Исследование кинетики образования поверхностных комплексов антиген-антитело с помощью сканирующего проточного цитометра тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.17 ВАК РФ

Введение.

Глава1. Взаимодействие антиген-антитело: экспериментальные методы исследования и теоретические модели.

§1.1. Взаимодействие антиген-антитело.

1.1.1. «Антиген» и «антитело».

1.1.2. Физическая основа взаимодействия антиген-антитело.

1.1.3. Характерные величины взаимодействия антиген-антитело.

§ 1.2. Экспериментальные методы исследования взаимодействия антиген-антитело.

§ 1.3. Математические модели взаимодействия антиген-антитело.

1.3.1. Равновесные модели.

1.3.2. Кинетические модели связывания антигена с антителом.

Глава 2. Экспериментальная установка и методика эксперимента.

§2.1. Сканирующий проточный цитометр.

§ 2.2. Измерение флуоресценции.

2.2.1. «Перпендикулярная» конфигурация измерения флуоресценции.

2.2.2. «Параллельная» конфигурация измерения флуоресценции.

2.2.3. Сравнение перпендикулярной и параллельной конфигураций измерения флуоресценции.

2.2.4. Процедуры, использованные при измерении флуоресценции.

2.2.5. Постановка кинетического эксперимента и влияние красителя в растворе.

§ 2.3. Использование светорассеяния для классификации частиц.

Глава 3. Кинетические модели связывания лигандов с поверхностными рецепторами клетки и иммуноагглютинации.

§3.1. Связывание моновалентного лиганда с моновалентным рецептором.

3.1.1. Формулировка физической модели.

3.1.2. Кинетическая схема процесса связывания.

3.1.3. Приближение непрерывной функции распределения.

3.1.4. Зависимость констант скоростей реакции от количества посадочных мест.

3.1.5. Кинетический предел.

3.1.6. Диффузионный предел.

3.1.7. Распределение клеток по количеству занятых рецепторов.

3.1.8. Необратимое связывание лиганда.

3.1.9. Обсуждение результатов.

§3.1. Кинетическая модель начальной стадии иммуноагглютинации.

Глава 4. Экспериментальные кннетнкн образования комплексов антиген -антитело: иммунофлуоресценция и иммуноагглютннация.

§4.1. Кинетика связывания флуоресцентно меченых антител с поверхностными рецепторами гибридомных клеток.

4.1.1. Постановка экспериментов.

4.1.2. Экспериментальные сигналы.

4.1.3. Экспериментальные результаты и их обсуждение.

§ 4.2. Исследование кинетики начальных стадий агглютинации.

4.2.1. Возможность использования СПЦ для исследования ранних стадий агглютинации.

4.2.2 Экспериментальные кинетики образования димеров на начальной стадии агглютинации.

Защита организма от инфекции - бактериальной, вирусной, грибковой или паразитарной - осуществляется системой иммунитета. Любая макромолекула, чуждая организму, может вызвать иммунный ответ. Взаимодействие антиген-антитело играет ключевую роль в иммунитете, являясь основой распознавания "свой-чужой" на молекулярном и клеточном уровне.

Антитела в организме представлены как в растворенном виде, так и в качестве поверхностных рецепторов на мембранах иммунокомпетентных клеток [1]. В последнем случае реакция антиген-антитело является гетерогенной, как и в случае, когда антигеном служит чужеродный микроорганизм. Связывание антитела с антигеном осуществляется за счет большого числа нековалентных взаимодействий (вандерваальсовское, гидрофобное и т.д.) и является обратимой бимолекулярной реакцией. Для образования

О II 1 комплекса антиген-антитело характерны высокие константы равновесия (10-10 М')и высокая специфичность взаимодействия [2]. Обычно считается, что разброс в константе скорости ассоциации для сходных по структуре антигенов невелик, а наблюдаемый разброс в константах равновесия вызван разницей в константах диссоциации комплекса антиген-антитело [ 3 ].Однако существуют экспериментальны данные, в которых наблюдалась обратная закономерность [4].

