Исследование светорассеивающих свойств несферических биологических частиц с использованием сканирующей проточной цитометрии тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.05 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

1 СКАНИРУЮЩИЙ ПРОТОЧНЫЙ ЦИТОМЕТР.

1.1 Методы определения параметров сканирующего проточного цитометра в однотриггерной конфигурации.

1.2 Программное обеспечение сканирующего проточного цитометра

1.2.1 Управление системой сбора данных сканирующего проточного цитометра.

1.2.2 Обработка результатов измерений сканирующего проточного цитометра.

1.3 Ориентация несферических частиц в гидродинамической системе цитометра.

1.3.1 Параболический профиль скоростей.

1.3.2 Сужающаяся (расширяющаяся) труба

2 РАСЧЕТЫ ПОЛЯ РАССЕЯНИЯ И РЕШЕНИЕ ОБРАТНОЙ ЗАДАЧИ СВЕТОРАССЕЯНИЯ ДЛЯ НЕСФЕРИЧЕСКИХ ЧАСТИЦ.

2.1 Особенности формирования индикатрисы одиночной несферической частицы.

2.1.1 Использование ВКБ приближения для расчета индикатрис рассеяния одиночными двояковогнутыми дисками в произвольной ориентации.

2.1.2 Расчет индикатрис светорассеяния для вытянутых сфероидов вращения методом Т-матриц.

2.2 Обратная задача светорассеяния для ориентированных сфероидов вращения.

3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СВЕТОРАССЕИВАЮЩИХ СВОЙСТВ НЕСФЕРИЧЕСКИХ ЧАСТИЦ

3.1 Классификация латексных частиц на сканирующем проточном цитометре.

3.2 Рассеяние света эритроцитами человека.

3.3 Рассеяние света бактериями Е.соН 70 3.3.1 Параметризация обратной задачи светорассеяния для сфероидальных частиц.

Дисперсные системы широко распространены как в живой, так и в неживой природе. Существует два принципиально разных подхода при исследовании дисперсных систем: исследование системы как целого, и изучение отдельных составляющих. При относительной простоте проведения исследований дисперсионной системы как целого, интерпретация результатов, полученных при таком подходе, является сложной задачей. Исследование же отдельных составляющих частей системы дает наиболее полную информацию о системе.

Например, анализ изображения в микроскопии позволяет не только классифицировать его, но и определить множество физических параметров (размеры, внутреннюю структуру, показатели преломления составляющих и т.д.). С другой стороны микроскопические методы позволяют лишь исследовать небольшие количества частиц дисперсной среды, и с их помощью невозможно накопить данные в статистически надежных количествах при исследовании редких событий. Кроме того, микроскопические исследования являются довольно трудоемким процессом.

С бурным развитием лазерной техники, систем автоматизации исследований и методов обработки данных стали стремительно развиваться методы исследования отдельных составляющих дисперсных системы. Среди них широкое распространение получили два метода, позволяющих исследовать систему частиц с большой статистической точностью, а именно, проточная цитометрия [1] и метод Култера [2]. Благодаря большой скорости регистрации параметров одиночных частиц (до 105 сек"1), эти методы представляют огромный шаг вперед по сравнению с микроскопическими методами.

До недавнего времени, количество измерений одной частицы, регистрируемых на проточных цитометрах, ограничивалось сигналами рассеяния в два телесных угла и сигналами флюоресценции на различных длинах волн. При таких методах регистрации стало возможным произвести классификацию составляющих дисперсной системы на подсистемы. Однако, определение же морфологических параметров той или иной подсистемы с использованием стандартного проточного цитометра, даже в простейшем случае, гомогенной сферической частицы, представляют собой сложнейшие процедуры с тщательной калибровкой системы [3].

Развитие быстрых методов определения морфологических параметров несферических объектов очень важно для медицины, биологических исследований, и т.д. Цитометрия, например, позволяет значительно ускорить изучение влияния антибиотиков на рост популяции клеток [4, 5].

