Амперометрические ДНК-сенсоры на основе стационарных электродов для определения тяжелых металлов и фармпрепаратов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

МОИСЕЕВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА

1

АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЕ ДНК-СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ СТАЦИОНАРНЫХ ЭЛЕКТРОДОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И ФАРМПРЕПАРАТОВ

02 00 02 - аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

□ ОЗОТ1631

Казань - 2007

003071631

Работа выпочнена на кафедре неорганической химии Химического института

им А М Бутлерова государственного образоватетьного учреждения ьысшего

профессионального образования «Казанского государственного \ниперситета им В И Ульянова-Ленина»

Научный руководитель доктор химических наук

профессор Бабкина Софья Сауловна

Официальные оппоненты доктор химических на\ к

профессор Гвтюгин I еннадий Артурович

кандидат химических наук, заведующий лабораторией Халдеева Елена Владимировна

Ведущая организация Казанский государственный технологический

университет (КГТУ)

Защита состоится «24» мая 2007 г в 14 00 ч на засетании диссертационной! Совета К 212 081 04 по химическим на)кам Казанского государственного университета по адресу ул Кремлевская 18. КГУ Бутлеровская аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в на) чной библиотеке им Н И Лобачевского Казанского государственного университета

Отзывы на автореферат просим направлять по адресу 420008, г Казань, ул Кремлевская 18, КГУ, Научная часть

Автореферат разослан «18» апречя 2007 г

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат химических наук

Л Г Шай,

.арова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Опредетение и изучение взаимодействия эффекторов ДНК различной природы является актуальной проблемой современной аналитической химии К таким эффекторам относятся в частности тяжетые металлы и противоопухолевые препараты Эти эффекторы имеют высокое сродство к молеку тм ДНК органи!ма поэтому их определение с помощью ДНК как аналитического pealen ia и ДНК-содержащих аналитических систем очень перспективно и акт\ально

Известно что тяжелые металлы, попадая в организм из среды промышленных предприятий и природных вод, вызывают повреждения в цепи ДНК, что говорит о потенциальной мутагенности и генотоксичности даже таких металлов которые до недавнего времени считались относительно безопасными например меди и кобальта С одной стороны, эти металлы являются необходимыми (эссенциальными) дтя организма так как они наряду с железом принимают участие в образовании гема и их недостаток приводит к развитию злокачественных анемий С другой стороны содержание данных тяжелых металлов в биосфере должно строго контролироваться coi ласно решению Це 1евой группы по выбросам Европейской экономической комиссии ООН и данные металлы признаны генотоксичными Межународным агентством по исследованию раковых заболеваний, поскольку возможна интоксикация организма данными тяжелыми металлами при массовых выбросах на производстве, а также при нарушениях в биохимических процессах организма приводящих к денатурации ДНК клеток В этом плане особенно актуальна проблема исследования малоизученной системы эффектор-денатурированная односпиральная ДНК (д-ДНК) которая максимально адекватно моделирует процессы, происходящие в организме под действием денатурирующих агентов Результаты таких исследований могли бы помочь в предсказании механизма такого воздействия и в выборе детоксикантов

Эффекторами ДНК являются также цитостатики - противоопухолевые препараш которые прочно связываются с ее цепями и подавляют синтез ДНК раковых клеток Однако с целью снижения возможных побочных эффектов и подбора правильной индивидуальной дозировки препаратов выяснения их фармакокинетики является актуальным определение фармпрепаратов в многокомпонентных био тогических жидкостях в том числе в сыворотке крови человека

В эколого-аналитическом мониторинге тяжелых металлов и в анализе противоопухолевых препаратов применяется ряд стандартных методов для определения данных эффекторов в объектах окружающей среды и в биологических жидкостях (кровь сыворотка, моча) - это методы масс-спектрометрии атомно-абсорбционной спектрометрии спектрофотометрии и др Однако применение их на практике имеет ряд недостатков например дорогостоящее обор)дование длительность проведения анализа и пробоподготовки и др

В случае мониторинга противоопухолевых препаратов в >словиях отечЛ клинических лабораторий регулярного контроля за содержанием данных фармпре сыворотке крови пациентов не проводится

Электрохимические биосенсоры на основе ДНК позволяют изучать взанм эффекторов с ДНК и определять их достаточно быстро без дорогостоящего обор без длительной пробоподготовки достаточно специфично и селективно на vpoe концентраций

Таким образом актуальна разработка биоаффинных методов опрелеления р эффекторов ДНК на основе ачперометрических ДНК-сенсоров

Цель исследования Разработка и оптимизация биоаффинных способов ont эффекторов ДНК различной природы - тяжелых металлов на примере ионов кобал! том числе при совместном присутствии на примере ионов кобальта (II) и меди (II) противоопухолевых препаратов - антибиотика адрибластина и алкалоида амперометрическими ДНК-сенсорами на основе стационарных электродов

Для достижения поставленной цели необходимо бьпо решить след} ющие задачй

ственных паратов в

действие удования не малых

«деления ьта (II), в , а также онковина

получить количественные характеристики процесса комптексообразования эффекторов с различными формами иммобилизованной ДНК с целью оптимизации биоаффинных методов их определения

выяснить роль специфической адсорбции тяжелых металлов в процессе их мембранного концентрирования на БС и определение аффинной константы связывания ионов кобальта (II) с иммобилизованной на мембране д-ДНК (д-ИДНК),

на основании полученных данных разработать биоаффинный способ определения кобальта(П) в присутствии матричных компонентов в модельных растворах и реальных образцах природной воды и сыворотки крови с помощью д-ИДНК-содержащего БС разработать биоаффинный способ определения антибиотика антрациклиновой Группы на примере адрибластина с помощью р-ИДНК-содержащего БС на основу СРПЭ в

модельных растворах и в образцах сыворотки крови,

разработать биоаффинный способ определения алкалоида индолового ряда нг примере онковина с помощью р-ИДНК-содержащего БС на основе СРП 3 в модельных растворах и в образцах сыворотки крови

Научная новизна полученных в диссертации результатов заключается в том ^то • получены количественные характеристики комплексообразования денат>рйрованной иммобилизованной ДНК с ионами тяжелых металлов и эффектвные сонсынш устойчивости и доли комплексных форм для ионов кобальта (И) и константы аффинного связывания ионов кобальта (II) для целенаправленной разработки способа определения тяжелых металлов с помощью амперометрического ДНК-сенсора на основе стационарного ртутно-пленочного электрода (СРПЭ)

• рассчитана максимальная сорбдионная емкость биочувствительной части ДНК-сенсора и установлена возможность определения кобальта (II) и меди (II) при совместном присутствии на основании изотерм биоаффинной сорбции ионов металлов на ДНК-модифицированной мембране

• получены количественные характеристики комптексообразования молекут цитостатиков - интеркаляторов с иммобилизованной ренатурированной ДНК подтверждающие целесообразность использования выбранной формы ДНК при иммобилизации в составе ДНК-сенсора на основе СРПЭ

• предложен биоаффинный способ селективного определения тяжелых металлов на примере ионов кобальта (II) и меди (II) с помощью д-ИДНК-содержащего БС на основе СРПЭ,

• разработан биоаффинный способ определения противооп>холевого антибиотика антрациклиновой группы адрибластина с помощью р-ИДНК-содержащего БС на основе СРПЭ,

• разработан биоаффинный способ опреде тения природного алкалоида онковина обладающего противоопухолевой активностью с помощью р-ИДНК-содержащего БС ,

• установлены оптимальные условия использования разработанных способов определения тяжелых металлов и фармпрепаратов в сыворотке крови при диагностике заболеваний, а также тяжелых металлов в природных объектах при экологическом мониторинге

Практическая значимость На основе пол\'ченны\ ДНК-сенсоров разработаны биоаффинные способы определения тяжелых металлов и фармпрепаратов Использование этих способов позволяет определять токсиканты на уровне ПДК и меньших концентраций и судить об их потенциальной мутагенной и канцерогенной активности Анализ образцов на содержание фармпрепаратов необходим при контроле их качества в процессе фармпроизводства и в сыворотке крови пациентов в процессе терапевтического мониторинга

Разработанные методики анализа просты относительно дешевы требуют очень малый объем образцов Правильность разработанных методик установлена сравнением со стандартными независимыми методами Методики определения апробированы при анализе реальных образцов Представляет интерес испо шзовать данные ДНК-сенсоры в анализе образцов природной воды и биологических жидкостей в \словия\ медицинских лабораторий и лабораторий эколого-аналитического контроля На защиту автор выносит

• обоснование выбора формы молекул ДНК для иммобилизации в составе биосенсора на основании исс гедования комплексообразования кобальта (II) и противоопухолевых препаратов с различными формами ДНК,

• рез> тьтаты изучения специфической адсорбции ионов Со(П) на ДНК-содеркащей мембране в составе биосенсора а также при совместной адсорбции ионов Co(II) и Cu(II,

• способ определения кобальта (II) и меди (II) с помощью амперометрическогЬ биосенсора на основе выбранной формы иммобитизованной денатурированп ДНК и СРПЭ,

• биоаффинные способы определения противоопухопевых препаратов -интеркаляторов различной природы (антибиотиков и алкалоидов) с помошы амперометрического биосенсора на основе иммоби шюванной ренаприровЭ! ДНК и СРПЭ

• выбор оптимальных параметров работы ДНК-сенсоров времени концентри)!» времени реактивации, рН, условий реактивации,

• аналитические и метрологические характеристики методик анализа объектов на содержание тяжечых метал ч о в и фармпрепаратов

Апробация работы Результаты исследований были дочожены и обс>жд:' международных и российских конференциях и изложены в материалах Между« конференции «Ломоносов-2000» (Москва, 2000), Поволжской конференщ аналитической химии (Казань, 2001) Итоговой научной студенческой конферени: (Казань, 2000), Всероссийской конференции «Современные проблемы теоретич экспериментальной химии» (Саратов 2001) Международной научной конференции химическая технология и биотехнология на рубеже тысячепетий» (Томск Всероссийской конференции «Экоаналитика-2006» (Самара. 2006) Междунф конгресса по аналитической химии ICAS-2006 (Москва 2006) Публикации По тематике диссертационной работы опубликовано 12 работ Из них 3 научных журналах и 9 тезисов доктадов на всероссийских и международных конфере

Настоящая работа является частью исследований проводимых на неорганической химии Казанского государственного университета в рамк; Министерства образования и науки РФ «Координационные соединения 3d-ncpe платиновых и редкоземельных металлов термодинамика и кинетика образо различных средах, синтез строение свойства направления практического исполни (per №01 960002010)

Структура и объем работы Диссертация иззожена на 143 страницах содержит 18 таблиц 27 рисунков и библиографию включающую 166 ссы юк Диссертационная работа соггоит из введения и шести глав обзора читературы, экспериментальной части, четырех глав результатов и их обсуждения, а также выводов и списка используемой литературы

В первой главе представлен обзор литературных данных по функционированию ДНК и ее эффекторов в организме и этектрохимическим методам их опредетения Основное внимание уделено использованию электрохимических ДНК-сенсоров

раз личных

ны на ародной ии по ии КГУ еской и «Химия 2006) родного

статьи в нциях кафедре темы ходных Вания в ования»

ах

Во второй паве описаны объекты и метолы исследования аппаратура Приведены методики иммобилизации различных форм ДНК а также методики построения изотерм биоаффинной сорбции тяжелых металлов и получения констант устойчивости и аффинного связывания тяжелых металлов и фармпрепаратов с различными формами иммобилизованной ДНК

В третьей главе изложены результаты изучения взаимодействия тяжелых металлов с ДНК и их определения с помощью амперометрического ДНК-сенсора на основе д-ИДНК

В четвертой главе отражено изучение взаимодействия с ДНК противоопухолевого антибиотика антрациклиновой группы на примере адрибластина оказывающего цитостатическое действие за счет интеркаляции, приведены результаты его определения с помощью р-ИДНК-сенсора

Глава 5 посвящена разработке биоаффинного мьтода опреде и.ния с помощью р-ИДНК-сенсора природного алкалоида индолового ряда на примере онковина также являющегося интеркалятором, представлены результаты изучения процесса его комплексообразования с р-ИДНК

Глава 6 посвящена аналитическому применению разработанных амперометрических ДНК-сенсоров на основе стационарных электродов в анализе объектов окружающей среды и сыворотки крови человека

Автор выражает бчагодарностъ заведующему кафедрой неорганической химии Казанского университета Н А Улаховичу за постоянную поддержку, полезные советы и замечания высказанные в процессе обс\ждения работы профессору кафедры неорганической химии Казанского университета Ю И Сатьников\ за проведение расчетов методом математического моделирования и помощь в обс\ждении полученных рез\льтатов

1 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

С целью решения поставленных задач использовались следующие методы исследования вольтамперометрия с использованием вопьтамперометрической системы SVA-1ВМ-01 «Аналитик» (Болгария), спектрофотометрия с использованием спектрофотометра U-2000 «Hitachi» (Япония), атомно-абсорбционная спектрофотометрия с использованием атомно-абсорбционного спектрофотометра Z - 6100 «Hitachi» (Япония)

В работе изучены следующие объекты денатурированная ДНК (д-ДНК) ее комплексы с ионами металлов (на примере ионов Со(11) и ионов Со(П) и Cu(II) при совместном присутствии) ренатурированная ДНК (р-ДНК) и ее комплексы с противоопухолевыми препаратами - антибиотиком адрибластином и алкалоидом онковином Приготовление биочувствительной части амперометрических ДНК-сенсоров Для получения биочувствительной части ДНК-сенсоров навеску НЦ массой 0 1 г со средним содержанием азота 11,5-12 % растворяли в смеси ацетона и толуола добавляли раствор д-ДНК, либо р-ДНК, раствор глутарового альдегида и гексан в качестве коагулянта

