Атомно-силовая микроскопия биомакромолекулярных комплексов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

На правах рукописи

ПРОТОПОПОВА Анна Дмитриевна

АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ БИОМАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ

Специальность 02.00.06 — высокомолекулярные соединения

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

1 7 ЯНВ 2013

Москва-2012

005048461

005048461

Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристаллов физического факультета Московского Государственного Университета имени

М.В .Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук

Яминский Игорь Владимирович.

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук

профессор

кандидат физико-математических наук

Шайтан Константин Вольдемарович, Клинов Дмитрий Владимирович.

Ведущая организация: Институт общей физики имени А.М.Прохорова РАН.

Защита состоится 13 февраля 2013 г в 17 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.002.01 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 35, Центр коллективного пользования МГУ, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в Отделе диссертаций Научной библиотеки МГУ имени М.В. Ломоносова (Ломоносовский просп., д. 27).

Автореферат разослан 28 декабря 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат физико-математических наук Лаптинская Т. В.

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Микроскопические исследования биомакромолекул белков и нуклеиновых кислот проводятся, главным образом, методами просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ). В настоящее время оба метода активно развиваются, определяются ниши применения того и другого экспериментального подхода. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) преимущественно используется для изучения процессов адсорбции вещества на подложки, например для исследования адсорбции белков, для работы в жидких средах и газах, для изучения механической жесткости биологических объектов и проведения экспериментов по растяжению единичных молекул — силовой спектроскопии. Широкий спектр возможностей, предоставляемых зондовой микроскопией для изучения биополимеров, обуславливает большое количество работ по этой тематике, публикуемых ежегодно в ведущих научных журналах.

Цель настоящей работы разработать методики для исследования с помощью метода АСМ структуры, свойств и особенностей процесса формирования биомакромолекулярных комплексов на примере двух биологически значимых систем системы свертывания крови и вирусных частиц.

Первый объект исследования белок фибриноген, играющий ключевую роль в свертывании крови. Под действием тромбина он переходит в активную форму, называемую фибрином, и ассоциирует, образуя крупную сеть макроскопических волокон основу будущего тромба. В настоящей работе исследовалась молекулярная структура ассоциатов фибрина, образующихся на ранних стадиях реакции.

Второй объект белок оболочки (БО) X вируса картофеля (ХВК). Известно, что в определенных условиях БО ХВК может образовывать спирально-симметричную оболочку вокруг РНК. В настоящей

работе исследовались структура, свойства и условия формирования комплексов, образованных БО ХВК с ДНК.

Основное различие между этими системами состоит в том, что ассоциаты фибрина это чисто белковые структуры, в то время как вирусные частицы стабилизируются нуклеиновой кислотой и являются более сложным нуклеопротеидным комплексом.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методики для визуализации ассоциатов фибрина на разных стадиях формирования волокон и исследовать структуру ранних ассоциатов фибрина методом АСМ.

2. Исследовать конформации молекул фибриногена, адсорбированных на различные подложки методами АСМ и молекулярной динамики (МД), сопоставить результаты моделирования с экспериментальными данными.

3. Исследовать условия формирования и структуру дезоксири-бонуклеопротеидов (ДНП), полученных in vitro на основе БО ХВК и ДНК, сравнить их структуру с рибонуклеонротеидами (РНП).

4. Исследовать возможность создания ДНП на основе БО другого нотексвируса вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт).

5. Разработать методику для анализа механических свойств вирусных частиц методом силового картирования (CK).

Материалы и методы. АСМ-измерения проводили на микроскопах Nanoscope За (Digital Instruments, США) и Multimode 5 (VEECO. США) в резонансном режиме на воздухе и в буферных растворах. При измерениях на воздухе использовали стандартные кремниевые кантилеверы fpNOl (резонансная частота 118 190 кГц, жесткость 5,3 Н/м и гарантированный радиус закругления иглы

25 им, NT-MDT, Россия) и острые кантилеверы fpKOlS (гарантированный радиус закругления иглы 10 им, остальные параметры те же). При сканировании в жидкости использовали кантилеверы SNL-10 В (резонансная частота 23 кГц, жесткость 0,12 Н/м и гарантированный радиус закругления иглы менее 12 им, VEECO, США) и DNP-10 D (резонансная частота 18 кГц, средняя жесткость 0,06 Н/м н гарантированный радиус закругления иглы 20 им, VEECO, США). Для обработки данных использовали программу ФемтоСкан Онлайн (ЦПТ, Россия).

Работа но исследованию процесса формирования фибриновой сети была проведена совместно с кафедрой химии природных соединений химического факультета МГУ. Использовали рекомбинантный человеческий тромбин со специфической активностью 3600 о.е./мг (HTI, США), человеческий тромбин со стандартной активностью 110 о.е./мл (NIBSC, Великобритания) и человеческий фибриноген, выделенный из плазмы крови (Calbiochem, Германия). Все реакции проводили при температуре около 27° С в буфере, состоящем из 20 мМ Трис-ацетат, рН 7,4, 0,14 М NaCl, 50 мМ КС1, 10 мМ MgCl2, 10 мМ СаС12- Перед каждым экспериментом по формированию фибриновой сети определяли активность тромбина, поскольку этот фермент очень чувствителен к циклам заморозки-разморозки и его активность может спонтанно падать. Для модификации поверхности слюды и стекла при сканировании в жидкости использовали гекса-метилдисилазан (ГМДС, Sigma-Aldrich, США).

Работа по моделированию адсорбции фибриногена методом МД была проведена совместно с кафедрой биофизики физического факультета МГУ. Моделирование сорбции проводили в программе NAMD 2.7 бесплатной программе для МД, обладающей высокой эффективностью распараллеливания вычислений и часто применяемой для симуляции больших систем, состоящих из миллионов атомов. Использовали силовое поле CHARMM. Все вычисления произ-

водились на суперкомпьютере Ломоносов, были задействованы 128 восьмиядерных процессоров.

Работа по реконструкции искусственных вирусных частиц была проведена совместно с кафедрой вирусологии биологического факультета МГУ. Были использованы ВО вирусов ХВК и ВМАльт, РНК ХВК и вируса табачной мозаики (ВТМ), ДНК-копия РНК ХВК, выделенные по стандартным протоколам из соответствующих вирусных частиц.

Научная новизна работы.

1. Разработана методика визуализации ассоциатов фибрина, образующихся на начальной стадии свертывания крови. Впервые показано, что наряду с нротофибриллами существуют более тонкие ассоциаты профибриллы. образованные при связывании о-С доменов соседних молекул друг с другом.

2. Проведено исследование процесса сорбции фибриногена на слюду и слюду, модифицированную ГМДС, методами АСМ и МД. Показано, что конформации молекул на гидрофильной и гидрофобной подложках существенно различаются.

3. Показана возможность формирования комплексов ВО ХВК с ДНК, подобраны оптимальные условия для формирования этих НП. Показано, что укладка белка в ДНП существенно отличается от структуры оболочки нативного вируса и РНП. Предположено, что ВО ХВК связывается с малой бороздкой ДНК.

4. Показано, что при использовании ВО другого потексвируса ВМАльт ДНП не образуются. Вместо этого формируются длинные тяжи ассоциаты ВО, не содержащие ДНК.