Взаимодействие антиген-антитело является элементарным актом иммунных процессов. Исследование реакции образования комплекса антиген-антитело необходимо для понимания молекулярной основы иммунитета. Изучение процесса образования комплекса антиген-антитело представляет интерес не только из-за явлений иммунитета. Антитела, особенно после распространения технологии моноклональных антител, являются одним из инструментов исследования в молекулярной биологии. С помощью антител идентифицировано большое количество клеточных рецепторов с различной функциональной ролью. Кроме того, возможно целенаправленное получение антител, имеющих структуру антиген-связывающего участка, сходную с молекулярной структурой других белковых молекул или вирусных рецепторов. Последнее особенно важно при исследовании взаимодействия особо опасных вирусов с клетками, поскольку антитела представляют в данном случае безопасную и адекватную модель вируса. Таким образом, исследование образования комплекса антиген-антитело выходит за рамки изучения только иммунной системы и оказывается связанным и с межклеточным взаимодействием, и с взаимодействием вирус-клетка. Во взаимодействии 4 антиген-антитело представляют интерес как структура самого комплекса, так и динамика его образования[5].

В большинстве экспериментальных работ, посвященных исследованию связывания антигена с антителом, традиционно определялась равновесная характеристика - константа равновесия комплекса антиген-антитело. Кинетический подход, хотя он и более информативен, использовался реже. Это связано с методическими трудностями в получении и анализе кинетических кривых. Например, непростой методической задачей является измерение кинетики ассоциации и диссоциации комплекса с минутным разрешением по времени. Отсутствие возможности непрерывной регистрации кинетики связывания для традиционных методик (радиоиммуноанализ, иммуноферментный анализ) накладывает серьезные ограничения на точность и надежность оценки кинетических параметров. Также остро стоит вопрос о способах учета неспецифического связывания в условиях далеких от равновесия [2].

В последние годы с разработкой новых методов исследования появляется все больше экспериментальных работ, посвященных кинетике образования комплексов антиген-антитело. При этом наиболее распространенными экспериментальными методиками традиционно являются радиоиммуноанализ, иммуноферментный анализ, иммунофлуоресцентный анализ, иммуноагглютинация, поверхностный плазмонный резонанс, техника полного внутреннего отражения, проточная цитометрия. Проточная цитометрия выгодно отличается от других методов, так как позволяет исследовать кинетику связывания антигена с антителом на поверхности одиночных клеток. Недавно было предложено новое направление в проточной цитометрии, обеспечивающее уникальные возможности для измерения светорассеяния от одиночных частиц, -сканирующая проточная цитометрия [6]. Сканирующий проточный цитометр позволяет измерять угловую зависимость интенсивности рассеянного света (индикатрису светорассеяния) одиночной частицы.

Диссертационная работа посвящена исследованию кинетики образования комплекса антиген-антитело в гетерогенной системе (растворенные антитела - клетка, растворенные антитела - латексная частица, покрытая антигеном) с использованием сканирующей проточной цитометрии. Исследования кинетики проводились по данным светорассеяния и флуоресценции от одиночных частиц. Измерение взаимодействия антиген-антитело на проточном цитометре можно реализовать, используя две методики: имуунофлюоресценцию и иммуноагглютинацию. Оба подхода были реализованы в данной работе.

В работе

1. Продемонстрировано использование сканирующего проточного цитометра для измерения кинетики связывания антигена с антителом в дисперсной системе (клетки, латексные частицы). Предложена и испытана «параллельная» конфигурация сканирующего проточного цитометра с использованием одного лазера для измерения светорассеяния и возбуждения флуоресценции.

2. Предложена математическая модель связывания растворенного лиганда с поверхностными рецепторами клетки, учитывающая гетерогенность клеточной популяции по количеству рецепторов. В приближении непрерывной функции распределения по количеству рецепторов показано, что для моновалентного лиганда учет гетерогенности клеточной популяции по количеству рецепторов не ведет к изменению кинетики среднего количества связанных лигандов.

3. Исследована кинетика связывания растворенных флуоресцентномеченых кроличьих анти-мышиных антител с поверхностными иммуноглобулиновыми рецепторами мышиных гибридомных клеток. Полученные экспериментальные данные позволяют без калибровки флюоресценции определить константу скорости реакции «лиганд-клеточный рецептор» к/, распределение клеток по количеству рецепторов, в том числе среднее количество и ширину распределения.

4. Предложена методика измерения ранних стадий иммуноагглютинационного процесса. Показано, что использование параметрического метода решения обратной задачи светорассеяния, развитого для сферических частиц, позволяет идентифицировать мономеры и димеры сфер.

5. Исследована кинетика начальной стадии агглютинации полимерных частиц, покрытых бычьим сывороточным альбумином (БСА), которая инициировалась добавлением кроличьих анти-БСА иммуноглобулинов. Предложена кинетическая модель начальной стадии агглютинации, которая была использована для описания экспериментальных данных. Получены кинетические параметры агрегации полимерных частиц и константа равновесия для образования комплексов антиген-антитело.

