Аналитический контроль процесса получения тагатозы направленной трансформацией лактозы тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

005010571

На правах рукописи

ГОРБУНОВА Елена Михайловна

АНАЛИТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРОЦЕССА ПОЛУЧЕНИЯ ТАГАТОЗЫ НАПРАВЛЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИЕЙ ЛАКТОЗЫ

02.00.02 - Аналитическая химия .01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнолопш)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2012

005010571

Работа выполнена на кафедре неорганической химии и химической технологии ФГБОУ ВПО Воронежского государственного университета инженерных технологий

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Нифталиев Сабухн Илнч-оглы (ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий»)

Официальные оппоненты: доктор химических наук, в.н.с.

Пирогов Андрей Владимирович

(ФГБОУ ВПО «Московский государственный

университет»)

доктор химических наук, профессор Бовин Николай Владимирович

(Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганнческон химии нм.академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчшшнкова (ИБХ РАН))

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Ивановский государственный

химико-технологический университет»

Защита диссертации состоится 29 февраля 2012 г. в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.120.05 при ФГБОУ ВПО Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу 119571, г. Москва, проспект Вернадского, д. 86, ауд. М-119.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВІ10 МГУТХТ им. М.В. Ломоносова.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitlil.ru. а также на официальном сайте Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан 27 января 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Никишина Е.Е.

Актуальность. Углеводы являются одним из основных компонентов клеток и тканей живых организмов, выполняют энергетическую, структурную, пластическую, рецепторную, защитную функции. Контроль содержания углеводов в продуктах питания - актуальная задача большинства производственных и исследовательских лабораторий. Разработка методов количественного и качественного анализов углеводов приоритет многих отраслей науки (аналитическая химия, медицина, биохимия, фармакология и т.д.). В природных объектах эти соединения находятся в виде сложных смесей, содержащих низкомолекулярные неорганические и высокомолекулярные органические вещества, а также соединения белковой природы. Разделение моносахаридов представляет сложную задачу вследствие близости многих физикохимических свойств этих соединений. Будучи весьма лабильными веществами, углеводы, под влиянием даже слабых воздействий, легко подвергаются различным изменениям. Важным является разработка современных, простых, экспрессных способов пробоподготовки и анализа углеводов. Перспективны

хроматографические методы, характеризующиеся высокой

чувствительностью и селективностью.

Физико-химические и биотехнологические свойства лактозы позволяют рассматривать ее в качестве сахара жизни для компонентов функциональных продуктов, медицинских препаратов. Актуальное научное направление - получение химической и биохимической трансформацией производных (дериватов) лактозы, в том числе тагатозы, востребованных на мировом рынке как пребиотики и бифидогенные производные.

Разработка технологии производства натурального.

подсластителя на основе тагатозы и применение аналитических методов дач контроля процесса на разных этапах трансформации лактозы вторичного сырья, позволяющие оптимизировать и регулировать выход конечного продукта, а также разработка методик идентификации углеводного состава является актуальной, представляет научную и практическую значимость. Решение проблемы позволит расширить ассортимент продуктов,

обладающих функциональными свойствами.________________'

Автор выражает благодарность д.т.н., профессору Мельниковой Е.И. за консультации при выполнении работы.

Цель работы - аналитический контроль процесса получения D-тагатозы путем направленной химической и биохимической трансформации лактозы вторичного сырья и разработка способа идентификации углеводов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- разработка способа получения тагатозосодержащего подсластителя из лактозы вторичного сырья;

- математическое обеспечение этапов трансформации лактозы:

- создание математической модели процесса гидролиза лактозы;

- изучение влияния различных факторов на процесс гидролиза лактозы методом полнофакторного статистического анализа с центральным композиционным униформ-планированием;

- оптимизация условий гидролиза с применением ридж-анализа;

- оптимизация процесса изомеризации D-галактозы с использованием искусственных нейронных сетей и пакета прикладных программ Statistica Neural Networks v.7.0e;

- исследование кинетики ферментативного гидролиза лактозы и расчет кинетических параметров;

- распознавание и количественное определение углеводного состава субстрата на разных этапах трансформации лактозы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии;

- разработка способа идентификации тагатозы;

- применение натурального подсластителя в производстве функциональных продуктов.

Научная новизна:

- разработан способ получения D-тагатозы из лактозы вторичного сырья;

- с применением многофакторного статистического анализа оптимизированы основные факторы [температура, время гидролиза, количество вносимого фермента, pH], влияющие на процесс гидролиза;

- оптимизирован процесс изомеризации галактозы в тагатозу с использованием искусственных нейронных сетей и пакета прикладных программ Statistica Neural Networks v. 7.0e;

- методом ВЭЖХ качественно и количественно установлен состав тагатозосодержащего подсластителя;

- разработан способ экспрессного детектирования углеводов.

Практическая значимость:

- способ получения тагатозосодержащего подсластителя из молочной сыворотки прошел опытно-промышленную апробацию на ГМЗ «Лискинский» (г. Лиски, Воронежская область);

- предложена математическая модель для оптимизации условий процесса гидролиза лактозы;

- установлен качественный и количественный углеводный состав на различных этапах трансформации лактозы;

- метод хроматографии в тонком слое предложен в качестве экспресс-метода идентификации углеводов, в том числе тагатозы.

Новизна практических разработок подтверждена материалами Роспатента

Основные положения, представляемые к защите:

- способ получения тагатозосодержащего подсластителя из лактозы вторичного сырья;

- математическая модель процесса гидролиза лактозы;

- оптимизация процесса изомеризации галактозы в 1>тагатозу с использованием искусственных нейронных сетей;

- распознавание и количественное определение методом ВЭЖХ углеводного состава на разных стадиях процесса направленной трансформации лактозы;

- экспресс-идентификация тагатозы методом ТСХ.

Апробация работы

Результаты работы доложены на 75-й конференции молодых ученых «Научные достижения молодежи - решению проблем питания человечества в XXI веке» (Киев, Украина, 2009), Международной конференции «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2009, 2010), Всероссийской конференции «Пищевая промышленность: интеграция науки, образования и производства» (Краснодар, 2009, 2010), XII научной конференции «Львовские химические чтения» (Львов, Украина, 2009), III Международно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности» (Воронеж, 2009) - очно, Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновационные

технологии в пищевой промышленности» (Самара, 2009), Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (Воронеж, 2009, 2010) - очно, Международном научно-практическом семинаре — Омского государственного аграрного университета «Современные технологии продуктов питания: теория и практика производства (Омск, 2010),

II Международной научно-технической, конференции «Новое в технологии и технике пищевых производств» (Воронеж. 2010), 47 _ 49 отчетных научных конференциях ВГТА (Воронеж, 2009 - 2011)-очно.

