Развитие техники сканирующей проточной цитометрии и методов решения обратной задачи светорассеяния для анализа одиночных сферических частиц тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

1. РАЗВИТИЕ ТЕХНИКИ СКАНИРУЮЩЕГО ПРОТОЧНОГО ЦИТОМЕТРА.

1.1. Основные принципы действия сканируещего проточного цитометра

1.2. Расчет безлинзовой оптической схемы СПЦ

1.3. Параметры оптической схемы СПЦ с отклонениями от осевой симметрии

1.4. Оценка влияния параметров СПЦ на погрешности параметров индикатрисы

1.5. Выводы к главе

2. РАЗВИТИЕ ПАРАМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА РЕШЕНИЯ ОБРАТНОЙ ЗАДАЧИ СВЕТОРАССЕЯНИЯ ДЛЯ СФЕРИЧЕСКИХ ЧАСТИЦ.

2.1. Основные принципы параметрического метода решения обратной задачи светорассеяния

2.2. Расширение области применения параметрического решения обратной задачи светорассеяния для сферических частиц

2.2.1. Сферические частицы сравнимые с длиной волны

2.2.2. Гомогенная сферическая частица с поглощением

2.3. Фурье-параметры и спад индикатрисы в решении обратной задачи светорассеяния

2.4. Параметрическое решение обратной задачи светорассеяния для Фурье-параметров

2.4.1. Гомогенная сферическая частица

2.4.2. Гомогенная сферическая частица с поглощением

2.4.3. Сферическая частица с ядром

2.5. Интеграл индикатрисы в решении обратной задачи светорассеяния для сферических частиц

2.6. Выводы к главе

3. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СКАНИРУЮЩЕГО ПРОТОЧНОГО ЦИТОМЕТРА.

3.1. Классификация лейкоцитов

3.2. Измерение размера и показателя преломления латексных частиц сравнимых с длиной волны

3.3. Определение объёма эритроцитов и концентрации гемоглобина в них на сканирующем проточном цитометре

3.4. Применение Фурье-параметра для измерения размера сферических частиц

3.5. Использование интеграла индикатрисы для измерения коэффициента преломления сферических частиц и концентрации гемоглобина в сферизованных эритроцитах

3.6. Анализ содержания жира в молоке на сканирующем проточном цитометре

3.7. Выводы к главе

Измерительная аппаратура и методы анализа, использующие светорассеяние, нашли широкое применение в различных областях науки и техники. Измерение различных характеристик рассеяния света применяется для анализа бактерий и клеток в биологии, состава и качества крови в медицине. Данные светорассеяния могут быть при этом представлены в двух видах: светорассеяние от ансамбля частиц и от одиночных частиц. Интерпретация данных второго вида проще и более информативна. Тем не менее, даже при анализе данных рассеяния света от одиночных частиц приходится решать ряд сложных задач физической оптики.

В теории взаимодействия электромагнитной волны с малой частицей существует два основных класса задач.

Прямая задача. Вычисление поля рассеяния по известным свойствам частицы и падающего на неё излучения.

Обратная задача. Определение свойств частицы путем анализа рассеянного ею поля.

За последние сто лет были сделаны значительные успехи в развитии методов решения прямой задачи. Точные решения существуют для огромного количества типов частиц, таких как однородные и неоднородные сферы, эллипсоиды, цилиндры и других. Наиболее полный обзор методов по расчету полей рассеяния от частиц произвольной формы представлен в монографии [1].

Обратная задача светорассеяния принадлежит к типу некорректных задач. Информация, требуемая для однозначного определения частицы, должна включать в себя: 1) векторную амплитуду и фазу поля, рассеянного во всех направлениях, и 2) поле внутри частицы [2]. Поле внутри частицы непосредственно измерить нельзя (при некоторых условиях его можно только аппроксимировать полем падающей волны). Измерение амплитуды и фазы рассеянного поля в принципе возможно, но на практике почти не достижимо. Обычно для исследования доступны измерения интенсивности света, рассеянного в нескольких направлениях, либо зависимость интенсивности рассеянного света от угла в некотором диапазоне углов. Поэтому почти всегда перед исследователем стоит задача попытаться описать частицу, располагая данными в меньшем объеме, чем это необходимо в идеальной теоретической постановке задачи. Однако это не обязательно приводит к безнадежному положению. Зачастую дополнительная информация о частицах оказывается достаточной для их описания.

