Анализ молока на содержание жира и общего белка методами оптической спектроскопии рассеяния тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

МЕЛЕНТЬЕВА АНАСТАСИЯ АЛЕКСЕЕВНА

АНАЛИЗ МОЛОКА НА СОДЕРЖАНИЕ ЖИРА И ОБЩЕГО БЕЛКА МЕТОДАМИ ОПТИЧЕСКОЙ СПЕКТРОСКОПИИ РАССЕЯНИЯ

02.00.02. - Аналитическая химия «

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 о дпг го15

Саратов - 2015 005561472

005561472

Работа выполнена на кафедре «Химическая технология и промышленная экология в ФГБОУ ВПО «Самарский государственный технический университет».

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Богомолов Андрей Юрьевич

кандидат химических наук, старший научный сотрудник кафедры химической технологии и промышленной экологии, ФГБОУ ВПО «Самарский государственный технический университет»

Доронин Сергей Юрьевич

доктор химических наук, доцент, профессор кафедры аналитической химии и химической экологии ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный

университет имени Н.Г. Чернышевского»

Кирсанов Дмитрий Олегович

кандидат химических наук, доцент кафедры радиохимии Института химии ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Воронежский государственный

университет инженерных технологий»

Защита состоится «24» сентября 2015 года в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 212.243.07 на базе ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» по адресу: 410012, Саратов, ул. Астраханская, 83, корп. 1, Институт химии.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке им. В.А. Артисевич ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» (410601, Саратов, ул. Университетская, 42) и на сайте http://www■sgu■ш/research/dissertation-council/d-212-243-07.

Автореферат разослан «.£?» июля 2015 г.

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук

Русанова Т.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность. Молоко - продукт массового потребления с мировым производством более 700 миллионов тонн в год, и проблема контроля его качества является одной из наиболее актуальных для молочной промышленности. В связи с этим определению состава молока и ежедневному контролю его качества уделяется повышенное внимание. Содержание питательных веществ определяет пищевую ценность продукта и, следовательно, его стоимость. Жир и белок - основные питательные компоненты молока, содержание которых служит индикатором его качества, а также отражает состояние здоровья животных, и сбалансированность их кормления. Поэтому контроль массовой доли жира и общего белка должен регулярно проводиться каждым молочным предприятием на всех стадиях производства.

Оптическая спектроскопия широко используется для контроля качества молока и молочных продуктов. Благодаря быстроте и высокой точности анализа, спектроскопия в средней инфракрасной (ИК) области (4000-400 см'1 или 2,5-25 мкм) принимается в качестве лабораторного стандарта определения жира и общего белка в молоке для крупных молочных заводов и специализированных аналитических центров. Однако высокотехнологичная автоматизация, применяемая для проведения анализов в средней ИК-области, приводит к повышению стоимости оборудования и делает данный метод недоступным для малых предприятий. Разработка новых методов анализа молока, позволяющих производить измерения со сравнимо высокой точностью и доступных для небольших предприятий и ферм, является одной из главных целей современной молочной промышленности. Анализ в области ближнего ИК (БИК) излучения от примерно 780 до 2500 нм (0,78-2,5 мкм) может служить экономически эффективной альтернативой средней ИК-области. Однако характерные для компонентов молока полосы поглощения здесь проявляются на фоне сильно доминирующего поглощения воды и эффектов рассеяния света, что осложняет анализ и снижает его точность.

Анализ молока в диапазоне видимого света и прилегающей коротковолновой БИК-области (Вид/КВ-БИК, 400-1100 нм) весьма привлекателен, благодаря широкой доступности недорогих источников света, детекторов и оптики, что существенно снижает стоимость спектральных анализаторов. В то же время, анализ молока в этой области осложняется сильным эффектом рассеяния света коллоидными частицами жира и белка, более чем на два порядка преобладающим над интенсивностью их полос поглощения. Исследователи обычно пытаются устранить наблюдаемые в спектрах эффекты рассеяния с помощью математической корректировки данных, но из-за чрезвычайной слабости полос поглощения молока в Вид/КВ-

БИК этот подход не приносит желаемой точности анализа. В связи с этим, спектроскопия Вид/КВ-БИК в настоящее время практически не применяется для анализа молока и молочных продуктов, а научные публикации на эту тему очень редки. В то же время, спектрально наблюдаемое рассеяние света в области от 400 до 1100 нм несет в себе информацию как о количестве, так и о размере коллоидных частиц, которая может быть использована для количественного анализа жира и белка.

Данная диссертационная работа посвящена разработке нового подхода к определению массовой доли жира и общего белка в натуральном или гомогенизированном молоке. В основу метода положено извлечение количественной информации из низкоселективных паттернов рассеяния света (зависимостей интенсивности рассеяния от длины волны) различными коллоидными частицами молока при помощи многомерного анализа наблюдаемых спектров диффузного пропускания образцов в области Вид/КВ-БИК излучения.

Цель работы: Разработка нового подхода к определению содержания жира и общего белка в молоке при помощи оптической спектроскопии в области 400-1100 нм.

В связи с поставленной целью было необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить состав и структуру молока как коллоидной системы.

2. Изучить влияние концентраций и распределения по размерам глобул жира, и мицелл белка в натуральном сыром молоке на Вид/КВ-БИК спектры и выявить возможность использования этих эффектов для количественного анализа жира и белка.

3. Разработать методику количественного анализа молока в области 4001100 нм. На серии лабораторных образцов проверить выполнимость анализа выбранным методом в присутствии значительной вариабельности размеров жировых глобул.

4. Построить градуировочные модели на основе большого массива исторических данных (глобальные модели) для определения содержания жира и общего белка в сыром молоке.

5. Изучить возможность реализации предложенного подхода в виде сенсорной системы на базе светодиодов; рассчитать оптимальные длины волн светодиодов в сенсоре.

6. Предложить области практического применения анализа содержания жира и белка, основанного на рассеянии света в Вид/КВ-БИК области.

