Анализ и разработка методов определения параметров одиночных частиц по данным светорассеяния в проточной цитометрии тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.08 ВАК РФ

^ #

^ ^¿СУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ^ ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ

КРАСНОЯРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

МАЛЬЦЕВ Валерий Павлович

АНАЛИЗ И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ ОДИНОЧНЫХ ЧАСТИЦ ПО ДАННЫМ СВЕТОРАССЕЯНИЯ В ПРОТОЧНОЙ

ЦИТОМЕТРИИ

Специальность 01.04.05 - оптика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Красноярск - 1996

Работа выполнена в Институте химической кинетики и горения СО РАН (г Новосибирск).

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор А.К.Петров,

доктор физико-математических наук, профессор В.НЛопатин

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор В.В.Слабко,

кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудни!

С.И.Еременко.

Ведущая организация: Институт оптики атмосферы СО РАН (г. Томск).

Защита состоится 1С " „и С^Л 1996 г. в (С? час. на заседали] Специализированного совета Д 064.61.01 при Красноярском государственно» университете по адресу Красноярск, пр. Свободный 79.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Красноярскоп государственного университета.

Автореферат разослан '¿У г.

Ученый секретарь Специализированного совета .

к. ф.-м.н., доцент Л Логинов Ю.Ю.

Актуальность проблемы. Определение параметров дисперсных сред методами светорассеяния - один из важнейших разделов физической оптики. При этом светорассеяние может применяться для решения этой проблемы в двух типах технологий, а именно, определение параметров дисперсной среды по данным светорассеяния от среды как целого и по данным светорассеяния от одиночных дисперсных элементов ср'еды. С точки зрения информативности второй метод обладает значительно большими возможностями, однако применение этого метода связано с значительными техническими трудностями.

В последнее время,' в связи с бурным развитием лазерной техники, средств автоматизации измерений и обработки данных, в научных исследованиях и при технологическом контроле широкое распространение получили оптические анализаторы одиночных частиц. Наиболее перспективна для анализа одиночных частиц техника проточной цитометрии, возможности которой отражены в монографии авторского коллектива под редакцией M.R.Melamed, T.Lindmo, and M.L.Mendelsohn (Flow cytometry and sorting. Wiley-Liss, New York, 1990). В русскоязычной литературе техника проточной цитометрии отражена в обзоре Стейнкампа (Дж.Стейнкамп. "Цитометрия в потоке", Приборы для научных исследований, N 9, с. 3-35, 1984). Создание и применение проточных цитометрических систем для автоматического анализа и разделения частиц в гидрозолях открыло новые возможности для исследований в области биологии и медицины. В проточных цитометрических системах частицы анализируются со скоростью до 300 тысяч штук в минуту. Уникальность методики цитометрии в потоке состоит в том, что измерения выполняются на отдельных частицах с очень большой скоростью. Это обеспечивает высокую статистическую точность и позволяет надежно выявлять малые популяции. Между тем возможности метода предъявляют все более высокие требования к анализу измеряемых данных, поэтому представляется важным дальнейшее совершенствование методов расчета параметров одиночных частиц по данным светорассеяния (обратная задача светорассеяния).

Оптические схемы существующих проточных цитометров стандартной конфигурации не являются оптимальными с точки зрения определения параметров одиночных частиц по данным светорассеяния. Практически отсутствуют данные об ошибках вычислений параметров сферических частиц при измерении светорассеяния от одиночной частицы. Кроме этого, такой цитометр

требует проведения трудоемкой и неоднозначной калибровки частицами с известными значениями размера и показателя преломления. Не было метода, позволяющего проводить абсолютное (без предварительной калибровки) измерение параметров одиночной частицы в реальном времени.

Приведенные выше обстоятельства в значительной степени определили основные направления настоящей работы.

Диссертационная работа выполнена в рамках программы С-117-93/86 "Сканирующая проточная цитометрия" (программа "Университеты России"), при поддержке грантами: "Высокочувствительный многовариантный иммуноанализ" Шведского сельскохозяйственного университета, "Многопараметрический анализ" Академии наук Финляндии.

Цель работы. Целью работы является анализ и разработка методов определения параметров одиночных частиц при использовании данных светорассеяния на базе проточной цитометрии.

Для достижения цели исследования были сформулированы следующие основные задачи:

1. Анализ влияния углов сбора рассеянного одиночной частицей излучения на точность вычисления параметров частицы; оценка ошибки вычисления параметров частицы по данным, измеренным на проточном цитометре стандартной конфигурации.