Однако, как и при классификации, так и при определении параметров частиц, форма которых отлична от сферической, возникают большие дополнительные трудности. Кроме роста числа определяемых параметров, появляются сложности, связанные с ориентацией объекта относительно направления подающего излучения. При исследовании несферических частиц возможно лишь определение некоторых, усредненных по множеству частиц, параметров. Такой подход возможен лишь в том случае, когда а priori известно, что разброс в морфологии частиц лежит в узких пределах, что далеко не всегда выполняется.

Например, в 1972 году Кроссом [6] впервые была измерена угловая зависимость интенсивности рассеянного на взвеси клеток Escherichia coli света. При интерпретации результатов использовалось приближение Релея - Ганса - Дебая, в котором использовались значения объема частиц, измеренные с помощью Култер метода.

Позднее группой Бронка исследовались поляризационные свойства взвесей палочкообразных бактерий Escherichia coli и Bacillus Subtilis. Экспериментально измеренное положение второго максимума в комбинации элементов матрицы Мюллера

-:'4 +использовалось [7, 8] для определения усредненного диаметра частиц взвеси. 5,, +513

Связь этой комбинации элементов матрицы Мюллера и параметров частиц определялась из сопоставления с данными микроскопии [8] и результатов расчета методом связанных диполей [9].

Де Гроссом [10, 11] на примере исследования белых кровяных телец было показано, что применение поляризационных измерений позволяют значительно повысить классификационные свойства проточной цитометрии.

Кроме бактериальных клеток, широко исследуемым несферическим объектом является взвесь нормальных эритроцитов человека. В работе Стейнке [12] при исследовании сферизованных и несферизованных эритроцитов было обнаружено, что сечение рассеяния пропорционально объему. Позднее различными авторами были проверены применимости различных приближений при интерпретации сигналов рассеяния на взвеси эритроцитов: аномальной дифракции [13], приближения Релея-Ганса-Дебая [14] и метод интегральных уравнений [15]. При этом форма эритроцита моделировалась сплюснутым сфероидом вращения.

Другой метод определения параметров отдельных составляющих дисперсной системы, впервые был продемонстрирован Гукером и Эганом [16] в 1961 году. Ими была предложена схема установки, регистрирующей картину рассеяния (индикатрису) в широком диапазоне углов и измерена индикатриса от одиночной частицы - 1.45 мкм сферической частицы из диотилфтолата. Частица фиксировалась в пространстве электрическим полем, и индикатриса светорассеяния сканировалась перемещением фотоприемника. Из полученной индикатрисы, по данным подгонки методом наименьших квадратов рассчитанных по теории Ми индикатрис к экспериментальной, были определены параметры частицы, т.е. решена обратная задача светорассеяния. Позднее Вяттом та же методика применялась и для негомогенных сферических объектов - различных спор и бактерий [17, 18, 19].

Такой метод определения параметров частицы, по всей картине рассеяния, является очень многообещающим, так как даже оптическая микроскопия является частным его случаем - в этом случае регистрируется рассеяние в передние углы при малой длине волны по сравнению с деталями объекта.

Однако техника регистрации (с пространственной фиксацией частицы в луче лазера), и медленный метод обработки, не позволяли проведение статистических исследований суспензий.

Появление техники сканирующей проточной цитометрии [20] и развитие метода пролетной индикатрисы [42] для определения параметров гомогенных сферических объектов диапазона 1 мкм - 10 мкм позволило совместить скорость проточной цитометрии (1000 сек"1) с точностью электронной микроскопии (-30 нм). С ее помощью были проведены эксперименты по определению жирности молока, количества гемоглобина в сферизованных эритроцитов человека, а так же исследован процесс дисперсионной полимеризации [21, 22].

Систематических исследований несферических объектов с использованием проточной цитометрии практически не проводилось, и данная абота является первой попыткой проведения таких исследований.