Научная новизна. Доказана возможность определения массовой доли жира и общего белка в молоке методом оптической спектроскопии в области 400-1100 нм в присутствии значительной вариабельности размеров жировых глобул. Количественный анализ в этой области становится возможным благодаря наблюдаемой по всему исследуемому диапазону разнице спектров

рассеяния коллоидными частицами жира и белка, которые различаются по размерам и концентрации. Математической основой построения градуировочных моделей для жира и белка является анализ многомерных данных (хемометрика), позволяющий эффективно использовать весь объем

спектральной информации.

Для изучения основных закономерностей рассеяния света в молоке в присутствии частиц разных размеров были сняты Вид/КВ-БИК спектры диффузного пропускания в процессе пошаговой гомогенизации образцов. Было обнаружено, что зависимости оптической плотности от времени гомогенизации образца проходят через максимум, за которым следует резкий спад. Наблюдаемые экстремальные зависимости были объяснены с точки зрения

теории представительных слоев (ТПС).

Коллоидная структура молока была впервые изучена методом конфокальной микроскопии комбинационного рассеяния (КР) со сканированием. Полученные гиперспектральные изображения молока были проанализированы методами многомерного анализа.

Разработаны глобальные модели для определения жира и общего белка, охватывающие широкий диапазон изменений состава молока и учитывающие сезонность, региональные различия между образцами различных производителей, а также другие факторы.

Показана возможность замены спектроскопии полной Вид/КВ-БИК области упрощенными оптическими сенсорными системами, основанными на использовании нескольких оптимальных длин волн. Лабораторная модель такой системы была создана с использованием 3-х светодиодов в качестве источника света и цифрового фотоаппарата в качестве детектора. С использованием нового интервального метода отбора переменных, разрабатываемого в СамГТУ, рассчитана оптимальная конфигурация (число и длины волн) светодиодов, необходимых для сенсорного анализатора жира и белка в натуральном молоке.

Практическая значимость работы:

1. Предложен новый подход к определению массовой доли жира и общего белка в натуральном и гомогенизированном молоке. Анализ производится посредством оптической спектроскопии в экономически эффективной Вид/КВ-БИК области.

2. Созданы глобальные (основанные на большом наборе представительных образцов) модели для определения массовой доли жира и общего белка в сыром молоке со среднеквадратичным отклонением предсказания 0,09 % и 0,10 %, соответственно. Модели предназначены для практического использования в анализе молока.

3. Показана возможность замены полноспектрального анализатора содержания жира и общего белка в молоке сенсорной системой, основанной на

светодиодах. Использование светодиодов на оптимальных длинах волн, рассчитанных методом интервального отбора переменных, позволяет получить точность сенсора сравнимую с точностью спектрального анализатора или превышающую ее.

Результаты работы могут быть использованы как для лабораторного анализа молока, так и для обеспечения непрерывного контроля качества на производственной линии. На основе данного подхода могут быть разработаны недорогие портативные, в том числе полевые, анализаторы молока.

Положения, выносимые на занппгу:

1. Новый подход к анализу жира и белка в сыром и гомогенизированном молоке, основанный на спектроскогош рассеяния в Вид/КВ-БИК области с применением методов многомерного анализа данных.

2. Регрессионные модели для количественного определения содержания жира и общего белка в сыром молоке, построенные на большом объеме представительных исторических данных.

3. Интерпретация экспериментальных зависимостей спектральных интенсивностей от размеров частиц, наблюдаемых при глубокой пошаговой гомогенизации, которые были объяснены с использованием теории представительных слоев (ТПС).

4. Оптимальная конфигурация оптического сенсора, основанного на светодиодах (число светодиодов и длины волн максимумов их спектров испускашм), рассчитанная с использованием метода интервального отбора переменных, как альтернатива полноспектральному анализу жира и общего белка в сыром молоке.

Публикации и апробации работы. Материалы диссертации опубликованы в 4-х статьях в журналах, входящих в утвержденный ВАК РФ перечень научных изданий, и 4-х тезисах докладов на международных конференциях. Результаты исследований были доложены на «VIII Winter Symposium on Chemometrics» (д. Дракино, 2012), «XIII Conference on Chemometrics in Analytical Chemistry» (г. Будапешт, Венгрия, 2012), «NIR2013 -16th International Conference on Near Infrared Spectroscopy» (r. JIa Гранд Мотт, Франция, 2013), «IX Winter Symposium on Chemometrics» (г. Томск, 2014), «17th International Diffuse Reflectance Conference» (г. Чамберсбург, США, 2014).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов исследования, методов проведеши эксперимента и анализа полученных данных, трех глав с обсуждением полученных результатов, заключения, выводов, списка принятых сокращений и терминов и списка использованных источников. Работа изложена на 134-х страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 45 рисунков. Библиофафия включает 106 источников.

Личный вклад автора. Основные экспериментальные результаты, приведенные в диссертации, получены самим автором или при его непосредственном участии. Автор проводил обработку, обобщение полученных результатов и формулировал основные научные положения и выводы. Наряду с научным руководителем и соавторами, автор участвовал в написании всех имеющихся публикаций, обсуждении результатов и формулировке выводов.1

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы цели и задачи исследования, рассмотрена научная новизна работы, описана практическая значимость результатов исследования.

Первая глава «Обзор литературы» посвящена описанию структуры молока и его свойств. В главе рассматриваются факторы, влияющие на состав молока, а также химические и физико-химические методы его количественного анализа. Особое внимание в литературном обзоре уделено современным методам оптической спектроскопии в средней и ближней ИК-области, применяемым для анализа жира и общего белка в молоке. Рассмотрены различные математические методы обработки данных, в том числе анализ многомерных данных, а также методы и приближения теории рассеяния. Сформулирована актуальность дальнейшего развития оптических методов количественного анализа молока на содержание жира и белка.