2. Разработка метода, позволяющего определять абсолютные параметры частиц в реальном времени по данным светорассеяния на одиночной частице.

3. Разработка и создание экспериментальной установки высокочувствительного проточного цитометра, позволяющего измерять индикатрису светорассеяния одиночной частицы в широком диапазоне углов.

На защиту выносятся следующие положения: 1. Оптимальными углами сбора рассеянного излучения, обеспечивающими наименьшую ошибку определения размера и показателя преломления частицы при использовании метода двумерного рассеяния Ми, являются телесные углы, образованные полярными углами 61=5-10 и 92=20-60 градусов. Рабочая область метода определяется диапазонами: 3 - 44 по параметру рассеяния а и до 1.12 по относительному показателю преломления п.

2. Использование третьего угла сбора рассеянного излучения расширяет рабочую область метода до а = 110. Оптимальными углами сбора рассеянного

излучения при использовании метода тройного двумерного рассеяния Ми являются телесные углы, образованные полярными углами 01=5-10, 02=20-60 и 03=120-170 градусов.

3. Метод пролетной индикатрисы светорассеяния одиночной частицы, заключающийся в использовании параметров индикатрисы (расстояние между минимумами и контраст индикатрисы), позволяет вычислять абсолютные значения размера и показателя преломления частицы в реальном времени с использованием оригинальных эмпирических уравнений. Рабочая область метода определяется диапазонами: а = 7 - 88 и относительным показателем преломления -до 1.125.

4. Оригинальная оптическая система сканирующего проточного цитометра позволяет измерять индикатрису светорассеяния движущейся в потоке одиночной частицы в углах от 5 до 125 градусов за характерное время 3 мсек.

Научная новизна. Проведен анализ влияния углов сбора излучения, рассеянного одиночной частицей, на точность вычисления размера и показателя преломления методом двумерного рассеяния Ми. Определены оптимальные с точки зрения решения обратной задачи светорассеяния углы сбора.

Предложен и проанализирован метод тройного двумерного рассеяния Ми, позволяющий определять характеристики одиночной частицы в диапазонах 3 -110 по параметру рассеяния а и до 1.12 по относительному показателю преломления. Численно продемонстрированы возможности метода при определении средних характеристик дисперсных сред на примере частиц жира в молоке.

На созданном проточном цитометре стандартной конфигурации разработан метод анализа двухкомпонентной дисперсной среды. Определена чувствительность метода при одновременном определении концентраций бактерий и соматических клеток в молоке.

При изучении процесса латексной агглютинации в присутствии полипептидов ВИЧ-1 и ВИЧ-2 на базе проточного цитометра стандартной конфигурации определены характерные времена образования комплексов в условиях реакции антиген-антитело, которые равнялись 2-5 мин.

Предложен и проанализирован метод пролетной индикатрисы светорассеяния одиночной частицы, позволяющий вычислять абсолютные значения размера и показателя преломления частицы по полученным эмпирическим уравнениям.

Разработан и создан сканирующий проточный цитометр, позволяющий измерять индикатрису одиночной частицы в углах от 5 до 125 градусов. Продемонстрирована способность метода пролетной индикатрисы светорассеяния определять абсолютные размер и показатель преломления латексных частиц.

Разработан и создан лазерный нефелометр с измерением индикатрисы дисперсной среды в углах от 5 до 85 и от 95 до 175 градусов. Проведены сравнительные исследования светорассеивающих характеристик суспензий различных видов бактерий.

Научная значимость результатов работы состоит в том, что проведенные теоретические и экспериментальные исследования существенно расширяют возможности техники проточной цитометрии, в части использования светорассеяния.

Практическая значимость. Результаты работы использованы при разработке экспресс-методов определения концентрации бактерий и содержания соматических клеток в молоке, определения массовой доли молочного жира, контроля процесса роста латексных частиц при их производстве. Кроме этого, метод пролетной индикатрисы светорассеяния, базирующийся на сканирующем проточном цитометре, может быть использован для диагностики природных водных дисперсных систем, . при многопараметрическом иммуноанализе, использующем латексные частицы в качестве носителя специфических антигенов.