Публикации ^

Основные положения диссертационной работы изложены в 2 патентах, 3 статьях, тезисах 17 докладов, сделанных на Международных, Всероссийских и региональных конференциях. Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, выводов, списка цитируемой литературы (140 источников, из них 40 на иностранных языках) и приложения (материалы Роспатента, обучающие выборки, акт опытно-промышленной выработки, протокол лабораторных исследований, почетные грамоты и диплом). Работа изложена на 151 страницах машинописного текста,

содержит 62 рисунка, 27 таблиц. _

Первая глава содержит сведения о генетической связи лактозы и ее бифидогенных производных; приведена характеристика тагатозы как низкокалорийного подсластителя; отражено применение методов аналитической химии в анализе

углеводов. •

Во второй главе охарактеризованы методы и объекты исследования - молочная сыворотка, фильтрат молочной сыворотки, лактоза, галактоза, тагатоза.

Распознавание и количественное определение углеводного состава субстрата на разных этапах трансформации лактозы проведены методами ТСХ и ВЭЖХ.

Контроль содержания углеводов (глюкоза, лактоза, галактоза, фруктоза, манноза, тагатоза), полученных в результате гидролиза лактозы с последующей изомеризацией <1-галактозы раствором Са(ОН>, осуществляли методом хроматографии в тонком слое на пластинах «БогЬШ», предварительно пропитанных 0,5 моль/дм

раствором дигидрофосфата натрия (ИаНгРОД В качестве растворителя использовали смесь - ацетон, изопропиловый спирт,

1 моль/дм3 раствор молочной кислоты в объемном соотношении 2:2:1. Для обнаружения углеводов пластину обрабатывали смесью растворов концентрированной фосфорной кислоты -анилина - дифениламина при объемном соотношение компонентов 3:2:1 соответственно. Проявленную хроматограмму сканировали на планшетном сканере при разрешении 600 dpi (точек на дюйм), переводя ее в компьютерное изображение в виде графических файлов. Далее изображение обрабатывали на персональном компьютере с использованием программы «Image J». Углеводы идентифицировали по коэффициенту смещения (Rf).

Для анализа углеводного состава смеси, полученной на разных стадиях процесса направленной трансформации лактозы, применяли жидкостный хроматограф «Varian 920 - LC» с автоматическим вводом пробы, рефрактометрическим детектором Varian 356 - LC; колонкой «Microsorb NH2 MV» 250x4,6 мм с сорбентом (производитель «Varian HPLC colums Advanced Chromatography Solutions») зернением 5 мкм. Промывку осуществляли в режиме подачи элюента; режим работы детектора -изократический; температура в колонке 25 °С; подвижная фаза -смесь деионизированной воды с ацетонитрилом в соотношении 20:80 без смешения из двух отдельных емкостей, скорость подачи элюента - 1,2 см3/мин.

Пробоподготовку анализируемого раствора проводили по разработанной методике. Пипеткой отбирали 5 см3 исследуемого образца и количественно переносили в химический стакан, дозатором добавляли 25 см3 изопропилового спирта и перемешивали. Твердофазную экстракцию углеводов осуществляли с применением комплекта Captiva С. Для этого его промывали предварительно 2 см3 изопропилового спирта и 4 см3 дистиллированной воды, а затем подготовленную пробу пропускали через колонку при скорости 1 - 2 см3. Первые порции фильтрата (I -

2 см3) удаляли. Для хроматографического разделения углеводов использовали последующие порции полученного фильтрата объемом 10 см3.

Идентификацию и расчет массовой концентрации (г/дм) углеводов в пробе осуществляли с применением системы сбора и обработки данных хроматографа Galaxy Chromatograph Data System.

Для определения содержания глюкозы в растворе применяли глюкометр ACCU-CHEK® ACTIVE. Погрешность измерений ка приборе ACCU-CHEK® ACTIVE составляет ±0,2 ммоль/дм . Перед началом испытаний провели калибровку прибора в соответствии с прилагаемой инструкцией фирмы-изготовителя по стандартным

растворам глюкозы.

Ферментативный гидролиз лактозы в ультрафильтрате подсырной сыворотки осуществляли с использованием ферментного препарата Lactozym -3000 L HP-G ф-галактозкдаза) при pH 6,2, что соответствует рекомендуемому интервалу (6-7 ед. pH) в инструкции по применению ферментного препарата. Установили оптимальную дозировку ферментного препарата, которая соответствует 2400-2700 LAU/дм3 (LAU — Lactase Activity Units) (рис. 25). Гидролиз проводили в интервале температур от 25 °С до 39 °С. По истечении 30 с. измеряли концентрацию глюкозы с интервалом в одну минуту в течение 870 с.

Глава 3 посвящена разработке способа получения тагатозосодержащего подсластителя и оптимизации процессов трансформации лактозы в D-тагатозу.

В качестве исходного сырья для получения подсластителя применяли подсырную сыворотку, которую пастеризовали, подвергали ультрафильтрации и концентрированию на обратноосмотической установке.

Далее осуществляли ферментативный гидролиз основного компонента обратноосмотического концентрата - лактозы ферментным препаратом Lactozym 6500 L Pure.

Изомеризацию D-галактозы в гидролизованном концентрате проводили в присутствии раствора Са(ОН)2 (катализатор СаС12) в течение 2 ч. В результате действия ионов кальция на молекулу D-галактозы происходит образование комплекса D-галактоза-Са, который переходит в D-тагатозаСа. Полученный комплекс нейтрализовали углекислым газом до значения pH 6,7, а карбонат кальция отделяли центрифугированием. Тагатозосодержащий подсластитель необходимо хранить при температуре 4±2 С не более 14 дней.

В ходе исследования кинетики ферментативного гидролиза лактозы рассчитаны параметры, представленные в табл. 1.

Данные свидетельствуют о том, что рост температуры до 37 °С приводит к увеличению максимальной скорости реакции, распада комплекса Дальнейшее увеличение температуры ведет к обратному результату, т.к. происходит постепенное уменьшение активности фермента.