Целью данной работы было исследование возможности использования техники сканирующей проточной цитометрии и ее развитие для регистрации рассеяния от несферических частиц и определения их параметров.

В диссертационной работе впервые:

1. Описана однотриггерная схема сканирующего проточного цитометра (СПЦ).

2. В приближении Венцеля - Крамерса - Бриллюэна промоделировано светорассеяние от двояковогнутых дисков, формы, которую имеют недеформированные нормальные эритроциты человека и исследована зависимость параметров индикатрисы светорассеяния от ориентации относительно падающего излучения.

3. С помощью сканирующего проточного цитометра измерены индикатрисы светорассеяния от одиночных эритроцитов человека.

4. Получено параметрическое решение обратной задачи светорассеяния для несферических частиц - вытянутых сфероидов вращения, ориентированных вдоль падающего излучения.

5. Предложен метод классификации латексных частиц по исходным сигналам сканирующего проточного цитометра.

6. Показана возможность определения параметров вытянутых сфероидов в сканирующем проточном цитометре.

7. Измерено дифференциальное сечение рассеяния от одиночных клеток E.coli.

Практическая ценность настоящей работы определяется использованием результатов при:

Проведении исследовании параметров несферических частиц с использованием цитометров стандартной конфигурации и на сканирующем проточном цитометре;

Решении обратной задачи по сигналу светорассеяния для ориентированных сфероидов;

Разработке проточных цитометров стандартной конфигурации для классификации латексных частиц или клеток E.coli;

Проведении кинетических исследований роста популяции бактериальных клеток.

Диссертация состоит из трех глав.

Первая глава посвящена развитию техники сканирующей проточной цитометрии.

В первом разделе описан модифицированный сканирующий проточный цитометр для проведения экспериментов с объектами, размеры которых сравнимы с длиной волны.

Во втором разделе описана структура программного обеспечения сканирующего проточного цитометра.

В третьем разделе исследован вопрос ориентации несферических частиц в гидродинамической системе сканирующего проточного цитометра.

Во второй главе диссертации рассмотрено влияние ориентации несферических объектов на картину светорассеяния и проведена параметризация обратной задачи для частного случая ориентации вытянутых сфероидов осью симметрии параллельно направлению распространения падающего излучения.

В первом разделе с помощью приближения ВКБ для двояковогнутых дисков и с использованием теории Т-матриц для вытянутых сфероидов вращения исследована зависимость картины светорассеяния в зависимости от ориентации частиц.

Во втором разделе проведена параметризация обратной задачи светорассеяния для сфероидов вращения, ориентированных вдоль падающего излучения.

Третья глава посвящена экспериментальным работам, проведенным на сканирующем проточном цитометре.

В первой части предложен и апробирован метод классификации латексных частиц на классы, дающий лучшее, по сравнению с методом пролетной индикатрисы разделение латексных частиц с разными размерами.

Во второй части представлены результаты экспериментального исследования нормальных эритроцитов человека.

В третьей части исследовано светорассеяние бактериальных клеток E.coli и применено параметрическое решение обратной задачи для ориентированных сфероидов вращения.

В приложение включена библиотека SFCADC.DLL, написанная на языке Delphi для работы с СПЦ через универсальную плату DAQ1201 фирмы Quatech.

На защиту выносятся следующие положения:

Параметры частиц с длиной от 0.5 мкм до 3.5 мкм, диаметром от 0.5 мкм до 1.5 мкм и коэффициентом преломления от 1.35 до 1.45 определяются с использованием проведенного параметрического решения обратной задачи светорассеяния, при этом погрешность определения параметров ~ 2% для размеров и -0.2% для показателя преломления.

- Для определения параметров клеток E.coli на СПЦ, а также для регистрации сигнала светорассеяния от нормальных эритроцитов человека толщина рабочей струи проточного цитометра должна быть не более 4 мкм.

- Дифференциальное сечение рассеяния клеток Е. coli изменяется в пределах от 3x10"8 см2 до 10~10 см2 при изменении угла рассеяния от 15° до 60°.