7

Из этой смеси на стеклянной поверхности получали пленку Полученную пленку закрепляли на поверхности стационарного ртутно-пченочного электрода (СРГ1Э)

Обработка данных комплексообразования ионов Со(П) и фармпрепаратов с ИДНК. При обработке результатов исследований комплексообразования Со(П)-д-ИДНК и фармпрепарат-р-ИДНК для установтения состава и определения эффективных констант устойчивости данных комплексов опретеляли равновесн\ю концентрацию ионов металла либо фармпрепарата в процессе их кочтексообразования при постоянной концентрации лиганда - ДНК (L) спектрофотометрически по погтощению комплексоната Со(П) прк 215 нм адрибластина при 232 нм, вольтамперометрически по величине 1р при - 1,3 В для комплексоната Со(Н) и при - 0,46 В и - 0 9 В для адрибластина и онковина, соответственно и по градуировочным графикам Обработка результатов проводилась методом математического моделирования с использованием программы CPESSP (Shevelkova А N Salmkov Yu I et at FEBS Letters 1996 V 383 P 259-263)

Построение изотерм адсорбции тяжелых металлов с помощью ДНК-сенсора Построение изотерм адсорбции ионов Со(Ш либо ионов Со(П) и Cu(II) при их совместном присутствии проводити на основании зависимостей оптических птотностей растворов комплексонатов соответствующих металлов (для ионов Со(П) см выше для ионов Cu(II) при 276 нм), либо по величине 1р этих растворов (для ионов Со(11) см выше, для ионов Cu(II) при

- 0,4 В), от исходной концентрации ионов тяжелых металлов в заданном диапазоне концентраций По градуировочным графикам зависимости определяли остаточные концентрации ионов Co(II) или Cu(II) в растворе

Определение констант аффинного связывания комплексов Co(II) - д-ИДНК и фармпрепарат - р-ИДНК. Константы аффинного связывания (КсВЯЭ) комплексов определяли вольтамперометрически по токам восстановления комплексоната Co(II) при потенци але

- 13 В, для фармпрепаратов при - 0 46 В или - 09 В дня адрибластина и онковина соответственно По градуировочным зависимостям определяли концентрации комплексов Со(Н)-д-ИДНК и фармпрепарат-р-ИДНК и равновесные концентрации Со(П) тибо адрибластина и онковина, которые использовали дчя построения графика Скетчарда.

2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ С ДНК КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ С ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ФОРМОЙ ДНК И БИОАФФИННАЯ СОРБЦИЯ НА ДНК-СОДЕРЖАЩЕЙ МЕМБРАНЕ БИОСЕНСОРА. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ С ПОМОЩЬЮ ДНК-СЕНСОРА НА ОСНОВЕ СРПЭ Изучение взаимодействия тяжелых металлов с ДНК проводилось на примере ионов Со(П) и Cu(Il), так как с одной стороны эти металлы являются жизненно необходимыми с другой стороны установлена их потенциальная генотоксичность что делает определение данных ионов в сыворотке крови и в экологических объектах актуальным Для выбора

формы ДНК. позволяющей наиболее эффективно решить поставленную аналитическую задачу ранее изучено взаимодействие ионов Cu(II) (выбраны в качестве модели, так как имеют наибольшее сродство к ДНК) с денатурированной неиммобилизованной (д-ДНК) и денатурированной иммобилизованной ДНК (д-ИДНК) (Babkina SS NA Ulakhovich Anal Chem 2005 V 77 P 5678-5685) Пол\ченные pei\ штаты (дтя д-ДНК соотношение нуклеотид-М(П) 1 1 и 1 2 Igß,фф = 10 1 ±0 4 14 3 ± 0 1 соответственно максимальная доля комплекса 0 8 для д-ИДНК соотношение нуклеотид-М(И) 125 lgß,$,|, - 6103 ± 0 02 максимальная доля комплекса 0 98) свидетельств\ют о том что форма д-ИДНК является биолигандом с высокой комплексообраз\ющей способностью и оптимальна для использования в составе БС С учетом описанных выше результатов, комплексообразование ионов Со(Н) изучалось только с выбранной формой д-ИДНК при выбранном рН=2 5 Для оценки параметров комплексообразования ионов Co(II) с д-ИДНК были определены равновесные концентрации ионов Co(II) после проведения реакции комплексообразования с д-ИДНК спектрофотометрическим методом (СФ) и методом атомно-абеорбционной спектрофотометрии (ААС) Результаты представлены на рис 1 и в табл 1 Обработка полученных данных выполнена методом математического моделирования (см раздел 1)

Таким образом на основании экспериментальных данных полччены количественные характеристики процесса комплексообразования ионов Со(П) с д-ИДНК которые >казывают на то, что ионы данного металла образуют достаточно прочные комплексы с д-ИДНК, что свидетельствует об их взаимодействии именно с азотистыми основаниями иммобилизованных молекул Однако по сравнению с ионами Си(П) взаимодействие ионов Со(П) протекает менее эффективно что свидетельствует о меньшем сродстве ионов СоПП не только к нативной ДНК (согласно литературным данным) но и к выбранной форме д-ИДНК вследствие меньшего числа вариантов взаимодействия их с биомолекулой даже в условиях доступности центров связывания

а

Рис 1 Доли накопления комплексов Со(П)-д-ИДНК при рН=2 5 по данным метода спектрофотометрии

1 - соотношение нуклеотид Co(II) = 1 2,

2 - соотношение нуклеотид Co(II) = 2 1 сднк=0 01 мг/мл

TS TS 7 4 72 70 -ев -в в <6 4 -в г -в О *S

lg Ccolll)

Таблица1

Результаты изучения комтексообразования ионов Co(II) с д-ИДНК

Состав комплекса

[COL2]

[Co2L]

Соотношение нуклеотид Со(Н)

2 1

1 2

1вЭэфф

13 69 ±0 07

Доля комплекса

при СсоШГ 1,75x10 ^ моль/л

15 71 1 007

0.25

1) 1Г

Доля ко при ¿CcKMV

l.OOxIOi

L - один нуклеотид

Биоаффиниая сорбция тяжелых металлов на д-ИДНК-содержащей мембране

Была уточнена сорбционная емкость модифицированной НЦ мембраны с д-ИДНК по отношению к ионам Си(Н) и оценена ее сорбционная емкость по отношению к ионам Со(Н) для получения значения максимального количества молей тяжелых металлов способных адсорбироваться на данной поверхности В исследуемой системе происходит хемосорбция выбранных ионов на биочувствительной части сенсора за счет комплексообразования с азотистыми основаниями д-ИДНК что позволяет получить более точные и воспроизводимые характеристики процесса Для контроля специфичности адсорбции проводили холостой опыт с НЦ матрицей не содержащей д-ИДНК

При построении изотерм адсорбции Ленгмюра (см раздел 1) концентрацию исходного раствора ионов металла увеличивали до выхода изотерм на предел (а») обусловленный сорбционной емкостью мембраны (рис 2) Это свидетельствует о предельном за возможных мест связывания с д-ИДНК на модифицированной мембране сорби ионами Полученные значения а, (рис 2, кривые 1, 3) для ионов Со(Н) (3,8±0 2)х10

для ионов Cu(II) (8,7±0,1)х10 моль/м2 (Babkina S S , N A Ulakhovich, Anal Chem 77 Р 5678-5685), что еще раз свидетельствует о меньшем сродстве ионов Со(11) к чем Cu(II) Были также построены изотермы адсорбции ионов Со(11) и Си(И) из раствора в котором эти ионы присутствовали совместно в соотношении 1 1 за счет достаточной разницы потенциалов этих пиков (ДЕ более чем 250 мВ)(рис 2 кривые2,4)

а х 103 мопь/мг

с х 10 моль/л

Рис 2 Изотермы адсорбции ионов металлов на л-ИДНК содержащей НЦ мембране амперометрического БС

(1) и (3) - при адсорбции из индивидуальных растворов Cu(ll) и Co(II),

(2) и (4) - при совместной адсорбци^ Cu(II) и Со(П) из их смеси в соотношении 1 1.

* - Babkina S S N A Ulakhovich Aral Chem.

2005 V 77 Р 5678-5685

моль/л

15

Й7~

руемыми моль/м2 2005 V д-ИДНК

Как видно из рис 2 в данных ¡сювияч на мембран} с д-ИДНК сорбируется практически одновременно оба вида ионов Следовательно с помощью ДНК-сенсора возможно определение этих ионов в совместном присутствии Из рис 2 также следует что и при условии конкурентной адсорбции сорбционная способность ионов Си(Ш больше чем ионов Со(П) что еще раз подтверждает большее их сродство к молекулам д-ИДНК

Определение константы аффинного связывания (Ксюп) комплекса Со(Н) - д-ИДНК. Для оценки специфичности из\ чаемых процессов проводили определение величины константы аффинного связывания (КСМ1) ионов Со(П) с д-ИДНК и для сравнения специфичности связывания Со(П) и Си(Н) с д-ИДНК воспроизвели эксперимент по определению Ксвя, также для меди (Babkina S S NA Ulakhovich Anal Chem 2005 V 77 P 5678-5685) Определение проводили на основании спектрофотометрических данных для ионов Со(Н) и вольтамперометрических данных для ионов Cu(Il) методом Скетчарда основанным на получении зависимости отношения концентрации образующегося комплекса [М(П)-д-ИДНК] к равновесной концентрации металла-комплексообразователя [М(Н)] от равновесной концентрации образующегося комплекса [М(П)-д-ИДНК] По тангенсу угла наклона полученных прямолинейных зависимостей найдено значение величины константы аффинного связывания KCB»i ионов Со(П) с д-ИДНК (3 9±0 2)х10^ л/моль (спектрофотометрические данные), Ксвя, для Си(11)-д-ИДНК составила (19,1±0,2)х10* л/моль (вольтамперометрические данные) Эти данные еще раз подтверждают достаточно высокое сродство ионов тяжелых металлов к выбранной форме молек} л ДНК и факт образования прочной связи данных ионов с д-ИДНК за счет координационной"! взаимодействия с азотистыми гетероциклическими основаниями ДНК и наличия дополнительных вариантов комплексообразования образования внутринитевого хелата между атомами N(7) и 0(6) гуанина д-ИДНК, образование внутринитевых сшивок с атомами N(7) гуанина д-ИДНК

Следует отметить, что результаты изучения сорбции ионов меди из индивидуальных растворов и специфичности их связывания с д-ИДНК полученные в данной работе хорошо согласуются с результатами, полученными ранее (Babkina SS NA Ulakhovich Anal Chem 2005 V 77 P 5678-5685) Это свидетельствует о хорошей воспроизводимости биочувствительной части сенсора и ее однородности

Полученные количественные характеристики виимодействия ионов Со(П) и Cu(Il) с д-ИДНК подтверждают данные об их генотоксичности и свидетельств} ют о целесообразности определения данных металлов в различных объемах с помощью предложенного д-ИДНК-содержащего БС на основе СРПЭ

Разработка способа определения ионов Co(II) и ионов Co(II) и Cu(II) при совместном присутствии с помощью амперометрического биосенсора на основе д-ИДНК. С учетом проведенного исследования амперометрический д-ИДНК-содержащий БС на основе СРПЭ был использован для опредетения тяжелых металлов на примере ионов Со(Н) и Си(Н)

В качестве материала для изготовления матрицы для ичмобилиюванныч биомолекул в данной работе был выбран нитрат целлюлозы (НЦ) как обладающим 1идрофил1ностью и минимальной неспецифической сорбцией Ковалентный способ иммобилизации д-ДНК предполагает включение молекул ДНК в полимерную матрицу из НЦ с одновременной кросс-сшивкой при обработке глутаровым альдегидом в качестве бифункционального реагента (см раздел 1) Подобранные смеси растворителей максимально сохраняют структуру и свойства биомолекул и способ иммобилизации позволяет получить воспроизводимые, устойчивые матрицы модифицированные биомолекулами, благодаря сочетанию механической фиксации ДНК в полимере с химическим связыванием

Аналитические возможности разработанного БС на основе д-ИДНК были оценены на примере определения ионов тяжелых металлов Со(П) и Cu(II) Предлагаемый биоаффинный способ определения ионов Со(Щ или Cu(II) в объектах аналитического контроля с помощью амперометрического ДНК-сенсора основан с одной стороны, на установленном нами высоком сродстве ионов Co(II) и Cu(ll) к молекулам д-ИДНК что позволяет провести эффективное биоаффинное концентрирование данных ионов Hi анали!ир\емого раствора с малой концентрацией на мембране с д-ИДНК в составе БС С другой стороны в методике используется реактивация БС путем удаления ионов Со(Н), либо Cu(II) с поверхнссти ДНК-сенсора обработкой его раствором комплексона III и определение ионов тяжелых металлов в виде комплексонатов При этом возможно определение более низких концентраций тяжелых металлов, а БС реактивируется и может быть многократно использован Появление на вольтамперограмме катодных пиков при - 1 3 В, либо при - 0 4 В после концентрирования ионов Со(П) или ионов Cu(II) на биосенсоре и его реактивации еще раз подтверждает факт разрушения комплекса ионов Co(II) либо ионов Cu(II) с д-ИДНК под действием комплексона III Величина этих сигналов зависит от концентрации ионов Со(Щ л<бо ионов Cu(Il) а при их постоянной концентрации - от способности молекул ДНК к комплексообразованию Молеку лы д-ДНК после иммобилизации сохраняю! свою ак1ивносгь не менее 30 дней Равенство аналитических сигналов, полученных при использовании различных участков мембраны с иммобилизованной д-ДНК равной площади, свидетельствует об однородности биочувствительной части сенсора по составу С помощью данного ДНК-сенсора возможно провести около 10 циклов измерений Следует сказать что при необходимости можно легко заменить модифицированную мембрану после проведения анализа на новую

