00 СошГвюрЬуа (31)

5рЬепорЬуи О»

\ ✓ ОишЫа

' 1

АКотусои:

оиад

АЯШроЯш у

солдат/ *ппаиза 1/ ^гИл«"«™»'

т \ ч

\ -СлкЗага,

«■тойуаОО Зрог.(!.Оии0^7Л5)1

ПюпорЬуи 01) \ Оошусои (30 / { \ '

\ /

СЫогорЬуи (31)

<зо\- \Ч

I Мухотгсои

рыгерьуш^ \ пио,н) I ЛОнуюрЬги 01)

ЯЬойорЬгч 00 \

ЭУБЛКТЕРИИ \ /

ПюрЬога (32Л30)

Р' ^ ч - Аэроои 01)

•г;—Мюшроыи оиио) — = / ь-

£—СпМшрогШ оиз-М) ^ о / ьг

2— 5рогою» (МЛЗО) §

— ■ ч

5згсоП1Ш!{орЬог> ° АРХЕ5АКТЕРИИ

уГхлофклыОЗ) -

& ~ 1 П---

I / / ГыоиюФилы (38)'« XX ««рсби О» -//нтнюхыЫХЯМ^Г^Ъ? С^рр;

К^ХО.V М«роирофил«01)ч 7 /^Тмиофилкны« - Ьп

^-

ПГОТОКЛЕТКА

Ч-.

Рас. 15. Сравнительное распределение алкоксилшщдов и их окисленных аналогов в живых организмах различных Царств Органического Мира (ОоиЫику, £989,1996; Деибишсий, 1989, 1991). Здесь и на Рис. 14 арабскими яяфраын в скобках обозначены химические соединения липидной природы.

винильную (С-0-СН=СН-) и далее на сложно-эфирную (С-О-СО-); фосфоновая (Р-С-) на фосфатную (Р-О-С-). У тех организмов, которые практически не изменили условий своего существования (архебактерии): высокая температура (до 365 С) и давление (до 265 атм.), большая кислотность (до 20 М серной кислоты), высокая соленностъ - апкоксилипиды их мембран, вероятно, остались такими же как у тех видов, которые существовали по меньшей мере 3.5-4.0 млрд лет тому назад.

Таким образом, предложенная модель проливает свет на. такой фоиоион Органического мира, как апкоксилипиды биомембран', позволяет понять и объяснить, как и почему выживают архебактерии и другие организмы при высоких температурах, большой кислотности и давлении. Выживание организмов, несомненно, обеспечивают биомембраны состоящие исключительно (или преимущественно) из алкрксилипндов, в которых жирные радикалы могут быть изопренойдные, разветвленные и/или алифатические. Функции двойных связей, необходимых для поддержания жидкостности биомембран, вылолдоют цикпопропановые или циклопентановые кольца, находящиеся внутри алифатической цепи.

ВЫВОДЫ

1. С использованием методического подхода, основанного на комплексном применении реакционной микро-тонкослойной хроматографии, ЯМР 13с, 1Н, 31 р, хромато-масс спектрометрии, ВЭЖХ и других методов, проведено широко-масштабное "зучение количественного распределения алкоксилипидов у представителей различных таксономических групп органического мира.

2. Разработаны методы качественного и количественного определения елкекил-ацильных, алкил-ацильных и диацильных форм гпицерофосфолипидов михро-ТСХ в биологических объектах без предварительного препаративного выделения индивидуальных классов липидов. Предложены новые системы для хроматорафжеаюго разделения продуктов деацилирования алноксилипидоа

3. Проведено исследование лилидного состава архебакгерий, выделенных из Мертвого моря. Показано, что все галофильные бактерии содержат в качестве основных липидных

| компонентов 2,3-0-ди-фитанильные фосфо- и гликолипиды.

4. Проведено изучение лилидного состава свободно-живущих простейших, выделенных из природных водоемов. Показано, что все представители содержат высокие концентрации алкил-ацильных фосфо- и фосфонолипидов. Впервые у инфузорий был выделен и охарактеризован 1,2-0-ди-алкил-фосфоэтаноламин.