5. Разработана методика для анализа механических свойств вирусных частиц методом СК.

Практическая значимость работы. Результаты диссертации носят в первую очередь фундаментальный характер. По мнению автора. наиболее интересны три результата: обнаружение тонких ас-социатов фнбрнна, в которых молекулы белка связанны, предположительно, за счет взаимодействия а-С доменов соседних молекул, определение особенностей структуры ДНП и определение жесткости вирусных частиц методом СК.

Важным методологическим результатом диссертации является разработанный алгоритм для анализа данных СК. Силовое картирование весьма трудоемкий экспериментальный метод, требующий сложного анализа и имеющий серьезные артефакты, которые часто не учитываются при обработке. Настоящая работа вносит вклад в развитие этого метода.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на следующих научных конференциях и школах: 2nd Internationa] School 011 Snrface Science «Technologies and Measurement.s on Atomic Scale» 2012, Sochi, Russia; Шестая международная конференция «Современные достижения бионаноскоиин» 2012, Москва, Россия; X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова 2011, Москва, Россия; 17th International Biophysics CongTess 2011, Beijing, China; 2nd International School «Nanomaterials and Nanotechnologíes in Living Systems. Safety and Nanomedicine» 2011, Moscow región. Russia; Пятая международная конференция «Современные достижения бнонаносконии» 2011, Москва, Россия; XXIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» 2011, Москва, Россия; ESF-EMBO Research Conference «Molecular Perspectives on Proteín-Protein Interactions» 2010, Sant Feliu de Gmxols. Spain; 20th Anniversary Korea-Russia Science and Technology Forum 2010, Москва, Россия; Четвертая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии» 2010, Москва, Россия; Тре-

тья международная конференция «Современные достижения био-наиоскошш» 2009, Москва, Россия: Первая международная научная школа «Наноматерналы и нанотехнологии в живых системах» 2009, Россия.

Личный вклад автора. Все экспериментальные измерения зон-довой микроскопии и подготовка образцов к сканированию выполнены автором лично. Анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.

Эксперименты но динамическому светорассеянию проведены совместно с Завьяловой Еленой. Моделирование методом МД проведено совместно с Толстовой Анной, Оферкиным Игорем и Годзи Максимом. Эксперименты по ферментному анализу ДНП и РНП проведены совместно с Никитиным Николаем и Полозовым Василием.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликована 21 работа, в том числе 7 статей и 14 публикаций в сборниках тезисов докладов конференций.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы, включающего 126 наименований. Работа изложена на 134 страницах, содержит 69 рисунков и 6 таблиц.

Основное содержание работы

Во Введении излагается актуальность выбранной темы диссертационной работы, определяются ее цели и задачи.

Глава I диссертации представляет собой обзор литературы и состоит из четырех разделов. В разделе 1.1 описываются основные методики АСМ, в разделе 1.2 рассказано об общих особенностях белок-белковых взаимодействий. В разделе 1.3 описывается система свертывания крови, перечисляются существующие модели молекулярной структуры волокон, образованных фибрином.

Подробно описаны результаты проводившихся ранее микроскопических исследований ранних волокон фибрина, отдельных молекул фибрина и фибриногена. В разделе 1.4 содержатся базовые сведения о структуре вирусных частиц, описаны известные экспериментальные результаты по созданию искусственных вирусов и по упаковке чужеродных материалов (нуклеиновых кислот, металлов и др.) в вирусную оболочку.

Глава II диссертации предегвляет собой описание и анализ результатов исследования процесса ассоциации фибрина при свертывании крови. В разделе II.1 описываются использованные в данной части работы методики: методы приготовления образцов фибриногена, разработанные для наблюдения отдельных молекул, методика определения активности тромбина, различные способы приготовления образцов ассоциатов фибрина, использовавшиеся методы сканирования.

В разделах II.2, II.3 и II.4 описываются результаты АСМ-экспериментов, проводится сравнение этих результатов с известными из литературы данными экспериментов по ПЭМ. Несмотря на то что интенсивные исследования процесса свертывания крови ведутся уже более 50 лет, механизм ассоциации фибрина на молекулярном уровне не до конца ясен. Имеющиеся данные о структуре волокон были получены главным образом при помощи ПЭМ. В соответствии с общепринятой моделью считается, что элементарным ассо-циатом фибрина является двутяжевой комплекс иротофибрилла (рис. 1а). В иротофибрилле каждый центральный IS-домен взаимодействует с двумя концевыми D-доменами двух соседних молекул. В данной работе предпринята попытка получить новые сведения о структуре первичных ассоциатов фибрина, для этого применяется другой микроскопический метод АСМ. В результате обнаружен альтернативный, возможно патологический, способ формирования тонких первичных ассоциатов профибрилл (рис. 16).

\ фийршиют« А / фнорашшеотад В «цфнСяжа К*^

Рис. 1: Схемы образования ассоциатов фибрина: а) нротофибрилл б) профибрилд.

Из литературных данных известно, что скорость сорбции фибриногена на различные подложки примерно одинакова, но влияние подложки на структуру белка может быть очень сильным. Исходя из этого все эксперименты проводили как на гидрофильной слюде, так и на гидрофобных ГМДС-слюде и ВОПГ. Стабильнее всего удавалось визуализировать доменную структуру фибриногена на поверхности слюды (рис. 2). В ходе сорбции на ВОПГ и ГМДС-слюду молекулы «распластываются» по поверхности из-за взаимодействия гидрофобных участков поверхности белка с подложкой, кроме того, на графите молекулы склонны к спонтанной агрегации друг с другом.

Было установлено, что у 20% молекул фибриногена на слюде при рН 7,5 визуализируются все три глобулярных домена. В то время как 80% молекул выглядят как двухдоменные «гантели». На рис. 2 показаны оба типа молекул, по увеличенным фрагментам АСМ-изображений можно предположить, как именно расположена на поверхности та или иная молекула (рис. 2 А, Б, Е). Средняя высота Б-доменов составила 2.2 ±0,4 им (размер выборки N=600), Е-доменов 1,3±0,4нм (N=150), средняя длина молекул 402±6 нм (N=150). Расстояние между Б-доменами одной молекулы 20 ±4 нм (N=1-50). Из изображений, приведенных на рисунке, ясно видно,

Рис. 2: АСМ-изображения молекул фибриногена на слюде (А. Б), ГМДС-слюде (Г. Д) и ВОПГ (3, И). На схемах Б, Д и И представлено возможное расположение молекул на поверхности. На графиках Е и Ж представлены характерные профили отдельных молекул фибриногена на слюде, на рисунке Е различимы все три домена, на рисунке Ж только Б-домены. На графиках К и Л представлены характерные профили отдельных молекул фибриногена на ГМДС-слюде (К) и на ВОПГ (Л).

что Е-домен четко различим только у самых длинных молекул, которые «растянуты» но поверхности. Известно, что участки альфа-спиралей, соединяющие глобулярные домены фибриногена, обладают большой подвижностью. Благодаря этому они способны изгибаться в ходе сорбции на поверхность и Б-домены могут по-разному расположиться друг относительно друга. Если они расположены близко, а участки альфа-спиралей между ними представляют собой извивающиеся нити, то из-за уширения, вносимого кантилеве-ром, центральный Е-домен оказывается практически неразличим и визуализируется только как перемычка (понижение профиля между двумя концевыми Б-доменами). Этим же. объясняется и большой разброс в значениях контурных длин молекул, определенных по АСМ-и юбражениям.