Выбрано оптимальное время концентрирования (10 мин) и время реактивации (20 мин) для определения изучаемых ионов металлов Проведено определение ионов Со(П)

л Cu(II) в

модельных растворах по градуировочным графикам зависимости lglp (мкА) от Ige (моль/л)

для ионов 9986 для Cu(II) с 12

которые имеют следующий вид Щ, = (0 262±0 002)1ус - (1 95±0 02) г = 0 9978 Со(Н) (пример определения - в табт 2) = (0 273±0 002)1£с + (2 62±0 01) г = С ионов Си(П) Линейная область определяемых концентраций ионов Со(Н) к

помощью амперометрического ДНК-сенсора составчяет 1 0x10 ' - 2 0x104 моть/т дчя ионов Со(Н), 10x10' - 4,0x10" мочь/л для ионов Си(И) Нижняя граница определяемых содержаний (с„) составляет 2,0х10'8 мочь/л и 4,0x10 " моль/т (зг=0,33) для ионов Со(И) и Си(Н), соответственно В таблице 3 представлены результаты определения данных ионов тяжечых металлов в модельных растворах при их совместном присутствии В случае определения более низких концентраций ионов тяжелого металла объем раствора при накоплении можно увепичить

Табчица 2

Результаты опредечения ионов Со(П) в модечьных растворах биоаффинным методом на основе амперометрического ДНК-сенсора (п=5 Р=0 95)

Введено, с х10\ моль/л Найдено, (с±8)х10< моль/л •V

0,002 0,0021 ±0,0003 0 15

0,01 0,012 ±0,002 0 13

0 05 0 049 ±0 002 0 03

0,1 0 10 ± 0 04 0 03

0,50 0 50 ±0 01 0 02

Табчица 3

Результаты опредечения Си(И) и Со(П) при совместном присутствии в модельных растворах с помощью амперометрического ДНК-сенсора _(п=5, Р=0,95)_

Введено, с х105, моль/л Найдено, (с±8)хЮ'; моль/л

Со(П) Си(Н) Со(Н) Си(Н) Со(Щ СиШ)

0,01 001 0 013 ± 0 001 0 015 ±0 002 0 06 0 10

0,1 0,1 0 И ±0,02 0,14±0,03 0,09 0,10

1,00 1,00 1 12±0 3 0.97±0 10 0 13 0,08

Таким образом предчожен биоаффинный способ опредечения чяжетыч металлов на примере ионов Со(П) и Си(П) с помощью амперометрического ДНК-сенсора который может применяться на практике для анализа разчичных объектов наряду со стандартными методиками определения так как нижние границы определяемых содержаний тяжелых металлов с помощью ДНК-сенсора позволяют определять данные эффекторы даже при очень малом их содержании в исследуемых растворах С помощью д-ИДНК-содержашего БС возможно определять и другие тяжелые металлы и оценить их потенциальную генотоксичность и мутагенность для ДНК организма

3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО АНТИБИОТИКА АДРИБЛАСТИНА С ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ДНК В СОСТАВЕ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО ДНК-СЕНСОРА НА ОСНОВЕ СРПЭ И ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЕ

При поиске новых более эффективных и менее токсичных онкопрепаратов при их получении, выяснении фармакокинетики, метаболизма и при контроле их сод ержания актуально изучение взаимодействия препаратов с ДНК и их определение В данном исследовании было оценено взаимодействие противооп\\о |евого антибиотика антрациклинового ряда на примере адриб истина с ДНК н прове гено определение с помощью ДНК-сенсора Препарат адрибластин (действующее вещество - доксорубицин) широко применяется в клинической практике для лечения различных видов злокачественных опухолей (острые лейкозы, рак молочной железы рак легкого и др) Решена задача оптимизации состава биочувствительной части сенсора при этом был учтен механизм действия данного препарата на двунитевую ДНК как интеркалятора а также его способность связываться в организме с денатурированной однонитевой ДНК за счет электростатического взаимодействия Поэтому при приготовлении биочувствительной части БС на основе ИДНК после термической денатурации ДНК проводили медленное охлаждение В результате, при сохранении одинарных цепей, образуются и фрагменты вторичной структуры т е двойных цепей ДНК за счет восстановления водородных связей либо между двумя цепями либо внутри одной спирали те происходит процесс частичной ренатурации В данном случае образуется ренатурированная ДНК или р-ДНК Затем проводили ковгшентную

иммобилизацию данной формы биомолекулы в НЦ-матрице и получали образцы

(см раздел 1) Нами было изучено комплексообразование адрибластина с молекулами р-ИДНК в составе НЦ матрицы для количественной оценки сродства эффектора именно к данной форме ДНК, а также для оптимизации разрабатываемого аналитического метода

На основе полученных данных (для достоверности получаемой информации использовали два независимых метода - СФ, ВА) методом математического моделирования с использованием программы СРЕББР рассчитаны составы комплексов доли их накопления (а) и эффективные константы устойчивости комплекса адрибластин-р-ИДНК и построены графики накопления всех значимых форм изучаемых комплексов На рис 3 приведен график по распредечению долей комплексов адрибластина с р-ИДНК Полученные дг.нные по комплексообразованию адрибластина с р-ИДНК системати¡ированы в 1 ао 1 4

р-ИДНК

Рис 3 Доли комплексов адрибчастин-р-ИДНК

1 - доля комплекса [АДРгЬ],

2 - доля комплекса [АДРЬг], сднк=0 01 мг/мл АБР рН=5 2

Из полученных данных (табл 4) видно, что проведенное исследование позволило оптимизировать состав разработанного р-ИДНК-содержащего биосенсора \становить факт эффективного связывания адрибластина с р-ИДНК и в дальнейшем дает возможность создать условия высокоэффективного концентрирования препарата на БС

Таблица 4

Результаты изучения кочплексообразования адрибластина с р-ИДНК

Форма ДНК р-ИДНК рН 5 2

Состав комплекса [АДР,Г] [АДР1.2]

Соотношение 1 2 2 1

нуклеотид препарат

18 Р>ФФ 13 8*0 5 14 4т0 2

Доля комплекса при

Садр= 1 05x10 7 моль/л 0,02 0 52

Доля комплекса при Сддр= 1,0x106 моль/л 0 89 0 11

- пара нуклеотидов

Определение константы аффинного связывания комплекса адрибластин -

р-ИДНК проводили для количественной характеристки специфичности комплексообразования методом Скетчарда К свят оценена нэ основании вольтамперометрических данных полученных по описанной выше методике (см раздел 1) Строили график в координатах [Сдик ллрИСлдр] - [Сднк \др] где [Слнк \ и>] - равновесная концентрация комплекса р-ИДНК-онкопрепарат [СЛдр] - равновесная те оставшаяся несвязанной после образования комплекса концентрация адрибластина Значение Кия) составило для адрибластина - (2 ">±0 2)х 10Л л/моль высокие значения К1ВЯ| свидетельствуют о перспективности проведения биоаффинного концентрирования препаратов данного класса на ДНК-сенсоре, возможности повышения чувствительности анализа и актуальности определения противоопухолевых препаратов этого класса с помощью биоаффинного метода

15

Юл

70 -68 -68 -64 82 60 |д с

на основе амперометрического р-ИДНК-содержащего сенсора

Разработка способа определения адриб!астина с помощью амперометрического биосенсора на основе р-ИДНК. Предлагаемый метод определения онкопрепаратов данного класса с помощью амперометрического ДНК-сенсора на основе СРПЭ основан на количественно установленном нами высоком сродстве адрибтастина к мочеку там р-ИДНК что позволяет провести эффективное концентрирование данного препарата из анализируемого раствора с малой концентрацией в том чисче из многокомпонентных биологических жидкостей Удаление фармпрепарата с поверхности БС обработкой его раствором с бочылой ионной ситой (нами бьп выбран 1 М NaCl) позволяет испочьзовать БС многократно, что делает метод более экономичным и экспрессным Аналитическим сигналом при определении адрибластина быт 1р восстановления на БС при потенциале - 0,46 В Оптимальное время концентрирования препарата на мембране с р-ИДНК составило 15 мин Оптимальное время реактивации составило 20 мин Таким образом выбраны рабочие условия определения с помощью ДНК-сенсора для сокращения времени проведения анализа без возможного ухудшения его чувствительности Уравнения градуировочного графика зависимости lgIp (мкА) от Ige (мочь/т) имеет следующий вид lg/,, = (0 117±0.002)lgc + (1,54±0 02) г = 0.9990 Линейная обчасть опречеляечых концентраций адрибтастина с помощью БС на основе р-ИДНК составляет 1 0x10 ^ - 1 ОхЮ"10 мочь/л Нижняя граница определяемых содержаний (с„) составляет 1 0x10 10 моль/л (sr= 33%) Ошибка определения не превышает 10% В случае определения более низких содержаний фармпрепарата можно увеличить объем раствора при накоплении В табл 5 представчены результаты опредечения адрибластина (фирма «Pharmacia&Upjohn», (Италия)) в модельных растворах с помощью ДНК-сенсора

Таблица 5

Результаты определения адрибластина с помощью амперометрического р-ИДНК-содержащего биосенсора (n=5 Р=0 9S)

Введено с хЮ6 моль/ч

0 0001

0,005

001

Найдено (~*5)х106 мочь/ч

I

0,00011 ±000002

0 0051 ±0 0004

0 012± 0 001

0,50

1,00

0 49 ± 0 03

1 05 ± 0 04

0 14

0 03

0 04

0 03

0 02

Таким образом, проведенное исследование позволило решить актуальну; изучения комплексообразования и дальнейшего усовершенствования биоаффинн определения онкопрепаратов - антибиотиков Разработанный метод опредечения данного класса позвочяет провести аналитический контрочь биообъектов со, адрибластин, в процессе терапевтического мониторинга

ю задачу зго метода препаратов держащих

4 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРИРОДНОГО АЛКАЛОИДА ОНКОВИНА, ОБЛАДАЮЩЕ1 О ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ, С ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ДНК В СОСТАВЕ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО ДНК-СЕНСОРА НА ОСНОВЕ СРПЭ И ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Как было сказано выше, успешное применение противоопухолевых препаратов возможно при строгом аналитическом контроле их содержания в биотогических жидкостях и лекарственных формах Актуально осуществление мониторинга фармпрепаратов для выбора адекватной индивидуальной дозировки онкопрепаратов и схемы их применения для повышения эффективности и безопасности лечения Это особенно актуально в связи с тем что в условиях клинических и биохимических лабораторий не проводится постоянного контроля за содержанием противоопчхолевых веществ в биологических жидкостях Препарат онковин (действующее вещество винкристин) является представителем др\гою класса онкопрепаратов - природным алка шитом индо ювого ряда выделенным из Caihaianihm roseus (барвинок), применяется для лечения различных видов опухолей в частности острой лейкемии и лимфогранулематоза

Поскольку, как отмечено выше механизм цитостатического действия алкалоидов, в частности онковина, аналогичен механизму действия противоопухолевых антибиотиков то при разработке ДНК-сенсора, применимого в анализе алкалоидов, использовалась выбранная выше форма ренатурированной ДНК для иммобилизации в составе БС Для количественного доказательства возможности использования формы р-ИДНК проведено изучение комплексообразования онковина с р-ИДНК 01

Рис 4 Доли комплексов онковин-р-ИДНК

1 - доля комп lehca [OHKiL]

2 - доля комплекса [ОНКЬ2], сднк=0,01 мг/мл, АБР рН=5 2

На основе вольтамперометрических дачных методом математического моделирования с использованием программы СРЕЭЭР рассчитаны доли накопления (а) и эффективные константы устойчивости (р ,фф) комплексов противоопухолевого препарата онковина с р-ИДНК и построены графики накопления всех значимых форм изучаемых комплексов Результаты изучения комплексообразования онковина с р-ИДНК представлены на рис 4 и в таблице 6

■62 -60 48 -56 -5Î -&2 -БО'дСд^

Таблица 6

Результаты изучения комплексообразования онковина с р-ИДНК

Форма ДНК р-ИДНК pH 5,2

Состав комплекса [OHKL2*] [OHKjL]

Соотношение нуклеотил препарат 2 1 I 3

Р*м> 15 2 to 8 19 5-i0 4

Дочя компчекса при Сонк = 7,5х 10 7 моль/л 0,63 0,32

Доля комплекса при сонк = 2,5x106 молъ/л 00) 0 99

р-ИДНК.