5. Впервые проведены широко-масштабные исследования лилидного состава пресноводных, солоноватоводных и морских водорослей и трав. Показано, что большинство видов зеленых водорослей содержат бетаиновый липид • ДГТС. Показано, что бурые водоросли содержат бетаиновый лилид - ДГТА, его структура и количественное содержание было определено. Изучен состав полиненасыщенных жирных кислот. Показано, что жирные кислоты также как и полярные липиды крупных отделов обладают характерными особенностями и имеют хемотаксономическое значение. Впервые было определено количественное распределение новых полиизопреноидных спиртов с длиной цепи Сго-С130 у различных представителей царства растений.

6. Впервые изучен состав полярных липидов бриофитов. Показано, что все бриофиты содержат бетаиновый лилид ДГТС. Изучен состав жирных кислот и показано, что бриофиты содержат ацетиленовые кислоты и их содержание может достигать 80%.

7. Впервые изучен липидный состав у представителей симбиотических и высших грибов и показано, что все они содержат бетаиновый лилид ДГТС. Изучено влияние температурных факторов на изменение содержания ДГТС и других фосфолипидов. Проведено исследование состава жирных кислот. Показано, что высшие грибы содержат широкий спектр гидрокси-кислот, некоторые из которых были найдены впервые.

8. Изучен состав алкоксилипидов и их составных фрагментов: алкиловых гфироз, жирных альдегидов, жирных кислот, фосфо- и фосфонолипидов у морских, пресноводных и со лоно ватоводных видов беспозвоночных. Показано, что беспозвоночные характеризуется

высоким содержанием ллазмалогенных и алкил-аципьных полярных лилидов. Показано, что каждый тип беспозвоночных имеет характерные особенности липидного состава. Выделено брлее 50 новых липидных компонентов: полярных липидов, полиизопреноидных жирных ipflpfjQT, кетонов. фураноидных и цикпопропановых кислот.

9. Выявлены общие и частные закономерности распределения эфмр-содержащих и бетаиновых липидоа в различных видах, классах, типах и царствах органического мира на примере более чем 500 видов-живых организмов от бактерий до высших растений, животных и грибов.

10. Исследован состав липидных компонентов морских отложений Большого Барьерного

Рифа (Австралия) и сделаны предварительные выводы о биогеохимических процессах

J '

происходящих с биолипидами и их возможную трансформацию в геолипиды.

11. На основе полученных экспериментальных результатов, предложена модель образования и биотрансформации алкоксилипидов в различных царствах органического мира. Многие из eé положений были подтверждены исследователями из различных стран.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах, в последовательности изложения экспериментального материала,

Обзорные с тэты»,

1. Дембицкий, В.М. Алкоксилипиды прокариотов. Биол. Науки, 1989, К'а 10, стр. 5-18.

2. Dembltsky, V.M. Ether lipids of the Organic World: Formation ^^Biotransformation. In: Fats for the Futuro. (Cambie, R.C., Ed). Ellis Horwood Series In Food. Science & Technology. Van Nostrand Relnhol/Avl, London. 1989, Chapt. 12. pp. 173-189.

3. Дембицкий, В.М. Алкоксилипиды - реликты органического мира; образование, био-трасформация и эволюция. Биологические Науки, 1991, Me 6, стр. 5-25.

4. Dambltsky, V.M. Betaine ether-linked gtycerollplds: Chemistiy and Biology. Progresa In UpkJ Research, 1995, Vol. 35, pp. 1-51.

5. Дембицкий, B.M. Алоксилипиды морских беспозвоночных. Журнал Эволюционной Биохимии и Физиологии, 1985, т. 21, стр. 70-76,

6. Дембицкий, В.М. и Чаломин, В.П. Липиды губок. Известия АН СССР, Серия Биол, 1985, № 1, стр. 53-60.

7. Дембицкий, В.М. и Розенберг, Г.С. Моделирование абиотического синтеза низкомолекулярных полиолов - структурных единиц биологических мембран. Биологические Науки, 1991, Nfl 6, стр. 137-143.

8. Dembltsky, V.M. Lipids of Lichens. Progress in Lipid Research, 1992, Vol.31, pp. 373-397.

9. Dembltsky, V.M. Lipids of Bryophytes. Progress in Lipid Research, 1993, Vol. 32, pp. 281-356.

Экспериментальны о статьи

10. Vaskovsky, V.E. & Dembitsky, V.M. Detemination of the plasmalogen conten. by micro-thin-layer chromatography. Journal of Chromatography, 1975, Vol. 115, pp. 645-647.