Изображения, полученные при рН 7,5 на поверхности ГМДС-слюды, существенно отличаются. Такая поверхность гидрофобна, и белок взаимодействует с ней иначе, чем с гидрофильной слюдой. На полученных изображениях трудно идентифицировать Б- и Е-домены, хотя в отдельных случаях это удается (рис. 2 Г, Д, Ж). Средняя высота Б-доменов на поверхности ГМДС-слюды составила 1,2±0,4 нм (N=100), средняя длина отдельных молекул 60±9 нм (N=30).

Третья из использованных подложек графит также гидрофобная. Высота Б-домепов на нем составила 1,6 ±0,4 нм (N=200). средняя длина отдельных молекул 50 ± 11 нм (N=30). На графите еще труднее, чем на ГМДС-слюде, определить, как именно расположены домены молекулы, но иногда это можно сделать. Отдельно хочется отмегнть, что на образцах, приготовленных на графите, не всегда возможно рассмотреть отдельные молекулы, поскольку часто молекулы агрегируют с образованием протяженных ассоциатов (см. рис. 2 В). Аналогичное сильное влияние ВОПГ на молекулы фибриногена было отмечено в ряде работ. Вследствие этого все экспе-

1 ' Ю »

Рис. 3: Данные моделирования: А) начальная конформация молекулы на слюде; Б) начальная конформация молекулы на ГМДС-слюде; В) конечная конформация молекулы на слюде; Г) конечная конформация молекулы на ГМДС-слюде.

рименты по наблюдению ассоциации фибрина проводили на слюде и дублировали на слюде, модифицированной ГМДС.

Для более глубокого понимания механизма сорбции белка на подложки и для более детальной интерпретации данных АСМ было проведено моделирование процесса сорбции при помощи метода МД, в котором временная эволюция системы атомов отслеживается путем интегрирования их уравнений движения. Силы межатомного взаимодействия представляются в классической форме как градиент потенциальной энергии системы. Данный метод был изначально разработан в теоретической физике, но получил большое распространение в химии и. начиная с 80-х годов XX века, в биофизике.

Отправной точкой в нашей модели является кристаллическая структура фибриногена, полученная путем рентгеноструктурного анализа и имеющая разрешение 2,90 А. Структура находится в открытом доступе в базе данных pdb-database под именем 3GHG.

На рис. 3 изображены начальные и конечные конформации белка, полученные в моделировании. Адсорбция произошла в обоих случаях, но существенно по-разному на слюде и ГМДС-слюде. Наи-

более существенные различия наблюдаются в областях глобулярных Б- и Е-доменов. Легко видеть, что на поверхности гидрофобной ГМДС-слюды глобулярные домены белка более плотно прилегают к поверхности подложки. В то же время, область альфа-спиралей на ГМДС-слюде образует меньше контактов с поверхностью, чем на чистой слюде.

Напротив, на слюде Б-домены «отталкиваются» от подложки и неплотно примыкают к ней. Область Е-домена не касается подложки. Участки альфа-спиралей па слюде плотно примыкают к подложке.

Для того чтобы сравнить полученные данные с АСМ-изображе-ниями, результаты моделирования удобно представить в виде топографических карт. Для этого в плоскости XV выбирали узлы сетки с шагом 3 А и в каждом узле определяли высоту белка над подложкой. Полученная сеточная функция Z(X,Y) представляет собой идеальную топографию адсорбированного белка и не является моделью АСМ-изображения, поскольку не учитывает деформаций, происходящих при сканировании. В реальном эксперименте игла оказывает на образец сильное воздействие, и в результате этого высота белка оказывается занижена. Для корректной симуляции процесса сканирования необходимо применять методы МД и производить расчеты на времена, которые существенно превышают возможности современных суперкомпьютеров (реальное время взаимодействия иглы с образцом Ю-6 с в каждой точке изображения).

Тем не менее, сравнивать АСМ-данные с идеальной топографией фибриногена удобнее, чем с моделью атомной структуры. Модельную топографию визуализировали с помощью программы ФемтоС-кап (рис. 4). В таблице 1 приведены сравнительные данные по высотам доменов на разных подложках. Из таблицы видно, что при переходе от гидрофильной подложки к гидрофобной как в эксперименте, так и в моделировании высота О-доменов становится меньше

Рис. 4: Топографическая визуализация результатов моделирования методом МД: А) на слюде. Б) на ГМДС-слюде.

Слюда Г М Д С - слюда

D-домен, им Длина, нм D-домен, нм Длина, нм

АСМ 2,2 ± 0,4 42 ± 7 1,2 ± 0,4 60 ±9

МД 7,5 34 5,5 41

Таблица 1: Сравнение данных АСМ и МД о высоте D-доменов и общей протяженности адсорбированного фибриногена.

(на 45% по данным АСМ и на 27% по данным МД). Длина молекулы становится больше (на 30% по данным АСМ и на 17% в модели).

Исследование процесса ассоциации фибрина проводили при разных концентрациях фибриногена. Концентрация фибриногена в крови около 9 мкМ. При такой концентрации через 30 секунд после добавления тромбина на поверхности наблюдаются крупные волокна высотой 11,7 ±4,5 нм (рис. 5а), а через 5 10 минут вся поверхность подложки покрыта плотной сетью со среднеквадратичной шероховатостью рельефа около 30 нм (рис. 56).

При концентрации 2 мкМ удалось получить зависимость толщины фибриновых волокон от времени реакции. Данные согласуются с результатами экспериментов по динамическому светорассеянию. Для того чтобы рассмотреть более мелкие детали, мы уменьшили концентрацию фибриногена до 0,2 мкМ. Процесс свертывания замедлился, средняя высота волокон спустя 1 минуту после добавления тромбина составила 8,5±2,5 нм. Стало возможно наблюдать поперечные полосы с периодом 23 нм на поверхности волокон (рис. 5г), хорошо известные из экспериментов по ПЭМ.

При дальнейшем уменьшении концентрации до 20 нМ нам удалось визуализировать первичные ассоциагы фибрина. Оказалось, что большая часть ассоциатов представляет собой не двутяжевые протофнбриллы, а более тонкие одиотяжевые ассоциагы, которые мы назвали нрофибриллами. Такие структуры наблюдали как на образцах, приготовленных на слюде (рис. 6а, с, е), так и на образцах, приготовленных на ГМДС-слюде (рис. 6, b, d, f).

Далее была предложена модель для описания процесса формирования профибрилл за счет взаимодействия а-С-доменов молекул (некристаллизуемых С-коицов о-цепей). Известно, что в фибриногене п-С-домепы располагаются вблизи центрального Е-домена, по после отщинления фибриноиептида В в фибрине они отдаляются от этой области молекулы. Кроме того, методами силовой спектроско-

ц ~ Щк

л 1

Рис. 5: А С М- изображен и я ассоциатов фибрина, образующихся при высокой концентрации фибриногена: А) 9 мМ спустя 30 секунд поете добавления тромбина В) 9 мМ спустя 10 минут после добавления тромбина С) 0,2 мМ спустя 1 минуту после добавления тромбина Б) 0,2 мМ спустя 1 минуту после добавления тромбина, при увеличении виден период на волокнах.