ковина с

ньше. чем труктур и

L' - пара нуклеотиюв

Определение константы аффинного связывания комплекса онковин -

Для количественной характеристки специфичности комплексообразования ок р-ИДНК провели также определение методом Скетчарда константы аффинного СЕ:язывания Ксвн оценивали по полученным вольтамперометрическим данным по описанной выше методике (см раздел 1) Строили графики в координатах [Сдпк-опк]/[Сонк] - [Сдн [Сднк-онк] - равновесная концентрация комплекса р-ИДНК-онковин, [Сонк] - равновесная те оставшаяся несвязанной после образования комплекса концентрация препарата Значение Кс,яз составило для онковина - (5,0=0 4)х10* л/моль Данное значение ме для комплекса адрибластин-р-ИДНК что по-видимому объясняется различием с молекулярных весов данных препаратов

Разработка способа определения онковина с помощью амперометрического биосенсора на основе р-ИДНК Предлагаемая методика определения противоопухолевого алкалоида индолового ряда онковина с помощью амперометрического ДНК-содержащего БС основана на количественно установленном нами высоком сродстве онковина к молекулам р-ИДНК, что также позволяет провести эффективное концентрирование препарата данного класса из анализируемого раствора с малой концентрацией в том многокомпонентных биологических жидкостей Удаление онковина с поверх обработкой его раствором 1 М NaCi позволяет повторно использовать БС при дальнейших анализах Аналитическим сигналом при определении онковина был 1Р восстановления на БС при потенциале - 0,9 В Оптимальное время концентрирования, также как и оп время реактивации мембраны составило 20 минут Для онковина уравнение градуи графика зависимости lgIp (мкА) от Ige (моль/л) имеет вид lgIp = (0,327±0 01 )lgc + (2 31±0,21), г = 0,9992 Данный график использовали для определения неизвестной концентрации онкопрепарата Результаты определения онковина в составе препарата «Онковин» (фирма «Lilly France SA» (Франция)) с помощью амперометрического р-ИДНК-содержашего БС

18

числе из ности БС

:тимальное ровочного

представлены в таблице 7 Линейная область определяемых концентраций онковина с помощью амперометрического БС на основе р-ИДНК составляет 1 (КЮ* - 2 Ох 104 моль/л Нижняя граница определяемых содержаний составляет 2 0\ 10 4 моль/л (Б, =• 31%) В случае определения низких концентраций онковина объем раствора можно увеличить на этапе концентрирования его на мембране БС

Таблица 7

Результаты определения онковина с помощью амперометрического р-ИДНК-содержащего БС (п=5 Р=0 95)

Введено сх10\ моль/л Найдено (с±5)х10'' моль/л V

0 0005 0 00053 ±0 00008 0 12

0 005 0 0052 ± 0 0003 0 05

0,01 0 013 ±0 001 0 06

0,50 0 51 ± 0 03 0 05

1,00 1 06 ±0,05 0,04

Таким образом, результаты изучения процесса комплексообразования фармпрепарата выбранного класса с р-ИДНК найденные оптимальные условия проведения анализа широкий диапазон определяемых содержаний во!можносль селективною определения онковина в присутствии электрохимически неактивных компонентов матрицы либо восстанавливающихся в иной области потенциалов позволяют использовать разработанный амперометрический ДНК-сенсор как новое средство биохимического контроля за содержанием данных онкопрепаратов в многокомпонентных биолси ических системах, в том числе в сыворотке крови человека и в лекарственных формах чанного препарата, что актуально на стадии контроля произволе 1ва и сроков юдности готового продукта

5. ПРИМЕНЕНИЕ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ ДНК-СЕНСОРОВ В АНАЛИЗЕ РЕАЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ

Для оценки аналитических возможностей амперометрических ДНК-сенсоров на основе СРПЭ, содержащих денатурированную, либо ренатурированную ДНК они быта применены в анализе реальных объектов

При определении тяжелых металлов в природной и питьевой во тс и сыворотке крови человека была адаптирована методика на основе д-ИДНК-сенсора Оценено влияние матричных компонентов сыворотки крови на определения (табл 8)

Некоторые результаты определения тяжелых металлов представлены в табл 9 Достаточная разница потенциалов восстановления комплексонатов Со(11) и Си(П) а также \сланрвленный факт независимой сорбции этих ионов при совместном присутствии позволяют определять эти металлы в многокомпонентных системах в частности в сыворотке крови при их совестном присутствии что является важным при диагностике анемии

Способ определения данных ионов металлов с помощью д-ИДНК-содержкцего БС отличается селективностью, хорошей воспроизводимостью простотой пробоподготовки достаточной экспрессностью и требует минимальный объем пробы Данная методика может быть использована как дополнительная к известным методам контроля за содержанием кобальта и меди в различных объектах анализа, при необходимости возможна дополнительная пробоподготовка

Таблица 8

Влияние матричных компонентов на результаты определения

7,5x10 моль/л ионов Со(Н) с помощью амперометрического ДНК-сенсора

Соотношение Со(П) М Найдено (с± 6) х108, моль/л

11 М = Ме(11), Ре(Ш), гп(П), А1(1П), Си(Н) 7 4±0,2 0 02

1 5 М = 1^(11), Ре(Ш), гп(Н) 7,5 ±0,3 0,03

I 10М = Мв(И), гп(Н) 7,6±0 1 001

1 юо м = ме(П) 7 3 ± 0 3 0 03

Для оценки возможности использования разработанного амперометрического р-ИДНК-сенсора как нового инструмента биохимического анализа при определении фармпрепаратов была разработана методика определения адрибластина и огковина в реальных объектах - в сыворотке крови человека (некоторые результаты представлены в табл 10) Разработанный метод был использован также для определения целевых компонентов - адрибластина и онковина - в инъекционной форме препарата в присутствии компонентов лекарственных форм с целью контроля состава готовой продукции [табл 11) Была проведена оценка мешающего влияния на результаты определения присутствующих в данной лекарственной форме других компонентов (лактоза, метилгидроксибензоат) Установлено, что сопутствующие компоненты электрохимически неактивны и не мешают определению целевых компонентов (адрибластина и онковина) так как эти вещества не являются эффекторами ДНК В сл\чае возможного мешающею действия компонентов матрицы возможно проведение дополнительной пробоподготовки

Как видно из таблицы 11 случайная погрешность незначима и не превышает 10%

Таблица 9

Результаты определения Со(И) и Си(П) в реальных объектах с помощью амперометрического ДНК-сенсора (п=5, Р=0,95, ^„=2,78, Р,абл=б,39)

Анализируемый объект металл Вольтамперометрия с ДНК-сенсором Контрольный метод 1расч р 1 рас 1

Найдено, (с ± 8) «г Найдено,(с+6) «г

Речная вода Со(И) (0,б±0,02)хЮ 4 мг/мл 0,02 (0,8±0,03)х104 мг/мл* 0,03 2,62 1.50

Питьевая вода Со(Н) (5,1 ±0,3)х107 моль/л 0,05 (5,6±0,4)х107 моль/л* 0 04 1 51 2 33

Озерная вода Си(И) (0,21±0,01)х103 мг/мл 0,04 (0,22±0,03)х10° мг/мл* 0,10 1,15 1,33

Сыворотка 1 Со(Н) (5,1±0,3)х107 моль/л 0,05 (5,4±0,1)х107 моль/л" 0,01 1,49 3 00

Сыворотка 2 Со(И) (3,7±0,1)х108 моль/л 0,02 (3,4±0,2)х10 8 моль/л* 0,05 1,73 2,38

Сыворотка 2 Си(Н) (3,4±0,2)х105 моль/л 0,11 (3,1±0,5)х105 моль/л* 0,13 1,13 2,50

*- атомно-абсорбционная спектрометрия,»-спектрофотометрия

Таблица 10

Результаты определения адрибластина и онковина в сыворотке крови

с помощью амперометрического ДНК-сенсора (п-5, Р=0,95)_

Анализируемый объект Вольтамперометрия с ДНК-сенсором

Найдено, АДР, с±5 «г Найдено, ОНК, ~с±5

Сыворотка 1 (1,4±0,2)х108 моль/л 0,07 (2,4±0,3)х108 моль/л 0,10

Сыворотка 2 (2,1±0,3)х10"9 моль/л 0,07 (0,23±0 02)х10-8 моль/л 0,07

Сыворотка 3 (0,8±0,1)х108 моль/л 0,06 (2,1 - 0,4)х10~8 моль/л 0,15

Сыворотка 4 (5,3±0,4)х10 9 моль/л 0,06 (4,5±0,3)х10"9 моль/л 0,05

Сыворотка 5 (2,4±0,2)х108 моль/л 0,04 (1,3±0,2)х108 моль/л 0,12

Таблица 11

Результаты определения адрибластина и онковина в лекарственных формах с помощью амперометрического р-ИДНК-содержащего БС (п=5, Р=0.95)

Фармпрепарат Лекарственная форма Аттестованное количество (по НД) Найдено, с±8 Эг

Адрибластин Инъекции 2 мг/мл 2,2±0,2 мг/мл 0,07

Онковин Инъекции 0,2 мг/мл 0,25±0,01 мг/мл 0,03

Таким образом, в настоящей работе продемонстрированы примеры изучения взаимодействия и определения эффекторов ДНК различной природы с помощью преда биоаффинных способов с использованием амперометрических ДНК-сенсоров на основе стационарные электродов Разработанные способы селективны, экспрессны и высокочувствительны, что позволило использовать их в анализе модельных систем и реальных образцов на содержание выбранных эффекторов (тяжелых металлов и противоопухолевых прег аратов интеркаляторов различных классов)

ВЫВОДЫ

Установлены составы и доли комплексов и получены количественные характгристики процессов взаимодействия тяжелых металлов на примере ионов Со(И) с денатурированной иммобилизованной ДНК (д-ИДНК) в составе НЦ мембраны и взаимодействия противоопухолевых препаратов - интеркаляторов на примере адрибластина и онкови-на с ренатурированной иммобилизованной ДНК (р-ИДНК) Определены константы аффинного связывания комплексов эффектор-ИДНК Показана целесообразность использования формы д-ИДНК в качестве аналитического реагента в составе БС на ос нове СРПЭ при определении тяжелых металлов и формы р-ИДНК при определении цитостатиков

Выявлено меньшее сродство ионов Со(Н) к д-ИДНК по сравнению с ионами Си(Н) как в условиях адсорбции из индивидуальных растворов, так и при адсорбции при соотношении концентраций ионов этих металлов в растворе 1 1, доказана возможность их селективного определения при совместном присутствии

Предложены биоаффинные селективные способы определения кобальта (II) и кобальта (II) и меди (II) при совместном присутствии с помощью амперометрич;ского д-ИДНК-сенсора на основе СРПЭ с использованием биоспецифического мембранного концентрирования на биосенсоре и реактивации биосенсора для его многократного использования Широкий линейный диапазон определяемых содержаний позволяет использовать ДНК-сенсор как новое средство биохимического и экоанали' ического контроля для определения тяжелых металлов с с„=2,0х10~8 моль/л для ионов Со(Н) и с с„=4,0х10 " моль/л для ионов Си(П)

Предложены биоаффинные способы определения противоопухолевых препаратов различных классов антибиотиков на примере адрибластина и природных алкалоидов на примере онковина с помощью разработанного амперометрического р-ИДНК-

сенсора на основе СРПЭ с использованием биоспецифического мембранногэ концентрирования на БС, выявлены условия функционирования и реактивации БС для многократного применения, позволяющие использовать ДНК-сенсоры как новое средство

биохимического контроля для определения выбранных противоопухолевых препаратов с с„ = 1,0x10 10 моль/л для адрибластина, сн = 2,0x10"9 моль/л для онковина 5 На основе амперометрических ДНК-сенсоров разработаны высокочувствительные методики анализа воды (природной и питьевой) и сыворотки крови человека на содержание Со(П) и Cu(II), в том числе при их совместном присутствии, а также адрибластина и онковина Определению не мешают сопутствующие матричные компоненты, в частности ионы металлов до соотношения 1 100 при определении Со(П) и Си(П) и компоненты сыворотки крови и лекарственной формы при определении онкопрепара-тов При сравнении полученных результатов с контрольными методами установлено что систематическая погрешность незначима

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1 Бабкина С С Определение противоопухолевого антибиотика доксорубицина с помощью амперометрического биосенсора на основе иммобилизованной ДНК / С С Бабкина, Е Н Моисеева, НА Улахович//Фармация -2006 -№ 5 - С 9-11

2 Бабкина С С Взаимодействие иммобилизованной ДНК с адрибластином и ионами кобальта (II) и их определение биоаффинными методами, основанными на использовании амперометрического ДНК-сенсора / С С Бабкина, Е Н Моисеева, Н А Улахович // Вестник Казанского технологического университета -2006 - №2 - С 211-218

3 Бабкина С С Изучение взаимодействия с ДНК и определение противоопухолевого препарата онковина с помощью амперометрического биосенсора на основе иммобилизованной ДНК / С С Бабкина, Е Н Моисеева, Н А Улахович, Ю И Сальников // Вестник Казанского технологического университета -2007 -№2 -С 46-51

4 Бабкина С С Амперометрический сенсор на основе дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) для определения ДНК / С С Бабкина, Н А Улахович, Ю И Зявкина, Е Н Моисеева // Междунар конференция «Сенсор-2000» Сенсоры и микросистемы Тез докл - С Петербург, 2000 - С 123-124

5 Моисеева Е Н Амперометрический биосенсор на основе иммобилизованной ДНК и его использование для определения тяжелых металлов / Е Н Моисеева // Тез докладов Международной конференции «Ломоносов-2000» - Москва, 2000 - С 184

6 Моисеева Е Н Амперометрический биосенсор на основе иммобилизованной ДНК и его использование для определения тяжелых металлов / Е Н Моисеева// Тез докладов Итоговой студенческой научной конференции КГУ - Казань, 2000 - С 48

7 Бабкина С С Контроль содержания тяжелых металлов в воде и продуктах питания путем их концентрирования на биосенсоре, содержащем дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) / С С Бабкина, НА Улахович, ЕН Моисеева, ЕЕФилюшина // Материалы и тез докладов региональной научной конференции «Методы аналитического контроля материалов и объектов окружающей среды» - Пермь, Изд-во Пермского университета 2001 - С 120