Основные результаты диссертации представлены в 5 публикациях, включенных в прилагаемый перечень. Содержание диссертации докладывалось на XXXV Международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (г.Новосибирск, 1997г.), на 7-ом европейском симпозиуме "Классификация частиц" (Нюрнберг, 10-12 марта 1998), на международном симпозиуме "Оценка биологических проектов России на пороге нового тысячелетия" (2-4 сентября, 1999 Новосибирск), международной конференции "Новые разработки в биомедицинской оптической спектроскопии, распознавании образов и диагностике" (Мюнхен, 13-17 июня 1999), а также на научных семинарах в Институте химической кинетики и горения СО РАН (Новосибирск, 1996-2000 гг.), в Институте автоматики и электрометрии СО РАН (Новосибирск, 2000 г.), и на отделении медицинской физики университета г. Турку (Финляндия, 1998 г.)

Основные результаты работы докладывались на:

1. Швалов А.Н., «Исследование светорассеивающих свойств эритроциттов с помощью сканирующей проточной цитометрии», материалы XXXV Международной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс», г. Новосибирск, 1997г.

2. Soini, J.T., Chernyshev, A.V., Shvalov, A.N., and Maltsev V.P. (1997). "Measurement of scattering patterns from individual non-spherical particles using scanning flow cytometer. " Abstr.Vol.,Workshop on Light Scattering by Non-spherical Particles, Univ. of Helsinki, 1997,37.

3. A.N.Shvalov, A.V.Chernyshev, J.T.Soini, E.Soini, and V.P.Maltsev

Flying Light-Scattering Indicatrix of individual erythrocytes 7th European Symposium "Particle characterization" Nuernberg, Germany, 10-12 March 1998, Preprints II, pp. 675684

4. A.N. Shvalov, J.T. Soini, I.V. Surovtsev, G.V. Kochneva, G.F. Sivolobova, A.K. Petrov, and V.P. Maltsev, "Individual E.Coli Cells Studied from Light Scattering with the Scanning Flow Cytometer", Advanced Receach Workshop "Assessment of Sponsored Biological Research in Russia for the New Millennium" (September 2-4, 1999 Novosibirsk, Russia).

5. Alexander N. Shvalov, Valeri P. Maltsev, Galina V. Kochneva and Galina V. Sivolobova, "Light-scattering properties of E.coli and E.coli infected by phage" (poster), CLEO Europe 1999 Focus Meetings, Novel Biomedical Optical Spectroscopy, Imaging, and Diagnostics

6. Valeri Maltsev, Alexander Shvalov, "Light-scattering properties of bacteria and cells measured with scanning flow cytometry" CLEO Europe 1999 Focus Meetings, Novel Biomedical Optical Spectroscopy, Imaging, and Diagnostics, и опубликованы в следующих изданиях:

1. Alexander Shvalov, Ivan Surovtsev, Andrei V. Chernyshev, Juhani T. Soini, Valeri P. Maltsev, "Particle Classification from Light Scattering with the Scanning Flow Cytometer", Cytometry Vol. 37, Issue 3, 1999, pp. 215-220.

2. Ivan V. Surovtsev, Ivan A. Razumov, Alexander N. Shvalov, "Kinetic Study of Formation of Antigen-Antibody Complexes on the Cell Surface with the Scanning Flow Cytometer", SPIE Proceedings v. 3604, pp. 199-206 (1999).