Рис. 6: АСМ-изображения первичных ассоциатов фибрина про-тофибрилл и ирофибрилл на слюде (А. С. Е) и на ГМДС-слюде (В, Э, Р).

пии и оптического пинцета было показано, что а-С-домены способны к взаимодействию друг с другом. Для проверки выдвинутой гипотезы были проведены эксперименты но ПЭМ ранних ассоциатов фибрина, исследовали свертывание фибрина в присутствии ингибитора GPRP, блокирующего образование протофибрилл, а также исследовали возможность образования однотяжевых ирофибрилл из desa-C-фибриногена.

В экспериментах но ПЭМ было показано, что короткие однотя-жевые нрофибриллы наблюдаются также и этим методом. В присутствии ингибитора GPRP в малых концентрациях фибриногена методом АСМ наблюдали образование ассоциатов, структура которых более соответствовала однотяжевым профнбриллам. Образование профибрил из desa-C-фибрина не было зафиксировано.

В результате проведенных экспериментов мы предполагаем, что нрофибриллы действительно образуются в разбавленных растворах фибрина за счет взаимодействия a-C-доменов соседних молекул друг с. другом. Мы предполагаем, что обнаруженные однотяже-вые ассоциаты являются переходной формой в структуре волокон, которая обеспечивает сближение молекул в ходе свертывания, для дальнейшей перегруппировки и образования протофибрилл.

Глава III. В разделе III.1 описываются экспериментальные методики получения и исследования НП. синтезированных на основе ВО спиральных вирусов растений. В том числе описываются методы выделения НК и вирусных белков, методики сборки искусственных РНП и ДНП комплексов на основе. БО ХВК и ВМАльт, описываются методы приготовления образцов для АСМ и использованные методики сканирования.

В разделе III.2 описываются результаты АСМ-исстедования НП. Несмотря на то что общий принцип реконструкции вирусных частиц известен с середины 70-х годов XX века, разработка конкретных методик сборки искусственных НП с использованием нового БО

или новой НК, а также определение структуры полученных частиц каждый раз представляют собой новую научную задачу. В данной работе использовали два различных БО ХВК и ВМАльт и два типа НК РНК и ДНК.

В работе показано, что в 0,01 М буфере Трис-HCl при рН 6,0 образуется стабильный комплекс БО ХВК с ДНК. Для получения фрагментов ДНК использовалась плазмида, содержащая нолноге-номную кДНК копню генома ХВК. Обработанный рестриктазамн препарат разделяли на фракции, содержащие фрагменты определенной длины: 500, 1000, 3000 и 5000 и. и. Полученные частицы исследовали при помощи АСМ, ПЭМ и гельэлектрофореза. Типичные изображения ДНП приведены на рисунке 7г. Отметим, что при рН 8,0 комплекс: ДНК с БО ХВК образуется малоэффективно и имеет характерную морфологию «бусин на нити».

Для контроля сборки использовали гомологичные и гетероло-гичные РНП. Для этого использовали описанную ранее методику: смесь РНК и БО в молярном соотношении 1:700 инкубировали в течение 15 минут в 0,01 М буфере Трис-HCl рН 7,5 8,0 в небольшом объеме 10 20 мкл при 20е С, реакцию останавливали добавлением бромфенолового синего, либо охлаждением реакционной смеси во льду. Ранее было показано, что ири рН 8,0 сборка комплекса проходит наиболее эффективно. Типичные изображения гомологичных и гетерологичных РНП приведены на рисунке 76 и 7в. Средняя высота как гомологичных, так и гетерологичных РНП, определенная по нашим данным, составила 10,0 ±0,6 нм. Длина РНП варьировалась от 30 40 нм до 350 400 нм.

Анализируя эти результаты, мы видим, что гомологичные и гете-рологичные РНП неразличимы по своей морфологии. От нативных вирионов ХВК они отличаются только длинной: при сборке РНП мы намеренно используем меньшее соотношение РНК:белок. чем в нативном вирионе (1:700 вместо 1:1350). Это дает возможность

Рис. 7: АСМ-изображения различных нуклеопротеидов на поверхности свежесколотой слюды: а) ХВК; б) гомологичные РНП: в) ге-терологичные РНП; г) ДНП: д) ДНП и РНП на одном поле. Мерный отрезок на всех изображениях составляет 1 мкм.

наблюдать недособранные «однохвостые частицы» и гарантировать отсутствие избытка белка на поверхности.

При помощи АСМ было показано, что морфология ДНП существенно отличается от морфологии РНП и нативных вирионов (рис. 7г, д). Частицы ДНП представляют собой протяженные извитые нити, высота которых неоднородна но длине и значительно ниже высоты РНП и ХВК. Это отчетливо видно на рис. 7д, на котором приведено изображение обоих типов частиц, РНП и ДНП на одном поле. Длина ДНП изменялась в зависимости от длины использованной ДНК. При использовании ДНК. состоящей из 5000 п. и., средняя длина полученных ДНП составила 1700 им. Поскольку длина одной пары оснований составляет 0,34 им, ДНК, состоящая из 5000 п. п., должна иметь длину ровно 1700 им. Таким образом, мы можем утверждать, что ДНК в составе комплекса находится в раснрав-

ленном состоянии и, следовательно, организация комплекса БО и ДНК в составе ДНП не соответствует структуре вириона.

Высота ДНП по данным АСМ оказалась неоднородна но длине частицы, что также говорит о нерегулярной структуре комплекса. Средняя высота ДНП составила 4,0 ±0,5 им, но высота отдельных участков некоторых частиц была еще меньше и соответствовала высоте ДНК менее 2 им. Этот эффект проявился в наибольшей степени в экспериментах по сборке ДНП при рН 8,0, когда взаимодействие БО с ДНК происходит малоэффективно, белок не полностью одевает ДНК и весь комплекс в целом представлял собой структуру типа бусин на нити.

Далее в работе была исследована возможность сборки аналогичных ДНП с использованием БО родственного вируса ВМАльт. Оказалось, что БО ВМАльт не образует устойчивого комплекса с ДНК. Было показано, что при рН 8,0 идет активная ассоциация самого БО, на поверхности образца наблюдали разветвленную сеть волокон, собранных из белка, и несвязанные с этими волокнами молекулы ДНК (рис. 8). В контрольных образцах в отсутствии ДНК также наблюдали образование белковых ассоциатов.

В разделе III.3 описываются результаты исследования структуры РНП и ДНП методами ферментного анализа, проведенные совместно с сотрудниками кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ, которые полностью подтверждают выводы, сделанные на основе результатов микроскопии.

При сравнении данных АСМ и ПЭМ о морфологии нативно-го вируса ХВК с данными о морфологии РНП и ДНП на основе его БО было сделано предположение о том, что коэффициент механической жесткости ДНП комплекса должен быть существенно ниже, чем коэффициенты жесткости ХВК и РНП, которые должны быть примерно одинаковы. Для того чтобы в будущем была возможность прямо проверить эту гипотезу, были разработаны мето-

Рис. 8: АСМ-изображения полимеров БО ВМальт (А), на увеличенном изображении (Б) видны молекулы ДНК, не входящие в эти агрегаты.