Роль дополнительной информации в решении обратной задачи, существование, единственность и устойчивость получаемого решения в теории рассеяния рассматриваются в сборнике под редакцией Болтса [3].

Анализ рассеяния света широко используется для определения характеристик частиц различного рода: биологических клеток, бактерий и т.п. В связи с развитием лазерной техники, средств автоматизации измерений и обработки данных в научных исследованиях и при технологическом контроле получили широкое распространение проточные цитометры. Скорость регистрации в таких приборах достигает до 1000 частиц в секунду. Таким образом, требования к скорости анализа данных светорассеяния становятся более жесткими.

Описанные в научной литературе работы, связанные с разработкой методов анализа одиночных частиц, демонстрируют некоторые возможности использования светорассеяния при определении морфологических характеристик одиночных частиц. Однако используемый в большинстве из них метод подгонки теоретических расчетов к экспериментальным результатам (метод наименьших квадратов, МНК) требует больших затрат времени и вряд ли найдет широкое применение при высокоскоростном анализе частиц. Поэтому представляется важным дальнейшее совершенствование методов определения параметров частиц по данным светорассеяния (обратная задача светорассеяния). При этом новые подходы в решении обратной задачи должны характеризоваться малым временем оценки параметров (1-10 мс) и достаточной точностью.

В настоящее время для анализа одиночных частиц широко применяется техника проточной цитометрии (см., например, обзоры [4, 5, 6, 7]). Создание и применение проточных цитометрических систем для автоматического анализа и разделения частиц в гидрозолях открыло новые возможности для исследований в области биологии и медицины. Цитометрия в потоке представляет собой большой шаг вперед по сравнению с обычными микроскопическими методами, при использовании которых анализ нескольких частиц занимает несколько часов. Измерение светорассеивающих свойств частиц в таких системах позволяет получать информацию об их морфологических характеристиках (размер, форма, особенности внутренней структуры, коэффициент поглощения и т. д.). Уникальность методики цитометрии в потоке состоит в том, что измерения выполняются на отдельных частицах с большой скоростью. Это обеспечивает высокую статистическую точность и позволяет надежно выявлять малые популяции. При этом анализаторы подобного типа обладают достаточно высокой производительностью и надежностью результатов анализа.

Кроме проточных цитометров существует ряд принципиально других приборов, в которых для анализа одиночной частицы используется её удержание в оптических [8, 9] и электростатических [10, 11] ловушках. Устройства, в которых частица удерживается в фиксированном положении, а вращающийся детектор или система неподвижных детекторов используются для записи индикатрисы, требуют относительно большого времени для измерения индикатрисы одиночной частицы и не позволяют накапливать данные от многих частиц для статистической обработки.

Сигналы светорассеяния в приборах могут быть представлены разными способами, поэтому методы для анализа данных светорассеяния будут отличаться. На рис. 1 представлено обобщение методов решения обратной задачи и приборов, измеряющих светорассеяние.

Одним из методов, позволяющим оценивать параметры рассеивающих частиц, является метод наименьших квадратов. Для сферических частиц величины размера d и показателя преломления п подбираются так, чтобы обеспечить наилучшую аппроксимацию экспериментальных данных рассчитанных по теории Ми. Данный метод широко использовался последнее время в связи с увеличением вычислительных мощностей компьютеров. Первоначально МНК использовался в экспериментах, связанных с индикатрисами одиночных зафиксированных частиц [11]. В этой работе применялась техника удержания частицы электрическим полем в луче лазера (Differential II, Science Spectrum, Inc.). В работе [12] была измерена индикатриса рассеяния частицы полистирольного латекса с диаметром 1099.6 нм. Использование МНК позволило определить диаметр и показатель преломления одиночной частицы: d = 1200+10 нм и п = 1.59+0.01. Возможности МНК в дальнейшем расширены [13]. В этой работе измерялись индикатрисы одиночных биологических клеток с использованием техники Differential И. Применяли МНК для модели сферической частицы с покрытием. В результате были определены параметры бактерий Staphylococcus epidermidis: диаметр 353±5 нм; толщина мембраны 25±5 нм; показатель преломления цитоплазмы 1.50+0.01; показатель преломления мембраны 1.54+0.01.