3. Alexander N. Shvalov, Juhani T. Soini, Andrey V. Chernyshev, Peter A. Tarasov, Erkki Soini and Valeri P. Maltsev "Light-scattering properties of individual erythrocytes" Applied Optics Vol. 38 No 1 pp. 230-235 (1999)

4. Alexander N. Shvalov, Juhani T. Soini, Ivan V. Surovtsev, Galina V. Kochneva, Galina V. Sivolobova, Alexander K. Petrov and Valeri P. Maltsev "Individual Escherichia coli Cells Studied from Light Scattering with the Scanning Flow Cytometer", Cytometry vol. 41, 2000, pp. 41-45

5. I.V. Surovtsev, I.A.Razumov, V.M.Nekrasov, A.N.Shvalov, J.T.Soini, V.P.Maltsev, A.K.Petrov, V.B.Loktev, and A.V.Chernyshev "Mathematical model of ligand-receptor binding kinetics on a cell surface" Binding Journal of Theoretical Biology, Vol. 206, No. 3, pp. 407-417 (October 2000)

Заключение

В диссертационной работе показана возможность определения параметров несферических частиц с использованием сканирующего проточного цитометра на примере клеток Е. coli и нормальных эритроцитов человека.

Суммируя, можно выделить следующие результаты данной работы: предложена однотриггерная схема сканирующего проточного цитометра для исследования объектов, размеры которых сравнимы с длиной волны.

- в гидродинамической системе сканирующего проточного цитометра сфероидальные объекты с отношением полуосей более 2 на выходе из гидрофокусировки ориентируются длинной полуосью вдоль потока. Кроме того, при толщине рабочей струи менее 2 мкм эта ориентация сохраняется до регистрационной зоны прибора.

- исследовано влияние ориентации несферических частиц (вытянутых сфероидов вращения и двояковогнутых дисков) на картину рассеяния, проведена параметризация обратной задачи светорассеяния для вытянутых осесимметричных сфероидов вращения, ориентированных вдоль направления падающего излучения в диапазоне параметров: оптическая длина от 1 - 8, диаметр от 1 - 3 относительный коэффициент преломления от 1.01 до 1.08. погрешностью определения параметров -2%.

- измерено дифференциальное сечение рассеяния клеток Е. coli.

- в предположении, что клетки E.coli ориентированы вдоль направления падающего излучения использовано параметрическое решение обратной задачи и определены параметры клеток.

Диссертационная работа выполнена при поддержке гранта СО РАН номер 702000 и гранта РФФИ номер 00-02-17467.

1.R. Lindmo Т., and Mendelsohn M.L. (Eds). Flow cytometry and sorting. -New York: Wiley-Liss, 1990. - 1140 c.

2. Kachel V. Electrical resistance pulse sizing: Coulter sizing. // Flow Cytometry and Sorting, 2nd ed., M.R. Melamed, T. Lindmo, M.L. Mendelsohn, eds. New York: Wiley, 1990. P. 45-81.

3. Tycko D.H., Metz M.H., Epstein E.A., and Grinbaum A. Flow-cytometric light scattering measurement of red blood cell volume and hemoglobin concentration. // Applied Optics. 1985. - V. 24. - P. 1355 - 1365.

4. Steen H.B., Skarstad K., and Boye E. Flow cytometry of bacteria: cell cycle kinetics and effects of antibiotics. //Ann.N.Y.Acad.Sci. 1986. - V. 468. - P. 329 - 338.

5. Steen H.B. and Boye E. Bacterial growth studied by flow cytometry. // Cytometry. -1980.-V. 1,-P. 32 36.

6. Cross D.A. and Latimer P. Angular dependence of scattering from Esherichia Coli cells. //Applied Optics. 1972. - V. 11. - P. 1225 - 1228.

7. Bronk B.V., Druger S.D., Czege J., and Van De Merwe W.P. Measuring diameters of rod-shaped bacteria in vivo with polarized light scattering. // Biophysical Journal. 1995. - V. 69.-P. 1170 - 1177.

8. Van De Merwe W.P., Li Z.-Z., Bronk B.V., and Czege J. Polarized light scattering for rapid observation of bacterial size changes. // Biophysical Journal. 1997. - V. 73. - P. 500 -506.

9. Terstappen L.W.M.M., de Grooth B.G., Visscher K., van Kouterik F.A., and Greve J. Four-parameter white blood cell differential counting based on light scattering measurements. // Cytometry. 1987. - V. 9. - P. 39-43.