Личный вклад автора. Все приведенные в диссертации теоретические результаты и результаты расчетов получены лично автором. Автору принадлежит основная идея метода пролетной индикатрисы светорассеяния, а также оптической системы сканирующего проточного цитометра и лазерного нефелометра. Автором выполнена обработка и интерпретация экспериментальных результатов. Кроме этого, автор принимал непосредственное участие в постановке и проведении экспериментов. По приглашению редакции журнала "Известия Академии наук", автором опубликован обзор по теме диссертации.

Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались на Международной конференции "Современные и лазерные технологии" (ALT92, Москва, 8-11 сентября 1992), Всероссийской конференции по лазерной химии

(Лазаревское, 30 сентября - 5 октября, 1992 г), Межреспубликанской конференции "Оптические методы исследования потоков" (Новосибирск; 2-3 июня 1993 г.), Международной конференции "Биомедицинская оптика" (Сан Хосе (США), 4-9 февраля 1995 г.), Межреспубликанском симпозиуме "Оптика атмосферы и океана" (Томск, 20-23 июня 1995 г.), а также на научных семинарах в Институте химической кинетики и горения СО РАН (Новосибирск, 1992-1996 гг.), в Биомедицинском центре университета г. Упсала (Швеция, 1993 г.), на физическом отделении Стокгольмского университета (Швеция, 1994 г.), на отделении медицинской физики университета г. Турку (Финляндия, 1994-1996 гг.).

Публикации. Основные результаты диссертации представлены в 9 публикациях, включенных в прилагаемый перечень.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения, приложения и списка цитированной литературы.

Объем диссертации составляет 83 страниц, включая 1 таблицу, 16 рисунков. Список цитируемой литературы насчитывает 53 наименования.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ВВЕДЕНИЕ

Описанные в научной литературе работы, связанные с разработкой методов анализа одиночных частиц, демонстрируют некоторые возможности использования светорассеяния при определении морфологических характеристик одиночных частиц. Однако используемый в большинстве из них метод подгонки теоретических расчетов к экспериментальным результатам требует больших затрат времени и вряд ли найдет широкое применение при высокоскоростном анализе частиц. Поэтому представляется важным дальнейшее совершенствование методов расчета параметров частиц по данным светорассеяния. При этом новые методы должны характеризоваться малым временем оценки параметров (1-10 мс в проточной цитометрии) и достаточной точностью. Особенно широкое распространение такие экспресс-методы могут получить с дальнейшим развитием цитометрических систем при проведении иммуноанализа и анализа элементов крови в медицине, при контроле качества продукции сельского хозяйства

(например, определении жирности и наличия бактерий в молоке), при экологическом контроле и т. д.

АНАЛИЗ И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ЧИСЛЕННОГО РЕШЕНИЯ ОБРАТНОЙ ЗАДАЧИ СВЕТОРАССЕЯНИЯ ДЛЯ ОДИНОЧНЫХ ЧАСТИЦ (ГЛАВА 1) Метод двумерного рассеяния Ми (Two-Dimensional Mie Scattering. 2DMS). В своей основе метод двумерного рассеяния Ми сводится к методу узлов прямой задачи рассеяния в двумерной плоскости. Интенсивности рассеяния в два телесных угла образуют узел и рассчитываются по теории Ми для дискретных значений размера и показателя преломления. Тогда значения d (размер) и а (показатель преломления) в точках, полученных из эксперимента и расположенных между узлами, вычисляются в линейном или квадратичном приближении относительно узловых значений. Метод 2DMS позволяет достаточно быстро и точно определять значения dun сферических частиц при условии предварительного расчета интенсивности в узловых точках. Оптимизация оптической схемы и определение точности метода представляется актуальной задачей, так как метод имеет значительный прикладной потенциал ввиду его главного достоинства, а именно, возможности использования серийных проточных цитометров фирм Becton Dickinson, Epics и т.д.

Существенные недостатки метода 2DMS: а) существование областей с множественными решениями обратной задачи светорассеяния (области скрутки сетки 2DMS), б) необходимость проведения калибровки значений интенсивностей, рассчитанных для узлов сетки, с учетом данных для частиц с известными размером и показателем преломления.