Проведенная работа позволила развить потенциал технологии сканирующей проточной цитометрии для кинетических исследований в биологических дисперсных системах. Практическая ценность настоящей работы определяется использованием полученных результатов:

- при разработке количественных экспресс-тестов, основанных на 6 иммуноагглютинации;

- для иммунофлуоресцентного анализа фенотипа клеток;

- в моделировании процессов иммунитета.

Работа выполнена в НИИ Молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии ВЕКТОР совместно с Институтом химической кинетики и горения СО РАН.

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения и списка цитируемой литературы, включающего 119 наименований. Диссертация изложена на 110 страницах, включает одну таблицу, 21 рисунок и приложение. Первая глава представляет собой литературный обзор, в котором представлены экспериментальные методы исследования кинетики взаимодействия антиген-антитело и математические модели описания процесса связывания лиганда с рецептором клетки.

Основные результаты работы докладывались на

1. Международной конференции «Биомедицинская оптика BIOS'99» (Сан-Хосе, США, 23-29 января 1999 г.);

2. На международном научном совещании «Оценка возможных биологических исследований в России в новом тысячелетии» (Новосибирск, 2-4 сентября 1999г.);

3. На международном симпозиуме серии «Химическая и биологическая угроза и ее предотвращение CBMTS III» (Щпиц, Швейцария, 6-13 мая 2000);

4. На международной конференции «Опасные патогенны» (Плимут, Великобритания, 4-7 сентября 2000 г.);

5. на международном симпозиуме серии «Химическая и биологическая угроза и ее предотвращение CBMTS IV» (Щпиц, Швейцария, и 26 апреля-2 мая 2002),

6. Международной конференции «Биомедицинская оптика BIOS'03» (Сан-Хосе, США, 26-30 января 2003 г.);

7. на научных семинарах и конкурсах в Институте химической кинетики и горения СО РАН (Новосибирск, 1998-2003) и НИИ молекулярной биологии ГНЦВиБ «Вектор» (Кольцово, Новосиб. обл., 1998-2003); и опубликованы в следующих работах:

1. A.N. Shvalov, I.V. Surovtsev, A.V. Chernyshev, J.T. Soini, and V.P. Maltsev. Particle Classification from Light Scattering with the Scanning Flow Cytometer, Cytometry, v.37, p.215-220, 1999.

2. I.V. Surovtsev, I.A. Razumov, A.N. Shvalov. Kinetic Study of Formation of Antigen-Antibody Complexes on the Cell Surface with the Scanning Flow Cytometer, SPIE Proceedings, v.3604, p.199-206, 1999.

3. A.N. Shvalov, J.T. Soini, I.V. Surovtsev, G.V. Kochneva, G.F. Sivolobova, A.K. Petrov, V.P. Maltsev. Individual Escherichia coli cells studied from light scattering with the scanning flow cytometer, Cytometry, v.41, p.41-45, 2000.

4. I.V. Surovtsev, I.A. Razumov, V.M. Nekrasov, A.N. Shvalov, J.T. Soini, V.P. Maltsev, A.K. Petrov, V.B. Loktev, and A.V. Chernyshev. Mathematical Modeling the Kinetics of Cell Distribution in the Process of Ligand-Receptor Binding, J. Theor. Biol., v.206, p.407-417, 2000.

5. I.V. Surovtsev, M.A. Yurkin, A.N. Shvalov, V.M. Nekrasov, G.F. Sivolobova, A.A. Grazhdantseva, V.P. Maltsev, and A.V. Chernyshev. Kinetics of Dimers Formation at the Initial Stage of Latex Agglutination Studied with the Scanning Flow Cytometer, представлена для публикации в Colloids and Surfaces В: Biointerface.

6. I.V. Surovtsev, A.N. Shvalov, G.F. Sivolobova, M.A. Yurkin. Kinetic study of the initial stages of agglutination process with Scanning Flow Cytometer, Manipulation and Analysis ofBiomolecules, Cells and Tissues, Photonic West 2003 (San Jose, USA), p.64, 2003.

7. I.V. Surovtsev, A.A. Grajdantseva, M.A. Yurkin. Use of Scanning Flow Cytometry for biodetection via earliest stages of agglutination immunoassay, Chemical Biological Medical Treatment Symposium III, (Spiez, Switzerland), p.47, 2002.

8. I.V. Surovtsev, I.A. Razumov, A.N. Shvalov. Scanning Flow Cytometry for kinetics study of antigen-antibody interaction on the cell surface, Chemical Biological Medical Treatment Symposium III, (Spiez, Switzerland), p.33, 2000.