10. Steinke J.M. and Shepherd A.P. Comparison of Mie theory and the light scattering of red blood cells. // Applied Optics. 1988. - V. 27. - P. 4027 - 4033.

11. Streekstra G.J., Hoekstra A.G., Nijhof E.-J., and Heethaar R.M. Light scattering by red blood cells in ektacytometry: Fraunhofer versus anomalous diffraction. // Applied Optics.- 1993.-V. 32. -P. 2266-2272.

12. Hammer M., Schweitzer D., Michel В., Thamm E., and Kolb A. Single Scattering by Red Blood Cells. // Applied Optics. 1998. - V. 37. - P. 7410 - 7418.

13. Borovoi A.G., Naats E.I., and Oppel U.G. Scattering of light by a red blood cell. // Journal of Biomedical Optics. 1998. - V. 3. - P. 364 - 372.

14. Gucker, F.T.Egan, J.J., J. Coll.Sci. 16, 68, 1961.

15. Wyatt P.J. Identification of bacteria by differential light scattering. // Nature. 1969.- V.221.-P. 1257 1258.

16. Wyatt P.J. and Phillips D.T. Structure of single bacteria from light scattering. // Journal of Theoretical Biology. 1972. - V. 37. - P. 493 - 501.

17. Wyatt P.J. and Jackson C. Discrimination of phytoplancton via light-scattering properties. // Limnology and Oceanography. 1989. - V. 34. - P. 96 - 112.

18. Maltsev V.P. Estimation of morphological characteristics of single particles from light scattering data in flow cytometry. // Russian Chemical Bulletin. 1994. - V. 43. - P. 1115 -1124.

19. Chernyshev A.V., Soini A.E., Surovtsev I.V., Maltsev V.P., and Soini E. A mathematical model of dispersion radical polymerization kinetics. // Journal of Polymer Science Part В Polymer Chemistry. - 1997. - V. 35. - P. 1799 - 1807.

20. Chernyshev A.V., Soini A.E., Maltsev V.P., and Soini E. A model of complete classical treatment of dispersion radical polymerization kinetics. // Macromolecules. 1998. -V. 31.-P. 6455 - 6460.

21. Soini J.Т., Chernyshev A.V., Hanninen P.E., Soini E., and Maltsev V.P. A New Design of the Flow Cuvette and Optical Set-Up for the Scanning Flow Cytometer. // Cytometry. 1998. - V. 31. - P. 78 - 84.

22. Ландау Л.Д., Лифшиц E.M. Теоретическая физика. Том 6 Гидродинамика.

23. Дж. Хаппель, Г. Бреннер. Гидродинамика при малых числах Рейнольдса. Москва. "Мир" 1976.

24. Brenner Н., Chem. Eng. Scl, 19 (1964) p. 703

25. Ландау JI.Д., Лифшиц Е.М. Теоретическая физика. Том 1 Механика.

26. Борен К. и Хафмен Д. Поглощение и рассеяние света малыми частицами: пер. с англ. М.: Мир, 1986. - 664 с.

27. Nilsson A.M.К., Alsholm P., Karlsson A., and Andersson-Engels S. T-matrix computations of light scattering by red blood cells. // Applied Optics. 1998. - V. 37. - P. 2735 - 2748.

28. Chiappetta P. and Torresani B. Some approximate methods for computing elecromagnetic fields scattered by complex objects. // Measurement Science and Technology. 1998. -V. 9. - P. 171 - 182.

29. Skalak R., Tozeren A., Zarda R.P., and Chien S. Strain Energy Function of Red Cell Membranes. // Biophysical Journal. 1973. - V. 13. - P. 245 - 264.

30. Mazeron P., Muller S., and Azouzi H.E1. On intensity reinforcements in small-angle light scattering patterns of erythrocytes under shear. // European Biophysical Journal. 1997. -V. 26. - P. 247 - 252.