Рис. 1 Обобщение методов решения обратной задачи и приборов, измеряющих светорассеяние

В проточной цитометрии МНК использовался в ряде работ [14, 15]. Так, состав пятикомпонентной смеси, состоящей из частиц с размерами 1.1, 5.0, 10.0, 15.6 и 19.5 мкм, определен [14] на основе данных по светорассеянию, измеренных на проточном цитометре. Для полистирольных латексных частиц получено достаточно хорошее согласие между измеренной функцией рассеяния и вычисленной по теории Ми. Из сравнения индикатрис рассеяния, рассчитанных по теории Ми для гомогенных сфер, определены [15] распределение по размерам и среднее значение показателя преломления для спор.

Метод наименьших квадратов с использованием точной теории рассеяния является наиболее точным методом решения обратной задачи светорассеяния для одиночных частиц. Однако он требует длительных вычислений и точного задания начальных параметров подгонки. Одной из первых попыток найти решение обратной задачей светорассеяния через создание эмпирических уравнений был метод оптического картографирования, предложенный Quist и Wyatt [16]. В дальнейшем этот метод получил развитие в определении распределения частиц по размеру и показателю преломления [17].

Спектральный подход в нахождении решения обратной задачи светорассеяния для одиночных частиц был развит Ludlow и Everitt [18,19]. Разложив поле рассеяния в ряд Гегенбауэра, авторы показали, что точка среза спектра однозначно связана с размером частицы. Авторы предположили, что из спектра также можно определить показатель преломления частицы. Быстрое преобразование Фурье было использовано Min и Gomez [38], чтобы определить размер частиц с известным показателем преломления с точностью 3%. Данный метод позволял определять размер частицы из индикатрисы, измеренной в углах от 9° до 18°. Аппроксимационное решение обратной задачи светорассеяния для частиц сравнимых с длиной волны был предложен Warner и Hirleman [20], которые продемонстрировали работоспособность метода для определения размера и показателя преломления частицы, лежащей на поверхности. Индикатриса, измеренная в углах 10° - 65°, аппроксимировалась функцией Гаусса и параметры частицы определялись из параметров полученной функции. Ulanowski и др . [21] использовали метод нейронных сетей (neural network), чтобы найти решение обратной задачи светорассеяния для сфер. Типичное время обучения такой нейронной сети и определения параметров частицы равнялись соответственно 50 секунд и 50 миллисекунд. При этом использовался пакет MATLAB 4.2, работающий на 166-МГц Intel 80586 процессоре. Рабочая область метода ограничивалась 0.5 мкм < d/2 <1.5 мкм по размеру и 1.2 < т < 1.27 по относительному показателю преломления.

Данные светорассеяния от одиночных частиц интенсивно используются в различных практических приложениях. Особенно это актуально в медицинской диагностике, при анализе состава клеток крови. При этом теоретические [22, 23, 24, 25] и экспериментальные [26, 27, 28, 29, 30, 31, 32] исследования рассеяния на одиночных клетках крови обеспечивают дальнейшее развитие методов анализа.

Техника сканирующей проточной цитометрии была предложена В.П. Мальцевым [34] и развивалась в 1994 - 2001 в лаборатории лазерной фотохимии Института химической кинетики и горения. Если цитометр стандартной конфигурации позволяет измерять сигналы светорассеяния в 2-3 фиксированных телесных угла, то сканирующий проточный цитометр (СПЦ) позволяет регистрировать дифференциальное сечение рассеяния, - индикатрису, в диапазоне полярных углов от 5 до 120 градусов. Это дает большие возможности в области определения параметров отдельных частиц и идентификации частиц по светорассеянию.