Образование областей скрутки обусловлено выбором углов сбора рассеянного излучения для определенных диапазонов размера и показателя преломления частиц. Для более полного использования метода актуальным является выбор углов сбора рассеянного излучения так, чтобы погрешности, возникающие в областях скруток, были минимальными в как можно более широком диапазоне d и п. Была рассчитана средняя точность решения обратной задачи светорассеяния методом 2DMS в ограниченных диапазонах изменений размера и показателя преломления частиц. Сеть 2DMS была построена для d = 0.4-20 мкм с шагом 0.2 мкм и и = 1.41-1.49 с шагом 0.01 при различных углах сбора рассеянного излучения (2-5°; 5-10°; 5-15°; 10-20°; 20-40°; 20-60°; 75-115°; 120-170°;

140—175°). Для вычисления средней ошибки по указанным диапазонам размеров и показателей преломления были построены зависимости рассеяния в вышеназванные углы для п = 1.435, 1.453, 1.455, 1.458, 1.475 с шагом 0.05 мкм по размеру. По рассчитанным значениям интенсивностей восстанавливались размер" и показатель преломления частицы методом 2DMS. Телесные углы сбора излучения, образованные полярными углами 0| = 20-60° и 02 = 5-10° обеспечили наименьшую среднюю ошибку оценки, которая равнялась 0.16 мкм для размера и 0.003 для показателя преломления в диапазоне размеров 0.5-6 мкм (длина волны излучения 632.8 нм, показатель преломления среды - 1.333).

С большой уверенностью можно предположить, что диапазон показателей преломления можно существенно расширить без заметного уменьшения точности метода. Значительные достоинства метода 2DMS - простота вычислений и скорость обработки.

Метод тройного двумерного рассеяния Ми (Triple Two-Dimensional Mie Scattering. 3x2DMS). Метод 2DMS позволяет быстро получать достаточно точные значения размера и показателя преломления одиночных частиц при обработке данных об интенсивности света, рассеянного в двух телесных углах. При этом рабочий диапазон метода ограничен размерами частиц 0.4-6 мкм. Для частиц размером больше 6 мкм метод 2DMS дает существенные ошибки как в определении размера, так и показателя преломления. С ростом диаметра частицы "скрутки" сетки становятся все чаще и области корректности задачи - все уже. Это ограничение можно преодолеть, выбирая для этих областей другую пару углов. С этой целью был разработан метод тройного двумерного рассеяния Ми (3x2DMS). Он заключается в одновременной обработке трех схем 2DMS с заранее установленным приоритетом для каждой из схем Таким образом метод 3x2DMS использует интенсивности рассеяния в трех телесных углах. Аналогично оптимизации, выполненной для метода 2DMS, была проведена оптимизация по третьему углу сбора рассеянного излучения. Минимальная средняя ошибка оценки по диапазону размеров была получена при использовании следующих полярных углов сбора рассеянного излучения: 9| = 5-10°; 02 = 20-60°; 03 = 120170°. Средняя ошибка оценки по всему диапазону размеров и показателей преломлений (1.41-1.49) равнялась 0.24 мкм и 0.003 соответственно. Использование метода 3x2DMS позволило расширить рабочий диапазон по

размеру до 15 мкм, при этом относительные ошибки вычисления размера и показателя преломления не превышали 12 % и 0.7%, однако это достигалось за счет увеличения времени обработки данных светорассеяния в 3 раза.

Следует отметить, что точность метода 3x2DMS существенно возрастает при определении в полидисперсных системах суммарных характеристик, таких, как общий объем частиц и средний показатель преломления.

Метод пролетной индикатрисы светорассеяния CFlving Light Scattering Indicatrix. FLSI). Индикатриса одиночной частицы представляет из себя сложную интерференционную картину, содержащую максимальные и минимальные значения интенсивности рассеяния при разных значениях угла наблюдения. Можно выделить несколько параметров индикатрисы (количество экстремумов, их угловое положение, контраст и т.д.), величина которых связана с морфологическими характеристиками рассеивающей частицы (размер, показатель преломления, форма и т.д.). Решение обратной задачи светорассеяния в этом случае будет состоять в

а) выборе параметров индикатрисы, обеспечивающих наилучшую точность оценки характеристик частицы;

б) установлении зависимостей, выражающих характеристики частицы через эти параметры;

в) оценке погрешности вычислений.

Вычисление может быть проведено с применением следующих параметров индикатрисы: расстояние в градусах между первым и /-ым минимумами ДЭДсра), выбранными после граничного угла cpd, и контраст индикатрисы Цсру) = (/1Пах-4iin)/( 4iax+-inin)> где Лпах и 4iin — значения интенсивности рассеяния в точках максимума и минимума, выбранных после граничного угла q>v. Выбор параметров не случаен, так как в пределах аппроксимаций Релея-Ганса-Дебая и дифракции Фраунгофера расстояние между экстремумами зависит только от размера, тогда как контраст, в основном, определяется относительной разницей показателей преломления частицы и среды.