ды экспериментов по силовому картированию вирусных частиц и алгоритм анализа полученных данных. Результаты работы в этом направлении описаны в главе IV. Детально описан алгоритм, разработанный для анализа данных экспериментов по силовому картированию, приведены результаты определения жесткости ВТМ.

Выводы

1. Методом АСМ показано, что на ранних стадиях ассоциации фибрина наряду с двутяжевыми протофибриллами существуют более тонкие ассоциаты короткие однотяжевые профиб-риллы, образованные при связывании а-С-доменов соседних молекул друг с другом.

2. Методом АСМ показано, что молекулы фибриногена сильно деформируются при адсорбции на гидрофильную слюду и в меньшей степени деформируются при адсорбции на гидрофоб-

ную ГМДС-слюду. Результаты ACM подтверждены методом МД.

3. Показана возможность формирования комплексов БО ХВК с ДНК. подобраны оптимальные условия для формирования ДНП. Показано, что укладка белка в ДНП не соответствует структуре оболочки нативного вируса.

4. Показано, что при использовании БО другого иотексвируса ВМАльт ДНП не образуются. Вместо этого формируются длинные тяжи ассоциаты БО, не содержащие ДНК.

5. Разработана методика для анализа механических свойств вирусных частиц методом силового картирования.

Список публикаций по теме диссертации

1. Zavyalova Е. G., Protopopova A. D., Yaminsky I. V., Kopylov А. М., Analytical Biochemistry., 2012, 412, pp. 234 239.

2. Архипенко М. В., Петрова Е. К., Никитин Н. А., Протопопова А. Д., Дубровин Е. В., Яминский И. В., Родионова Н. П., Карпова О. В., Атабеков И. Г., Acta Naturae, 2011, 3 (10), стр. 47 53.

3. Zavyalova Е. G., Protopopova A. D., Kopylov А. М., Yaminsky I. V., Langmuir, 2011, 27, pp. 4922 4927.

4. Никитин H. А., Сушко А. Д., Архиненко М. В., Родионова Н. И., Карпова О. В., Яминский И. В., Коллоидный журнал. 2011, том 73, 2V* 4, стр. 512 519.

5. Сушко А. Д., Завьялова Е. Г., Копылов А. М., Яминский И. В., Наноиндустрия, 2010, 6, стр. 26 27.

6. Никитин Н., Сушко А.. Карпова О., Яминский И., Напоипду-стрия. 2009, 6, стр. 16 17.

7. Архипенко М. В., Дубровин Е. В., Карпова О. В., Сушко А. Д., Яминский И. В., Атабеков И. Г., Наноипдустрия. 2009, 5, стр. 38.

8. Protopopova A. D., Tolstova А. P., Zavyalova Е G., Kopylov А. М., Tverdislov V. A., Yaminsky I. V., Сборник тезисов 2nd International School on Surface Science "Technologies and Measurements on Atomic Scale - 2012 Sochi, Russia.

9. Петрова E. К., Никитин H. А., Савватеев M. H., Протопопова А. Д., Карпова О. В., Шестая международная конференция «Современные достижения бионаноскошш 2012», Москва, Россия.

10. Протопопова А. Д., Завьялова Е. Г., Толстова А. П., Оферкин И. В., Годзи М. Г., Ахмерова Д. Р., Копылов А. М., Яминский И. В., Сборник тезисов научной конференции но биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» 14 -17 ноября 2011, стр. 54.

11. Protopopova A. D., Tolstova А. P., Oferkin I. V., Zavyalova Е. G., Godsie М. G., Absracts book of 17th International Biophysics Congress, 31 October 3 November 2011, p. 244.

12. PetrovaE. K., Nikitin N. A., Protopopova A. D., Dubrovin E. V., 2nd International School "Nanomaterials and Nanotechnologies in Living Systems. Safety and Nanomedicine" September 19 24 2011, Moscow region, Russia, pp. 187.

13. Петрова E. К., Архипенко M. В., Никитин H. А., Протопопова А. Д., Дубровин Е. В., Яминский И. В., Карпова О. В., Атабеков II. Г., Сборник тезисов Пятой международной конференции «Современные достижения бионаносконии», Москва, 15 17 июня 2011, стр. 38 40.

14. Толстова А. П., Протопопова А. Д., Оферкин И. В.. Завьялова Е. Г., Годзи М. Г., Сборник тезисов Пятой международной конференции «Современные достижения бионаноскопии», Москва. 15 17 июня 2011, стр. 52 53.

15. Петрова Е. К., Никитин Н. А.. Сушко А. Д., Архипенко М. В.. Сборник тезисов 15 Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология Наука XXI века», Пу-щино, 18 22 апреля 2011, стр. 67.

16. Сушко А. Д.. Завьялова Е. Г., Копылов А. М., Яминский И. В., XXIII Международная зимняя школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2011, стр. 58.

17. Sushko A. D., Zavyalova Е. G-, Kopylov А. М., Yaminsky I. V., ESF-EMBO Research Conference «Molecular Perspectives on Protein-Protein Interactions», Spain. 2010, p. 75.

18. Sushko A. D., 20th Anniversary Korea-Russia Science & Technology Forum, Moscow, 2010, p. 42.

19. Завьялова E. Г., Сушко А. Д., Копылов A. M., Яминский И. В., Сборник тезисов конференции «Современные достижения бионаноскопии», Москва, 2010, стр. 26.

20. Архипенко М. В., Никитин Н. А., Полозов В. М.. Сушко А. Д., Дубровин Е. В., Сборник тезисов 1-й международной научной школы «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах», Москва, 2009, стр. 160 162.

21. Сушко А. Д., Никитин Н. А., Полозов В. М., Архипенко М. В., Яминский И. В., Сборник гезнсов конференции «Современные достижения бионаноскопии», Москва, 2009, стр. 52 53.

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус, e-mail: globus9393338@yandex.ru тел.: 8 (495)939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 26.12.2012 г.

Введение

I Обзор литературы

1.1 Атомно-силовая микроскопия

1.2 Белок-белковые взаимодействия.

1.3 Свертывание крови.

1.3.1 Ранние работы по ПЭМ.

1.3.2 Исследования при помощи АСМ.

1.3.3 Современные работы по ПЭМ.

1.3.4 Растяжение фибриновых волокон: силовая спектроскопия и МД

1.4 Контейнеры на основе вирусных белков

1.4.1 Общие сведения о вирусах.

1.4.2 АСМ-эксперименты по изучению вирусных частиц.

1.4.3 Вирусы в нанотехнологии.

II Исследование процесса ассоциации фибрина

II. 1 Материалы и методы.

11.2 АСМ-исследование ассоциатов фибрина.

11.3 АСМ-исследование отдельных молекул фибриногена.

П.4 Исследование роли а-С-доменов в образовании первичных ассоциатов

IIIИсследование белковых капсидов на основе БО ХВК и ВМАльт

III. 1 Материалы и методы.

111.2 Сравнительный анализ РНП и ДНП с нативными вирионами.

111.3 Анализ РНП и ДНП методами ферментного анализа.