К началу наших работ, одной из нерешенных задач, очень важной с точки зрения повышения точности измерений на СПЦ, являлась определение влияния параметров оптической схемы СПЦ на измеряемые характеристики частиц. Решение данной задачи позволило бы выявить источники ошибок измерения характеристик исследуемых частиц и после их выявления - устранить. Знание того, какие параметры оптической схемы СПЦ и насколько влияют на измерение характеристик частиц, будет в дальнейшем способствовать проектированию и изготовлению нового поколения СПЦ.

Другая задача - это расширение области применения и повышение точности параметрического метода решения обратной задачи светорассеяния. Основным моментом в получении параметрического решения обратной задачи является выбор параметров индикатрисы. Выбор обусловлен следующими факторами: 1) однозначная связь параметра с характеристикой исследуемой частицы, 2) наименьшая погрешность вычисления характеристики исследуемой частицы по параметру, 3) наименьшая ошибка определения параметра для экспериментально измеренной индикатрисы на СПЦ. Зачастую из-за низкого уровня сигнала по отношению к шуму либо ошибок измерений, вносимых оптической схемой цитометра, некоторые параметры не удовлетворяют третьему условию, что и ограничивает область применения параметрического решения обратной задачи светорассеяния.

Данная диссертационная работа посвящена разработке физических решений, развивающих технику СПЦ и методы параметрического решения обратной задачи светорассеяния для сферических частиц.

Цель и задачи работы

Цель настоящей работы состоит в следующем:

- развитие методов определения параметров сферических частиц по данным светорассеяния (обратная задача светорассеяния для одиночных частиц), способных в более широком диапазоне по размерам и с высокой точностью определять характеристики сферических частиц;

- повышение точности измерения параметров сферических частиц на СПЦ; В задачи работы входило:

- Определение влияния ошибок параметров оптической схемы СПЦ на погрешности измеряемых характеристик сферических частиц.

- Проведение исследований по разработке на базе СПЦ новых методов анализа, идентификации и классификации различных частиц.

При этом новые методы анализа одиночных частиц должны отвечать малому времени оценки параметров (1-10 мс в проточной цитометрии).

Научная новизна работы

Научная новизна диссертационной работы определяется следующими результатами полученными впервые.

- Предложена безлинзовая оптическая схема СПЦ. Рассчитаны аппаратная и передаточная функции такой схемы. На основании полученных функций показано, что по своим основным характеристикам, а именно угловому разрешению и эффективности сбора рассеянного света, такая система не уступает стандартной системе. Попутно получено аналитическое выражение для аппаратной функции СПЦ с линзой.

- Рассчитаны передаточная и аппаратная функции для оптической системы СПЦ, в которой введены отклонения от осевой симметрии. Проанализировано влияние ошибок параметров оптической схемы СПЦ на погрешности параметров индикатрисы. Показано, что самым чувствительным параметром индикатрисы к ошибкам параметров СПЦ является Фурье-контраст. Установлено, что погрешности параметров индикатрисы: положение спектрального максимума, Фурье-контраста и спада, увеличиваются при увеличении размера исследуемой частицы при фиксированных параметрах СПЦ.

- Показано, что для того чтобы погрешность определения на СПЦ Фурье-контраста индикатрис сферических частиц с размерным параметром а<40 не превышали 1 %, необходимо выполнения следующих условий: отношение диаметра диафрагмы на фотоприемнике к фокусному расстоянию Д// < 1.5x10"3, величина отклонения частицы от оптической оси СПЦ т < 2 мкм, величина отклонения оси сферического зеркала от оси капилляра е < 20 мкм.

- Предложены параметры индикатрисы для определения размера и показателя преломления сферических частиц в диапазоне размеров от 0.5 мкм до 1.5 мкм и показателей преломления от 1.37 до 1.65, позволяющие определять размер и показатель преломления со средней погрешностью 1.5 % и 2.5 % соответственно.

- На базе СПЦ получен не требующий калибровки метод определения объема эритроцитов и концентрации гемоглобина в них. Объем эритроцитов и концентрация гемоглобина в них определяется с точностью -0.3 % и ~1 % соответственно.