Заключение

В данной работе исследовалась кинетика взаимодействия антиген-антитело в гетерогенной системе, а именно на поверхности клеток и латексных частиц. Для исследования использовалась техника сканирующей проточной цитометрии, имеющая уникальные возможности измерения индикатрисы светорассеяния одиночных частиц. Для идентификации клеток использована индикатриса светорассеяния, что позволило проводить измерения кинетики образования комплексов антиген-антитело на поверхности живых клеток. В этом случае важна задача выделения полезных сигналов от присутствующих в пробе мертвых, разрушенных клеток, агрегатов белков и т.д. Применение сканирующей проточной цитометрии в сочетании с развитой методикой иммунофлуоресцентного анализа позволило решить поставленную задачу.

Теоретический анализ кинетики взаимодействия был сфокусирован на задаче описания экспериментальных данных, получаемых в проточной цитометрии, то есть на описании временной эволюции распределения по флуоресценции. Разработана оригинальная математическая модель процесса образования комплекса «лиганд-рецептор клетки», использующая понятие функции распределения клеток по количеству рецепторов, то есть учитывающая гетерогенность клеточной популяции по количеству рецепторов. Модель использует весь набор экспериментальных данных, получаемых в кинетическом эксперименте на проточном цитометре, и позволяет оценить влияние гетерогенности клеточной популяции на кинетику процесса. Предложенная математическая модель может быть использована при моделировании различных процессов (мультивалентное связывание, реакция клетки на внешнее воздействие) и для описания данных, получаемых при измерении таких процессов.

Кроме этого предложена модель, в которой процесс агрегации частиц лимитируется диффузионным транспортом. Существенным является учет стерических эффектов, возникающих из-за анизотропной реакционной способности частиц. Именно использование модели агглютинации частиц для описания экспериментальных результатов позволило оценить константу равновесия для образования комплекса антиген-антитело.

В работе впервые для исследования кинетики образования комплекса антиген-антитело использован сканирующий проточный цитометр. С этой целью сканирующий проточный цитометр был модифицирован для флюоресцентных измерений, что позволило впервые реализовать одновременное измерение флюоресценции и индикатрисы светорассеяния одиночной частицы. В экспериментах предложена и опробована ранее не использовавшаяся «параллельная» конфигурация измерения флюоресценции. Экспериментально исследована кинетика связывания флюоресцеин-меченых анти-мышиных антител с поверхностными рецепторами живых мышиных гибридомных клеток. Для практического использования важна продемонстрированная в работе возможность количественной характеризации клеточных популяций без процедуры калибровки флюоресцентного канала.

Возможности сканирующего проточного цитометра в измерении светорассеяния одиночны частиц позволяют исследовать кинетику взаимодействия антиген-антитело с помощью иммуноагглютинационных методов. Показано, что, исследуя ранние стадии агрегации латексных частиц, покрытых антигеном, можно получить количественную характеристику «элементарного акта» - константу равновесия взаимодействия антиген-антитело. Если же система используемых латексных частиц уже охарактеризована (определена константа равновесия для соответствующей пары антиген-антитело), то можно определять концентрацию антител в пробе. То есть открываются возможности использования иммуноагглютинационных методов для количественной диагностики. Предложенный метод может быть использован и для исследования агглютинации клеток, вызываемой взаимодействием с вирусом. В этом случае появляется уникальная возможность определять количественные характеристики взаимодействия вирус-клетка на одиночных клетках неразрушающим методом, не требующим конъюгирования вирусных частиц с флюоресцентными красителями.

Проведенная работа позволила развить потенциал технологии сканирующей проточной цитометрии для кинетических исследований в биологических дисперсных системах. Были получены следующие результаты:

1. Продемонстрировано использование сканирующего проточного цитометра для измерения кинетики связывания антигена с антителом в дисперсной системе (клетки, латексные частицы). Предложена и испытана «параллельная» конфигурация сканирующего проточного цитометра с использованием одного лазера для измерения светорассеяния и возбуждения флуоресценции.

2. Предложена математическая модель связывания растворенного лиганда с поверхностными рецепторами клетки, учитывающая гетерогенность клеточной популяции по количеству рецепторов. В приближении непрерывной функции распределения по количеству рецепторов показано, что для моновалентного лиганда учет гетерогенности клеточной популяции по количеству рецепторов не ведет к изменению кинетики среднего количества связанных лигандов.

92

3. Исследована кинетика связывания растворенных флуоресцентномеченых кроличьих анти-мышиных антител с поверхностными иммуноглобулиновыми рецепторами мышиных гибридомных клеток. Полученные экспериментальные данные позволяют без калибровки флюоресценции определить константу скорости реакции «лиганд-клеточный рецептор» ку, распределение клеток по количеству рецепторов, в том числе среднее количество и ширину распределения.