31. Shimuzi K. Modification of the Rayleigh-Debye approximation. // Journal of Optical Society of America A. 1983. - V. 73. - P. 504 - 507.

32. Lopatin V.N. and Shepelevich N.V. Consequences of the integral wave equation in the Wentzel- Kramers-Brillouin approximation. // Optics and Spectroscopy. 1996. - V. 81. -P. 115 - 118.

33. B.H Лопатин, H.B Шепелевич. Метод Вентцеля-Крамерса-Бриллюэна (ВКБ) как основное приближение для описания рассеяния света "мягкими" частицами //Оптика атмосферы и океана. (1996).- Т.9, N 6.- С. 846-852.

34. Klett J.D. and Sutherland R.A. Approximate methods for modeling the scattering properties of nonspherical particles: evaluation of the Wentzel-Kramers-Brillouin method. // Applied Optics. 1992. - V. 31. - P. 373 - 386.

35. Wriedt T. A Review of Elastic Light Scattering Theories. // Particle & Particle

36. Systems Characterization. 1998. - V. 15. - P. 67 - 74.96

37. Mishchenko M.I., Travis L.D., and Mackowski D.W. T-matrix computations of light scattering by nonspherical particles: A review. // Journal of Quantitative Spectroscopy & Radiative Transfer. 1996. - V. 55. - P. 535 - 575.

38. Ф.Я. Сидько, B.H. Лопатин, JI.E. Парамонов. Поляризационные характеристики взвесей биологических частиц. Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, (1990).

39. Shepelevich N.V., Lopatin Y.V., Maltsev V.P., and Lopatin V.N. Extrema in the light-scattering indicatrix of a homogeneous sphere. // Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 1999.-V. 1,-P. 448 -453.

40. Maltsev V.P., Chernyshev A.V., Sem'yanov K.A. and Soini E. Absolute real-time determination of size and refractive index of individual microspheres. // Measurement Science and Technology. 1997.-V. 8.-P. 1023 - 1027.

41. Shepelevich N.V., Prostakova I.V., and Lopatin V.N. Extrema in the Light-Scattering Indicatrix of a Homogeneous Spheroid. // J QUANT SPECTROSC RADIAT. 1999. - V. 63. -P. 353 - 367.

42. Maniatis T, Fritsch E.F, Sambrook J. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring: Harbor. - 1982. 576 c.

43. Mansour J.D., Robson J.A., Arndt C.W., and Schulte Т.Н. Detection of Escherichia coli in Blood using Flow Cytometry. // Cytometry. 1985. - V. 6. - P. 186 - 190.

44. Boye E., Steen H.B., and Skarstad K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. // J.Gen.Microbiol. 1983. - V. 129 (Pt 4). - P. 973 -980.

45. Boye E. and Lobner-Olesen A. Bacterial growth control studied by flow cytometry. // Res.Microbiol. 1991. - V. 142.-P. 131 - 135.

46. Jonston R.G., Singham S.B., and Salzman G.C. Polarized light scattering. // Comments Molecular Cell Biophysics. 1988. - V. 5. - P. 171 - 192.

47. Bronk B.V., Van De Merwe W.P., and Stanley M. In vivo measure of average bacterial cell size from a polrized light scattering function. // Cytometry. 1992. - V. 13. - P. 155 - 162.

48. Bronk B.V., Druger S.D., Czege J., and Van De Merwe W.P. Measuring diameters of rod-shaped bacteria in vivo with polarized light scattering. // Biophysical Journal. 1995. -V. 69. - P. 1170 - 1177.

49. Van De Merwe W.P., Li Z.-Z., Bronk B.V., and Czege J. Polarized light scattering for rapid observation of bacterial size changes. // Biophysical Journal. 1997. - V. 73. - P. 500 - 506.

50. Krossbacher L.M, Klima J, Psenner R. Determination of bacterial cell dry mass by transmission electron microscopy and densitometric image analysis. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 688 - 694.