- Получена линейная связь размерного параметра а с параметром положения спектрального максимума индикатрисы Р/, позволяющая вычислять размер частицы с погрешностью, не превышающей 2 % по всему диапазону изменения а от 12 до 100 и для любых значений показателя преломления в диапазоне от 1.35 до 1.6.

- С помощью использования Фурье-параметров индикатрисы реализовано параметрическое решение обратной задачи светорассеяния для сферических частиц с ядром. Эти частицы имеют следующие параметры: размерный параметр частицы 43<а<86, размерный параметр ядра 0.5а<ас<0.7а, показатель преломления оболочки Цг=1.36, показатель преломления ядра 1.4< нс<1.6. При этом средняя точность определения размера частицы составляет 2 % и точность определения размера ядра составляет 1.4 %.

- Показана возможность классификации лейкоцитов на основные классы по сигналу СПЦ.

- На СПЦ с применением параметрического метода решения обратной задачи измерены распределения по размеру и показателю преломления двух монодисперсных проб с полистирольными частицами. Среднее значение и ошибка среднего составили для размеров 0.66±0.01 мкм, 0.86+0.01 мкм, для показателей преломления 1.582±0.007,1.671±0.003 соответственно для каждой из проб.

- Продемонстрировано уменьшение ошибки в определении размера вызванное процедурой поиска минимумов при использовании Фурье-параметра индикатрисы для обработки экспериментально измеренных индикатрис.

- На СПЦ осуществлены измерения коэффициента преломления капель иммерсионного масла, жировых шариков молока и концентрации гемоглобина в сферизованном эритроците с использованием интеграла индикатрисы.

Практическая и научная ценность

Характерной особенностью развиваемой в данной работе технологии анализа одиночных частиц по светорассеянию является высокая скорость и универсальность. Индикатриса светорассеяния частицы измеряется со скоростью 300 штук в секунду. СПЦ - единственный в мире прибор, определяющий размер и показатель преломления одиночных частиц в реальном времени без процедуры калибровки. СПЦ является наиболее эффективным инструментом по сепарации частиц в различные категории.

Проведенные теоретические и экспериментальные исследования расширяют возможности техники сканирующей проточной цитометрии. Результаты работы могут быть использованы при проектировании СПЦ новой модификации, а также при создании анализатора клеток крови на базе СПЦ.

Структура работы

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и списка цитируемой литературы. Работа содержит 82 страницы текста, 30 рисунков, библиография из 50 наименований занимает 4 страницы.

Основные результаты работы докладывались на:

1. XXXIV Международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», Новосибирск, апрель 1996г.

2. IV международном совещательном семинаре "Фундаментальные науки в деятельности международного научно-технологического центра", Новосибирск, 23-27 апреля, 2001.

3. Всероссийской конференции " Медицинская физика - 2001", Москва, 26-30 июля, 2001.

4. Научных семинарах в Институте химической кинетики и горения СО РАН, Новосибирск, 1996-2001 гг. и опубликованы в следующих изданиях:

1. Maltsev V.P., Chernyshev A.V., Semyanov К.А., and Soini E. Absolute real-time measurement of particle size distribution with the flying light-scattering indicatrix method. // Applied Optics. - 1996. - V. 35. - P. 3275 - 3280.

2. Maltsev V.P., Chernyshev A.V., Semyanov K.A., and Soini E. Absolute real-time determination of size and refractive index of individual microspheres. // Measurement Science and Technology. - 1997. - V. 8. - P. 1023 - 1027.

3. Semyanov K.A and Maltsev V.P, Sub-Micron Spherical Particles Analysis with the Scanning Flow Cytometry. // Particles and Particles Systems Characterization. -2000 V. 17, p. 225-229.

4. Скрибунов, И.В., Тарасов П.А., Семьянов K.A. и Тихонова М.А., Кинетика накопления препарата "Фотосенс" лейкоцитами и эритроцитами крови человека. // Лазерная Медицина. - 1999. Т.З, вып 3-4. стр. 62-63.

5. Semyanov K.A, Р.А Tarasov, Е. Soini, А.К Petrov and V.P Maltsev, Calibration Free Method to Determine the Size and Hemoglobin Concentration of Individual Red Blood Cells from Light Scattering. // Applied Optics. - 2000. V. 39, p. 5884 -58B9.