IV Силовое картирование вирусных частиц

V Выводы

VI Благодарности

Список иллюстраций

1.1 Потенциал Леннарда-Джонса взаимодействия двух атомов.

1.2 Схематический вид прямоугольного и треугольного кантилеверов длиной шириной w и с углом а при вершине.

1.3 Схематический вид типичной силовой кривой.

1.4 Общий вид силовых кривых и кривых разделения при разных типах взаимодействия зонда и образца.

1.5 Зависимость силы, действующей на канилевер при приложении напряжения, от расстояния между кончиком иглы и поверхностью образца.

1.6 Двойной электрический слой.

1.7 Кристаллографическая структура фибриногена.

1.8 Волокна из бычьего фибрина.

1.9 Схема образования волокон из бычьего фибрина.

1.10 Увеличенные изображения периодичности на фибриновых волокнах.

1.11 Изображения фибриногена.

1.12 Доменная структура фибриногена (слева) и модель формирования крупных волокон фибрина (справа), предложенные Холлом по данным ПЭМ

1.13 Данные светорассеяния из работы [37].

1.14 ПЭМ-изображения протофибрилл и поясняющая их схема [43].

1.15 Модель структуры первичных ассоциатов фибриногена, предложенная в работе [44].

1.16 Структуры ранних ассоциатов фибриногена, классифицированные в работе [44].

1.17 ПЭМ-изображения ранних ассоциатов фибрина (слева) и схема образования точек ветвления в ассоциатах (справа) [45].

1.18 Первое АСМ-изображепие молекулы фибриногена как трехдоменной структуры [46].

1.19 АСМ-изображения слоя фибриногена, адсорбированного на поверхность кремния из буфера с рН 8.

1.20 Изотермы адсорбции фибриногена при низкой ионной силе 2 мМ (А) и при высокой ионной силе 300 мМ (В).

1.21 АСМ-изображения отдельных молекул фибриногена на поверхности слюды и графита.

1.22 АСМ-изображения фибриногена на поверхности графита и слюды. Сканирование в жидкости [52], [53].

1.23 ПЭМ-изображения отдельных молекул фибриногена и фибрина [61], [58].

1.24 ПЭМ-изображения отдельных аС-доменов и содержащих их агрегатов различного рода [58].

1.25 Схема эксперимента по силовой спектроскопии фибриногена и полученная силовая кривая [64].

1.26 Результаты моделирования растяжения молекулы фибриногена при помощи молекулярной динамики.

1.27 Первое АСМ-изображение ВТМ [66].

1.28 АСМ-изображение кристалла сателитного вируса мозаики табака размером 1x1 мкм.

1.29 АСМ-изображение, показывающее рост двумерных кристаллов вируса мозаики костра.

1.30 АСМ-изображения вируса мятлика, вируса полосатой мозаики ячменя, ВТМ, ВМК и вируса мозаики люцерны.

1.31 АСМ-изображения ВТМ и высвобождающейся из его оболочек РНК и свободной РНК ВТМ на слюде.

1.32 АСМ-изображения высвобождения РНК из капсида риновируса 2.

1.33 АСМ-изображения отдельных частиц и агрегатов ВИЧ на стекле.

1.34 АСМ изображения вируса герпеса, лишенного пентонов.

1.35 Схема и результаты эксперимента по индентированию вируса герпеса.

1.36 Деформация капсида вируса герпеса под действием индентирования.

II. 1 АСМ-изображения агрегатов фибрина, образующихся после добавления тромбина к препарату фибриногена с концентрацией 9 //М за 30 секунд (А, Б); за 5-10 минут (В).

И. 2 АСМ-изображения ассоциатов фибрина на слюде, образующихся после добавления тромбина к препарату фибриногена с концентрацией 2 мкМ за 1 минуту (А), 3 минуты (Б) и 5 минут (В).

11.3 Зависимости высоты и длины волокон фибрина, образующихся после добавления тромбина к препарату фибриногена с концентрацией 2 мкМ, от времени, определенные по данные АСМ.

11.4 АСМ-изображения ассоциатов фибрина на слюде, образующихся после добавления тромбина к препарату фибриногена с концентрацией 0,2 мкМ за 1 минуту.

11.5 Результаты эксперимента по ДСР.

11.6 АСМ-изображения первичных ассоциатов фибрина — протофибрилл и профибрилл — на слюде (А, С, Е) и на ГМДС-слюде (В, D, F).

11.7 Возможные механизмы формирования фибриновых ассоциатов.

11.8 АСМ-изображения молекул фибриногена на слюде, ГМДС-слюде и ВОПГ.

11.9 АСМ-изображения отдельных доменов фибриногена на различных подложках.

11.10 АСМ-изображения des-Q-C-фибриногена на различных подложках.

11.11 Структура 3GHG из базы данных PDB [118].

11.12 Начальные и конечные конформации моделирования адсорбции фибриногена.

11.13 Модельная топография фибриногена на слюде (А) и ГМДС-слюде (Б).

11.14 АСМ-изображения молекул фибрина, образующих ассоциаты в присутствии ингибитора А- и B-дырок GPRP.

11.15 АСМ-изображения ассоциатов des-a-C-фибриногена, образующихся после добавления тромбина.

11.16 ПЭ М-изображения ранних ассоциатов фибрина и соответствующие схемы расположения молекул фибрина на подложке.

11.17 Ассоциаты смешанной структуры на слюде в АСМ и поясняющие их схемы.

III. 1 АСМ-изображения ХВК (а) и ВМАльт (б) на поверхности слюды. Сканирование на воздухе.

111.2 АСМ-изображения слоя БО ХВК на поверхности слюды и распределение агрегатов, встречающихся в этом слое, по высоте.

111.3 АСМ-изображения РНК ХВК на поверхности слюды в условиях сборки РНП и распределение агрегатов, встречающихся в этом препарате, по высоте.

111.4 АСМ-изображения ДНК-копии РНК ХВК на поверхности слюды.

III. 5 АСМ-изображения различных НП на поверхности свежесколотой слюды

III.6 АСМ-изображения ДНП, собранных при pH 8,0.

111.7 АСМ-изображения полимеров БО ВМальт.

111.8 Результаты электрофоретического анализа комплексов, полученных при инкубации БО ХВК с гомологичной и гетерологичной РНК и ДНК.

111.9 Результаты электрофоретического анализа препаратов РНК ХВК, выделенных из РНП, обработанных МН.

ШЛОРезультаты электрофоретического анализа ДНП, обработанных ДНКазой

I и МН.

Ш.ИРезультаты трипсинового теста.

IV. 1 Схема сил, действующих на кантилевер со стороны деформируемого объекта при разных взаимных положениях кантилевера и образца.

IV.2 Топографическое изображение сферических частиц риновируса 2 и соответствующая карта жесткости.

IV.3 Топографическое изображение частицы ВТМ и соответствующие силовые данные.

IV.4 Зависимость наблюдаемой жесткости кед от силы.

IV.5 Зависимости жесткости вируса и кантилевера от приложенной силы.

Список таблиц

1.1 Данные из статьи Хоуна и Портера [27].

1.2 Данные о форме и характерных размерах молекул фибриногена на различных подложках, известные из литературных источников. (*) — Молекулы такой формы присутствуют на изображениях, приведенных в статьях, но не обсуждаются авторами.