4. Предложена методика измерения ранних стадий иммуноагглютинационного процесса. Показано, что использование параметрического метода решения обратной задачи светорассеяния, развитого для сферических частиц, позволяет идентифицировать мономеры и димеры сфер.

5. Исследована кинетика начальной стадии агглютинации полимерных частиц, покрытых бычьим сывороточным альбумином (БСА), которая инициировалась добавлением кроличьих анти-БСА иммуноглобулинов. Предложена кинетическая модель начальной стадии агглютинации, которая была использована для описания экспериментальных данных. Получены кинетические параметры агрегации полимерных частиц и константа равновесия для образования комплексов антиген-антитело.

1. Р.В. Петров. Иммунология, Медицина, М.,1987.

2. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: практический курс, ФАИР-ПРЕСС, М., 1999.

3. Берзофски Дж., Берковер А. Взаимодействие антиген-антитело. В Иммунология, под ред. У. Пола, Москва, Мир, 1989, стр.6-87.

4. Курочкин И.Н., Зайцев С.В., Белоусов А.С., Склянкина О.А., Варфоломеев С.Д. Физико-химическое исследование гетерогенной популяции опиоидных рецепторов, Биохимия, т.53, стр.41-53, 1988.

5. Б. Албертс, Д. Брей, Дж. Льюис, М. Рэфф, К. Роберте, Дж. Уотсон. Молекулярная биология клетки, Мир, М., 1994.

6. Maltsev V.P. Scanning flow cytometry for individual particle analysis. Rev. Sci. Instruments, v.71, p.243-255, 2000.

7. Falk S, Oulianova N., Berteloot A. Kinetic mechanism of inhibitor binding: relevance to the fact-acting slow-binding paradigm, Biophys. J.,\.ll, p.173-188, 1999.

8. Paul S., Voile D.J., Beach C.M., Johnson D.R., Powell M.J., Massey R.J.A. Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody, Science, v.244, p. 1158-62, 1989.

9. Nevinsky G., Buneva V. Human catalytic RNA- and DNA-hydrolyzing antibodies, J. Immunol. Methods, v.269, p.235-249, 2002.

10. Kennet R.H., McKearn T.J., Bechtol K.B. Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A new dimension in biological analysis, PlenumPress, New York, 1980.

11. Протопопова Е.В., Хусаинова А.Д., Коновалова С.Н., Локтев В.Б. Получение и изучение свойств антиидиотипических антител, несущих на своей поверхности паратопы вируса клещевого энцефалита, Вопросы Вирусологии, N1, стр.50-53, 1996.

12. Bongard P. Ligand-receptor interactions. Rep. Prog. Phys., v.62, p.921-968, 1999.

13. Варфоломеев С.Д. Рецепторно-ферментные системы. Кинетические закономерности действия. Биохимия, т.53, стр.1677-1683, 1988.

14. Figge М.Т. Statistical model for receptor-ligand binding thermodynamics, Phys.Rev. E, v.66, p.061901, 2002.

15. Сухомлин Т.К., Мелихова E.M., Курочкин И.Н., Варфоломеев С.Д. Колебания рецепторного связывания. Биохимия, т.57, стр.1711-1721, 1988.

16. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. Высшая школа, М., 1991.

17. Time resolved fluorescence assay. InPronciples and practice of immunoassay, p.374-379.

18. Bonifacino J.S., Paladini А.С. Effect of the incomplete separation of bound and free ligand on binding experiments. Anal. Biochem., v.118, p.213-220, 1981.

19. Storch M.-J., Marbach P., Kerp L. A time-resolved fluoroimmunoassay for human insulin based on two monoclonal antibodies, J. Immunol Metk, v.157, p.197-201.

20. Chan S.S., Arndt-Jovin D.J., Jovin T. Proximity of Lectin receptors on the cell surface measured by flurescence energy transfer in a flow system. J. Histochem. Cytochem., v.21, p.55-64, 1979.

21. Tron L., Szollosi, Damjanovich S., flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surface. Biophys. J., v.45, p. 939-946, 1984.

22. Mogokolsirichaikul D., Tarnchompoo В., Ratanabanangkoon K. Development of a latex agglutination inhibition reaction test for amphetamines in urine. J. Immunol. Metk; v.157, p.189-195, 1993.