Во второй главе представлены сведения о сборе и подготовке образцов молока для анализа, описаны используемые методы исследования и алгоритмы анализа многомерных данных.

Исследования выполнялись автором в научно-исследовательских лабораториях фирм «J&M Analytik» (г. Эссинген, Германия) и «Witek» (г. Ульм, Германия), в лаборатории кафедры «Технология пищевых производств и парфюмерно-косметических продуктов» ФГБОУ ВПО «Самарский государственный технический университет» (СамГТУ), а также в лаборатории завода «МК «Самаралакто» ОАО «Данон-Юнимилк» (г. Самара, Россия).

В качестве арбитражных (референтных) были использованы следующие методы анализа: 1) определение массовой доли жира - метод Гербера, ГОСТ 5867-90; 2) определение массовой доли белка - метод Кьельдаля, ГОСТ 2332798; 3) определение массовой доли жира и белка — спектроскопия в средней ИК-области на приборе «Milkoscan» (для сырого молока — «Milkoscan FT6000» и

1 Автор одержала победу в конкурсе по моделированию на конференции «П"1 International Diffuse Reflectance Conference» (г. Чамберсбург, США, 2014). Ей также получены 2 гранта на поездку на конференции «NIR2013 -16"' International Conference on Near Infrared Spectroscopy» (г. Ла Гранд Мотг, Франция, 2013) и «17th International Diffuse Rcflcctance Conference» fr. Чамберсбург. США, 2014).

«Milkoscan FT120», для пастеризованного - «Milkoscan FT2»), ГОСТ 322552013.

В исследовании использовались образцы молока из различных источников:

1) стандартные образцы молока (далее в тексте «стандарты QSE») -образцы с точно известной массовой долей жира, белка и лактозы фирмы «QSE GmbH» (г. Вольнцах, Германия); такие стандартные образцы обычно используются для градуировки оборудования в молочной промышленности;

2) образцы сырого молока - образцы, полученные на заводе «МК «Самаралакто» (г. Самара, Россия), собранные с различных молочных хозяйств Приволжского федерального округа;

3) образцы гомогенизированного молока - образцы молока различных производителей России и Германии, купленные в супермаркетах.

Коллоидная структура молока была изучена с помощью конфокальной КР-микроскопии на сканирующем оптическом ближнепольном микроскопе, оснащенном детектором комбинационного рассеяния Alpha300S (компания «Witek», г. Ульм, Германия). Для анализа использовались стандарты QSE с различным содержанием жира и белка.

Для исследования влияния размеров жировых глобул на Вид/КВ-БИК спектры к четырем стандартам QSE с различным содержанием жира и белка была применена глубокая пошаговая гомогенизация с помощью ультразвукового гомогенизатора UP50H фирмы «Hielscher Ultrasonics GmbH» (г. Тельтов, Германия). Шаг гомогенизации образцов начинался с 3 с; далее временные интервалы регулировались по ходу эксперимента в зависимости от наблюдаемых спектральных изменений. Эффективность гомогенизации контролировалась под оптическим микроскопом при 40-кратном увеличении.

Для количественного анализа молока были построены модели на различных градуировочных сериях: образцы, приготовленные путем смешивания стандартов QSE («лабораторная модель»), образцы молока, купленного в супермаркетах («модель для гомогенизированного молока»), и большой набор образцов сырого молока («глобальная модель»),

Градуировочные серии образцов для лабораторных моделей были приготовлены путем смешивания двух наборов стандартов QSE с известными концентрациями (по 4 образца в каждом наборе), в которых преимущественно варьировалась массовая доля жира (F-набор) или массовая доля белка (Р-набор). Образцы исходных наборов попарно смешивались между собой во всевозможных комбинациях в соотношении 1:2 и 2:1 (рис. 1). Таким образом, результирующие F- и Р-серии состояли из 16 образцов каждая: 4 исходных стандарта и 12 образцов, приготовленных путем смешивания. В углах схемы на рис. 1 расположены исходные стандарты, в то время как смешанные образцы

лежат на соединительных линиях. Дистанция между образцами вдоль линий соответствует пропорции смешения.

Размеры глобул жира в сыром молоке распределяются в основном в пределах от 1 до 10 мкм. Для того чтобы сделать модель устойчивой к натуральной вариации размеров жировых глобул в молоке, к градуировочной серии была применена легкая ультразвуковая гомогенизация. Каждый образец анализировался 3 раза: в исходном виде и после двух последовательных 10-ти секундных гомогенизаций. Таким образом, полный набор данных для построения лабораторных моделей состоял из 96 измерений: 32 образца в Б- и Р-наборах в 3-х степенях гомогенизации каждый (исходный образец, и он же после гомогенизации с суммарным временем 10 и 20 с).

Рис. 1. Схема смешивания градуировочных образцов лабораторной модели.

Образцы сырого молока для построения глобальных моделей были собраны в течение одного года на крупнейшем молочном предприятии Самарской области «МК «Самаралакто» ОАО «Данон-Юнимилк». Они доставлялись на завод из 72-х молочных хозяйств Приволжского федерального округа. Чтобы расширить концентрационный диапазон по жиру, часть образцов молока была смешана со свежим обратом, взятым на производственной линии завода «Самаралакто». Таким образом, диапазон концентраций по жиру составил 1,55-4,97 %, а по белку 2,27-4,25 %, что отражает вариабельность состава натурального молока. Чтобы изучить влияние хранения образцов на моделирование, 208 образцов после пробоотбора были сохранены в холодильнике при температуре 5+1 °С и проанализированы на следующий день (через 15-24 ч). Полный набор данных для моделирования по жиру включал 1006 образцов, а по белку - 1000 образцов молока.

Было проведено исследование покупного гомогенизированного молока от различных российских и немецких производителей. Кроме различий по количественному составу образцов, анализируемое молоко различалось по типам обработки: пастеризованное, ультрапастеризованное и молоко с нулевым содержанием лактозы. Чтобы расширить концентрационное разнообразие образцов для моделирования, образцы одной марки с различным содержанием жира были смешаны между собой в разных пропорциях. Жирность молока немецких производителей варьировалась от 1,5-3,8 %, а российских -1,5-6 %.