II. 1 Данные ДСР для ассоциатов фибрина, образующихся после добавления тромбина к препарату фибриногена с концентрацией 20 нМ.

11.2 Высоты доменов фибриногена и его фрагментов, определенные по АСМ-изображениям на различных подложках.

11.3 Сравнение данных АСМ и МД о высоте D доменов и общей протяженности адсорбированного фибриногена.

III. 1 Сравнение размеров и свойств различных нуклеопротеидов. * — Эксперименты по ПЭМ проведены нашими коллегами с Биологического факультета МГУ. ** н/о — не определялось.

Список используемых сокращений

АСМ — атомно-силовая микроскопия БО — белок оболочки ВМАльт — вирус мозаики альтернантеры ВТМ — вирус табачной мозаики ДНП — дезоксирибонуклеопротеид МД — молекулярная динамика НК — нуклеиновая кислота НП — нуклеопротеид

ПЭМ — просвечивающая электронная микроскопия РНП — рибонуклеопротеид СЗМ сканирующая зондовая микроскопия СК — силовое картирование ХВК — X вирус картофеля

Белки (протеины, полипептиды) — важнейшие полимеры в составе живых организмов. Pix количество в клетках превосходит какие бы то ни было другие органические соединения: на их долю приходится более 50% общей сухой массы клеток. Белки состоят из аминокислот — органических соединений с пептидной связью, в составе которых одновременно присутствуют карбоксильная и аминная группы. В большинстве случаев в белках используются только 20 стандартных аминокислот, кроме того, в живых организмах встречается небольшое количество редких аминокислот, а также известно свыше 150 аминокислот, которые не входят в состав белков, а встречаются в клетках в свободном или связанном виде, могут являться промежуточными продуктами на пути синтеза стандартных аминокислот.

Пептидные связи между аминокислотами могут образовываться в результате поликонденсации, но в живом организме последовательность аминокислот жестко контролируется и должна соответствовать генетическому коду белка, записанному на клеточной ДНК. Последовательность аминокислот, соединенных друг с другом пептидной связью в полипептидной цепи называют первичной структурой белка. Аминокислотная последовательность белка определяет его биологическую функцию. Кроме того, для всякого белка характерна особая пространственная структура, образующаяся за счет взаимодействия друг с другом несоседних аминокислотных звеньев, она называется третичной структурой (вторичной структурой называются отдельные элементы пространственной укладки белка, такие как а-спираль или /3-елой). Многие крупные белки состоят из нескольких полипептидных цепей, удерживаемых вместе за счет гидрофобных взаимодействий, а также при помощи водородных и ионных связей. Способ совместной упаковки таких цепей называют четвертичной структурой белка.

Функции белков в организме более разнообразны, чем функции других органических молекул, таких как нуклеиновые кислоты, полисахариды и липиды. Это не только каталитическая (ферментативная) функция, но и структурная, защитная, регуля-торная, сигнальная, транспортная, резервная, рецепторная, моторная (двигательная). Как правило, в выполнении той или иной функции задействовано несколько белков, а ряд биологически значимых клеточных процессов выполняются огромными белковыми машинами, состоящими из десятков белковых молекул, объединенных за счет белок-белковых взаимодействий [1].

Под белок-белковыми взаимодействиями понимается связь двух и более белковых молекул друг с другом, как правило обратимая. Кроме того, белки способны взаимодействовать и с другими молекулами — с нуклеиновыми кислотами, с липидами, полисахаридами, ионами и атомами. Нарушение белок-белковых взаимодействий может приводить к возникновению различных заболеваний, включая опухолевые, нейро-дегенеративные, сердечно-сосудистые, аутоиммунные и др. Поэтому изучение взаимодействующих партнеров и анализ белковых сетей, образованных белок-белковыми взаимодействиями, представляет собой важный инструмент в диагностике заболеваний, выяснении механизма их возникновения и развития, а также эффективности тех или иных терапевтических подходов (2].

Группы физически взаимодействующих белков, которые функционируют в клетке совместно и скоординировано, контролируя взаимосвязанные процессы, образуют так называемые белковые сети. На сегодняшний день показано, что большинство белков имеют несколько функциональных центров (сайтов) и полифункциональны, то есть каждый может участвовать в нескольких независимых процессах. Поэтому белковые сети в клетке имеют сложно переплетенную структуру, и важной задачей на пути к пониманию механизмов работы всей клетки и всего организма является построение таких сетей. Для решения этой задачи необходимо проводить структурно-функциональное картирование белков, позволяющее локализовать их функционально важные участки, в том числе и те, благодаря которым осуществляются белок-белковые взаимодействия, а затем прослеживать участие этих функциональных участков в клеточных процессах — искать новых контрагентов.

Актуальность работы

Для исследований в этой сфере приходится пользоваться всеми доступными экспериментальными и теоретическими методами. Среди теоретических методов особо выделяется метод молекулярной динамики (МД). В числе экспериментальных методов: рентге-ноструктурный анализ, метод дрожжевого двугибридного анализа, фаговый дисплей, аффинная очистка в тандеме с масс-спектрометрией. Широкие возможности для исследования белок-белковых взаимодействий предлагают различные микроскопические методы, в том числе флуоресцентная микроскопия, электронная микроскопия, крио-электронная томография и сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ). В настоящей работе предложено исследовать крупные белок-белковые комплексы при помощи одного из методов СЗМ — атомио-силовой микроскопии (АСМ). Данный метод предназначен для визуализации закрепленных на подложке объектов с высоким пространственным разрешением на воздухе или в жидкой буферной среде, а также для исследования локальных механических свойств поверхности образца и для наблюдения динамики процессов. С его помощью можно получить информацию о физических свойствах объектов, не доступную другим методам, а также микроскопическую информацию, дополняющую результаты просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).

Широкий спектр возможностей, предоставляемых АСМ для изучения биополимеров, обуславливает большое количество работ по этой тематике, публикуемых ежегодно в ведущих научных журналах.

Цель работы

Цель настоящей работы — разработать методики для исследования с помощью метода АСМ структуры, свойств и особенностей процесса формирования биомакромолекуляр-ных комплексов на примере двух биологически значимых систем — системы свертывания крови и вирусных частиц.

Первый объект исследования — белок фибриноген, играющий ключевую роль в процессе свертывания крови. Под действием тромбина он переходит в активную форму, называемую фибрином, и ассоциирует, образуя крупную сеть макроскопических волокон — основу будущего тромба. В настоящей работе исследовалась молекулярная структура ранних ассоциатов фибрина.

Второй объект — белок оболочки (ВО) X вируса картофеля (ХВК). Известно, что в определенных условиях БО ХВК может образовывать спирально-симметричную оболочку вокруг РНК. В настоящей работе исследовались структура, свойства и условия формирования комплексов, образованных БО ХВК с ДНК.

Основное различие между этими системами состоит в том, что ассоциаты фибрина — это чисто белковые структуры, в то время как вирусные частицы стабилизируются нуклеиновой кислотой и являются более сложным нуклеопротеидным комплексом.

Задачи

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методики для визуализации ассоциатов фибрина на разных стадиях реакции и исследовать структуру ранних ассоциатов фибрина методом АСМ.