Параметр индикатрисы Д9з(20) обеспечил минимальную среднюю ошибку при вычислении размера частицы с использованием следующей функции:

d=a,+ а2><|Д9з(20)]"1 + азх|де3(20)]"3 + сх4х1Д93(20)]-4, (1)

где «1 = 0.156 (а = 0.026), а2 = 51.5 (а = 0.6), а3 = 330 (а = 50), а4 = 1310 (а = 230). Абсолютная средняя ошибка вычислений размера частицы составляет 0.090 мкм (относительная ошибка не превышает 5%).

Для вычисления показателя преломления частицы были использованы два параметра индикатрисы: Д0з(2О) и Ц40).

п = р!+р2х Ц40)+р3х Ц40)х[Д93(20)]-3+р4х[ И40)]2х[Дв3(20)]-,+

р5х[Д93(20)]-з+р6х[Д93(20)]-4 (2)

где р, = 1.581 (а = 0.006), р2 = -0.173 (а = 0.014), р3 = 37 (а = 7), р4 = -1.99. (а = 0.20), Рб = 13 (а = 4), р6 = -123 (а = 27). Применение уравнения (2) позволило получить абсолютную среднюю ошибку вычисления показателя преломления частицы, равную 0.014 в диапазонах размеров от 1 до 12 мкм и показателей преломления до 1.50 при показателе преломления среды 1.333 и длине волны излучения 632.8 нм. Для частиц с размерами меньше 7 мкм максимальная погрешность не превышала 1%. Для больших размеров погрешность достигала величины 6%, что сравнимо с размером диапазона показателей преломления.

Таким образом, использование таких параметров индикатрисы, как контраст и расстояние между минимумами, позволяет определять размер и показатель преломления частиц с достаточно высокой точностью. Следует отметить, что преимущество метода РЦ31 в определении параметров частицы по сравнению с методом Зх20МБ в том, что абсолютные значения интенсивностей светорассеяния при вычислениях не используются.

РАЗРАБОТКА ПРОТОЧНОГО ПИТОМЕТРА И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО ВОЗМОЖНОСТИ В ИЗМЕРЕНИИ СВЕТОРАССЕИВАЮШИХ ХАРАКТЕРИСТИК ОДИНОЧНЫХ ЧАСТИЦ (ГЛАВА 2) Проточный питометр стандартной конфигурации. Двухкомпонентная полидисперсная система (молоко после предварительной обработки) изучена на установке с измерением рассеянного на одиночной частице излучения. Разработанная методика подготовки пробы позволяла растворить мицеллы белка и жировые шарики молочной пробы, после чего проба представляла из себя двухкомпонентную полидисперсную систему, состоящую из бактерий (Е.соИ) и соматических клеток (С\М).

Получено уравнение, связывающее концентрацию E.coli (Neco/) с числом частиц с d < 5 мкм (л<): NEco! = 790хя< — 570000. Чувствительность данной методики определения концентрации E.coli в двухкомпонентной системе в проведенных экспериментах составляла (9.0±0.6)х105 мл"1. Аналогичное уравнение получено для концентрации клеток CV-1: A^y.j = 1020хл< — 120хл> + 12000. Чувствительность данной методики определения концентрации соматических клеток в двухкомпонентной системе в проведенных экспериментах можно оценить величиной (2.5±0.2)10s мл"1.

Исследовался процесс латексной агглютинации, при котором полипептиды вирусов ВИЧ-1 и ВИЧ-2 адсорбировались на поверхность частиц латекса размером 0.8 мкм. Агглютинацию суспендированных частиц латекса инициировали добавлением сывороток, содержащих антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 из контрольной панели фирмы Gemini Bio-Products Inc (США). Измеряли зависимость числа образующихся в процессе агглютинации латексных комплексов от времени для различных сывороток. Полученные кинетические кривые аппроксимировали функцией N — JV„x(l-exp[-Ax(f - f^]), где t и t0 - текущее и начальное время процесса агглютинации, N- число образовавшихся комплексов к моменту времени t, - конечное число образовавшихся комплексов, к — характерное обратное время процесса агглютинации. Характерное время процесса в экспериментах составило 170—300 с для различных положительных сывороток. Измерялось также число образующихся комплексов при различных разбавлениях сывороток (от 1 : 10 до 1 : 3200). Для контрольных сывороток были определены оптимальные концентрации антител для образования агглютината.