Спектральный анализ молока в Вид/КВ-БИК области (400-1100 нм) проводился с помощью диодно-матричного спектрофотометре серии «TIDAS Е» (компания «J&M Analytik», г. Эссинген, Германия) в кювете из специального оптического стекла с длиной оптического пути 4 мм (фирма «Hellma GmbH & Co. KG», г. Мюльхайм, Германия).

Для исследования молока методом анализа цифровых изображений были использованы образцы градуировочной серии лабораторной модели (96 измерений). Цифровые изображения молока были получены с помощью фотоаппарата Canon 400D при поочередном подсвечивании каждого образца объемом 4 мл, находящегося в чашке Петри, тремя светодиодами (голубой -максимальная интенсивность при 465 нм, зеленый - 526 нм, красный - 630 нм) через оптоволоконный кабель. Схема экспериментальной установки показана на рис. 2. Каждое изображение фиксировало световое пятно, полученное на поверхности образца в результате диффузного пропускания света от источника. Для каждого образца было получено по пять изображений от каждого источника света с использованием брекетинга со временами экспозиции: 1, 16, 14, 1/8 и 1/15 с. Таким образом, каждый образец был представлен 15-ю изображениями.

Рис. 2. Схема экспериментальной установки для анализа образцов молока при помощи цифровой фотографии.

Для анализа данных использовались различные хемометрические методы. Для углубленного изучения структуры данных использовался метод главных компонент (МГК). Для построения градуировочных моделей по жиру и общему белку использовалась ПЛС-регрессия. Для сбора признаков изображений использовался метод концентрических колец, предложенный в настоящей работе. Для улучшения моделей (точности и надежности прогнозирования) были применены три метода отбора переменных: интервальный ПЛС (ИПЛС), метод конкурентной адаптивной перевзвешанной выборки (КАПВ) и новый метод отбора интервалов, предназначенный для оптимизации оптических сенсоров, разработанный в лаборатории «Многомерный анализ и глобальное

о

J фотоаппарат

источник света

^ Я/~\ ПГЧ1/П

моделирование» («МАиГМ») СамГТУ. Этот метод частично представлен в настоящей работе.

Обработку данных проводили с помощью программного обеспечения PLS Toolbox v6.7 (Eigenvector Research inc., г. Венатчи, США) для MATLAB R2008b и R2012a (The Math Works Inc., г. Натик, США).

Третья глава посвящена качественному анализу молока методами оптической спектроскопии. Изучение коллоидной структуры молока необходимо для углубленного понимания эффекта рассеяния, лежащего в основе анализа в Вид/КВ-БИК области. Использование конфокальной КР-микроскопии позволяет получать микроизображения исследуемых образцов, несущих спектральную информацию в каждой своей точке («пшерспектры»). В данной работе образцы молока различного состава были впервые изучены при помощи пшерспектральных изображений, полученных конфокальной КР-микроскописй. Использование этого метода позволило подробно изучить химический состав различных элементов изображения с пространствешшм разрешением 1 мкм и менее.

Мультимодальное распределение размеров коллоидных частиц (жира и белка) в молоке усложняет его количественный анализ методом спектроскопии в Вид/КВ-БИК области. Для изучения влияния размеров глобул жира на спектры диффузного пропускания был проведен следующий эксперимент. Образцы молока различного состава (стандарты QSE) подвергались пошаговой гомогенизации с одновременной регистрацией спектров в области 400-1100 им. Характер спектральных изменений описывался двумя последовательно сменяющими друг друга фазами: 1) начальным ростом спектральной интенсивности во всей исследуемой области при относительно слабых степенях гомогенизации и 2) резким падением интенсивности в длинноволновой области спектра (выше 600-750 нм) при высоких степенях гомогенизации (рис. 3). Таким образом, оптическая плотность в длинноволновой области спектра проходила через максимум и затем резко падала. Следует отметить, что наблюдаемое необычное поведение спектров является следствием только физических изменений в образце, при том, как его химический состав остается неизменным.

(а) (б)

Длина волны (нм) Длина волны (нм)

Рис. 3. Спектры диффузного пропускания образцов молока различного состава: (а) низкая массовая доля белка; (б) высокая массовая доля белка; (в) низкая массовая доля жира; (г) высокая массовая доля жира в различных степенях гомогенизации; время гомогенизации показано переходами оттенков между тремя цветами: синим (0 с), черным (200 с) и красным (1600 с).

Объяснение наблюдаемых эффектов было дано на основе теории представительных слоев (ТПС). Первичная гомогенизация ведет к быстрому росту числа глобул жира в образцах молока. Например, одна глобула диаметром Юмкм может быть разбита на 8 равных частиц по 5 мкм каждая. Таким образом, на месте одного слоя частиц появляются два. Согласно ТПС, рассеяние света одной отдельно взятой частицей прямо пропорционально площади ее поперечного сечения. ТПС рассматривает модель двунаправленного распространения света. Так, весь пропущенный свет проходит через представительный слой в прямом направлении (180°), а весь рассеянный свет отражается под углом 0° по отношению к падающему свету. На рис. 4а схематично изображена рассчитанная по ТПС зависимость оптической плотности образца от размера частиц и соответственно от количества представительных слоев. Чем меньше размеры частиц, тем больше число представительных слоев и тем сильнее рассеяние. Стоит отметать, что

картина распределения горизонтальных линий на рис. 4а сходна с характером спектральных изменений на начальном этапе гомогенизации (рис. 3).