Таблица 1

Кинетические параметры ферментативного гидролиза лактозы

рН=б,2 25 °С 29 °С 33°С 37 °С 39 °С

у гтах моль/Сдм3 -с) 1,27-Ю"6 5,797-10-6 9,09-10-6 1,08-105 9,439-10"5

кга моль/дм3 0,00159 0,00181 0,00194 0,0024 0,00219

11 0,9459 0,8413 0,7877 0,6967 0,8346

кз 1,0015 1,0074 1,0091 1,0097 1,0076

-V, моль/(дм3 -с) 7,63-10'7 3,36-10* 4,99-10"6 6,4-10-6 5,98-10-6

Установлены оптимальные параметры гидролиза лактозы в пермеате подсырной сыворотки ферментным препаратом Р-галактозидазы ЬасЮгуш -3000 Ь НР-О : температура 37 °С, pH 6,2, количество вносимого фермента 2400-2700 ЬАи/дм3. Рассчитаны кинетические параметры: максимальная скорость, порядок

химической реакции (Кпих = 1,08-10'5, п =0,6967).

В ходе математического моделирование процесса гидролиза лактозы получена информация о факторах, влияющих на процесс гидролиза, построена математическая модель процесса, оптимизированы условия процесса гидролиза

В качестве основных факторов, влияющих на процесс гидролиза лактозы в обратноосмотаческом концентрате пермеата подсырной сыворотки, изучены: X/ - температура, °С;

X? - продолжительность гидролиза, мин; Х3 - активность ферментного препарата Ьа^огут 6500 Ь Риге, ед. 1А11; Х4 - pH концентрата.

Все факторы совместимы и некоррелируемы между собой. Критерий оценки оптимизации процесса - степень гидролиза лактозы (У).

Для построения математической модели применены центральное композиционное ротатабельное униформ-планирование и полный факторный эксперимент 24 (ПФЭ24).

Полнено уравнение регрессии, адекватно описывающее процесс гидролиза под влиянием учитываемых факторов:

У- 17,498 -11;717Х/ + \\,1ПХ2+ 1,168^-2,085^--3,063Х,Х2 - 3,813Х,Х3 -20,625Х,Х4 + 4,186&Х>+11 ,ОООХ2Х4 -

- 17,000№ +6,996X7 + 13,090Х22 + 17,028*/ +14,776*Д Анализ коэффициентов свидетельствуют о том, что на процесс гидролиза лактозы в большей степени влияют температура (X/), продолжительность гидролиза (Х2) и pH концентрата (Х4). Отрицательные значения коэффициентов при соответствующих членах полинома свидетельствуют о наличии области экстремума выходного параметра (50-

Задача оптимизации - нахождение условий процесса гидролиза, которые в широком диапазоне изменения входных параметров обеспечивают максимальную степень выхода галактозы. На рис. 3 изображена поверхность значений выходного параметра, отражающая его зависимость от входных факторов X) и X».

Для установления эффективных условий процесса гидролиза применяли «ридж-анализ», основанный на методе неопределенных множителей Лагранжа. Оптимальные параметры процесса гидролиза лактозы в обратноосмотическом концентрате подсырной сыворотки: температура 38,7 °С, время гидролиза 2 70 мин, количество вносимого фермента 7550 ед. ЬАУ, pH 6,2.

I .о «>=« ед. ЬАи, времени »-с гидролиза 270 мин.

£58С-50 Рис. 3 - Поверхность “ отклика выходного

» параметра при значении

“ ■«* дозировки фермента 7500

30

50

Для оптимизации процесса изомеризации D-галактозы использовали метод искусственных нейронных сетей и пакет прикладных программ Statistica Neural Networks v7.0e.

В качестве переменных параметров были выбраны следующие факторы: массовая доля галактозы, температура, активная кислотность, время. Функцией отклика (выходным параметром) являлась массовая доля тагатозы, г/дм3.

С помощью обучающих алгоритмов нейронную сеть приводили в соответствие с экспериментальными данными. Определение условий адаптации вели с использованием генетического алгоритма путем создания массива данных с учетом всех возможных вариантов хода технологического процесса изомеризации галактозы в тагатозу. На следующем этапе осуществлялась обработка массива нейронной сетью и полученные результаты оптимизировались.

Генетический алгоритм персептрона позволяет учесть все межфакторные взаимодействия и комплексно оптимизировать технологический процесс изомеризации галактозы. Моделью процесса в пакете прикладных программ Neural Networks является нейронная сеть, которая способна не только к адаптации, но и к интерполяции данных. Таким образом, был получен теоретический массив расчетных данных, состоящий из более чем 3000 виртуальных опытов, в которых степень изомеризации галактозы в тагатозу варьировала от 0 до 95 %.

На основании виртуального эксперимента и теоретического массива данных, можно заключить что оптимальными условиями изомеризации являются температура 21 °С, pH 12,6 и время изомеризации 140 мин. Выход тагатозы при этих условиях составил 95,9 %.

Апробация оптимальных параметров, проведенная в лабораторных условиях, показала адекватность расчетным данным, воспроизводимость результатов, а также возможность получения концентрата тагатозы с 95%-ной степенью изомеризации галактозы в тагатозу. Хроматограмма, полученная методом ВЭЖХ, полностью это подтверждает (рис. 4).

С использованием программы Neural Networks получены и проанализированы результаты в ЗО-пространстве при изменяющихся значениях визуально невидимых факторов.

1

Рис. 4 - Хроматограмма концентрата гагатозы

Представляет интерес изучение попарного влияния параметров при прочих оптимальных на протекание процесса изомеризации галактозы, в частности на ее степень изомеризации. На рис. 5 представлена поверхность отклика выходного параметра (концентрация тагатозы) и изолинии ее сечений, позволяющие выполнять анализ оптимальных условий.

Анализ п>афических зависимостей показывает, что увеличение температуры, времени выдержки системы, активной кислотности и концентрации галактозы способствует повышению степени изомеризации галактозы в тагатозу, и достигает максимума в интервале температур 20-22 °С, pH 12,4 — 12,7 и времени 140-160 мин. Дальнейшее возрастание этих параметров приводит к обратному эффекту, даже при высоких концентрациях галактозы, что связано с образованием различных побочных продуктов, в том числе оксикислот.

1)

2)

Рис. 5 - Поверхность отклика выходного параметра и изолинии ее сечений в зависимости от: 1) температуры и времени; 2) pH и времени; 3) концентрации галактозы и температуры; 4) концентрации галактозы и pH;

5} концентрации галактозы и времени; 6) pH и температуры.

Глава 4 посвящена разработке способов идентификации углеводов на различных этапах трансформации лактозы. Разработана пробоподготовка углеводов, методом ВЗЖХ определен качественный и количественный состав углеводного комплекса, содержащего тагатозу. Разработан экспресс-способ идентификации углеводов с применением метода хроматографии в тонком слое.