Сканирующий проточный цитометр. Основным отличием сканирующего проточного цитометра от проточного цитометра стандартной конфигурации является наличие оптической системы, в которой свет, рассеянный одиночной частицей, сканируется по апертуре фотоприемника во время ее движения в потоке. Основное излучение фокусируется через оптическое окно в верхней части гидрофокусирующей головки в кювету. Фокусировка луча в оптической кювете обеспечивает постоянную освещенность движущейся частицы во время измерения индикатрисы. Другая линза фокусирует выходящее из кюветы (через призму) рассеянное излучение на диафрагму, расположенную на входном окне фотоумножителя. Для любой точки внутри зоны измерения свет, рассеянный

только под определенным углом, отразится сферическим зеркалом параллельно оси потока и, отразившись от поверхности призмы, покинет оптическую кювету.

Электронная система сканирующего проточного цитометра записывает в память ЭВМ интенсивность рассеяния как функцию времени или положения частицы внутри рабочей зоны. При условии, что фотоприемник регистрирует только лучи, образующие цилиндр, ось которого совпадает с осью потока, положение частицы (расстояние I от частицы до дна сферического зеркала) можно выразить через угол рассеяния 0 и параметры оптической системы.

г = Х + |х«8(9) + ^^хс18(<р|) + (\/^х7к^^-у)хс18(9:,), (3)

где <р, =агссо5(^-хсо5(9)) (4 = 1,2),

По - показатель преломления среды, П1 - показатель преломления капилляра, 1Ъ -показатель преломления иммерсионной жидкости; О и й - внешний и внутренний диаметры капилляра, соответственно;

Х = Ях

1 ,.- «КСф;))

; Я - радиус сферического зеркала.

2

Данная оптическая схема является инструментальным дополнением к методу ри>1. Основные характеристики сканирующего проточного цитометра:

1) индикатриса одиночной частицы измеряется в полярных углах от 5 до 120° с интегрированием по азимутальным от 0 до 360°,

2) измерения проводятся с использованием одного фотоприемника,

3) во время измерения частица движется в зоне постоянной освещенности.

Электронная система сканирующего проточного цитометра записывает в

память ЭВМ интенсивность рассеяния как функцию времени или положения частицы внутри рабочей зоны.

Работоспособность сканирующего проточного цитометра проверялась с использованием латексных частиц с неизвестными параметрами. Для оценки размера и показателя преломления латексных частиц был использован метод РЬ51 с модифицированными уравнениями. Использовали следующие параметры индикатрисы: Д02(2О) и Ц30) и эмпирические уравнения для вычисления размера и показателя преломления. Полученные в результате оценки для размеров и показателей преломления латексных частиц составляли 3 мкм и 1.576; 4.95 мкм и 1.57. Метод подгонки дал следующие результаты: 3 мкм и 1.58; 4.68 мкм и 1.58

соответственно. Микроскопический анализ позволил получить средние размеры латексных частиц в двух измеренных суспензиях. Для первой суспензии средний диаметр частиц 3 мкм, для другой — 4.7 мкм. По литературным данным показатель преломления латексных частиц лежит в диапазоне от 1.57 до 1.59.

Эксперименты с латексными частицами на сканирующем проточном цитометре продемонстрировали возможность применения метода полетной индикатрисы светорассеяния для определения параметров одиночных частиц. Использование цитометра такого типа и метода РЬ81 для обработки данных светорассеяния позволило определять размер и показатель преломления сферических частиц без проведения предварительной калибровки оптического и электрического трактов цитометра. С целью получения более точных значений параметров частицы в качестве стартовых для метода подгонки можно использовать результаты, полученные методом

Конструктивные особенности сканирующего проточного цитометра обеспечивают дальнейшее развитие методов анализа одиночных частиц на базе проточной цигометрии. В частности, интегрирование рассеянного света по азимутальному углу позволяет получить высокое значение отношения сигнала к шуму для достаточно малых частиц, что, в свою очередь, дает возможность использовать более дешевый и надежный Не-№-лазер вместо применяемого обычно аргонового.