8 Бабкина С С Определение ионов тяжелых металлов и комплексов платины в крови человека с помощью иммобилизованной дезоксирибонуклеиновой ки< ставе биосенсора / С С Бабкина, Н А Улахович, Е Н Моисеева, Ю И Зявкиь люшина / Тез докл Междисциплинарной конференции с международным уч, вые биокибернетические и телемедицинские технологии 21-го века для диагнс чения заболеваний человека» НБИТТ-21 - Петрозаводск, 2002 -С 64

9 Бабкина С С Определение ионов железа(Ш) в сыворотке крови с помощью и ванной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в составе биосенсора / С Н А Улахович, Е Н Моисеева, Е Е Филюшина // 2-я Российская научная ъ Всероссийской конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной ской химии» - Пермь, 2002 - С 86-87

10 Бабкина С С Биоаффинные методы, основанные на использовании ампером ДНК-биосенсора, для изучения взаимодействия и противоопухолевых препар сичных металлов с ДНК и для их определения / С С Бабкина, Е Н Моисеев! хович // Материалы Междунар научной конфер «Химия, химическая технол* технология на рубеже тысячелетий» - Томск, 2006 - Т 2, С 332-334

11 Бабкина С С Амперометрический анализ экологических объектов с помо сенсора на содержание тяжелых металлов как генотоксичных эффекторов ДН С С , Моисеева Е Н , Улахович НА// Тез докл Всероссийской конференции тика-2006» - Самара, 2006 - С 68

12 Babkina S S Amperometnc DNA biosensor for investigation of Co(II)-DNA int cobalt assay / S S Babkina, E N Moiseeva, N A Ulakhovich // Abs International analytical sciences ICAS-2006 - Moscow, 2006 - С 834

сыворотке .{лоты в со-а. Е Е Фи-астием «Но-стики и ле-

ммобитизо-Г Бабкина, нференция аналитиче-

етрического атов и ток, Н А Ула-огия и био-

щью ДНК-К / Бабкина «Экоанали-

;raction and congress on

Отпечатано в ООО «Печатный двор» г Казань,yi Журналистов, 1/16, оф 207

Тел 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51 Пииеншя ПД№7-0215 от 0111 2001 г Выдана Поволжским межрегиональны и территориальным управ чепиеч МПТР РФ Подписано в печать 17 04 2007г Уел п л 1,5 Заказ № К-6361 Тираж 100 экз Формат 60x841/16 Бу мага офсетная Печать - ризография

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1. ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ДНК И ЕЕ ЭФФЕКТОРОВ В ОРГАНИЗМЕ И ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ, В ТОМ ЧИСЛЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДНК-БИОСЕНСОРОВ (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)

1.1. Роль ДНК в организме человека. Взаимодействие ДНК с ионами металлов и их комплексами

1.2 Биологическая роль кобальта и меди в организме человека и их действие на ДНК

1.3. Взаимодействие ДНК с антибиотиками и алкалоидами, обладающими противоопухолевой активностью

1.3.1. Методы для изучения взаимодействия противоопухолевых препаратов с ДНК и для их определения

1.4. Биохимический процесс гибридизации ДНК и его 35 использование в аналитических целях

1.5. Электрохимические методы определения эффекторов ДНК на основе ДНК-биосенсоров

1.5.1. Иммобилизация ДНК и ее фрагментов

1.5.2. Электрохимические методы определения металлов, в том числе, на основе ДНК-сенсоров

1.5.3. Электрохимические методы определения антибиотиков и алкалоидов, в том числе, на основе ДНК-сенсоров

1.5.4. Электрохимические методы изучения процесса 54 гибридизации на основе ДНК-сенсоров (геносенсоров)

2. ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ, АППАРАТУРА, ОБЪЕКТЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ

ЭКСПЕРИМЕНТА

2.1. Постановка задачи

2.2. Аппаратура, объекты исследования

2.3. Приготовление биочувствительной части амперометрических ДНК-сенсоров

2.3.1. Методика иммобилизации д-ДНК

2.3.2. Методика иммобилизации р-ДНК

2.4. Обработка спектрофотометрических данных комплексообразования тяжелых металлов с д-ИДНК

2.5. Методика построения изотерм адсорбции ионов тяжелых металлов с помощью амперометрического ДНК-сенсора

2.6. Методика определения констант аффинного связывания комплексов М(Н) - д-ИДНК и фармпрепарат - р-ИДНК и 62 эффективных констант устойчивости комплексов фармпрепарат - р-ИДНК

3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ С ДНК:

КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЕ С ИММОБИЛИЗОВАННОЙ

ФОРМОЙ ДНК И БИОАФФИННАЯ СОРБЦИЯ НА ДНК

СОДЕРЖАЩЕЙ МЕМБРАНЕ БИОСЕНСОРА.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ С ПОМОЩЬЮ

ДНК-СЕНСОРА НА ОСНОВЕ СРПЭ

3.1. Комплексообразование ионов тяжелых металлов с денатурированной иммобилизованной ДНК на примере 63 ионов Со(П)

3.2. Биоаффинная сорбция тяжелых металлов на д-ИДНК-содержащей мембране

3.3. Определение константы аффинного связывания 74 комплекса Co(II) - д-ИДНК

3.4. Разработка способа определения ионов Со(Н) и ионов Со(И) и Cu(II) при совместном присутствии с помощью 78 амперометрического биосенсора на основе д-ИДНК

3.4.1. Выбор оптимальных условий определения тяжелых металлов с помощью амперометрического биосенсора на основе д-ИДНК

3.4.2. Методика определения ионов тяжелых металлов в модельных растворах с помощью амперометрического ДЫК-сенсора

4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО АНТИБИОТИКА АДРИБЛАСТИИА С ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ДНК В СОСТАВЕ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО ДНК-СЕНСОРА НА ОСНОВЕ СРПЭ И ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЕ

4.1. Выбор формы ДНК для иммобилизации в составе амперометрического ДНК-сенсора и изучение комплексообразования противоопухолевых препаратов с иммобилизованной ДНК

4.2. Электрохимическое и спектрофотометрическое изучение комплексообразования адрибластина с ренатурированной иммобилизованной ДНК (р-ИДНК)

4.3. Определение константы аффинного связывания комплекса адрибластин - р-ИДНК

4.4. Разработка способа определения противоопухолевых препаратов с помощью амперометрического биосенсора на основе р-ИДНК

4.4.1. Выбор оптимальных условий определения фармпрепаратов с помощью амперометрического 98 биосенсора на основе р-ИДНК

4.4.2. Методика определения адрибластина и онковина в модельных растворах с помощью амперометрического ДНК-сенсора

5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРИРОДНОГО АЛКАЛОИДА ОНКОВИНА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ 103 АКТИВНОСТЬЮ, С ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ДНК В СОСТАВЕ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО ДНК-СЕНСОРА НА ОСНОВЕ СРПЭ И ЕГО ОПРЕДЕЛЕНИЕ

5.1. Электрохимическое изучение комплексообразования 104 онковина с ренатурированной иммобилизованной

ДНК (р-ИДНК)

5.2. Определение константы аффинного связывания 108 комплекса онковин - р-ИДНК

5.3. Разработка способа определения онковина с 109 помощью амперометрического БС на основе р-ИДНК

5.3.1. Выбор оптимальных условий определения онковина с 110 помощью амперометрического ДНК-сенсора

5.3.2. Методика определения онковина с помощью 112 амперометрического ДНК-сенсора на основе СРПЭ

6. ПРИМЕНЕНИЕ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ

ДНК-СЕНСОРОВ В АНАЛИЗЕ РЕАЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ

6.1. Применение амперометрического ДНК-сенсора в анализе природных вод и биологических объектов на 115 содержание ионов Co(II) и Cu(II)

6.2. Применение амперометрического ДНК-сенсора в анализе сыворотки крови на содержание 120 адрибластина и онковина

ВЫВОДЫ

Актуальность темы. Определение и изучение взаимодействия эффекторов ДНК различной природы является актуальной проблемой современной аналитической химии. К таким эффекторам относятся, в частности, тяжелые металлы и противоопухолевые препараты. Эти эффекторы имеют высокое сродство к молекулам ДНК организма, поэтому их определение с помощью ДНК как аналитического реагента и ДНК-содержащих аналитических систем очень перспективно и актуально.

Известно, что тяжелые металлы, попадая в организм из среды промышленных предприятий и природных вод, вызывают повреждения в цепи ДНК, что говорит о потенциальной мутагенности и генотоксичности даже таких металлов, которые до недавнего времени считались относительно безопасными, например меди и кобальта. С одной стороны, эти металлы являются необходимыми (эссенциальными) для организма, так как они, наряду с железом, принимают участие в образовании гема и их недостаток приводит к развитию злокачественных анемий. С другой стороны, содержание данных тяжелых металлов в биосфере должно строго контролироваться, согласно решению Целевой группы по выбросам Европейской экономической комиссии ООН и данные металлы признаны генотоксичными Межународным агентством по исследованию раковых заболеваний, поскольку возможна интоксикация организма данными тяжелыми металлами при массовых выбросах на производстве, а также при нарушениях в биохимических процессах организма, приводящих к денатурации ДНК клеток. В этом плане особенно актуальна проблема исследования малоизученной системы эффектор-денатурированная односпиральная ДНК (д-ДНК), которая максимально адекватно моделирует процессы, происходящие в организме под действием денатурирующих агентов. Результаты таких исследований могли бы помочь в предсказании механизма такого воздействия и в выборе детоксикантов.

Эффекторами ДНК являются также цитостатики противоопухолевые препараты, которые прочно связываются с ее цепями и подавляют синтез ДНК раковых клеток. Однако с целью снижения возможных побочных эффектов и подбора правильной индивидуальной дозировки препаратов, выяснения их фармакокинетики является актуальным определение фармпрепаратов в многокомпонентных биологических жидкостях, в том числе в сыворотке крови человека.

В эколого-аналитическом мониторинге тяжелых металлов и в анализе противоопухолевых препаратов применяется ряд стандартных методов для определения данных эффекторов в объектах окружающей среды и в биологических жидкостях (кровь, сыворотка, моча) - это методы масс-спектрометрии, атомно-абсорбционной спектрометрии, спектрофотометрии и др. Однако применение их на практике имеет ряд недостатков, например дорогостоящее оборудование, длительность проведения анализа и пробоподготовки и др.

В случае мониторинга противоопухолевых препаратов в условиях отечественных клинических лабораторий регулярного контроля за содержанием данных фармпрепаратов в сыворотке крови пациентов не проводится.

Электрохимические биосенсоры на основе ДНК позволяют изучать взаимодействие эффекторов с ДНК и определять их достаточно быстро, без дорогостоящего оборудования, без длительной пробоподготовки, достаточно специфично и селективно, на уровне малых концентраций.

Таким образом, актуальна разработка биоаффинных методов определения различных эффекторов ДНК на основе амперометрических ДНК-сенсоров.

Цель исследования. Разработка и оптимизация биоаффинных способов определения эффекторов ДНК различной природы - тяжелых металлов на примере ионов кобальта (II), в том числе при совместном присутствии на примере ионов кобальта (II) и меди (II), а также противоопухолевых препаратов - антибиотика адрибластина и алкалоида онковина амперометрическими ДНК-сенсорами на основе стационарных электродов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• получить количественные характеристики процесса комплексообразования эффекторов с различными формами иммобилизованной ДНК с целью оптимизации биоаффинных методов их определения;

• выяснить роль специфической адсорбции тяжелых металлов в процессе их мембранного концентрирования на БС и определение аффинной константы связывания ионов кобальта (II) с иммобилизованной на мембране д-ДНК (д-ИДНК);

• на основании полученных данных разработать биоаффинный способ определения кобальта(П) в присутствии матричных компонентов в модельных растворах и реальных образцах природной воды и сыворотки крови с помощью д-ИДНК-содержащего БС;

• разработать биоаффинный способ определения антибиотика антрациклиновой группы на примере адрибластина с помощью р-ИДНК-содержащего БС на основе СРПЭ в модельных растворах и в образцах сыворотки крови;

• разработать биоаффинный способ определения алкалоида индолового ряда на примере онковина с помощью р-ИДНК-содержащего БС на основе СРПЭ в модельных растворах и в образцах сыворотки крови.

Научная новизна полученных в диссертации результатов заключается в том, что

• получены количественные характеристики комплексообразования денатурированной иммобилизованной ДНК с ионами тяжелых металлов и эффективные константы устойчивости и доли комплексных форм для ионов кобальта (II) и константы аффинного связывания ионов кобальта (II) для целенаправленной разработки способа определения тяжелых металлов с помощью амперометрического ДНК-сенсора на основе стационарного ртутно-пленочного электрода (СРПЭ);

• рассчитана максимальная сорбционная емкость биочувствительной части ДНК-сенсора и установлена возможность определения кобальта (II) и меди (II) при совместном присутствии на основании изотерм биоаффинной сорбции ионов металлов на ДНК-модифицированной мембране;

• получены количественные характеристики комплексообразования молекул цитостатиков - интеркаляторов, с иммобилизованной ренатурированной ДНК, подтверждающие целесообразность использования выбранной формы ДНК при иммобилизации в составе ДНК-сенсора на основе СРПЭ;

• предложен биоаффинный способ селективного определения тяжелых металлов на примере ионов кобальта (II) и меди (И) с помощью д-ИДНК-содержащего БС на основе СРПЭ;

• разработан биоаффинный способ определения противоопухолевого антибиотика антрациклиновой группы адрибластина с помощью р-ИДНК-содержащего БС на основе СРПЭ;

• разработан биоаффинный способ определения природного алкалоида онковина, обладающего противоопухолевой активностью, с помощью р-ИДНК-содержащего БС;

• установлены оптимальные условия использования разработанных способов определения тяжелых металлов и фармпрепаратов в сыворотке крови при диагностике заболеваний, а также тяжелых металлов в природных объектах при экологическом мониторинге.