Для фильтрации проб, содержащих осаждаемые белки использовали микропланшетную систему Captiva С, состоящую из 96-позиционной матрицы фильтров с глубиной 0,45 мкм, вакуумного экстрактора CaptiVac™ и покрытия Duo Seal™ 96.

На основе литературных данных для осаждения белков были выбраны следующие растворители: ацетон, этил ацетат, бугил ацетат, пропанол, изопропанол, этиловый эфир, ацегонитрил. В результате использования изопропанола наблюдалось значительное улучшение воспроизводимости результатов исследований за счет более четкого разделения пиков, в остальных случаях сахара элюировались не селективно.

Результаты ВЭЖХ анализа обратноосмотаческого концентрата и щдролизата обратноосмотаческого концентрата сыворотки приведены в таблице 2. Основной компонент концентрата представлен углеводом животного происхождения лактозой, концентрация которого составила 97,6 % от общего содержания углеводов. Степень гидролиза лактозы в гидролизованном концентрате составляет 92 %. Глюкоза и галактоза образуются в равных пропорциях.

Таблица 2

Качественные и количественные параметры хроматографирования

углеводов

Углевод Обратноосмотаческий концентрат Гидролизат обратноосмотического концентрата

т, мин Высота пика, цЯШ С, г/дм3 т, мин Высота пика, цЫи С, г/дм

Глюкоза 11,63 5,3 2,1±0,Ю 11,63 120,1 82,1*0,29

Галактоза 12,40 7,8 2,0±0,09 12,40 ИЗ,4 82,0±0,26

Лактоза 26,51 73,7 168,1*0,32 26,51 9,7 8,10±0,15

Полученную в результате гидролиза лактозы галактозу модифицировали в тагатозу. Для достижения максимального выхода тагатозы изомеризацию О-галактозы в гидролизованном обратноосмотическом концентрате проводили, варьируя значениями pH и температуры.

Результаты изомеризации Е)-галактозы при различных значениях температуры и pH представлены в таблице 3. В условиях изомеризации при I =21 ”С, pH 12,6 (стандартные) выход тагатозы составил 41 %. Увеличение температуры отрицательно сказывается на результатах изомеризации - выход тагатозы 29 % . При

уменьшении температуры и увеличении pH (I =15 'С, pH 13,5) выход тагатозы снижается до 39,9 %. Уменьшение pH до 10,5 сокращает образование тагатозы до 38 %.

Таблица З

Параметры хроматографирования углеводов после изомеризации

" Углеводы Показатели Тагатоза Фруктоза Манноза Глюкоза Галактоза Лактоза

Т 21 °С pH 12,6 т, мин 8,42 9,44 10,47 11.61 12,41 26,65

Высота пика, цШи 116,4 9,4 0,7 7 і,0 8,9 3,0

С, г/дм5 70,6 7,4 5.1 68,0 10,0 8,1

Т 35 °С рн 12.5 т, мин 8,40 9.40 10,73 11,58 13,02 26.54

Высота пика, цЯШ 49,4 14,9 3,6 39,3 8,7 0,4

С, г/дм* 35,7 10,3 12.3 44,3 16,5 1,7

т 15 °С pH 13,5 г, мин 8,16 9,10 10,36 11,13 12,40 25,63

Высота пика, цРЛи 101,7 13,0 2,7 54,1 9,9 2,3

С, г/дм5 65,8 9,2 9Д 61,8 15,1 8,0

Т 15 °С рн 10,6 т, мин 8,33 9,33 10,74 51,51 12,91 26,57

Высота пика, цЯШ 87,0 12,6 2,7 52,0 8,1 1,6

С, г/дм' 62,4 8,7 92 59,6 14,5 6,8

Видно, что наибольший выход тагатозы в результате изомеризации О-галактозы наблюдается при 1 — 21 °С и pH 12,6. Но этот показатель не сильно отличается от результатов, полученных при изомеризации в других условиях 0=15 °С, pH 13,5 и 1=15 °С, pH 10,5). Однако, с повышением температуры до 35 °С наблюдается значительное снижение концентрации тагатозы в растворе, что обусловлено смещением равновесия, и галактоза только частично изомеризуется в тагатозу. С точки зрения экономии энергоресурсов рекомендовано проводить изомеризацию галактозы в тагатозу при г = 21 °С pH 12,6.

Точность полученных данных проверяли методом «введено-найдено» (табл. 4). Погрешность измерений не превышает 3 %.

Методом хроматографии в тонком слое осуществляли контроль содержания углеводов в смеси, полученной в результате гидролиза молочной сыворотки с последующей изомеризацией О-галактозы. Для разделения углеводов применяли пластины «БогЬШ» (Россия) марки ПТСХ-П-А-УФ, неподвижная фаза -силикагель, закрепленный на пленке полиэтилентерёфталатной (ПТЭФ), флуоресцирующие в ультрафиолетовом спектре. Толщина рабочего слоя микрофракционированного сорбента силикагеля

марки СТХ-1ВЭ составляет 90-120 мкм, разброс толщины слоя сорбента на одной пластине составляет ±5 мкм.

Таблица 4

___________ Определение углеводов; п-3,Р- 0,95_______________

Углевод Введено, г/дм3 Найдено, г/дм3 Sf Введено, г/дм3 Найдено, г/дм3 sr

Тагатоза 5,00 4,99±0,10 0,09 50,00 49,95±0,21 0,10

Фруктоза 5,01±0,11 0,09 49,87±0,14 0,09

Манноза 4,92±0,08 0,04 50,00±0,12 0,04

Глюкоза 5,02±0,07 0,05 49,88±0,11 0,04

Галактоза 4,87±0,16 0,12 49,99±0,24 0,11

Лактоза 5,00±0,13 0,11 50,00±0,25 0,12

Выбор элюента обусловлен природой сорбента и сорбатов. Силикагель - полярный неорганический сорбент, поверхность которого содержит силанольные и силоксановые группы. Наличие липофильного внешнего слоя сорбента на пластине обусловливает применение гидрофильных растворителей или водных растворов в качестве подвижной фазы.