ИССЛЕДОВАНИЕ СВЕТОРАССЕИВАЮШИХ ХАРАКТЕРИСТИК БАКТЕРИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛАЗЕРНОГО НЕФЕЛОМЕТРА (ГЛАВА Измерение индикатрисы светорассеяния одиночной частицы позволяет получить практически полную информацию о свойствах дисперсных сред. Однако, в некоторых ситуациях достаточно грубо определить характеристики дисперсной среды. В этом случае возможно использование данных светорассеяния от среды, как целого, т.е. провести нефелометрические измерения. Как и в случае с одиночной частицей, наиболее полную информацию о свойствах дисперсной среды можно получить из индикатрисы светорассеяния.

Наиболее распространенным и детально разработанным является метод малоуглового рассеяния. Метод имеет существенные ограничения в применении как-то:

- не принимается во внимание зависимость индикатрисы от показателя преломления частиц (в малоугловой области индикатриса слабо зависит от показателя преломления частицы);

- в следствии значительной зависимости интенсивности рассеяния в малоугловую область от размера (от шестой степени в области Релея до второй - в области дифракции фраунгофера), метод дает существенные ошибки дли широкораспределенных по размеру систем.

Использование индикатрисы светорассеяния дисперсной среды не только в малых, но и в средних углах позволит, во-первых, учесть влияние, т.е. измерить средний показатель преломления частиц, во-вторых - повысить точность метода при измерении широкораспределенных по размеру систем, так как в области средних углов интенсивность рассеянного света не так сильно зависит от размера.

Разработана схема лазерного нефелометра, позволяющего измерять индикатрису рассеяния в углах от 5 до 85 и/или от 95 до 175 градусов (для водной среды в плоской кювете углы рассеяния изменяются от 5 до 49 и/или от 131 до 175 градусов). Время измерения индикатрисы 0.01 сек.

Следующая система уравнений связывает угол рассеяния 9 с углом поворота вращающегося зеркала <р (значение <р контролируется электронно-оптической системой нефелометра).

y = (a-X)xtg(00-G). y-yl

x = xi--rr-

L Ig(<p)

y

2x<p+G = e0+aiWg(—) + n,

где a - расстояние от диафрагмы до центра кюветы;

9о - угол между распространением излучения и осью, связывающую

положение диафрагмы и центра кюветы;

X, Y - координаты точки отражения на вращающемся зеркале;

XI, Yl - координаты оси вращающегося зеркала.

Лазерный нефелометр использовался для сравнительного изучения индикатрис различных видов молочнокислых бактерий. Исследование проводилось с целью выяснения возможности определения общей концентрации бактерий различных видов по интегральному измерению светорассеяния. Определение обшей концентрации в этом случае возможно при существовании диапазона углов, в

которые интенсивности светорассеяния от одинаковых концентраций бактерий различных видов одинакова,

Были измерены индикатрисы наиболее распространенных видов бактерий в молоке, в частности индикатрисы суспензий чистых культур бактерий видов Streptococcus lactis, Streptococcus diacetilactis, Streptococcus termophilus и Lactobacterium lactis. Результаты свидетельствуют о существенных различиях в исследуемых диапазонах углов интенсивности рассеяния у разных видов микроорганизмов. На основании литературных данных и измеренных индикатрис, можно предположить, что наиболее короткие цепочки образуют Streptococcus diacetilactis. Так как бактерии типа Lactobacterium lactis - палочкообразные, а эффективность рассеяния не значительно отличается от Streptococcus diacetilactis, вероятно длина цепочек у этих бактерий также не значительна. Наиболее длинные цепи образуют Streptococcus lactis о чем свидетельствует значительная эффективность рассеяния и наибольшая асимметрия индикатрисы.

Проведенные измерения свидетельствуют о значительной зависимости индикатрисы от вида бактерий, т.е. от морфологии рассеивателя и может служить для идентификации микроорганизмов различных типов. В тоже время, отсутствие в измеренном диапазоне углов области с одинаковой эффективностью рассеяния не позволяют использовать нефелометрический метод для определения общей концентрации микроорганизмов различных типов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В диссертационной работе проанализированы методы и экспериментальные системы, позволяющие определять параметры одиночных частиц по данным светорассеяния. Главный результат исследования заключается в разработке метода пролетной индикатрисы светорассеяния одиночной частицы на базе оригинального сканирующего проточного цитометра. Относительно простая оптическая схема и несложные эмпирические уравнения позволяют решать очень важную проблему физической оптики, а именно определять параметры дисперсной среды без привлечения каких-либо других методов. Анализ и разработка методов определения параметров одиночных частиц на базе светорассеяния привели к следующим результатам:

1. Проведен анализ влияния углов сбора излучения, рассеянного одиночной частицей, на точность вычисления размера и показателя преломления методом

двумерного рассеяния Ми. Определены оптимальные с точки зрения решения обратной задачи светорассеяния углы сбора.