6. Scribunov I.G., P.A Tarasov, K.A. Semyanov, V.P. Maltsev, A.V. Chernyshev, E.R. Chernych, M.V. Tichonova, Kinetics of Accumulation of Aluminum(III)-Sulfophthalocyanine by Leukocytes Measured with a Scanning Flow Cytometer. //Proceedingsof SPIE. -2000. V. 4162p. 108 - 119.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В диссертационной работе проанализированы методы и экспериментальные системы, позволяющие определять параметры одиночных частиц по данным светорассеяния. Главный результат исследования заключается в дальнейшем развитии технологии сканирующей проточной цитометрии. Относительно простая оптическая схема и несложные эмпирические уравнения позволяют решать очень важную проблему физической оптики, а именно определять параметры сферических частиц без привлечения каких - либо других методов.

Суммируя можно выделить следующие результаты данной работы:

1. Определены Фурье-параметры индикатрисы и проанализировано их поведение в зависимости от параметров сферической частицы.

2. Использование Фурье-параметров индикатрисы позволяет исключить влияние наличия граничного угла и позволяет решать обратную задачу светорассеяния для частиц с ядром.

3. Выяснено, что самым чувствительным параметром индикатрисы к отклонениям от симметрии оптической системы СПЦ является контраст.

4. Влияние смещения е оси капилляра от центра сферического зеркала на ошибку определения контраста можно существенно уменьшить соответствующим выбором положения фотоприемника относительно оптической оси системы СПЦ и положения траектории частицы относительно оси капилляра.

5. Использование Фурье-параметра индикатрисы при обработке экспериментально измеренных индикатрис позволяет уменьшить ошибки в определении размера вызванные процедурой поиска минимумов.

6. Расширена область применения решения обратной задачи светорассеяния для частиц сравнимых с длиной волны.

7. На СПЦ измерены распределения по объему сферизованных эритроцитов и концентрации гемоглобина в них.

Диссертационная работа выполнена при поддержке гранта СО РАН номер 702000 и гранта РФФИ номер 00-02-17467.

1. Mishchenko M.1., Hovenier J.W., Travis L.D. (Eds). Light Scattering by Nonspherical Particles. - New York: Academic Press, 2000. - 856 c.

2. Hart R.V, Gray E.P, Determination of particle structure from light scattering. // Journal of Applied Physics, v. 35, p. 1408 1415, 1964.

3. Болте Г.П. (Ред.). Обратные задачи в оптике. М.: Машиностроение, 1984.199 с.

4. Стейнкамп Дж . Цитометрия в потоке // Приборы для научных исследований. -1984.-N9.-С. 3-35.

5. Melamed M.R., Lindmo Т., and Mendelsohn M.L. (Eds). Flow cytometry and sorting. New York: Wiley-Liss, 1990. - 1140 c.

6. Cram L.S., Martin J.C., Steinkamp J.A., Ioshida T.M., Buican T.N., Marrone B.L., Jett J.H., Salzman G. and Sklar L. New flow cytometryc capabilities at the national flow cytometry resource. // Proceedings of the IEEE. 1992. - V. 80. - P. 92-97.

7. Maltsev V.P. Scanning flow cytometry for individual particle analysis. // Review of Scientific Instruments. 2000. - V. 7. - P. 243 - 255.

8. Ashkin A., Dziedzic J. M. Applied Optics. 1980. - V. 19. - P. 660.

9. Doornbos R.M.P., Schaeffer M., Hoekstra A.G., Sloot P.M.A., Degrooth B.G., and Greve J. Elastic light-scattering measurements of single biological cells in an optical trap. // Applied Optics. 1996. - V. 35. - P. 729 - 734.

10. Cooke D.D. and Kerker M. Particle size distribution of colloidal suspensions by light scattering based upon single particle counts-polystyrene latex. // J. Colloid Interface Sei. 1973.-V. 42.-P. 150-155.

11. Marx E. and Mulholland G.W. Size and refractive index determination of single polystyrene spheres. // J. of the National Bureau of Standards. 1983. - V. 88. -P. 321 -338.