Практическая значимость. На основе полученных ДНК-сенсоров разработаны биоаффинные способы определения тяжелых металлов и фармпрепаратов. Использование этих способов позволяет определять токсиканты на уровне ПДК и меньших концентраций и судить об их потенциальной мутагенной и канцерогенной активности. Анализ образцов на содержание фармпрепаратов необходим при контроле их качества в процессе фармпроизводства и в сыворотке крови пациентов в процессе терапевтического мониторинга.

Разработанные методики анализа просты, относительно дешевы, требуют очень малый объем образцов. Правильность разработанных методик установлена сравнением со стандартными независимыми методами. Методики определения апробированы при анализе реальных образцов. Представляет интерес использовать данные ДНК-сенсоры в анализе образцов природной воды и биологических жидкостей в условиях медицинских лабораторий и лабораторий эколого-аналитического контроля. На защиту автор выносит:

• обоснование выбора формы молекул ДНК для иммобилизации в составе биосенсора на основании исследования комплексообразования кобальта (II) и противоопухолевых препаратов с различными формами ДНК;

• результаты изучения специфической адсорбции ионов Со(П) на ДНК-содержащей мембране в составе биосенсора, а также при совместной адсорбции ионов Со(П) и Cu(II;

• способ определения кобальта (II) и меди (II) с помощью амперометрического биосенсора на основе выбранной формы иммобилизованной денатурированной ДНК и СРПЭ;

• биоаффинные способы определения противоопухолевых препаратов - интеркаляторов различной природы (антибиотиков и алкалоидов) с помощью амперометрического биосенсора на основе иммобилизованной ренатурированной ДНК и СРПЭ;

• выбор оптимальных параметров работы ДНК-сенсоров: времени концентрирования, времени реактивации, рН, условий реактивации;

• аналитические и метрологические характеристики методик анализа различных объектов на содержание тяжелых металлов и фармпрепаратов.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на международных и российских конференциях и изложены в материалах: Международной конференции «Ломоносов-2000» (Москва, 2000), Поволжской конференции по аналитической химии (Казань, 2001), Итоговой научной студенческой конференции КГУ (Казань, 2000), Всероссийской конференции «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2001), Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006), Всероссийской конференции «Экоаналитика-2006» (Самара, 2006), Международного конгресса по аналитической химии ICAS-2006 (Москва, 2006). Публикации. По тематике диссертационной работы опубликовано 11 работ. Из них 4 статьи в научных журналах и 7 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях.

Настоящая работа является частью исследований проводимых на кафедре неорганической химии Казанского государственного университета в рамках темы Министерства образования и науки РФ «Координационные соединения Зё-переходных, платиновых и редкоземельных металлов, термодинамика и кинетика образования в различных средах, синтез строение, свойства, направления практического использования» (per. № 01.960002010). Структура и объем работы. Диссертация изложена на 143 страницах, содержит 18 таблиц, 27 рисунков и библиографию, включающую 166 ссылок. Диссертационная работа состоит из введения и шести глав: обзора литературы, экспериментальной части, четырех глав результатов и их обсуждения, а также выводов и списка используемой литературы.

ВЫВОДЫ:

1. Установлены составы и доли комплексов и получены количественные характеристики процессов взаимодействия тяжелых металлов на примере ионов Со(П) с денатурированной иммобилизованной ДНК (д-ИДНК) в составе НЦ мембраны и взаимодействия противоопухолевых препаратов - интеркаляторов на примере адрибластина и онковина с ренатурированной иммобилизованной ДНК (р-ИДНК). Определены константы аффинного связывания комплексов эффектор-ИДНК. Показана целесообразность использования формы д-ИДНК в качестве аналитического реагента в составе БС на основе СРПЭ при определении тяжелых металлов и формы р-ИДНК при определении цитостатиков.

2. Выявлено меньшее сродство ионов Co(II) к д-ИДНК по сравнению с ионами Cu(II) как в условиях адсорбции из индивидуальных растворов, так и при адсорбции при соотношении концентраций ионов этих металлов в растворе 1:1; доказана возможность их селективного определения при совместном присутствии.

3. Предложены биоаффинные селективные способы определения кобальта (II) и кобальта (II) и меди (II) при совместном присутствии с помощью амперометрического д-ИДНК-сенсора на основе СРПЭ с использованием биоспецифического мембранного концентрирования на биосенсоре и реактивации биосенсора для его многократного использования. Широкий линейный диапазон определяемых содержаний позволяет использовать ДНК-сенсор как новое средство биохимического и экоаналитического контроля для определения тяжелых металлов с с„=2,0х10"8 моль/л для ионов Со(П) и с с„=4,0х10"11 моль/л для ионов Cu(II).

4. Предложены биоаффинные способы определения противоопухолевых препаратов различных классов: антибиотиков на примере адрибластина и природных алкалоидов на примере онковина с помощью разработанного амперометрического р-ИДНК-сенсора на основе СРПЭ с использованием биоспецифического мембранного концентрирования на БС; выявлены условия функционирования и реактивации БС для многократного применения, позволяющие использовать ДНК-сенсоры как новое средство биохимического контроля для определения выбранных противоопухолевых препаратов с с„ = 1,0x10'10 моль/л для адрибластина, си = 2,0x10"9 моль/л для онковина.

5. На основе амперометрических ДНК-сенсоров разработаны высокочувствительные методики анализа воды (природной и питьевой) и сыворотки крови человека на содержание Со(Н) и Cu(II), в том числе при их совместном присутствии, а также адрибластина и онковина. Определению не мешают сопутствующие матричные компоненты, в частности ионы металлов до соотношения 1:100 при определении Со(П) и Cu(II) и компоненты сыворотки крови и лекарственной формы при определении онкопрепаратов. При сравнении полученных результатов с контрольными методами установлено, что систематическая погрешность незначима.

1. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот/ В.Зенгер. М.: Мир.-1987.-584 с.

2. Anderson C.F. Sodium-23 NMR studies of cation-DNA interaction / C.F.Anderson, M.T.Record, P.A.Hart // Biophys. Chem.-1978.-V. 7, №4.- P. 301-316.

3. Касьяненко H.A. Исследование молекулярного механизма взаимодействия ДНК с двухвалентными ионами/ Н.А.Касьяненко, Н.Е.Дьяконова, Э.В.Фрисман // Молекуляр. биология. 1989.-Т. 23, № 4.-С. 835-841.

4. Исидоров В.А. Введение в химическую экотоксикологию / В.А. Исидоров // Учеб. пособие. СПб: Химиздат. - 1999. - 144 с.

5. Благой Ю.П. Металлокомплексы нуклеиновых кислот в растворах / Ю.П. Благой, В.Н. Галкин, Г.О. Гладченко.- Киев: Наукова думка, 1991.- 372 с.

6. Неорганическая биохимия / Под.ред. Г.Эйхгорна.-М.: Мир, 1978.- Т.2.- 736 с.

7. Яцимирский К.Б. Константы устойчивости комплексов металлов с биолигандами / К.Б.Яцимирский, Е.Е. Крисс, В.Л.Гвяздовская. Киев: Наукова думка, 1979.-228 с.

8. Kornilova S.V. Effect of metal ions on DNA conformation and their biological action on genetic structures of cells / S.V. Kornilova, Yu.P. Blagoy, I.P. Moskalenko // Stud. Biophys.-1988.-V. 123, № 2.-P. 7784.

9. Zimmer Ch. Interaction of zinc(ll) ions with native DNA / Ch.Zimmer // Stud. Biophys.-1973 .-V. 35, № 2.-P. 115-121.

10. Брегадзе В.Г. Интерпретация ультрафиолетовых дифференциальных спектров ДНК в комплексе с некоторыми ионами первого переходного ряда / В.Г.Брегадзе // Биофизика.-1974.-Т. 19, № 1.-С. 179-181.

11. Petri I. Application of matrix rank analysis to the binding of copper(II) ions with DNA and acridine orange with a polyphosphate / I.Petri, W.Forster, G.Lober // Stud. Biophys.-1974.-V. 45, № l.-P. 61-74.

12. Fritzsche H. New results about the copper(II)-DNA complex /

13. H.Fritzsche // Stud. Biophys.-1970.-V. 21/22, № 5.-P. 315-320.

14. Sissoeff J. Studies of metal ions-DNA interactions: Specific behaviour of interactive DNA sequences / J.Sissoeff, J.Grisvaid, E.Guite // Progr. Biophys. and Mol. Biol.-1976.-V. 31, № 2.-P. 165-199.

15. Kantz G.P.P. A nuclear magnetic resonance relaxation time study of the manganese(II) inosine-5-triphosphate complex in solution / G.P.P.Kantz, G.A.Kotowyez // Biochemistry.-1975. V. 14, P. 41444150.

16. Андроникашвили Э.Л. Малигнизация и изменение некоторых физико-химических свойств биомакромолекул и надмолекулярных структур / Э.Л.Андроникашвили // Биофизика,-1987.-Т. 32, № 5.-С. 782-799.

17. Eichgorn G.L. Interaction of metal ions with polynucleotides and related compounds. The relative effect of various metal ions on DNA helity / G.L.Eichgorn, Y.A.Shin // J. Amer. Chem. Soc.-1968.-V. 90, № 26.-P. 7323-7328.

18. Sorokin V.A. Studies of formation of bivalent copper complexes with native and denatured DNA / V.A.Sorokin, Yu.P.Blagoi, V.A.Valeev // J. Inorg. Biochem.-1987.-V. 30, № 2.- 87-101.

19. Eichhorn G.L. Interactions of metal ions with polynucleotides and related compounds. The binding of copper(II) to nucleosides, nucleotides and deoxyribonucleic acids / G.L.Eichhorn, P.Clark, E.D.Becker // Biochemistry.- 1976.- V. 5, № 2,- P. 246-253.

20. Кантор Ч. Биофизическая химия: в 3 т. / Ч.Кантор, П.Шиммел-М.: Мир, 1985.-Т. 3.-536 с.

21. Venner Н. Studies on nucleic acids changes in the stability of DNA secondary structure by interaction with divalent metal ions / H.Venner, Ch.Zimmer // Biopolymers.- 1966.-V. 4, № 2,- P. 321-335.

22. Blagoi Yu.P. Magnesium ion effect on the helix-coil transition of DNA / Yu.P. Blagoi, V.A. Sorokin, V.A. Valeev // Biopolymers.-1978.-V. 17, №5.-P. 1103-1118.

23. Baxter-Gabbard K. The effects of cations and diamines on the viscosity of T-2 DNA / K.Baxter-Gabbard, D.Freser // Biopolimers.-1974.-V. 13, № l.-P. 207-216.

24. Zimmer Ch. DNA-copper(II) complex and the DNA-conformation / Ch. Zimmer, G. Luck, H. Fritzsche // J. Mol. Biol.-1983.-V. 169, № l.-P. 217-234.

25. Howard F.B. Poly(inosinic acid) helices: essential chelation of alkali metal ions / F.B.Howard, H.T.Miles // Biochemistry.- 1982.-V. 21, № 26.- P. 6736-6745.

26. Fiol J.J. Some new derivatives of Ni(II) witn uracil, uridine and nucleotides / J.J.Fiol, A.Terron, V.Moreno // Inorg. Chem. Acta.-1986.-V. 125, №3.- P. 159-166.

27. Kim S.-H. Binding sites and stabilities of transition metal ions with nucleosides and related ligands / S.-H.Kim, R.B.Martin // Inorg. Chem. Acta.-1981 .-V. 91, № 1P. 19-21.

28. Мартин Р.Б. Взаимодействие между ионами металлов и нуклеиновыми основаниями, нуклеозидами и нуклеотидами в растворах / Р.Б.Мартин, Я.Х.Мариам // Ионы металлов в биологических системах / Под ред. Х.Зигеля.-М.: Мир, 1982.-Т. 3.- С. 53-103.

29. Osipov A.N. DNA-protein cross-links in leukocytes of mice induced by Zn(II), Cd(II) and Pb(II) / A.N.Osipov, V.D.Sypin, O.G.Polsky //Biochemistry.-1997.-V.62, N.6.-P. 681-683.

30. Clement R.M. Interaction of metallic cations with DNA. Specific binding of Mg2+ and Mn2+ / R.M.Clement, J.Sturn, M.P.Daune // Biopolymers.- 1973.-V. 12, № 2.- P. 405-421.

31. Fritzsche H. Interaction of DNA and metal ions. A 13C-NMR study of some nucleobides and nucleotides adding Cu(II) and Mn(II) ions /

32. H.Fritzsche, K.Arnold, R.Krusche // Stud. Biophys.-1974.-V. 45, №1.-P. 131-143.

33. Chen M.S. Complexes of divalent metal ions with nucleosides and nucleotides / M.S. Chen // Inorg. Perspect. Biol. Med.-1983.-V. 1, № 3.-P. 217-222.

34. Mikulski Ch.M. Guanine complexes with first row transition metal perchlorates /Ch. M.Mikulski, L. Matucci, Y. Smich // Inorg. Chem. Acta.-1983.-V. 80, № 3.-P. 127-133.