В качестве элюентов при разделении углеводов нами изучены смеси: бутанол - пиридин - вода (в объемном соотношении

6:4:3); адегонитрил - уксусная кислота - раствор аммиака с концентрацией 0,35 моль/дм3 (в объемном соотношении 8:1:1); ацетон - изопропиловый спирт - раствор молочной кислоты с концентрацией 1 моль/дм3 (в объемном соотношении 2:2:1); уксусная кислота - ацетон - пиридин - вода (в объемном соотношении 1:7:5:1); н-бутанол-уксусная кислота-этилацетат-вода (в объемном соотношении 9:6:3: 1). Оптимальный состав подвижной фазы ацетон - изопропиловый спирт - раствор молочной кислоты с концентрацией 1 моль/дм3 в объемном соотношении 2:2:1 обеспечивает полное разделение углеводов. Полученную хроматограмму обрабатывали на персональном компьютере с использованием программы «Image J», принцип работы которой основан на процессе перевода графического изображения в оцифрованный хроматографический сигнал. При этом количественно оцениваются все разделившиеся компоненты одного образца и строится хроматограмма в координатах X - «Rf», Y - «Интенсивность». «Интенсивность» - это интенсивность окраски пятна по отношению к значению фона. Таким образом,

определяется и площадь пика. Углеводы идентифицировали по коэффициенту смещения - (табл. 5).

Разработанный способ идентификации углеводов позволяет достаточно быстро, точно, надежно и с высокой воспроизводимостью определять глюкозу, лактозу, галактозу, фруктозу, маннозу, тагатозу при их совместном присутствии.

Таблица 5

Коэффициенты смещения углеводов (и == 3 и р = 0,93)

Углеводы Коэффициенты смещения (Яг) 5, Л %

Лактоза 0,23±0,05 0,019 5,90

Галактоза 0,33±0,08 0,034 8,52

Глюкоза 0,42±0,08 0,034 6,93

Фруктоза 0,48±0,07 0,029 6.26

Маниоза 0,55±0.06 0,026 7,00

Тагатоза 0,60±0,09 1 0,039 6,49

Глава 5 посвящена применению тагатозы как натурального подсластителя в технологии напитка и низкокалорийного мороженого. Отражено исследование по токсикологической безопасности тагатозосодержащего подсластителя.

Токсикологические показатели безопасности

тагатозосодержащего комплекса осуществляли на базе «Центра гигиены и эпидемиологии в Воронежской области». Представленный образец по проверенным показателям безопасности согласно ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества. Классификация безопасности» отнесен к IV (четвертому) классу опасности. Средне - смертельная доза при введении в желудок, ЛД-50 (белые крысы) составила более 10000 мг/кг.

Работа по созданию напитка и низкокалорийного мороженого на основе тагатозосодержащего подсластителя заключалась в разработке новой рецептуры и в усовершенствовании технологической линии с учетом производства

тагатозосодержащего концентрата. Преимущества технического решения заключаются в частичной замене сахарозы и полной воды и лимонной кислоты при одновременном обогащении напитка и мороженого комплексом функциональных углеводов, аминокислот, макро-, микроэлементов и водорастворимых витаминов.

Полученные напиток и мороженое обладают качественно новыми органолептическими показателями, характеризуются высокой пищевой ценностью, антиоксидатными и гипогликемическими свойствами, расширяют ассортимент продукции функциональной направленности.

ВЫВОДЫ

1. Разработан способ получения тагатозы из лактозы вторичного сырья.

2. С применением математических методов планирования эксперимента оптимизированы факторы, влияющие на процесс гидролиза лактозы - температура, продолжительность, дозировка ферментного препарата, pH.

3. Исследована кинетика ферментативного гидролиза лактозы и рассчитаны параметры процесса: максимальная скорость, порядок химической реакции (vmax = 1,08-10'5, п = 0,6967).

4. Процесс изомеризации D-галактозы в D-тагатозу оптимизирован с использованием искусственных нейронных сетей и пакета прикладных программ Statistica Neural Networks v.7.0e.

5. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на разных стадиях процесса направленной трансформации лактозы определен качественный и количественный состав углеводного комплекса, содержащего тагатозу.

6. Разработан экспресс-способ идентификации углеводов, в том числе тагатозы, с использованием метода хроматографии в тонком слое с применением в качестве элюента растворителя, состоящего из ацетона, изопропилового спирта и раствора молочной кислоты.

Способ получения тагатозосодержащего подсластителя из молочной сыворотки прошел опытно-промышленную апробацию на ГМЗ «Лискинский» (г. Лиски, Воронежская область).

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах.

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Разработка тагатозосодержащего подсластителя - натурального биокорректора [Текст] / Е.И. Мельникова, С.И. Нифталиев, Е.М Лобанова и др. Н Фундаментальные исследования. - 2009 - №7 - С. 22-23.

2. Исследование кинетики ферментативного гидролиза лактозы [Текст] / С.И. Нифталиев, Е.И. Мельникова, Е.М. Горбунова и др. II Журнал химическая технология - 2010-№11 - С. 693-696.

3. Получение О-тагатозы из лактозы вторичного сырья и

аналитический контроль процесса [Текст] / С.И. Нифталиев, Е.И. Мельникова, Е.М. Горбунова и др. // Журнал химическая технология -2011-№11 -С. 682-686. ’

Материалы некоторых докладов

1. Определение тагатозы методом тонкослойной хроматографии [Текст] / С.И. Нифталиев, Е.И. Мельникова, Е.М Лобанова, М.О. Ширунов // X Межд. конф. молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии». - Казань, 2009. — С. 467.

2. Анализ углеводного состава нового натурального подсластителя методом хроматографии в тонком слое [Текст] 1 С.И. Нифталиев, Е.И. Мельникова, Е.М Лобанова н др. // III Всерос. конф. «Аналитика России». - Краснодар, 2009. - С. 411.

3. Разработка нанобиотехнологии природного подсластителя [Текст] / С.И. Нифталиев, Е.И. Мельникова, Е.М Лобанова, М.О. Ширунов //

III Межд. науч. конф. «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности». - Воронеж, 2009. - С. ) 19-120.

4. Определение тагатозы методом хроматографии в тонком слое [Текст] / Ю.С. Грибанова, М.О. Ширунов, Е.М Лобанова и др. // XII науч. конф. «Львівські хімічні читання - 2009». - Львов, 2009. - А8.

5. Разработка ресурсосберегающей технологии натурального подсластителя и безалкогольных напитков на его основе [Текст] / М.О. Ширунов, Е.М. Горбунова, Е.Ю. Колесова, А.Г. Мягкова // Всерос.научн. конф. Студ, асп. И молодых ученых. - Воронеж, 2009. -С. 108-111.