23. Peula-Garsia J.M., Bolivar J.A.M., Velasco J., Rojas A., Gonzales F.G. Interaction of bacterial endotoxine (lipopolysaccaride) with latex particles: application to latex agglutination immunoassays. J. Colloid. Interface. Sci., v.245, p.230-236, 2002.

24. Ellis R.W., Sobanski M.A. Diagnostic particle agglutination using ultrasound: a new technology to rejuvenate old microbiological methods. J. Med. Microbiol., v.49, p.853-859, 2000.

25. Yinuesa J.L.O., Bolivar J.A.M., Peula J.M., Alvarez RH. A comparative study of optical techniques applied to particle enhanced assays of C-reactive protein. J. Immunol. Metk, v.205, p.151-156, 1997.

26. H. Kitano, S. Iwai, Т. Okubo, N. Ise. J. Am. Chem. Soc., v.109, p.7608-7612, 199?.

27. Ball R.C., Weitz D.A., Witten T.A., Leyvraz F. Universal kinetics in reaction-limited aggregation. Phys. Rev. Let., v.58, p.274-277, 1987.

28. Wiltzius P. Hydrodynamic behavior of fractal aggregates. Phys. Rev. Let., v.58, p.710-713, 1987.

29. Nakamura M., Ohshima H., Kondo T. Aggregation behavior of antibody-carrying latex particles. J. Colloid Interface Sci., v.154, p.393-399, 1992.

30. Thompson J.C., Graig A.R., Davey C.L., Newman D.J., Londsdale M.L., Busher W.J., Nagle P., Price C.P. Kinetics and proposed mechanism of the reaction of an immunoinhibition, particle-enhanced immunoassay. Clin. Chem., v.43, p.2384-2389, 1997.

31. Quesada M., Puig J., Delgado J.M., Peula J.M., Molina J.A., Higaldo-Alvarez R. A simple kinetic model of antigen-antibody reactions in particle-enhanced light scattering immunoassays. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v.8, p.303-309, 1997.

32. Laurenzi I.J. Diamond S.L. Monte Carlo simulation of the heterotypic aggregation kinetics of platelets and neutrophis, Biophys. J., v. 77, p. 1733-1746, 1999.

33. Long M., Goldsmith H.L., Tees D., Zhu C. Probabilistic modeling of shear-induced formation and breakage of doublets cross-linked by receptors-ligand bonds. Biophys. J., v.76, p.l 112-1128, 1999.

34. O'Schannessy. Determination of kinetic rate and equilibrium binding constants for macromolecular interactions: a critique of the surface plasmon resonance literature. Current opinion in Biotechnology, v.5, p.65-71, 1994.

35. Malmborg A.-C., Michaelsson, Ohlin M., Jansson, Borrebaeck C.A.K. Real time analysis of antibody-antigen reaction kinetics, Scand. J. Immunol., v. 35, p.643-650, 1992.

36. Sadana A., Chen Z. Influence of non-specific binding on antigen-antibody kinetics for biosensor applications. Biosensors & Bio electronics, v.ll, p. 17-33, 1996.

37. Balgi G., Leckband D.E., Nitsche J. Transport effects on the kinetics of protein-surface binding. Biophys.J., v.68, p.2251-2260,1995.

38. Sadana A. A single- and dual fractal abnalysis of antigen-antibody binding kinetics for different biosensors application. Biosensors & Bioelectronics, v.14, p.515-531, 1999.

39. Liebert R.B., Prieve D.C. Species-species long range interaction between receptors/ligand pairs. Biophys.J., v.69, p.66-73, 1995.

40. Thompson N.L., Axelrod D. Immunoglobulin suface-binding kinetics studied by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy, Biophys.J., v.43, p.103-114, 1983.

41. Starr Т.Е., Thompson N.L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy: combined surface reaction and solution diffusion. Biophys.J.80, p.1575-1584, 2001.

42. Flow Cytometry and Sorting, Melamed M.R., Lindmo Т., Mendelson M.L. (eds.), Wiley-Liss, New York, 1990.

43. McCarthy D.A., Macey M.G. Cytometric analysis of cell phenotype and function, Cambridge University Press, 2001.

44. Labus J.M., Petersen B.H. Quantitation of human anti-mouse antibody in serum by flow cytometry, Cytometry, v.13, p.275-281, 1992.

45. Sklar L.A., Finney D.A., Oades Z.G., Jesaitis A.J., Painter R.G., Cochrane C.G. the dynamics of ligand-receptor interactions. J. Biol. Chem., v.259, p.5661-5669, 1984.

46. Sklar L.A., Edwards B.S., Graves S.W., Nolan J.P., Prossnitz E.R. Flow cytometric analysis of ligand-receptor interactions and molecular assemblies, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., v.31, p.97-119, 2002.