35. Granol J. Interactions of DNA with divalent metal ions / J.Granol, D.R.Kearns, J.Feigon // Biopolymers.- 1982.-V. 21, № 1.- P. 203-232.

36. Shirotake S. Complexes between nucleic acid bases and bivalent metal ions. Synthesis and spectroscopic analysis of adenine zinc chloride and calcium chloride complexes / S.Shirotake // Chem. Pharm. Bull.-1980.-V. 28, № 6.-P. 1673-1682.

37. Bregadze V.G. RF inductivity coupled plasma spectrometry of DNA-metal complexes: Binding constants and water desorption kinetics / V.G.Bregadze, G.N.Berhiashvili, E.S.Gelagutashvili // Stud. Biophys.-1984.-V. 101,№ l.-P. 151-152.

38. Сорокин В.А. Исследование связывания ионов трехвалентного железа с ДНК / В.А. Сорокин, Г.О. Гладченко, В.А. Валеев // Молекуляр. биология. 1983.-Т. 17, № 4.- С. 868-877.

39. Record М.Т., Double helical DNA: Conformations, physical properties and interactions with ligands / M.T. Record, S.I. Mazur, P. Melanson // Ann. Rev. Biochem. 1981. - V. 50. - P. 997-1024.

40. Clement R.M. Interaction of metallic cations with DNA / R.M.Clement, J.Sturn, M.P.Daune // Biopolymers.- 1983.-V. 1, № 2.-P. 608-630.

41. Сорокин В.А. Исследование влияния ионов двухвалентной меди на конформацию полирибоадениловой кислоты / В.А. Сорокин, Ю.П. Благой, В.А. Валеев // Молек. биол.-1982.- Т. 16, № 2.-С. 369-378.

42. Франк-Каменецкий М.Д. Флуктуационная подвижность ДНК / М.Д. Франк-Каменецкий // Молек. биол.-1983.-Т. 17, № З.-С. 639652.

43. Слоницкий С.В. Влияние ионной силы на термодинамическую жесткость молекулы нативной ДНК в водных и водно-органических растворителях / С.В.Слоницкий, Э.В.Фрисман, А.К.Валеев, А.М.Ельяшевич // Молек. биол.-1983.-Т. 14, № З.-С. 496-506.

44. Скальный В.А. Химические элементы в физиологии и экологии человека / В.А. Скальный// М.: Мир. 2004. - 216 с.

45. Barany Е. Iron status influences trace element levels in human blood and serum / E. Barany, I. Bergdahl, L. Bratteby, T. Lindt // Environ. Res. 2005. - V. 98, N. 2. - P. 215-223.

46. Руководство по медицине. Диагностика и терапия./ Под ред. Р. Беркоу, Э. Флетчера.- М.: Мир, 1997. С. 771-878.

47. Hengstler J. Occupational exposure to heavy metals: DNA damage induction and DNA repair inhibition prove co-exposures to cadmium, cobalt and lead as more dangerous than hitherto expected / J.

48. Hengstler, U. Bolm-Audorff // Carcinogenesis. 2003. - V. 24, N. 1. -P. 63-73.

49. Lopez-Ortal P. DNA damage produced by Cd(II) in a human fetal hepatic cell line / P. Lopez-Ortal, V. Souza, L. Bucio // Mutat. Res.-1999.-V. 439, № 2.-P. 301-306.

50. Picco S.J. Association between copper deficiency and DNA damage in cattle / S.J. Picco, M.C. Abba, G.A. Mattioli, L.E. Fazzio, D. Rosa, J.C. De Luca, F.N. Dulout // Mutagenesis. 2004. - V.19, N.6 - P. 453-457.

51. Кодчайнова B.H. Медь / B.H. Кодчайнова, JI.M. Симонова. M.: Наука, 1990.-103 с.

52. Некоторые вопросы токсичности ионов металлов / Под ред. Х.Зигель, А.Зигель. М.: Мир, 1993. - С. 222-227.

53. Aslanoglu М. Voltammetric measurements of the interaction of metal complexes with nucleic acids / M. Aslanoglu, C. Isaak, A. Houlton, B. Horrocks//Analyst.-2000.-V. 125, N. 10.-P. 1791-1798.

54. Шапиро Я.С. Биологическая химия / Я.С. Шапиро. СПб.: «Элби СПб», 2004.-368 с.

55. Бандман А.Л. Вредные химические вещества неорганических соединений элементов V-VIII групп / А.Л. Бандман, Н.В. Волкова, Т.Д. Грехова. СПб.: Химия, 1989. - 592 с.

56. Кампанелла Л. Некоторые причины возникновения опухолей: точка зрения химика-аналитика/ Л.Кампанелла // Экспер.онкология,- 2001. -Т.23. -С.76-77.

57. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функции клеток / А. Ленинджер. М.: Мир, 1974. - 958 с.

58. Rauf S. Electrochemical approach of anticancer drugs-DNA interaction / S. Rauf, J.J. Gooding, K. Ahtar//J. of Pharm. and Biomed. Analysis. 2005. - V. 37, №. 2. - P. 205-217.

59. Hall M. The fate of platinum (II) and platinum (IV) anti-cancer agents in cancer cells and tumors / M. Hall, R. Alderden, M. Zhang, Z. Cai // J. of Struct. Biol. 2006.- V. 23, N.3. - P. 237-241.

60. Brown D.B. Synthesis and antitumor activity of new platinum complexes / D.B. Brown, A.R.Khokhar, M.P. Hacker // J. Med Chem.-1982.- V. 25.- P. 952-956.

61. Rosenberg B. Platinum compounds: a new class of potent antitumor agents / B.Rosenberg, L.VanCamp, J. E.Trosko, V.H.Mansour // Nature.- 1969. V. 222. - P. 385-386.

62. Kidani Y. Antitumor activity of 1,2-diaminocyclohexane platinum complexes against Sarcoma-180 ascites form / Y. Kidani, K. Inagaki, M.Iigo // J. Med Chem.-l 978.-V. 21 .-P. 1315-1318.

63. Brabec V. DNA sensor for the determination of antitumor platinum compounds / V. Brabec // Electrochim. Acta. 2000. - V. 45, N. 18. -P. 2929-2932.

64. Kopf-maier P. Non-platinum group metal antitumor agents: history, current status, and perspectives / P.Kopf-maier, H.Kopf // Chem. Rev.-1987.-V.87, № 5.-P.1137-1152.

65. Wong L.C. Primary treatment with vincristine, dactinomycin and cyclophosphamide in cell tumor of the ovary / L.C. Wong, H. Nhgan, H. Ma// Gynecologic Oncology. 1989. -V. 34, N. 2. - P. 155-158.

66. Souquet P.J. Carboplatin, vinblastin and mytomycin (CMV) in advanced and disseminated non small cell lung cancer / P.J. Souquet, P. Fournel // Lung cancer. 1991. - V. 7, N. 1. - P. 102.

67. Korper S. Differential effects of alkaloids on sodium currents of isolated single skeletal muscle fibers / S. Korper, M. Wink, R. Fink // FEBS Lett. 1998. - V. 436. - P. 251 -255.

68. Li N. Interaction of echinomycin with guanine: electrochemistry and spectroscopic studies / N. Li, L. Guo, J. Jiang, X. Yang // Biophys. Chem. 2004. - V. 111, N. 3. - P. 259-265.

69. Wang S. Electrochemical determination of interaction parameters for DNA and mitoxantrone in an irreversible redox process / S. Wang, T. Peng, C. Yang//Biophys. Chem. 2005.-V. 104,N. l.-P. 239248.

70. Yuan X. The influence of Cu(II), Mg(II) on the binding of adriamycin with DNA and the study on their interaction mechanism / X. Yuan, D. Guo, M. Zang // Spectrochim. Acta Part A: Mol. And Biomol. Spectroscopy. 2006. - V. 63, N. 2. - P. 444-448.

71. Ozkan D. Electrochemical genosensor for mitomycin C-DNA interaction based on guanine signal / D. Ozkan, II. Karadeniz, A. Erdem // J. of Pharm. and Biomed. Analysis. 2004. - V. 35, N. 4. -P. 905-912.

72. Машковский В.Б. Лекарственные средства./ В.Б.Машковский. -М.: Медицина, 1993. С. 221-230.

73. Cullinane С. Formation of adriamycin-DNA adducts in vitro / C. Cullinane, S. Cutts, A. Rosmalen, D. Phillips 11 Nucl. acids res. -1994. V.22, №12. - P. 2296-2303.

74. Matkar S.S. Two closely related nickel complexes have different effects on DNA damage and cell viability / S.S. Matkar, L. Wrischnik, P. Jones // Biochem Biophys. Res. Com. 2006. - V. 343, N. 3. - P. 754-761.

75. Бабкина С.С. Определение аутоантител к ДНК с помощью биосенсора на основе комплекса Pt(II) с ДНК / С.С.Бабкина, Н.А.Улахович, Э.П.Медянцева, О.В Климович // Прикл.биохимия и микробиология. 1998. - Т.34, №5. - С.572-575.

76. Babkina S.S. Amperometric DNA biosensor for the determination of autoantibodies using DNA interaction with Pt(II) complex / S.S.Babkina, N.A.Ulakhovich, Yu.I.Zyavkina // Analytica Chimica Acta. 2004. - V.502, N.l. - P.23-30.

77. De Beer E. Doxorubycin and mechanical performance of cardiac trabeculae after acute and chronic treatment: a review / E. De Beer, A.

78. Bottone, E. Voest // European J. of Pharmacology. 2001. - V. 415, N. l.-P. 1-11.

79. Благой Ю.П. Взаимодействие ДНК с биологически активными веществами (ионами металлов, красителями, лекарствами) / Ю.П. Благой // Соросовский образовательный журнал. 1998. - Т. 10, №35.-С. 18-25.

80. Wang S. Investigation on the interaction of DNA and electroactive ligands using a rapid electrochemical method / S. Wang, T. Peng, C. Yang // J. of Biomed. And Biophys. Methods. 2003. - V. 55, N. 3. -P. 191-204.

81. Карпенко E.H. Разработка полимерных лекарственных пленок с доксорубицином / Е.Н. Карпенко, JI.H. Ерофеева, J1.E. Сипливая, О.Д. Печенин, В.Т. Дудка // Фармация. 2005. - №3. - С. 25-28.

82. Vails N. Variable role of ions in two intercalation complexes of DNA / N. Vails, R.A. Steiner, G. Wright // J. Biol. Inorg. Chem. 2005. -V. 15, N. 5. - P. 476-482.

83. Kostoryz E. Oxidative mutagenesis of doxorubicin-Fe(III) complex / E. Kostoryz, D. Yourtee // Mut. Res. 2001. - V. 490, N. 2. - P. 131139.

84. Piedade J.A.P. Electrochemical sensing of DNA-adriamycin interactions / J.A.P. Piedade, I.R. Fernandes, A.M. Oliveira-Brett // Bioelectrochemistry.-2002.- V. 56,№1.-P. 81-83.

85. Oliveira-Brett A.M. Electrochemical detection of in situ adriamycin oxidative damage to DNA / A.M. Oliveira-Brett, M. Vivan, J.A.P. Piedade, I.R. Fernandes // Talanta. 2002. - V. 56, №5. - P. 959-970.

86. Pividori M. Electrochemical genosensing based on rigid carbon composites / M. Pividori, S. Alegret // Anal. Lett. 2005. - V.38, N.15.-P. 2541-2567.

87. Vo-Dinh T. Biosensors and biochips: advances in biological and medical diagnostics / T. Vo-Dinh, B. Cullum // Fres. J. Anal. Chem. -2000.-V. 366.-P. 540-551.

88. He W. DNA array biosensor based on electrochemical hybridization and detection / W. He, Q. Yang, Z. Liu, X. Yu, D. Xu // Anal. Lett. -2005. V.38, N.l 5. - P. 2567-2579.

89. Thevenot D. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification / D. Thevenot, K. Toth, R. Durst, G. Wilson // Biosens. and bioelectron. 2001. - V. 16, № 1 -2. - P. 121 -131.

90. Будников Г.К. Биосенсоры как новый тип аналитических устройств / Г.К.Будников // Соросовский общеобраз.журн. 1996. -№12.-С.26.

91. Mascini М. DNA electrochemical biosensor / M.Mascini, I.Palchetti, G.Marazza // Fresenius J.Anal.Chem. 2001. - V.369, №2. - P. 15-22.

92. Биосенсоры: основы и приложения / Под ред. Э. Тернера.- М.: Мир, 1991.-615 с.

93. Евдокимов Ю.М. Биодатчики на основе нуклеиновых кислот / Ю.М.Евдокимов, С.Т.Скуридин // ВИНИТИ Итоги науки и техники. Биотехнология.-1990.-Т. 26.-С. 134-161.

94. Mello L. Investigations of the antioxidant properties of plant extracts using a DNA-electrochemical biosensor / L. Mello, S. Hernandes, G. Marazza, M. Mascini, L. Kubota // Biosens. and bioelectron. 2006. -V. 21, №7. - P. 1374-1382.

95. Bagni G. Deoxyribonucleic acid (DNA) biosensors for environmental risk assessment and drug studies / G. Bagni, D. Ozella, R. Sturchio, M. Mascini // Anal. Chim. Acta. 2006. - V. 1016. - P. 345-353.

96. Wang R. Immobilization of DNA probes for the development of SPR-based sensing / R. Wang, S. Tombelli, M. Minunni, M. Mascini // Biosens.&Bioelectron. 2004. - V. 20, № 5. - P. 967-974.