6. Оптимизация условий ферментативного гидролиза лактозы в пермеате подсырной сыворотки [Текст] / М.О. Ширунов, Е.М. Г орбунова, Е.И. Мельникова, С.И. Нифталиев И XI Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии». - Казань, 2010. -С. 222.

7. Минорные углеводы как компоненты биологически активных добавок [Текст] / Е.М. Горбунова, М.О. Ширунов, Е.А. Ковырялова и др. // Межд. науч.-пракг. Семинар «Современные технологии продуктов питания: теория и практика производства». - Омск, 2010. - С. 69- 71.

8. Получение функциональных производных лактозы [Текст] / Е.И. Мельникова, С.И. Нифталиев, Е.М. Горбунова и др. // Международный журнал экспериментального образования М.: «Академия естествознания», 2010- №7— С.121.

9. Горбунова, Е.М. Химическая и биохимическая трансформация лактозы в функциональные углеводы [Текст] / Е.М. Горбунова, М.О. Ширунов, Е.А. Ковырялова // Сб. трудов регион. Науч. Прает. конф. Студ., асп. и молодых уч. «Наукоемкие технологии и материалы». - Воронеж, 2010.-С. 164-165.

10. Горбунова, Е.М. Определение дериватов лаетозы методом ВЭЖХ [Текст] / Е.М. Горбунова, С.И. Нифталиев // Материалы XLIX отчетной науч. конф. ВГТА за 2010 год. — Воронеж, 2011.-4.1. — С. 278.

Патенты

1. Пат. 2396560 РФ, МПК 7 G 01 N 30/90. Способ идентификации углеводов [Текст] / С.И. Нифталиев, Е.И. Мельникова, Е.М. Лобанова, М.О. Ширунов и др. - № 2009116966/28; Заявл. 04.05.2009; Опубл. 10.08.2010, Бюл. №22, Ч. Ill, 2010.- С.-910.

2. Патент 2409963 РФ, МПК 7 А 53 С 21/00. Способ получения тагатозосодержашей добавки - подсластителя из молочной сыворотки [Текст] / Е.И. Мельникова, С.И. Нифталиев, М.О. Ширунов, Е.М. Лобанова и др. № 2009115432/10, Заявл. 23.04.2009;. Опубл. 27.01.2011, Бюл. № 3-

Ч. III, 2011.-С. 631.

Подписано в печать 25,01.12г. Формат 60x84 1/16 Уел. печ. л. 1,0. Тираж 100 эга. Заказ Кз 03.

ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» (ФГБОУ ВПО«ВГУИТ»)

Отдел полиграфии ФГБОУ ВПО «ВГУИТ»

Адрес университета и отдела полиграфии:

394036 Воронеж, пр. Революции, 19

61 12-2/248

ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНЖЕНЕРНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

На правах рукописи

Горбунова Елена Михайловна

АНАЛИТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРОЦЕССА ПОЛУЧЕНИЯ ТАГАТОЗЫ НАПРАВЛЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИЕЙ ЛАКТОЗЫ

02.00.02 - Аналитическая химия 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель - доктор химических наук, профессор НИФТАЛИЕВ Сабухи Илич-оглы

Воронеж. - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 4

Глава 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 9

1.1 Лактоза как источник получения бифидогенных производных 9

1.1.1 Лактулоза 14

1.1.2 Лактитол 15

1.1.3 Лактосахароза 17

1.1.4 Галактоолигосахариды 18

1.2 Характеристика тагатозы как низкокалорийного подсластителя 20

1.2.1 Физиологическое и медицинское значение тагатозы 20

1.2.2 Функционально-технологические свойства Б-тагатозы 20

1.2.3 Направления применения Б-тагатозы 23

1.2.4 Промышленный способ получения тагатозы 24

1.2.5 Обоснование возможности использования вторичного молочного сырья для получения концентрата с тагатозой 25

1.3 Применение методов аналитической химии в анализе углеводов 27 Глава 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 43

2.1 Объекты исследования 43

2.2 Определение углеводов 49

2.2.1 Метод ТСХ 49

2.2.2Метод ВЭЖХ 50

2.3 Определение концентрации глюкозы 51 2.4Материальная база эксперимента 52

2.4.1 Ультрафильтрационная установка 52

2.4.2 Обратноосмотическая установка 54 2.5 Математическая обработка результатов анализа 57

Глава 3 ТРАНСФОРМАЦИЯ ЛАКТОЗЫ В ТАГАТОЗУ И

ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССОВ 60 3.1 Способ получения тагатозосодержащей добавки

подсластителя из молочной сыворотки 60 3.2Исследование кинетики ферментативного гидролиза лактозы 64 3.3 Математическое обеспечение процесса трансформации лактозы 71

3.3.1 Моделирование процесса гидролиза лактозы 71

3.3.2 Оптимизация параметров гидролиза 76

3.3.3 Оптимизация процесса изомеризации

Б-галактозы искусственными нейронными сетями 79 Глава 4 РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ УГЛЕВОДОВ НА РАЗЛИЧНЫХ ЭТАПАХ

ТРАНСФОРМАЦИИ ЛАКТОЗЫ 96

4.1 Пробоподготовка перед ВЭЖХ 96

4.2Гидролиз лактозы 98

4.3 Изомеризация тагатозы 101

4.4Экспресс-способ идентификации тагатозы 106 Глава 5 ПРИМЕНЕНИЕ ТАГАТОЗЫ КАК НАТУРАЛЬНОГО

ПОДСЛАСТИТЕЛЯ 110 5.1 Токсикологическая оценка тагатозосодержащего натурального

подсластителя 110

5.2Напиток на основе тагатозосодержащего подсластителя 112

5.3Технология производства низкокалорийного мороженого 117

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Углеводы являются одним из основных компонентов клеток и тканей живых организмов, выполняют энергетическую, структурную, пластическую, рецепторную, защитную функции. Контроль содержания углеводов в продуктах питания - актуальная задача большинства производственных и исследовательских лабораторий. Разработка методов количественного и качественного анализов углеводов приоритет многих отраслей науки (аналитическая химия, медицина, биохимия, фармакология и т.д.). В природных объектах эти соединения находятся в виде сложных смесей, содержащих низкомолекулярные неорганические и высокомолекулярные органические вещества, а также соединения белковой природы. Разделение моносахаридов представляет сложную задачу вследствие близости многих физико-химических свойств этих соединений. Будучи весьма лабильными веществами, углеводы, под влиянием даже слабых воздействий, легко подвергаются различным изменениям. Важным является разработка современных, простых, экспрессных способов пробоподготовки и анализа углеводов. Перспективны хроматографические методы, характеризующиеся высокой чувствительностью и селективностью.