Для больших частиц наблюдаемые при гомогенизации эффекты не зависят от длины волны. При уменьшении частиц до размеров, сравнимых с длиной волны и менее, что характерно для второй стадии гомогенизации, оптическая плотность начинает зависеть от длины волны в соответствии с экспоненциальной функцией в различных степенях, что схематически изображено на рис. 46. (а)

''мам»;

■ Т^: ; Длина волны

¿-7*

"г- ' -т :

§ Т : :*» ;

О» | ... *

° ; • :

и

"1 ! и : »

¿ г ; ; —; -

Размер частиц(условные ед.)

Рис. 4. (а) Схематическая иллюстрация зависимости изменения оптической плотности образца от количества представительных слоев (число справа от горизонтальных

линий) и соответствующего размера частиц. Т - коэффициент пропускания, посчитанный по ТПС; (б) Схематические зависимости оптической плотности от длины волны для частиц разных размеров. Слева приведены степени экспоненциальной функции, характеризующей правую часть кривой (0 - для частиц, которые гораздо больше, чем длина волны, 4,0 - для частиц с намного меньшим размером, чем длина волны).

Описанные спектральные эффекты наблюдаются во всех изученных образцах, однако амплитуда изменений, наблюдаемая в первой и второй фазах гомогенизации, а также скорости перехода из одной фазы в другую, зависит от исходного состава образца (рис. 3). Наиболее раннее и глубокое падение оптической плотности наблюдается у образца с наименьшей массовой долей жира (рис. Зв). Для образца же с высоким содержанием жира (рис. Зг) требуется гораздо большее время для того, чтобы гомогенизация привела к падению спектральной интенсивности в длинноволновой области. Спад интенсивности для этих образцов слабее, и спектры быстро приходят в конечное равновесие. В этом состоянии плотность частиц настолько высока, что они склонны к реагломерации, что и объясняет отсутствие дальнейших изменений при глубоких степенях гомогенизации. В двух других образцах с высоким содержанием жира (рис. За и б), но различным содержанием белка начальная стадия гомогенизации схожа. Однако спад спектральной интенсивности наиболее выражен и проходит глубже у образца с наибольшей массовой долей белка. Это объясняется увеличением суммарной площади поверхности глобул

жира при гомогенизации, что требует большего количества белка для создания стабилизирующих мембран. Таким образом, чем больше белка содержится в образце, тем более глубокую гомогенизацию он может выдержать.

В четвертой главе описаны результаты количественного анализа жира и общего белка в молоке посредством оптической спектроскопии в области 4001100 нм для различных серий образцов (лабораторная модель, глобальная модель и модель для гомогенизированного молока). В главы также уделено внимание проблеме переноса модели с одного серийно производимого прибора на другой.

На рис. 5 показаны 96 спектров образцов молока, использованных для построения лабораторных моделей жира и белка. Выделенные кривые иллюстрируют спектральные особенности образцов различного состава. Так, образцы с высоким содержанием жира характеризуются более высоким поглощением во всей исследуемой области. В то же время, различное содержание белка преимущественно проявляется в «наклоне» спектров, т.е. в наличии зависимости интенсивности от длины волны. Влияние размеров частиц на спектры сходно с эффектом изменения концентрации жира, поскольку также ассоциируется с плотностью рассеивающих частиц в образце, однако имеет свои спектральные особенности. Методы регрессионного анализа, такие как ПЛС, позволяют, основываясь на относительно небольших спектральных отличиях в области 400-1100 нм, строить количественные модели для определения содержания жира и белка при значительной вариабельности размеров частиц.

низкое содержание белка высокое содержание белка низкое содержание жира

400 500 600 700 800 900 1000 1100 длина волны (нм)

Рис. 5. Спектры образцов молока лабораторной модели (96 измерений).

В табл. 1 представлены результаты построения градуировочных ПЛС-моделей содержания жира и общего белка. Для статистической проверки (валидации) моделей было использовано три метода: полная перекрестная

проверка (ППП), сегментная перекрестная проверка (СПП, сегменты складывались из спектров одного образца в трех степенях гомогенизации) и проверка с помощью спланированного тестового набора образцов (по дизайну).

Модели, основанные на необработанных спектральных данных, уже демонстрируют достаточно высокую точность анализа по сравнению с литературными данными: среднеквадратичное отклонение (СКО) предсказания перекрестной проверки сегментами равно 0,14 % для жира и 0,04 % для белка. Так как применяемый метод основан на рассеянии, использование методов предварительной обработки спектров для корректировки рассеяния, например, метода коррекции многократного рассеяния (МКР), только увеличивает ошибку предсказания.

Дальнейшее улучшение моделей может быть достигнуто методом интервального ПЛС (ИПЛС), который позволяет выбрать наиболее информативные спектральные участки для определения жира и белка. При использовании ИПЛС ошибка предсказания массовой доли жира снижается до 0,08 %. Ошибка предсказания массовой доли белка также несколько снижалась (по результатам полной и сегментативной проверки), но за счет появления дополнительной ЛП. Графики зависимостей предсказанных от измеренных значений для ИПЛС-моделей по жиру и белку показаны на рис. 6.

Таблица 1

Результаты ПЛС-моделирования: статистика градуировки и валидации лабораторных моделей

Набор данных а* Градуировка ППП6 СПП" По дизайну'

СКОГ И СКОПП к* СКОПП И2 СКОП И2

содержание жира

рд 5 0,121 0,963 0,134 0,954 0,141 0,949 0,130 0,952

Рми>е 4 0,198 0,899 0,215 0,882 0,224 0,872 0,198 0,893

р ж г о1117| 5 0,069 0,986 0,077 0,983 0,077 0,983 0,070 0,984

содержание общего белка

Р 4 0,040 0,965 0,042 0,961 0,043 0,960 0,040 0,959

Рмкр 5 0,059 0,923 0,071 0,889 0,073 0,884 0,061 0,911

р 3 г ошп 5 0,037 0,971 0,040 0,965 0,041 0,964 0,038 0,965

Примечание: 'количество латентных переменных (ЛП) в модели; 6полная и "сегментативная перекрестная проверка (обе характеризуются среднеквадратичным отклонением перекрестной проверки, СКОПП); г проверка с помощью тестового набора; д полный набор данных в моделях по определению содержания жира (Б) или общего белка (Р) в оптимальной спектральной области: 420-1035 нм и 420-1070 нм, соответственно; 'спектры, предварительно обработанные методом МКР; "модель Б с семью выбросами с выбранными при помощи ИПЛС оптимальными спектральными интервалами: 520-539 и 860-959 нм, 5 образцы Р модели с одним выбросом с выбранными при помощи ИПЛС оптимальными спектральными интервалами: 440459,480-519, 560-579, 740-759, 800-819 и 900-959 нм.