11. Дембицкий, В.М. Алхоксилипиды сердца млекопитающих. Украинский Биохимический Журнал, 1987, т. 59, стр. 50-55.

12. Dembitsky, V.M. Quantification of plasmalogen, alkyiacyi- and diacylglycerolipids by micro-thin-layer chromatography. Journal ol Chromatography, 1988, Vol. 436, pp. 467-473.

13. Дембицкий, B.M., Епланова, Г.В:, Жарикова, Н.И. и Жариков, В.В. Липиды простейших. 1. ФосфолШ#1Йй вйййй %<ИрдАб sp.. Химия Природных Соединений, 1989, № 2, стр. 281'282. "

14. Йбмбй^й, 6.Wl. А ЁМЙМЙЮ, Липиды простейших. 2. Фосфолипидный и мрМйШтМШй 'сйс'гйв Рйт&ША ft Paramecium caudatum. Химия Природных СШШйий, 1990, :Ка 1 , стр. 15-17.

15. Дембицкий, В.1Й. 1(3),2-ДМ^№лйцеро-(3)-0-4'-(Л/,/7,М-триметил)-гомо-серин из Vlephrochlons sallna. Химия ПриродныХЪоёдинений, 1988, Na 4, стр. 589-590.

16. Dembltsky, О. А. & Rozentsvet, О .A. DSTS and phospholipid composition of some фГЙ'е'И marine macrophytes. Phytochemlstry, 1989, Vol. 28, pp. 3341-3344.

17. Dembitsky, V.M., Rozentsvisi; O.A. & Pechenkina, E.E. Glycolipids, phospholipids and tefty acids of some brown alg36 swedes from the Black Sea. Phytochemlstry, 1S90, Vol. 29, pp. 3417-3421.

18. Dembltsky, V.M. & kozentsvet, O.A. Phospholipid composition of some marine red algae. Phytochefnisby, 1990, Vol. 29, pp. 3149-3152.

IS. bembltsky, V.M., Rezanka, T. & Rozentsvet, O.A. Lipid composition of three macro-fihytes from the Caspian Sea. Phytochemlstry, 1993, Vol. 33, pp. 1015-1019.

20. Dembitsky, V.M. & Rozentsvet, O.A. Distribution of polar lipids In marine, brackish and freshwater green macrophytes. Phytochemlstry, 1996, Vol. 41, pp. 483-488. •

21. Dembitsky, V.M., Rezanka, Т., Bychek, l-A. & Afonlna, O.M. Acetylenic acids and lipids ci iome mosses from Russia. Phytochemlstry, 1993, Vol. 33, pp. 1021-1027.

22. Dembltsky, V.M., Rezanka, Т., Bychek, I.A. & Afonina, O.M. Polar lipids and fatty acids compositions of bryophytes. Phytochemlstry, 1993, Vol. 33, pp. 1009-1014.

23. Dembltsky, V.M., Rezanka, Т., Bychek., I.A. & Afonina, O.M. Chemical constituents of some moss species. Journal ofHattori Botany Lab.(Japan), 1994, Vol. 75. pp. 161-172.

24. Dembltsky, V.M. & Rezanka, T. Distribution of acetylenic acids and polar lipids in some aquatic bryophytes. Phytochemlstry, 1995, Vol. 40. pp. 93-97.

25. Dembltsky, V.M. & Rezanka, T. Distribution of diacylglycerylhomoserines, phospholipids and fatty acids in thirteen moss species from South-Western Siberia. Biochemical Systematica and Ecology, 1995. Vol. 23, pp. 71-78.

26. Rezanka, T. & Dembltsky, V.M. Occurrence of C40-C130 polyisoprenoid alcohols in lower plants. Phytochemlstry, 1993, Vol. 34, pp. 1335-1339.

27. Dembltsky, V.M., Shublna, E.E. & Kashin, A.G. Phospholipid and fatty acid compositions of some Basidiomycetes. Phytochemlstry, 1992, Vol. 31, pp. 845-849.

28. Dembltsky, V.M., Rezanka, T. & Shublna, E.E. Unusual hydroxy fatty acids from some fungi. Phytochemlstry, 1993, Vol. 34, pp. 1057-10E .