Физико-химические и биотехнологические свойства лактозы позволяют рассматривать ее в качестве сахара жизни для компонентов функциональных продуктов, медицинских препаратов. Актуальное научное направление -получение химической и биохимической трансформацией производных (дериватов) лактозы, в том числе тагатозы, востребованных на мировом рынке как пребиотики и бифидогенные производные.

Разработка технологии производства натурального подсластителя на основе тагатозы и применение аналитических методов для контроля процесса на разных этапах трансформации лактозы вторичного сырья, позволяющие оптимизировать и регулировать выход конечного продукта, а также

разработка методик идентификации углеводного состава является актуальной, представляет научную и практическую значимость. Решение проблемы позволит расширить ассортимент продуктов, обладающих функциональными свойствами.

Цель работы - аналитический контроль процесса получения D-тагатозы путем направленной химической и биохимической трансформации лактозы вторичного сырья и разработка способа идентификации углеводов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи;

• разработка способа получения тагатозосодержащего

подсластителя из лактозы вторичного сырья;

• математическое обеспечение этапов трансформации лактозы:

- создание математической модели процесса гидролиза лактозы;

- изучение влияния различных факторов на процесс гидролиза лактозы методом полнофакторного статистического анализа с центральным композиционным униформ-планированием;

- оптимизация условий гидролиза с применением ридж-анализа;

оптимизация процесса изомеризации D-галактозы с использованием искусственных нейронных сетей и пакета прикладных программ Statistica Neural Networks v.7.0e;

• исследование кинетики ферментативного гидролиза лактозы и расчет кинетических параметров;

• распознавание и количественное определение углеводного состава субстрата на разных этапах трансформации лактозы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии;

• разработка способа идентификации тагатозы;

• применение натурального подсластителя в производстве функциональных продуктов.

Научная новизна:

• разработан способ получения D-тагатозы из лактозы вторичного сырья;

• с применением многофакторного статистического анализа оптимизированы основные факторы [температура, время гидролиза, количество вносимого фермента, pH], влияющие на процесс гидролиза;

• оптимизирован процесс изомеризации галактозы в тагатозу с использованием искусственных нейронных сетей и пакета прикладных программ Statistica Neural Networks v.7.0e;

• методом ВЭЖХ качественно и количественно установлен состав тагатозосодержащего подсластителя;

• разработан способ экспрессного детектирования углеводов.

Практическая значимость:

• способ получения тагатозосодержащего подсластителя из молочной сыворотки прошел опытно-промышленную апробацию на ГМЗ «Лискинский» (г. Лиски, Воронежская область);

• предложена математическая модель для оптимизации условий процесса гидролиза лактозы;

• установлен качественный и количественный углеводный состав на различных этапах трансформации лактозы;

• метод хроматографии в тонком слое предложен в качестве экспресс-метода идентификации углеводов, в том числе тагатозы.

Новизна практических разработок подтверждена материалами Роспатента.

Основные положения, представляемые к защите:

• способ получения тагатозосодержащего подсластителя из лактозы вторичного сырья;

• математическая модель процесса гидролиза лактозы;

• оптимизация процесса изомеризации галактозы в Б-тагатозу с использованием искусственных нейронных сетей;

• распознавание и количественное определение методом ВЭЖХ углеводного состава на разных стадиях процесса направленной трансформации лактозы;

• экспресс-идентификация тагатозы методом ТСХ.

Апробация работы

Результаты работы доложены на 75-й конференции молодых ученых «Научные достижения молодежи - решению проблем питания человечества в XXI веке» (Киев, Украина, 2009), Международной конференции «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2009, 2010), Всероссийской конференции «Пищевая промышленность: интеграция науки, образования и производства» (Краснодар, 2009, 2010), XII научной конференции «Львовские химические чтения» (Львов, Украина, 2009), III Международно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности» (Воронеж, 2009) - очно, Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновационные технологии в пищевой промышленности» (Самара, 2009), Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (Воронеж, 2009, 2010) - очно, Международном научно-практическом семинаре -Омского государственного аграрного университета «Современные технологии продуктов питания: теория и практика производства (Омск, 2010), II Международной научно-технической, конференции «Новое в

технологии и технике пищевых производств» (Воронеж. 2010), 47 - 50 отчетных научных конференциях ВГТА (Воронеж, 2009 - 2011) - очно.

Публикации

Основные положения диссертационной работы изложены в 2 патентах, 3 статьях, тезисах 17 докладов, сделанных на Международных, Всероссийских и региональных конференциях.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, выводов, списка цитируемой литературы (140 источников, из них 40 на иностранных языках) и приложения (материалы Роспатента, обучающие выборки, акт опытно-промышленной выработки, протокол лабораторных исследований, почетные грамоты и диплом). Работа изложена на 151 странице машинописного текста, содержит 62 рисунка, 27 таблиц.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Лактоза как источник получения бифидогенных производных

К бифидогенным веществам (пребиотикам) относятся неперевариваемые ингредиенты пищи, способствующие улучшению здоровья за счет избирательной стимуляции роста и (или) метаболической активности одной или нескольких групп бактерий, обитающих в организме. Эффект пребиотиков заключается в снижении продукции аммиака, повышении иммунитета, подавлении роста клостридий, кандид, листерий и др., увеличении всасывания Са из пищи на 40-60 %, усилении энергообеспечения и регенерации эпителия толстой кишки [1].

Производные лактозы, такие как лактосахароза, галактоолигосахариды, лактулоза, лактитол являются бифидогенными веществами [2].

Чтобы компонент пищи был классифицирован как пребиотик, он должен обладать: способностью не расщепляться и не абсорбироваться в верхних отделах желудочно-кишечного тракта; возможностью использования в качестве селективного субстрата для полезных микроорганизмов, стимулируя их рост или метаболическую активность; способностью приводить к нормализации состав кишечной микрофлоры [3].

Лактоза является единственным низкомолекулярным углеводом животного происхождения и одним из трех основных компонентов молока (молочного сырья) [4]. Уникальные физико-химические и биотехнологические свойства лактозы, сформированные в результате эволюции млекопитающих животных и человека для обеспечения их жизни, позволяют рассматривать данный углевод в качестве сахара жизни для компонентов функциональных продуктов, медицинских препаратов.