Рис. 6. Зависимость предсказанных от измеренных значений в лабораторных ИПЛС-моделях: (а) жира и (б) общего белка.

Проведенное лабораторное исследование доказало принципиальную возможность количественного анализа жира и общего белка предложенным оптическим методом, основанным на рассеянии света, при значительной вариабельности размеров жировых глобул, присущей натуральному молоку.

Для успешного практического применения данного подхода необходимо построить многомерную модель, обученную на представительном наборе образцов молока (глобальную модель), которая будет устойчива к их естественным химическим и физическим изменениям. Колебания свойств молока могут быть обусловлены сезонностью, географическими факторами, генетическими особенностями животных, а также условиями их содержания и кормления. Для построения таких глобальных моделей для определения массовой доли жира и общего белка были использованы образцы молока, собранные в течение одного года.

Было обнаружено, что содержание жира и общего белка в молоке имеет сезонные различия. Выделено два периода: теплый (с мая по сентябрь) и холодный (с октября по апрель), между которыми наблюдались наиболее заметные изменения. Наибольшее среднее значение массовой доли жира и белка наблюдается в холодный период. Это преимущественно связано с тем, что в теплый период животные питаются природной растительностью на пастбищах, а в холодный — специальными кормами, содержащими добавки, повышающие питательность. Таким образом, режим и рацион кормления, а также метаболическая адаптация к климатическим изменениям, влияют на питательность молока. Количественные изменения в составе молока также были найдены в образцах, полученных из различных хозяйств. Около 50 % исследуемых образцов были собраны с молочных хозяйств Самарской области. Остальные образцы доставлялись из Оренбургской, Ульяновской областей,

Татарстана, Башкортостана, республики Чувашии и Пермского края. Несмотря на сходство климатических условий данных регионов (в основном умеренно-континентальный климат), образцы, полученные от различных хозяйств, отличаются по среднему значению содержания жира и белка. Анализ этих различий позволяет предположить, что состав молока зависит от условий содержания животных (кормления, доения и т.д.). Рассмотренные факторы, влияющие на состав молока, обязательно должны быть учтены при построении количественных моделей состава молока путем включения соответствующих образцов в обучающий набор.

Помимо этого, было изучено влияние длительности хранения образцов молока на Вид/КВ-БИК спектры. Несмотря на небольшие спектральные изменения, наблюдаемые в образцах в результате суточного хранения (максимальная разница 0,02 в единицах оптической плотности), они могут быть включены в ПЛС-модели без ущерба для точности прогнозирования. Наблюдаемая разница объяснена тем, что в процессе хранения коллоидная структура молока претерпевает некоторые изменения. Так, структура оболочек жировых глобул постепенно нарушается, что приводит к частичному переходу фосфолипидов из оболочек в плазму. В случае же белка, часть мицелл казеина растворяется, в конечном итоге превращаясь в сыворотку. Это растворение -длительный процесс, который достигает равновесия примерно через сутки.

Результаты моделирования методом ПЛС-регрессии приведены в табл. 2. Несмотря на большое разнообразие образцов, полученные точности предсказания сравнимы с приведенными ранее результатами для лабораторной модели (табл. 1). Учитывая большое количество потенциальных факторов, влияющих на состав молока, построенные модели характеризуются математической простотой: оптимальное количество ЛП для жира и белка составило 5 и 6, соответственно.

Таблица 2

Результаты ПЛС-моделирования: статистика градуировки и валидации глобальных моделей.

Набор данных Метод а а Градуировка С ГШ" ПТН"

ског К СКОПП К1 СКОП К1

^006 ПЛСе 5 0,163 0,882 0,172 0,867 0,165 0,881

ПЛС+инт ж 0,093 0,961 0,096 0,959 0,091 0,961

р л Г1000 ПЛС 6 0,115 0,691 0,125 0,636 0,114 0,682

ПЛС+инт3 0,093 0,797 0,102 0,758 0,097 0,805

Примечание: 3 количество ЛП; 6 сегментативная перекрестная проверка десятью смежными блоками; 1 проверка случайно выбранным тестовым набором (30 % от общего количества образцов);г полный набор данных для модели по жируй л по белку;с ПЛС на полном наборе спектральных данных; * ПЛС-модель по жиру для отобранных оптимальных интервалов длин волн (нм): 619-649, 707-737, 720-750, 761-791, 792-822, 837-867, 874-904, 886-916, 901-931, 925-955 с усреднением внутри интервалов (1-я производная по Савицкому-Голаю,

ширина фильтра = 18 (без центральной точки), порядок полинома = 2); 3ПЛС-модель по белку для отобранных оптимальных интервалов длин волн (нм): 556-582, 604-663, 739-765, 796-829, 860-933, без усреднения (1-я производная по Савицкому-Голаю, ширина фильтра = 10 (без центральной точки), порядок полинома = 2).

В результате использования предложенного в «МАиГМ» СамГТУ метода отбора интервалов удалось значительно улучшить точности предсказания (СКОП) глобальных моделей до 0,091 % для определения содержания жира и 0,097 % для определения содержания белка (рис. 7).

(б)

1

1

1 1 1 дй В- ----

1 .у» ГьНЯ 'ПШиИН "ШцШ /ц :

|

2.5 3 3.5 4 4.5 5 2.6 2.8 3 3.2 3,4 3.6 3.8 4 4.2 % жир измеренный % белок измеренный

Рис. 7. Графики зависимости предсказанных от измеренных значений для глобальных моделей (а) жира и (б) общего белка для отобранных оптимальных интервалов длин

волн.