12. Phillips D.T., Wyatt P.J., and Berkman R.M. Measurement of the Lorenz-Mie scattering of a single particle: polystyrene latex. // J. Colloid Interface Sei. 1970.- V. 34. - P. 159-162.

13. Wyatt P.J. Light scattering in the microbial world. // Journal Colloid and Interface Science. 1972. - V. 39. - P. 479-491.

14. Bartholdi M., Salzman G.C., Heibert R.D., and Kerker M. Differential light scattering photometer for rapid analysis of single particles in flow. // Applied Optics. 1980. -V. 19.-P. 1573 - 1584.

15. Ludlow I.A. and Kaye P.H. A scanning diffractometer for the rapid analysis of microparticles and biological cells. // J. Colloid Interface Sci. 1979. - V. 69. - P. 571 - 589.

16. Quist G.M. and Wyatt P.J. Empirical solution to the inverse-scattering problem by the optical strip-map technique // J. Opt. Soc. Am. A2. 1985. - P. 1979 - 1986.

17. Jones M.R., Leong K.H., Brewster M.Q., and Curry B.P. Inversion of Light-Scattering Measurements for Particle Size and Optical Constants: experimental study. // Applied.Optics. 1994. - V. 33. - P. 4025-4034.

18. Ludlow I.K. and Everitt J. Application of Gegenbauer analysis to light scattering from spheres: Theory. // Physical Review E. 1995. - V. 5 . - P. 2516 - 2526.

19. Ludlow I.K. and Everitt J. Systematic behavior of the Mie scattering coefficients of spheres as a function of order. // Physical Review E. 1996. - V. 53. - P. 2909 - 2924.

20. Warner T.L. and Hirleman E.D. Toward Classification of Particle Properties Using Light Scattering Techniques. // Journal of the Institute of Environmental Science. 1997. - V. 40.-P. 15-21.

21. Ulanowski Z., Wang Z., Kaye P.H., and Ludlow I.K. Application of Neural Networks to the Inverse Light Scattering Problem for Spheres. // Applied Optics. 1998. - V. 37.-P. 4027-4033.

22. Borovoi A.G., Naats E.I., and Oppel U.G. Scattering of light by a red blood cell. // Journal of Biomedical Optics. 1998. - V. 3. - P. 364 - 372.

23. Hammer M., Schweitzer D., Michel B., Thamm E., and Kolb A. Single Scattering by Red Blood Cells. //Applied Optics. 1998. - V. 37. - P. 7410 - 7418.

24. Nilsson A.M.K., Alsholm P., Karlsson A., and Andersson-Engels S. T-matrix computations of light scattering by red blood cells. // Applied Optics. 1998. -V. 37. - P. 2735 - 2748.

25. Uzunoglu N.K., Yova D., and Stamatakos G.S. Light scattering by pathalogical and deformed erythrocytes: an integral equation model. // Journal of Biomedical Optics. 1997. -V. 2.-P. 310-318.

26. Bedner E., Burfeind P., Gorczyca W., Melamed M.R., and Darzynkiewicz Z. Laser scanning cytometry distinguishes lymphocytes, monocytes, and granulocytes by differences in their chromatin structure. // Cytometry. 1997. - V. 29. - P. 191 -196.

27. Adams K.H. Mechanical Deformability of Biological Membranes and the Sphering of Erythrocyte. // Biophysical Journal. 1973. - V. 13. - P. 209 - 217.

28. Doornbos R.M.P., Hennink E.J., Putman C.A., de Grooth B.G., and Greve J. White blood cell differentiation using a solid state flow cytometer. // Cytometry. 1993. - V. 14. - P. 589 - 594.

29. Bohmer R-M. and King J.C. Immuno-Gold Labeling for Flow Cytometric Analysis. // J. Immun. Methods. 1984. - V. 74. - P. 49.

30. Keller H.U., Fedier A., and Rohner R. Relationship between light scattering in flow cytometry and changes in shape, volume, and actin polymerization in human polymorphonuclear leukocytes. // Journal of Leukocyte Biology. 1995. - V. 58. - P. 519 -525.