29. Dembltsky, V.M., Bychek, I.A., Rozentsvet, O.A. & Shustov, M.V. Fatty acid and phospholipid compositions of some lichen species from the Volga river basin. Cryptogamic Botany, 1992, Vol. 2, pp. 391-394.

30. Dembltsky, V.M., Bychek, IA & Rozentsvet, O.A. DGTS and phospholipid compo-sition of some lichen species. Phytochemlstry, 1993, Vol. 34, pp. 1535-1536.

31. Dembltsky, V.M., Rezanka, T. & Bychek, I.A. Seasonal examination of lipids of the tree-growing lichen of gen. Physcia. Phytochemlstry, 1994, Vol. 36, pp. 601-608.

32. Дембицкий, B.M. Плазмапогены в фосфолипидах морских беспозвоночных. Биология Моря, 1979, № 5, стр. 66-90.

33. Dembltsky, V.M., Rezanka, Т. & Kashin, A.G. Comparative examination phospholipids and fatty adds from some Caspian invertebrates. Comparative Biochemistry and' Physiology, 1993, Vol. 104B, pp. 617-622.

34. Дембицкий, B.M. и Небылицы», Б .Д. Липиды морсхого происхождения. 2. Сравнительное исследование фосфолипидного и жирнокислотного состава морских губок Японского моря. Биоорганическая Химия, 1980, т. 6, стр. 1542-1548.

35. Дембицкий, В.М. Плазмапогенный состав пресноводных губок класса Demo-sponglae из озера Байкал. ЖурцаяЭво/j, иФиаиоп., 1982, т. стр. 92-95.

3Jj Дембицкий, Лига^ы, происхождения, 4, 1;2-д11-0-Алкил-глицеро-

^O^i^^W^^W' Хсщя^Щ^йт^^Фтт^

1988, Na 5, стр. 751-752,

37. Dembltsky, V.M, ПОЭДЙОД ^thet, li^ds, Ш.

AJT

aldehydes of the marina sponges and echinoders. Proceedings of Fifth International

Conference on Chemistry and Biotechnology of Active Natural Products. IUPAC, Varna,

1 *

Bulgaria, 1989, Vol. 2, pp. 315-317.

38. Dembltsky, V.M. Gorlna, I.A., Fedoroya, I.P. & Solovleva, M.V. Comparative investigation of plasmalogens, alkyl-acyl, and diacyl glyceroph'o'spholipids of marine sponges (Type Porifera, Class Demospongiae). Comparat/ve Biochemistry end Physiology, 1989, Vol. 92B, pp. 733-736.

39. Dembltsky, V.M., Kashln, A.G. & Karaganova, M.V. Phospholipid and fatty acid composition of freshwater sponge Euspongilla lacustris: from the^ Volga driver estuary. Comparative Biochemistry and Physiology, 1991, Vol. 100B, pp. 185-187..

40. Dembltsky, V.M., Rezanka, T. & Kashln, A.G. Comparative study of the endemic freshwater fauna of Lake Baikal12. Unusual lipid composition of two sponges Balcatospon-gla bacilifera and B.intermedia (Family Lubomirskiidae, Class Demospongiae). Comparative Biochemistry and Physiology, 1993, Vol. 106B, pp. 825-831.

41. Dembltsky, V.M.,. Rezanka, T. & Kashln, A.G. Comparative study of the endemic freshwater fauna of Lake Baikal. 6. Unusual fatty acid and lipid composition of the endemic sponge Lubomirskia bajcalensis and sponge's amphipod crustacean parasite Brandtia_ (Splnacantus) parasitica.^Comparative Biochemistry and Physiology, 1994, Vol. 109B, pp. 415426. ' . "" - -

42. Rezanka, T. & Dembltsky, V.M. IsOprenoid polyunsaturated fatty acids from freshwater sponges. Journal of Natural Products, 1993, Vpl. 56, pp. 1898-1904.

43. Dembltsky, V.M., Rezanka, T. & Kashln, A.G. Comparative study of the endemic freshwater fauna of Lake Baikal. 3. Phospholipid and fatty acid compositions Of the amphipod crustacean of genus Eulimnogammarus. Comparative Biochemistry and Physiology, 1994, Vol. 107B, pp. 317-323.