Разнообразие анализируемых образцов в глобальной модели позволяет охарактеризовать набор данных как представительный, учитывая, что в него включены основные факторы изменчивости, присущие сырому молоку в исследованной географической области. Поэтому ожидается, что эти модели смогут обеспечить высокий уровень точности при анализе новых образцов.

Возможность применения спектроскопии в Вид/КВ-БИК области для определения жира также была проверена на промышленно гомогенизированном молоке, представленном в продаже в торговых сетях. Для этого были построены ПЛС-модели для определения содержания жира в образцах немецкого и российского молока, а также на объединенном наборе данных. Несмотря на некоторые различия в режимах обработки исследуемых образцов (механическая и термическая), модель для объединенных данных имеет высокую точность предсказания (СКОГТП = 0,131 %). Анализ графиков счетов показал, что различные режимы термообработки влияют на состав молока. Это доказывает, что различия в образцах немецкого и российского молока (например, по географическому фактору и режимам обработки) можно охватить в рамках одной ПЛС-модели.

В четвертой главе также уделено внимание проблеме переноса модели с одного серийно производимого прибора на другой. Параллельный анализ образцов лабораторной модели на двух спектрометрах одной марки (ТГОА8 Е)

показал, что спектры, снятые различными приборами, могут существенно отличаться. Таким образом, при серийном производстве приборов необходимо осуществлять перенос модели с одного анализатора на другой. В данной работе был успешно использован метод коррекции отсечения и наклона с помощью поправочных коэффициентов, вносимых в модель вторичного прибора (прибора, на который переносится модель). Этот метод позволяет производить перенос модели практически без потери точности.

В пятой главе предложены подходы к созданию оптической сенсорной системы для анализа молока. В современной молочной промышленности наиболее востребованы недорогие компактные анализаторы, позволяющие производить контроль питательных компонентов молока в небольших лабораториях, а также в полевых условиях. Такие анализаторы, действующие по принципу сенсорной системы, могут быть разработаны с помощью последних достижений в области светодиодной техники, волокошюй оптики и электропики. При этом спектроскопия полного диапазона (400-1100 нм) может быть заменена набором светодиодов, поочередно излучающих импульсы на нескольких длинах волн и фотоприемником, детектирующим результат взаимодействия света с образцом. Замена спектрометра оптической сенсорной системой дает значительную экономическую выгоду.

Для исследования принципиальной возможности анализа с использованием отдельных длин волн был проведен следующий эксперимент. Образец объемом 4 мл помещался в чашку Петри и подсвечивался снизу при помощи оптического волокна из кварцевого стекла диаметром 1,2 мм. Источниками света при этом служили три светодиода в видимой области спектра. Изображения световых пятен, образующихся благодаря диффузному рассеянию света при его прохождении через слой образца, фиксировались при помощи цифровой фотокамеры (рис. 2). Измерения проводились на лабораторной серии образцов.

На рис. 8 представлены цифровые изображения образцов молока различного состава (рис. 8а и б) и в различных степенях гомогенизации (рис. 8в). Увеличение массовой доли бежа и жира, а также гомогенизация, приводит к заметному росту оптической плотности образца, и, следовательно, к понижению общей интенсивности, как видно из этих изображений. Во всех случаях, рост оптической плотности образцов сопровождается увеличением интенсивности рассеяния из-за увеличения количества частиц в образце, но трехмерные профили наблюдаемых интенсивностей у каждого эффекта свои, что видно из графиков разности соответствующих пар изображений (рис. 8 г, д, е). Это может бьггь использовано для количественного анализа жира и белка с применением регрессионного анализа изображений.

Построенные ПЛС-модели позволяют определять содержание жира и белка с точностью 0,22 % и 0,12 % (СКОПП), соответственно. Небольшое

снижение точности по сравнению с лабораторной моделью на тех же данных объясняется заменой полного спектрального диапазона тремя произвольно выбранными длинами волн видимого диапазона.

(г) (д) (е)

Рис 8. Цифровые изображения образцов молока для времени экспозиции !4 с: (а) слева - образец с низким содержанием белка, справа - образец с высоким содержанием белка без гомогенизации; (б) слева - образец с низким содержанием жира, справа - образец с высоким содержанием жира без гомогенизации; (в) слева -образец с высоким содержанием жира после 10 с, справа - 20 с гомогенизации; (г) (Д), (е) трехмерные графики разности между парами зеленых изображений в (а), (б),

(в), соответственно.

Для разработки отдельного устройства оптического анализатора, помимо выбора оптимальных длин волн сенсоров, необходимо учитывать их амплитудно-частотные характеристики. Такая оптимизация была проведена математически с использованием спектральных данных лабораторной модели. Для этого применялся метод отбора интервалов переменных, разрабатываемый в лаборатории «МАиГМ», использующий для оптимизации модифицированный генетический алгоритм (рис. 9).

длина волны (нм)

Рис. 9. Оптимальная конфигурация сенсора для одновременного определения жира и общего белка в молоке. Поверх спектральных данных лабораторной серии (серые линии) изображены нормированные спектры испускания светодиодов оптимизированного набора.

Найденные интервалы положены в основу разрабатываемого в СамГТУ нового оптического сенсора для определения жира и общего белка в молоке.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Объемное исследование, выполненное в настоящей работе, предлагает и обосновывает новый подход к определению содержания жира и общего белка в молоке. Подход основан на многомерном (хемометрическом) анализе низкоселективных спектральных сигналов (паттернов), отражающих зависимости интенсивности рассеяния коллоидными частицами разных размеров от длины волны в области 400-1100 нм. В противовес существующим основанным на рассеянии методам определения жира в молоке (таким как турбидиметрия), настоящий подход позволяет анализировать не только гомогенизированное, но и сырое натуральное молоко, в котором распределение жировых глобул по размерам непостоянно. Разность размеров рассеивающих частиц до настоящего времени считалось непреодолимым препятствием для точного количественного анализа молока турбидиметрическими методами. Кроме того, предложенный подход позволяет определять содержание мицеллярного и общего белка, и проводить анализ без какой-либо предварительной пробоподготовки.