В соответствии с современными представлениями углеводы выполняют важную пластическую функцию, участвуя в построении различных классов гликопротеидов, к которым относится большинство

белков плазмы крови (включая иммуноглобулины, трансферрин, ингибиторы трипсина, факторы свертывания крови и др.). В состав многих рецепторных гликопротеидов в качестве терминального функционального звена входит галактоза, образующаяся в результате гидролиза лактозы. В связи с этим существует точка зрения, что именно поэтому основным углеводом рационов детей первых месяцев жизни служит дисахарид лактоза [5-7].

В последние годы вызывает особый интерес новое перспективное научное направление — получение производных лактозы (глюкозы, галактозы, лактобионовой кислоты, лактулозы, лактитола и олигосахаридов) [8 - 10]. «Дерево целей» лактозы и ее производных, построенное на основе имеющейся в распоряжении информации, приведено на рисунке 1 и показывает значительное расширение спектра производных и его неограниченную перспективу по ширине и глубине.

/ Мвояачтоз.ч ^ \ \

\

( $*»пмт«ет%т

^ ^Эганоя )

Рис. 1 - «Дерево целей» лактозы и ее производных

Подробная схема генетической связи лактозы и ее производных приведена на рис. 2.

В настоящее время разработаны отечественные и зарубежные технологии получения глюкозо-галактозных сиропов из молочной сыворотки с содержанием не менее 60 % сухих веществ, в том числе глюкозы не менее 11 %. В общем виде схема производства сывороточных концентратов предусматривает получение трех видов продуктов: сыворотка гидролизованная сгущенная, сыворотка гидролизованная сгущенная нейтрализованная, сыворотка гидролизованная сгущенная

деминерализованная [9-14].

Сывороточные концентраты с гидролизованной лактозой рационально использовать в плавленых сырах (замена 30-40 % свекловичного сахара и 15 - 25 % нежирного сыра), при изготовлении сгущенного молока и молочного шербета (замена до 50 % > свекловичного сахара), в качестве заменителя цельного молока (замена до 40 % обезжиренного молока), а также в технологии мучных, кондитерских и булочных изделиях (замена до 100 % свекловичного сахара) [15-17].

Однообразный углеводный состав рационов не обеспечивает снабжение организма минорными моносахаридами, в частности фукозой, маннозой и галактозой [9, 18]. Оптимизирован метод получения L- и D-фукозы на основе D-галактозы, полученной из глюкозо-галактозного сиропа [19, 20]. Хроматографический анализ подтверждает получение препаратов с содержанием фукозы 99,9 %.

В настоящее время производство лактозы достигло 710 тыс. т, а ее производных (рис. 3) - до 900 тыс. т.

В 2010 г мировой рынок лактозы и ее производных составил около 1,5 млрд. долларов. По сравнению с 2008 г объем продаж вырос на 8 %, а прибыль компаний-производителей - на 25 % [21].

сн2он СН.ОН н—он

ноЛ—но—с—н

-о—с—н

Лактитол

он он

он о

мн-с:

но-^он НО^он

Лактозилмочеаина

он „ОН /~ои

Уо~\9н соон

НО-^ОН ОН

-Пактобионоеая кислота

сн2он

сн,он

он он

он он

— • » . - ------ип у**' » ^П -V

МАс * ОН

Лаето- N -тетраоза

НО-^бн

ОН СНгОН

о \—о

ОН ОН

Тиолактоза

снгон НО/1 °чон

СНгОН

/~\он

НО

Глюкозо-галактозный сироп

СНгОН

ОН он

Неолактоза

ОН

Зпилактоза

ОН ОН ОН

З-Эпилактоза

Галактоолигосахариды (п = 1-4-6}

м

14)

Рис. 2 - Схема генетической связи лактозы и ее пооизволных

■ Молочная кислота

■ Лактоза пищевая Лактоза фармацевт.

я Сухой пермеат в Лактулоза

г гос

Лактитол • Лактосахароза

Рис. 3 - Объемы производства лактозы и ее производных в 2010 г

Основные фирмы-производители производных лактозы представлены в табл. 1.

Таблица 1 - Фирмы-производители дериватов лактозы [21]

Продукт Производитель

Лактулоза Moringa, Milel, Inalco, Fresenlus-Kabi, Relax, Biofac

Лактитол Danisco, Purac, Towa, Nikken

Лактобионовая кислота Solvay, Sandoz, US Dairy Ingredient Company

ГОС Friesland Foods Domo, Morinaga, Snow Brand, Yakult, Nissin

Спирт Carbery, Anchor Alcohol

Молочная кислота Purac, Cargill, Hendan Jindan, ADM, Galactic

Лактосахароза Hayashibara, Ensuiko

Тагатоза Aria Foods Ingredients

Дериваты лактозы в настоящее время востребованы на мировом рынке как ингредиенты для функциональных продуктов питания [22]. Экономический потенциал производных лактозы не только окупает затраты на разработку их производства, но и компенсирует все издержки на исходное сырье.

Пребиотики, стимулирующие развитие бифидофлоры, называют также бифидогенными факторами (бифидус-факторами). К ним относят целый ряд разнообразных по строению, природе и свойствам веществ, в т.ч. лактулозу,

лактосахарозу, галакто-, фрукто-, изомальто-, мальто-, ксилоолигосахариды, лизоцим, дрожжевые экстракты, низкоосахаренную кукурузную патоку, яч-менно-солодовый экстракт, гидролизаты казеина и сывороточных белков, муцин, пантетин, лактоферрин и другие [23 - 24].

Наиболее изученным пребиотиком является лактулоза. Полученная впервые как химическое вещество в 1929 году лактулоза в настоящее время стала классическим средством воздействия на метаболизм микрофлоры кишечника.

1.1.1 Лактулоза

Лактулоза - углевод, относящийся к классу олигосахаридов и подклассу дисахаридов, его молекула состоит из остатков галактозы и фруктозы [25]. Методом масс-спектроскопии доказано, что связь между этими моносахаридами - это 1-4 связь [26]. Химическое название лактулозы по современной номенклатуре - 4-0-(3-В-галактопиранозил-0-фруктоза (в сокращенной форме (Р-В-0а1-(1-4)-((3-0-Рш)). Строение молекулы лактулозы может быть представлено в виде структурной, циклической (рис. 4) и конформационных формул [27].

Рис. 4 - перспективная (циклическая) формула лактулозы по У.Хеуорсу

К основным свойствам лактулозы относятся: увеличение численности бифидо- и лактобактерий; подавление патогенной, условно-патогенной микрофлоры, токсичных метаболитов и вредных ферментов; увеличение абсорбции минералов и укрепление костей; стимулирование функции

ОН

печени; активиз