2. Предложен и проанализирован метод тройного двумерного рассеяния Ми, позволяющий определять характеристики одиночной частицы в диапазонах 3 -110 по параметру рассеяния а и до 1.12 по относительному показателю преломления. Численно продемонстрированы возможности метода при определении средних характеристик дисперсных сред на примере частиц жира в молоке.

3. На созданном проточном цитометре стандартной конфигурации разработан метод анализа двухкомпонентной дисперсной среды. Определена чувствительность метода при одновременном определении концентраций бактерий и соматических клеток в молоке.

4. При изучении процесса латексной агглютинации в присутствии полипептидов ВИЧ-1 и ВИЧ-2 на базе проточного цитометра стандартной конфигурации определены характерные времена образования комплексов в условиях реакции антиген-антитело, которые равнялись 2-5 мин.

5. Предложен и проанализирован метод пролетной индикатрисы светорассеяния одиночной частицы, позволяющий вычислять абсолютные значения размера и показателя преломления частицы по полученным эмпирическим уравнениям.

6. Разработан и создан сканирующий проточный цитометр, позволяющий измерять индикатрису одиночной частицы в углах от 5 до 125 градусов. Продемонстрирована способность метода пролетной индикатрисы светорассеяния определять абсолютные размер и показатель преломления латексных частиц.

7. Разработан и создан лазерный нефелометр с измерением индикатрисы дисперсной среды в углах от 5 до 85 и от 95 до 175 градусов. Проведены сравнительные исследования светорассеивающих характеристик суспензий различных видов бактерий.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Мальцев В.П., Мальцева Т.В., Сорокин A.M. и Матвеева Е.К. Устройство для измерения углового распределения рассеянного излучения. Авторское свидетельство 1289196 (1985).

2. V.P.Maltsev, A.V.Khadaev, T.S.Mashnin, V.I.Prots, Diagnostics of Multy-Component Varigrained Systems by Analyzing the Light Scattered by a Single Particle.

Measurement of the Concentration of Bacterial and Somatic Cells in Milk. International Conference on Advanced and Laser Technologies ALP92. Book of summaries, part 3, September 8-11, Moscow, 1992, p. 100

3. V.P.Maltsev, Triple Two-Dimensional Mie Scattering. Estimation of Refractive Index and Size of Spherical Particles from Single Particle Scattering Pattern. Calculation of Fat Content of a Milk. International Conference on Advanced and Laser Technologies ALT'92. Book of summaries, part 5, September 8-11, Moscow, 1992, p. 91.

4. Т.С.Машнин, В.П.Мальцев, И.АЛавриненко, В.АБурмистров, А.А.Дорошкин. Исследование процесса латексной агглютинации с использованием пептидов антигенов вируса иммунодефицита человека методом проточной цитометрии. Тезисы докладов конференции' "Оптические методы исследования потоков", Новосибирск, июнь 1993 г., с. 58.

5. В.П.Мальцев. Эффективность селекции частиц с использованием светорассеяния в проточной цитометрии. Тезисы докладов конференции "Оптические методы исследования потоков", Новосибирск, июнь 1993 г., с. 56.

6. В.П.Мальцев, А.В.Хадаев, С.Г.Струц, Б.Г.Егиазаров. Способ определения общего количества бактерий в молоке. Патент RU 2016407 (1995).

7. В.П.Мальцев. Оценка морфологических характеристик одиночных частиц по данным светороссеяния в проточной цитометрии. Известия Академии наук. Серия химическая. 1994, N7, 1182-1190.

8. A.V.Chernyshov, V.I.Prots, A.A.Doroshkin, and V.P.Maltsev. Measurement of scattering properties cf individual particles with a scanning flow cytometer. Applied Optics v. 34, N. 27, pp. 6301-6305 (1995).

9. V.P.Maltsev, A.V.Chernyshev, A.A.Doroshkin, and E.Soini, Light scattering and fluorescence of single particles measured by a scanning flow cytometer. In: Ultrasensitive Instrumentation for DNA Sequencing and Biochemical Diagnostics, edited by G.E.Cohn, J.M.Lerner, K.J.Liddane, A.Scheeline, and S.ASoper, Proceedings of SPIE 2386, pp. 199-205 (1995).