31. Eisele S., Lackie J.M., Riedwyl H., Zimmermann A., and Keller H.U. Analysis of lymphocyte shape by visual classification, calculated measures of shape or light scattering. // J Immunol .Methods. -1991 . V. 138. - P. 103 - 109.

32. Ormerod M.G., Paul F., Cheetham M., and Sun X.M. Discrimination of apoptotic thymocytes by forward light scatter. // Cytometry. 1995. - V. 21. - P. 300 -304.

33. Maltsev V.P., Chernyshev A.V., Semyanov K.A., and Soini E. Absolute real-time determination of size and refractive index of individual microspheres. // Measurement Science and Technology. 1997. - V. 8. - P. 1023 - 1027.

34. Maltsev,V.P, Estimation of morphological characteristics of single particles from light scattering data in flow cytometry. // Russian Chemical Bulletin. 1994. v. 43, p. 1115 -1124.

35. Maltsev,V.P, V.N Lopatin, Parametric solution of the inverse light-scattering problem for individual spherical particles. // Applied Optics. 1997. v. 36, p. 6102 - 6108.

36. Chernyshev, A.V, V.I Prots, A.A Doroshkin, V.P Maltsev, Measurement of scattering properties of individual particles with a scanning flow cytometer. // Applied Optics. 1995. v. 34, p. 6301-6305.

37. Semyanov K.A, P.A Tarasov, E. Soini, A.K Petrov and V.P Maltsev, Non-Calibration Method to Determine the Size and Hemoglobin Concentration of Individual Red Blood Cells from Light Scattering. // Applied Optics. 2000. v. 39, p. 5884 - 5889.

38. Min S., A Gomez, High-resolution size measurement of single spherical particles with a fast Fourier transform of the angular scattering intensity. // Applied Optics. 1996. v. 35, p. 4919-4926.

39. Bracewell R. N. The Fourier transform and its application. London: Mc-Grow Hill, 1986.

40. Begemann H. and Rastetter, J. Atlas of clinical hematology. New York: Springer Verlag, 1979.

41. Salzman G.C., Crowell J.M., Martin J.C., Trujillo T.T., Romero A., Mullaney P.F. and Labauve P.M. Cell classification by laser light scattering: identification and separation of unstained leukocytes // Acta Cytologica. 1975. - V. 19. P. 374-377.

42. Lin C.K., Lin J.S., Chen S.Y., Jiang M.L., and Chiu C.F. Comparison of hemoglobin and red blood cell distribution width in the differential diagnosis of microcytic anemia. //Arch.Pathol.Lab.Med. 1992. - V. 116 - P. 1030 - 1032.

43. Tycko D.H., Metz M.H., Epstein E.A., Grinbaum A. Flow-cytometric light scattering measurement of red blood cell volume and hemoglobin concentration. // Applied Optics. 1985. - V. 24. - P. 1355-1365.

44. Mohandas N., Kim Y.R., Tycko D.H., Orlik J., Wyatt J., and Groner W. Accurate and independent measurement of volume and hemoglobin concentration of individual red cells by laser light scattering. // Blood. 1986. - V. 68. - P. 506 - 513.

45. Kim Y.R., Ornstein L. Isovolumetric sphering of erythrocytes for more accurate and precise cell volume measurement by flow cytometry. // Cytometry. 1983. - V. 3. - P. 419 -427.

46. Борен К. и Хафмен Д. Поглощение и рассеяние света малыми частицами: пер. с англ. М.: Мир, 1986. - 664 с.

47. Bunyaratvej A., Buthachat S., Ratanasritong S. and Chitagatgone S. Thalassemic red cells determined by different technology of blood cell analyzers. // J. Med. Assoc. Thai. -1992.-V. 75.-P. 223 -227.

48. Maltsev V.P, Chernyshev A.V, Sem'yanov K.A. and Soini E. Absolute real-time measurement of particle size distribution with the method of flying lightscattering indicatrix. // Applied Optics. 1996. - V. 35. - P. 3275 - 3280.

49. Тепел А. Химия и физика молока. Москва: Пищевая промышленность, 1979. - 436 с.9fv1. Л i- ■•• .зл£о e>