47. Зенин B.B., Аксенов Н.Д., Шатрова A.H., Клопов Н.В., Крам Л.С., Полетаев А.И. Устройство для предобработки образца при анализе методом цитометрии в потоке, Биофизика, т.44, стр. 303-312, 1999.

48. Broide M.L., Cohen R.J. Measurements of cluster-size distributions arising in salt-induced aggregation of polysterene microspheres, J. Colloid and Interface Sci., v.153, p.493-508, 1992.

49. Bohen M.S., Broide M.L., Cohen R.J. Determination of cluster-size distributions using an optical pulse particle size analyzer, J. Colloid and Interface Sci., v.105, p.605-616, 1985.

50. Shvalov A.N., Soini J.T., Chernyshev A.V., Tarasov P.A., Soini E., Maltsev V.P. Light-scattering properties of individual erythrocytes, Applied Optics, v.38, p.230-235, 1999.

51. Boborvnik S.A. Ligand-receptor interaction. Klotz-Hunston problem for two classes of binding sites and its solution. J. Biochem. Biophys Methods, v.52, pi35-143, 2002.

52. Современные проблемы биокинетики. Под ред. С.Д. Варфоломеева. Изд-во Моск. Ун-та, М.,1987.

53. Junghans R.P. Cruel antibody fictions! Cellular antigen enumeration by "saturation binding", Immunlogy Today, v.20, p.401, 1999.

54. Saroff H.A. Ligand dependent aggregation and cooperativity: a critique, Biochem., v.30, p. 10085-10090, 1991.

55. Aranyi P. Kinetics of the glucocorticoid hormone-receptor interaction. False Association constants determined in slowly equilibrating systems. Biochim. Biophys. Acta, v.584, p.529-537, 1979.

56. Иваницкий T.P., Кринский В.И., Сельков Е.Е. Математическая биофизика клетки, Наука. М„ 1978.

57. Vassent G. Multi-random binding molecular interactions: a general kinetic model, J. Theor. Biol., \.44, p. 241-270, 1974.

58. Aranyi P. Kinetics of the hormone-receptor interaction. Competition experiments with slowly equilibrating ligands, Biochim. Biophys. Acta, v.628, p.220-227, 1980.

59. Almagor H., Levitzki A. Analytical determination of receptor-ligand dissotiation constants of two populations receptors from displacement curves, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v.87, p.6482-6486, 1990.

60. Rodbard D., Weiss G.H. Mathematical theory of immunoradiometric (labeled antibody) assays .Anal. Biochem., v.52, p.10-44, 1973.

61. Yeakley J.M., Comparison of glucocorticoid-receptor binding kinetics with predictions from bimolecular model, J. Biol. Chem., v.255, p.4182-4188, 1980.

62. McQuarrie D.A.Kinetics of small systems I. J. Chem. Phys.,\. 38, p. 433-436, 1963.

63. Williams Т.Е., Nagarajan S., Selvaraj P., Zhu C. Concurrent and independent binding of Fey receptors Ila and Illb to Surface bound IgG. Biophys. J., v.79, p. 1867-1875,2000.

64. Chesla S.E., Selvaraj P., Zhu C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophys.,/., v.75, p. 1553-1572, 1998.

65. Kuo S.C., Hammer D.A., Lauffenberg D.A. Simulation of detachment of specifically bound particles from surfaces by shear flow. Biophys. J., v.73, p. 517-531, 1997.

66. Zhu С., Williams Т.Е. Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion. Biophys. J., v.79, p. 1850-1857, 2000.

67. Berg H.C., Purcell E.M. Physics of chemoreception. Biophys. J., v.20, p.193-217, 1977. 86 . Doktorov А.В., Lkzen N.N. Diffusion-controlled reactions on an active site, Chem.Phys.Lett., v.79, p.498-502, 1981.

68. Бердников B.M., Докторов А.Б. Сетрический фактор в элементарном акте в жидкой фазе, Теорет. и Эксперим. Химия, т.17, стр.318-326, 1981.

69. Докторов А.Б. Кинетика процессов, индуцированных бинарными встречами частиц в растворе, Диссертация на соискание степени доктора физико-математических наук, Новосибирск, 1986.

70. Northrup S.H. Diffusion-controlled ligand binding to multiple competing cell-bound receptors. J. Phys. Chem.,v.92, p.5847-5850, 1988.