44. Dembitsky, V.M., Rezanka, T. & Kashln, A.G. Phospholipid and fatty acid compo-sitions of the endemic amphipod crustacean Issycogammams berg! from the brackish moun-tain Lake Issyk-Kul (Tian Shan, Middle Asia). Comparative Biochemistry and Physiology, 1994, Vol. 107B, pp. 331-336. y

45. Dembltsky, V.M., Kashln, A.G. & Rezanka, T. Comparative study of the endemic freshwater fauna of Lake Baikal. 5. Phospholipid and fatty acid composition of the deep-water amphipod crustacean Acanthogammarus (Brachyuropus) grewlngkii. Comparative Blo-chemistry and Physiology, 1994, Vol. 108B, pp. 443-448.

45. Dembltsky, V.M. & Rezanka, T. Furan fatty acids in some brackish invertebrates from Caspian Sea. Comparative Biochemistry and Physiology, 1996, Vol. 114B, pp. 317-320.

47. Rezanka, T. & bittibltsky, V.M. Identification of unusual cyclopropane monounsatura-ted

fatty acids from deep-wster invertebrate Acanthogammarus grewlngkli. Comparative Biochemistry and Physiology, 1994, Vol. 109B, pp. 407-413.

48. Rezanka, T. & Dembltsky, V.M. The occurrence and structural Identification of long-chain unsaturated ketones in the deep-lake invertebrate Acanthogammarus grewlngkil. Comparative Biochemistry and Physiology, 1995, Vol. 111B, pp. 249-255.

49. Дембицкий, B.M. Плазмалогенный состав различных органов и тканей осьминога Octopus sp.. Журнал Эволюционной Биохимии и Физиологии, 1981, т. 17, стр. 296-298.

50. Dembltsky, V.M., Kashln, A.G. & Stefanov, К. Comparative investigation of phospholipids and fatty acids of freshwater molluscs from the Volga river basin. Comparative Biochemistry and Physiology, 1992, Vol. 1023, pp. 193-198.

51. Dembltsky, V.M., Rezanka, T. & Kashln, A.G. Fatty acid and phospholipid compo gitions of freshwater molluscs Anadonta plscinalis and Umnaea fragiiis from the river Volga. Comparative Biochemistry and Physiology, 1993, Vol. 105B, pp. 597-601.

52. Dembltsky, V.M., Rezanka, T. & Kashln, A.G. Comparative study of the endemic freshwater fauna of Lake Baikal. 1. Phospholipid and fatty acid composition of two molluscs species Balcalia oviformls and Benedlctia baicalensls. Comparative Biochemistry and Physiology, 1993, Vol. 106B, pp. 819-823.

53. Dembltsky, V.M., Rezanka, T. a Kashln, A.G. Comparative study of the endemic freshwater fauna of Lake Baikal. 4. Phospholipid and fatty acid composition two gastropod molluscs of genus Valvata. Comparative Biochemistry and Physiology, 1S94, Vol. 107B, pp. 325-330.

54. Дембицкий, B.M. Липиды морского происхождения. Исследование фссфолипид-ного состава Ophiura sarsl. Биоорганическая химия, 1980, т. 6, стр. 426-430.

55. Дембицкий, П.М. Фосфолипидный и жирнокислотный состав иглокожих. 1. Класс Ophiuraidea. Химия Природных Соединений, 1S86, Na 5, стр. 547-551.

56. Дзмбицкий, В.М. Липиды морского происхождения. 3. Фосфоглицеролипиды с простой эфирной связью из морской звезды Henricia sp.. Биоорганическая Химия, 1937, т. 13, стр. 409-414.

57. Дембицкий, В.М. Фосфолипидный и жирнокислотный состав иглокожих. 2. Класс Asteroldea. Химия Природных Соединений, 1988, На 3, стр. 353-357.

58. Johns, R.B, Brady, В.А., Butler, M.S., Dembltsky, V.M. & Smith, J.D. Organic geochemical and geochemical studies of inner Great Barrier Reef sediments. 4. Identification of terrigenous and marine sourced Inputs. Organic Geochemistry, 1994, Vol. 21, pp. 1027-1035.

Сдано в печать 11.11.1996. Бумага офсетная. Печать офсетная. Формат 60x90/16. Уч. изд. л. N 2, 3,6. Тираж 70 экз. Заказ N 9. ИПЦ МИТХТ им. М.В.Ломоиосова, 117571, Москва, пр-т Вернадского, 86