Для обоснования предложенного подхода было тщательно изучено влияние размеров жировых глобул на спектры диффузного пропускания. Наблюдаемые экстремальные зависимости спектральной интенсивности от степени гомогенизации образца были успешно объяснены с точки зрения теории представительных слоев и других теорий рассеяния. Коллоидная структура молока впервые изучена с использованием гиперспекгральных микроскопических КР-изображений. Была разработана уникальная лабораторная методика создания калибровочной серии путем смешивания стандартов молока известного состава и их частичной ультразвуковой

гомогенизации для имитации естественной вариабельности размеров жировых глобул. Методика была использована для создания и сравнения различных лабораторных моделей и для их углубленной интерпретации.

Разработанный подход имеет большую практическую ценность, и может быть положен в основу целого ряда аналитических устройств. Сюда относятся как лабораторные анализаторы жира и белка в сыром и гомогенизированном молоке, так и экспрессные аналитические системы сенсорного типа, предназначенные для полевого анализа или встраивания в производственную линию. Применимость подхода к анализу гомогенизированного молока была проверена на большом объеме разнообразных образцов, доступных в торговых сетях России и Германии. Немалую практическую ценность представляют глобальные модели, построенные на представительном объеме образцов, собранных в течение года в большом географическом регионе. Модели уже используются для контроля состава молока в процессе производства сыра в СамГТУ. Проведенный расчет сенсорной системы для одновременного анализа жира и белка, базирующийся на семи светодиодах, показал, что переход от полноценной спектроскопии к компактным и недорогим аналитическим устройствам возможен без потери точности анализа.

В целом, результаты настоящей диссертационной работы представляют значительный интерес для исследователей в области анализа молока и имеют высокую практическую значимость.

ВЫВОДЫ

1. Доказана возможность количественного анализа жира и общего белка в молоке методом спектроскопии в видимой и коротковолновой ближней ИК-области при значительной вариабельности размеров жировых глобул.

2. Построены глобальные модели для определения жира и общего белка в сыром молоке, основанные на большом объеме представительных исторических данных и учитывающие все основные факторы вариабельности состава молока.

3. Обнаружено, что глубокая гомогенизация образцов молока характеризуется необычными спектральными изменениями: равномерный рост оптической плотности во всей области 400-1100 нм сменяется ее резким падением в длинноволновой области спектра. Наблюдаемый эффект был объяснен с применением теории представительных слоев.

4. Показано, что метод «наклона и отсечения» может быть использован для переноса модели с одного прибора на другой без потери точности, что необходимо при серийном производстве анализаторов.

5. Разработанный новый подход был успешно применен к анализу жира в гомогенизированном молоке, приобретенном в различных супермаркетах.

Обнаружены и проанализированы особенности молока различных производителей России и Германии.

6. С помощью лабораторной установки была показана возможность количественного определения состава молока методом анализа цифровых изображений дри просвечивании образцов молока светодиодами на разных длинах волн. При помощи интервального метода отбора переменных было рассчитано число и длины волн свегодиодов, необходимых для создания молочного сенсора.

7. Для изучения состава и коллоидной структуры молока впервые применен метод конфокальной микроскопии комбинационного рассеяния.

Основные материалы работы опубликованы в следующих работах:

1. Bogomolov A., Melenteva A. Scatter-based quantitative spectroscopic analysis of milk fat and total protein in the region 400-1100 nm in the presence of fat globule size variability // Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 2013, Vol. 126, P. 129-139.

2. Bogomolov A., Melenteva A., Dahm D J. Fat globule size effect on visible and short-wave near infrared spectra of milk // Journal of Near Infrared Spectroscopy. 2013, Vol. 21, P. 435-440.

3. Kucheryavskiy S„ Melenteva A., Bogomolov A. Determination of fat and total protein content in milk using conventional digital imaging // Talanta. 2014, Vol. 121, P. 144-152.

4. Galyanin V., Melenteva A. Bogomolov A. Selecting optimal wavelength intervals for an optical sensor: A case study of milk fat and total protein analysis in the region 400-1100 nm // Sensors & Actuators B: Chemical. 2015, Vol. 218, P. 97-104.

5. Melenteva A., Bogomolov A. Quantitative analysis of raw milk with Vis/SW-NIR spectroscopy // 8th Winter Symposium on Chemometrics (WSC-8) "Modem Methods of Data Analysis". Drakino, Russia, 2012. P. 50.

6. Melenteva A., Kucheryavskiy S., Bogomolov A. Visible light scatter as a quantitative information source on milk constituents // ХГП Conference on Chemometrics in Analytical Chemistry (CAC-2012). Budapest, Hungary, 2012. P. 135.

7. Melenteva A., Bogomolov A. Scatter-based quantitative analysis of fat and total protein content in raw milk by Vis/SW-NIR spectroscopy // 16th International Conference on Near Infrared Spectroscopy (NIR2013), IRSTEA, La Grande-Motte, France, 2013. P. 42.

8. Melenteva A., Bogomolov A. Modeling of fat and protein content in raw milk based on historical spectroscopic data // 9th Winter Symposium on Chemometrics (WSC-9), Tomsk, Russia, 2014. P. 16.

Автореферат отпечатан с разрешения диссертационного совета Д 212.243.07

ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского» (протокол № 6 от 01.07.2015 г.)

Заказ X» 538 Тираж 100 экз.

Отпечатано на ризографе.

ФГБОУ ВПО «Самарский государственный технический университет» Отдел типографии и оперативной печати 443100 г. Самара ул. Молодогвардейская, 244