97. Lu Y. New highly sensitive and selective catalytic DNA biosensors for metal ions / Y. Lu, J. Liu, J. Li, A. Brown // Biosens. and Bioelectron. -2003.- V.18, №. 5-6. P. 529-540.

98. Lucarelli F. Electrochemical DNA biosensor as a screening tool for the detection of toxicants in water and wastewater samples /

99. F.Lucarelli, I.Palchetti, G.Marrazza, M.Mascini // Talanta. 2002. -V.56.-P. 949-957.

100. Pedano M. Immobilization of DNA on glassy carbon electrodes for the development of affinity biosensors / M. Pedano, G. Rivas // Biosens.Bioelectron. 2003. - V. 18, N. 2-3. - P. 269-277.

101. Mannelli I. Direct immobilization of DNA probes for the development of affinity biosensors /1. Mannelli, M. Minunni, S. Tombelli, R. Wang, M. Mascini // Bioelectrochem. 2005. - V. 66, №. 1-2.-P. 129-138.

102. Palecek E. Electrochemistry of nucleic acids and development of DNA sensors / E.Palecek, F.Jelen // Crit.Rev.Anal.Chem. 2002. -V.32, No.3.-P. 261-270.

103. Teh H. Electrochemical biosensing of DNA with capture probe covalently immobilized onto glassy carbon surface / H. Teh, H. Gong, X. Dong, X. Zeng // Anal. Chim. Acta. 2005. - V. 551, №. 1 -2. - P. 23-29.

104. Pchelintsev N. Desing affinity surfaces for biomolecule immobilization and biosensor construction / N. Pchelintsev, A. Vakurov, H. Hays // Abs. Intern. Congress on Anal. Sciences. -Moscow, Russia, 2006. P. 647.

105. Будников Г.К. Современное состояние и перспективы развития вольтамперометрии / Г.К.Будников // Журн. аналит. химии,-1996.- Т. 51, №4.-С. 374-383.

106. Palecek Е. Electrochemical behaviour of biological macromolecules/ E.Palecek//Bioelectrochem.- 1986.-V. 15, № 1-2.-P. 275-295.

107. Barker G. Electron exchange between mercury and denatured DNA strands / G.Barker //J. Electroanal. Chem.- 1986.- V. 214. P. 373390.

108. Palecek E. New trends in electrochemical analysis of nucleic acids / E.Palecek //J. Electroanal. Chem.- 1988. V. 254. - P. 179-193.

109. Fojta M. Mercury electrodes in nucleic acid electrochemistry: Sensitive analytical tools and probes of DNA structure. A review /

110. M.Fojta// Collect.Czech.Chem.Commun. 2004. - V.69. - P.715-747.

111. Jelen F. Microanalysis of DNA by stripping transfer voltammetry / F. Jelen, A. Kourilova, P. Pecinka, E. Palecek // Bioelectrochem. 2004. -V. 63, N. 1-2.-P. 249-252.

112. Palecek E. New trends in electrochemical analysis of nucleic acids / E.Palecek//J. Electroanal. Chem. 1988. - V. 254. - P. 179-193.

113. Fojta M. Electrode potential modulated cleavage of surface confined DNA by hydroxyl radicals detected by an electrochemical biosensor / M.Fojta, T.Kubicarova, E.Palecek // Biosens.Bioelectron. 2000. -V.15. -P.107-115.

114. Murphy L. Biosensors and bioelectrochemistry / L. Murphy // Current opinion in chem. biol.-2006.-V. 10,N. 2.-P. 177-184.

115. Hahn S. Nucleic acid based biosensors: the desires of the user / S. Hahn, S. Mergenthaler, B. Zimmermann // Bioelectrochem. 2005. -V. 67, N. 2.-P. 151-154.

116. Jiao K. Syntesys, characterization and DNA-binding properties of a new cobalt(II) complex: Co(bbt)2C12 / K. Jiao, Q. Wang, F. Jian // J. of Inorg. Biochem. V. 99, N. 6. - P. 1369-1375.

117. Stoica A. Determination of cobalt in pharmaceutical products / A. Stoica, M. Peltea, G. Baiulescu // J. of Pharm. and Biomed. Analysis. 2004. - V. 36, N. 3. - P. 653-656.

118. Bauer С. Bridged cobalt amine complexes induce DNA conformational changes effectively / C. Bauer, A. Wang // J. of Inorg. Biochem. 1997-V. 68, N. 2.-P. 129-135.

119. Lu X. Voltammetric studies of the interaction of transitition-metal complexes with DNA / X. Lu, M. Zhang, H. Liu, J. Kang // J. Biochem. Biophys. Methods. 2002. - V. 52, N. 3. - P. 189-200.

120. Sancho D. Determination of nickel and cobalt in refined beet sugar by adsorptive cathodic stripping voltammetry without sample pretreatment / D. Sancho, L. Deban, I. Campos, R. Pardo, M. Vega // Food chemistry. 2000. - V. 71, №. 1. - P. 139-145.

121. Kajic P. Determination of trace cobalt concentrations in human serum by adsorptive stripping voltammetry / P. Kajic, I. Milosev, B. Pihlar, V. Pisot // J. of Trace elements in Medicine and Biology. 2003. - V. 17, №3.-P. 153-158.

122. Safavi A. Highly sensitive and selective measurments of cobalt by catalytic adsorptive cathodic stripping voltammetry / A. Safavi, E. Shams // Talanta. 2000. - V. 51, №. 6. - P. 1117-1123.

123. Zhang H. The determination of interactions of cobalt(ll) with organic compounds in seawater using cathodic stripping voltammetry / H. Zhang, M. Constant, V. Berg, R. Wollast // Marine Chem. 1990. -V. 28, №. 4.-P. 285-300.

124. Elwood M. Determination of organic complexation of cobalt in seawater by cathodic stripping voltammetry / M. Elwood, C. Berg // Marine Chem. 2001. - V. 75, N. 1-2. - P. 33-47.

125. Korolczuk M. Determination of traces of cobalt in the presence of nioxime and cetyltrimethylammonium bromide by adsorptive stripping voltammetry / M. Korolczuk, A. Moroziewicz, K. Paluszek // Talanta. 2005. - V. 65, N. 4. - P. 1003-1007.

126. Jelen F. Osmium tetroxide reactivity of DNA bases in nucleotide sequencing and probing of DNA structure / F.Jelen, P.Karlovsky, E.Palecek//Gen. Physiol. Biophys.- 1991. V. 10. - P. 461-473.

127. Havran L. Voltammetric behavior of DNA modified with osmium tetroxide 2,2'-bipyridine at mercury electrodes / L.Havran, M.Fojta, E.Palecek // Bioelectrochemistry. 2004. - V.63, №.1-2. - 239-243.

128. Slepchenko G. Voltammetric control of organic and inorganic microcomponents in biological samples / G. Slepchenko, N. Pikula, T. Schukin // Abs. Intern. Congress on Anal. Sciences. Moscow, 2006. -P. 130.

129. Strouhal M. Electrochemical study of heavy metals and metallothionein in yeast Yarrowia lipolitica / M. Strouhal, R. Kizek, J. Vacek, L. Trnkova // Bioelectrochem. 2003. - V. 60, №. 1-2. - P. 29-36.

130. Zhang Q. Synthesis, characterization and DNA-binding studies of Co(III) polypyridyl complexes / Q. Zhang, J. Liu, H. Xu, H. Zhou, L. Qu, L. Ji // Polyhedron. 2001. - V. 20, N. 26-27. - P.3049-3055.

131. Wang J. Electrochemical biosensors: towards point-of-care cancer diagnostics / J. Wang // Biosens.Bioelectron. 2006. - V. 21, N. 10.-P. 1887-1892.

132. Li N. Interaction of anticancer drug mitoxantrone with DNA analyzed electrochemical and spectroscopic methods / N. Li, Y. Ma, C. Yang // Biophys. Chem. 2005. - V. 116, N. 3. - P. 199-205.

133. Cutts S.M. Adriamycin-induced DNA adducts inhibits the DNA interaction of transcription factors and RNA polymerase / S.M. Cutts, P. Parsons, R. Sturm, D. Phillips // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271, №. 10.-P. 5422-5429.

134. MO.Zeman S. Caracterization of covalent adriamycin-DNA adducts / S. Zeman, D. Philips, D. Crothers // Biochemistry. 1998. - V. 95, N. 20.-P. 11561-11565.

135. Kiyomiya K. Differences in intracellular sites of action of adriamycin in neoplastic and normal differentiated cells / K. Kiyomiya, S. Matsuo, M. Kurebe // Cancer chemotherapy and Pharmakology. -2001.-V. 41,N. l.-P. 51-56.

136. Szpakowska I. Pentamidine analogues as potential chemotherapeutics tested using electrochemical DNA biosensor /1. Szpakowska, B. Krassowska-Swiebocka // Abs. Intern. Congress on Anal. Sciences. -Moscow, 2006.-P. 561.

137. Бабкина C.C. Электрохимические сенсоры на основе стационарных электродов и иммобилизованной ДНК либо ее фрагментов и оценка их аналитических возможностей/

138. C.С.Бабкина, Э.Палечек, Ф.Йелен, М.Фойта // Тез.докл. VI Всеросс. конфер. по электрохимическим методам анализа. ЭМА2004.- Уфа, 2004.-С. 19-21.

139. Бабкина С.С. Электрохимические сенсоры на основе стационарных электродов и иммобилизованной ДНК либо ее фрагментов и оценка их аналитических возможностей / С.С. Бабкина, Э. Палечек, Ф. Йелен, М. Фойта // Журн. анал. химии.2005.-Т. 60,№6.-С. 639-645.

140. Budnikov Н.С. An enzyme amperometric sensor for toxicant determination/ Budnikov H.C., Medyantseva E.P.,Babkina S.S.// J.Electroanal.Chem. 1991. - V.310. - P.49-55.

141. Shevelkova A.N. Thermodynamic mechanism of catalysis by haloper-oxydases / Shevelkova A.N., Salnikov Yu.I., Kuzmina N.L., Ryabov A.D. // FEBS Letters. 1996. - V.383. - P. 259-263.

142. Варфоломеев С.Д. Биокинетика / С.Д.Варфоломеев. M.: ФАИР-Пресс, 1999 -720 с.

143. Некоторые вопросы токсичности ионов металлов / Под ред. Х.Зигель, А.Зигель. М.: Мир, 1993. - С. 222-227.

144. Tan L. Differetial interaction of plasmid DNA, RNA and endotoxine with immobilized and free metal ions / Tan L., Lai W., Lee C., Kim

145. D., Choe W. // J. of Chromatography A. 2007 - V. 1141, № 2 - P. 226 - 234.

146. Babkina S.S. Complexing of heavy metals with DNA and new bioaffinity method of their determination based on amperometric

147. DNA-based biosensor / S.S. Babkina, N.A. Ulakhovich // Anal. Chem. -2005.-V. 77.-P. 5678-5685.

148. Cai Y. DNA damage in human peripheral blood lymphocyte caused by Ni(II) and Cd(II) / Y.Cai, Z.Zhuang // Mutat. Res. 1999. - V.33, № 2. - P. 75-77.

149. Клиническая оценка лабораторных тестов / Под. ред. Н.У. Тица. М.: Медицина, 1986. - 480 с.

150. Давыдов Д.Ю. Гидролиз катионов металлов с образованием полиядерных гидроксокомплексов в растворах / Д.Ю Давыдов, В.В. Торопова, Н.И. Торопова, А.С. Титов / Журн. неорг. химии. -2005.-Т. 50, №3.-С. 527-531.

151. Babkina S.S. Amperometric DNA biosensor for investigation of Co(II)-DNA interaction and cobalt assay / S.S. Babkina, E.N. Moiseeva, N.A. Ulakhovich // Abs. International congress on analytical sciences ICAS-2006. Moscow, 2006. - C. 834.

152. Бабенко Г.А. Биологическая роль меди / Г.А. Бабенко.- М.: Наука, 1970.-235с.

153. Дятлова Н.М. Комплексоны / Н.М.Дятлова, В.Я.Темкина, И.Д.Колпакова. М.: Химия, 1970. - 416 с.

154. Архипова О.Г. Методы исследования в профпатологии (биохимические) / О.Г. Архипова, Н.Н. Шацкая, JI.C. Семенова. -М.: Медицина, 1988. С. 123-125.

155. Реестр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарственных средств. М., ООО «РЛС». - 2004. - С. 317-318.

156. Bijnen P. Drug interactions in oncology / P. Bijnen, J. Schellens // Oncology. 2004. - V. 5, N. 8. - P. 489-496.

157. Graves D. Intercalative binding of small molecules to nucleic acids /

158. D. Graves, L. Velea // Cur. Org. Chem. 2000. -V. 4, N. 9. - P. 915929.

159. Бабкина C.C. Определение противоопухолевого антибиотика доксорубицина с помощью амперометрического биосенсора на основе иммобилизованной ДНК / С.С. Бабкина, Е.Н. Моисеева, Н.А. Улахович // Фармация. 2006. - №. 5. - С. 9-11.

160. Бабкина С.С. Биоаффинные методы, основанные на использовании амперометрического ДНК-биосенсора, для изучения взаимодействия и противоопухолевых препаратов и токсичных металлов с ДНК и для их определения / С.С. Бабкина,

161. E.Н. Моисеева, Н.А. Улахович // Материалы Междунар. научной конфер. «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий». Томск, 2006. - Т.2, С. 332-334.