71. Goldstein B.,Wigel F. XXX. Biophys. J., v.43, p.121, 1982.91. van Opheusden J.H.J., Wiegel F.W., Goldstein В., Forward rate constants fgor receptor clusters. Variational methods for upper and lower binding. Biophys. Chem., v.20, p.237-248, 1984.

72. Shoup D., Szabo A. Role of diffusion in ligand binding to macromolecules and cell-bound receptors. Biophys. J., v.40, p.33-39, 1982.

73. Wigel F.W. Diffusion and physics of chemoreception. Phys. Rep., v.95, p.283-319, 1983.

74. Zwanzig R. Diffusion controlled ligand binding to spheres partially covered by receptors: an effective medium treatment. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v.87, p.5856-5857, 1990.

75. Zwanzig R., Szabo A. Time dependent rate of diffusion-influenced ligand binding to receptors on cell surface. Biophys. J., v.60, p.671-678, 1991.

76. Sole K, Stockmayer W.H. Kinetic of diffusion-controlled reaction between chemically asymmetric molecules. I. General theory. J. Chem. Phys., v.54, p2981-2987, 1971.

77. Hill T.L. Effect of rotation on the diffusion controlled rate of ligand-protein association, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v.72, p4918-4922, 1975.

78. Schmitz K.S., Schurr J.M. The role of orientation constraints and rotational diffusion in bimolecular solution kinetics, J. Phys. Chem., v.76, p534-545, 1972.

79. Докторов А.Б.б Лукзен H.H. Усреднение анизотропии реакционной способности трансляционным и вращательным движением реагентов, Хим. Физика, т.4б, с.616-624,1985.

80. Lagerholm B.C., Thompson N.L., Theory for ligand rebinding at cell membrane surfaces. Biophys. J., v.74, p. 1215-1228, 1998.

81. Berg O.G. On diffusion-controlled dissociation. Chem. Phys., v.31, p.47-57, 1978.

82. Copich I.V., Agmon N. Rigorous derivation of the long-time asymptotics for reversible binding. Phys. Rev. Let.,\.84, p.2730-2733, 2000.

83. Adam G., Delbruck M. Reduction of dimensionality in biological diffusion process. In Structural chemistry and molecular biology. A. Rich and N. Davidson, editors. W.H.Freeman and Co Publishers, San Fransisco, p. 198-215, 1968.

84. Berg O.G. Orientation constraints in diffusion- limited macromolecular association. Biophys. J., \.41, p. 1-15, 1985.

85. Cukier R.I. The effect of surface diffusion on surface reaction rates. J. Chem. Phys., v.79, p.2430-2435, 1983.

86. Bloomfield V.A., Prager S. Diffusion controlled reaction on spherical surfaces. Biophys. J., v.27, p. 447-453, 1979.

87. Van Haastert P.J.M., De Wit R.J.W. Demonstration of receptor heterogeneity and affinity modulation by nonequilibrium binding experiments. J. Biol. Chem., v.259, p. 13321-13328, 1984.

88. Lancet D., Sadovsky E., Seideman E. Probability model for molecular recognition in biological receptor repertoires: significance to olfactory systems. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v.90, p.3715-3719, 1993.

89. Курочкин И.Н., Зайцев С.В., Белоусов А.С., Склянкина О.А., Варфолмеев С.Д. Физико-химическое исследование гетерогенной популяции опиоидных рецепторов. Биохимия, т.53, с.41-53, 1988.

90. Jose M.V., Jose V.J. Probability distributions affinities for heterogeneous receptor populations. J. Theor. Biol., v.190, p. 85-92, 1998.

91. Sulzer В., Perelson A.S. Equlibrium binding of multivalent ligand to Cells: effects of cell and receptor density, Math. Biosci., v.135, p. 147-185, 1996.

92. Туницкий Н.Н. Диффузия и случайные процессы. Наука, Сибирское отделение, 1970.

93. А.В. Doktorov and B.I. Yakobson. Contact reactions of randomly walking particles,

94. Chem. Phys., v.60, p.223-230, 1981.

95. A.I. Burshtein, A.B. Doktorov and V.A. Morozov. Contact reactions of randomly walking particles. Chem. Phys. v.104, p. 1-18,1986.

96. Иммунологические методы. Под ред. Фримеля И.Я., Москва, 1987.

97. Hoekstra A.G., Sloot P.A. Biophysical and biomedical applications of nonspherical scattering. In Light Scattering by Nonsperical Particles: Theory, Measurements, and Applications, p.585-673, 2000.

98. Yoon J.Y., Kim K.H., Choi S.W., Kim J.H., Kim W.S., Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v.27, p.3-10, 2003.1. РОСОИС***