2. Исследовать конформации молекул фибриногена, адсорбированных на различные подложки методами АСМ и молекулярной динамики (МД), сопоставить результаты моделирования с экспериментальными данными.

3. Исследовать условия формирования и структуру дезоксирибонуклеопротеидов (ДНИ), полученных in vitro на основе БО ХВК и ДНК, сравнить их структуру с рибону-клеопротеидами (РНП).

4. Исследовать возможность формирования ДНП на основе БО другого потексвиру-са — вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт).

5. Разработать методику для анализа механических свойств вирусных частиц методом силового картирования (СК).

Научная новизна диссертации

1. Разработана методика визуализации ассоциатов фибрина, образующихся на начальной стадии свертывания крови. Впервые показано, что наряду с протофиб-риллами существуют более тонкие ассоциаты — профибриллы, образованные при связывании а-С доменов соседних молекул друг с другом.

2. Проведено исследование процесса сорбции фибриногена на слюду и слюду, модифицированную ГМДС, методами АСМ и МД. Показано, что конформации молекул на гидрофильной и гидрофобной подложках существенно различаются.

3. Показана возможность формирования комплексов БО ХВК с ДНК, подобраны оптимальные условия для формирования этих НП. Показано, что укладка белка в ДНП существенно отличается от структуры оболочки нативного вируса и РНП. Предположено, что БО ХВК связывается с малой бороздкой ДНК.

4. Показано, что при использовании БО другого потексвируса — ВМАльт — ДНП не образуются. Вместо этого формируются длинные тяжи — ассоциаты БО, не содержащие ДНК.

5. Разработана методика для анализа механических свойств вирусных частиц методом СК.

Практическая значимость работы

Результаты диссертации носят в первую очередь фундаментальный характер. По мнению автора, наиболее интересны три результата: обнаружение тонких ассоциатов фибрина, в которых молекулы белка связанны, предположительно, за счет взаимодействия а-С доменов соседних молекул, определение особенностей структуры ДНП и определение жесткости вирусных частиц методом СК.

Важным методологическим результатом диссертации является разработанный алгоритм для анализа данных СК. Силовое картирование - весьма трудоемкий экспериментальный метод, требующий сложного анализа и имеющий серьезные артефакты, которые часто не учитываются при обработке. Настоящая работа вносит вклад в развитие этого метода.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы докладывались на следующих научных конференциях и школах:

• 2nd International School on Surface science «Technologies and Measurements on Atomic Scale», 2012, Sochi, Russia;

• Шестая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии», 2012, Москва, Россия;

• X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова, 2011, Москва, Россия;

• 17th International Biophysics Congress, 2011, Beijing, China;

• 2nd International School «Nanomaterials and Nanotechnologies in Living Systems. Safety and Nanomedicine», 2011, Moscow region, Russia;

• Пятая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии», 2011, Москва, Россия;

• XXIII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 2011, Москва, Россия;

• ESF-EMBO Research Conference «Molecular Perspectives on Protein-Protein Interactions», 2010, Sant Feliu de Guixols, Spain;

• 20tli Anniversary Korea-Russia Science and Technology Forum, 2010, Москва, Россия;

• Четвертая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии», 2010, Москва, Россия;

• Третья международная конференция «Современные достижения бионаноскопии», 2009, Москва, Россия;

• Первая международная научная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах», 2009, Россия.

Личный вклад автора

Все экспериментальные измерения зондовой микроскопии и подготовка образцов к сканированию выполнены автором лично. Анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.

Эксперименты по динамическому светорассеянию проведены совместно с Завьяловой Еленой. Моделирование методом МД проведено совместно с Толстовой Анной, Оферкиным Игорем и Годзи Максимом. Эксперименты по ферментному анализу ДНП и РНП проведены совместно с Никитиным Николаем и Полозовым Василием.

Публикации

По теме диссертационной работы опубликована 21 работа, в том числе 7 статей и 14 публикаций в сборниках тезисов докладов конференций.

Выводы

1. Методом АСМ показано, что на ранних стадиях ассоциации фибрина наряду с двутяжевыми протофибриллами существуют более тонкие ассоциаты — короткие однотяжевые профибриллы, образованные при связывании а-С-доменов соседних молекул друг с другом.

2. Методом АСМ показано, что молекулы фибриногена сильно деформируются при адсорбции на гидрофильную слюду и в меньшей степени деформируются при адсорбции на гидрофобную ГМДС-слюду. Результаты АСМ подтверждены методом МД.

3. Показана возможность формирования комплексов БО ХВК с ДНК, подобраны оптимальные условия для формирования ДНП. Показано, что укладка белка в ДНП не соответствует структуре оболочки нативного вируса.

4. Показано, что при использовании БО другого потексвируса — ВМАльт — ДНП не образуются. Вместо этого формируются длинные тяжи — ассоциаты БО, не содержащие ДНК.

5. Разработана методика для анализа механических свойств вирусных частиц методом силового картирования.

Глава VI

Благодарности

Выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю Яминскому Игорю Владимировичу за предоставленную возможность свободно работать на экспериментальном оборудовании над интересными мне темами, за безоговорочную помощь и поддержку во всех моих начинаниях. Я также благодарна Копылову Алексею Михайловичу и Карповой Ольге Вячеславовне за поставленные научные задачи.

Я искренне благодарна Завьяловой Лене за великолепную творческую атмосферу совместной работы, а также всем моим коллегам, с кем мы совместно проводили эксперименты, обсуждали и обрабатывали их результаты: Анне Толстовой, Игорю Оферкину, Максиму Годзи, Арзуманян Ирине, Петровой Екатерине, Никитину Николаю, Моник Якобе и Елене Зивкович.

Большое спасибо Александру Филонову за предоставленное программное обеспечение и консультации по его работе. Хочу также выразить благодарность Евгению Дубровину за обучение различным методикам работы на АСМ, приготовлению образцов, многочисленные консультации и поддержку в ходе выполнения этой работы.

Я благодарю Александра Чертовича за консультации и помощь в проведении МД моделирования, Соколову Ольгу Сергеевну за помощь с экспериментами по ПЭМ и Анастасию Большакову за внимательное прочтение автореферата.

Особенную благодарность хочу выразить моей маме, Сушко Светлане Владимировне, заведующей редакции журнала ТМФ, за редактирование текстов диссертации и автореферата.

Заключение

В данной части работы

• Показана возможность формирования комплексов ВО ХВК с ДНК, подобраны оптимальные условия для формирования ДНП. Показано, что укладка белка в ДНП не соответствует структуре оболочки нативиого вируса.

• Показано, что при использовании ВО другого потексвируса ВМАльт ДНП не образуются. Вместо этого формируются длинные тяжи — ассоциаты ВО, не содержащие ДНК.

• Разработана методика для анализа механических свойств вирусных частиц методом силового картирования.

Глава V

1. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология в 3-х томах, под ред. Р. Сопера, М. Мир 1996.

2. Терентьев А.Л., Молдогазиева Н.Т., Шайтан К.В. Динамическая протеомика в моделировании живой клетки. Белок-белковые взаимодействия, Усп. биол. хим., т. 49, 2009, с. 429-480.

3. Binning G., Quate С., Atomic force microscope, Phys.Rev. Lett., v. 56, p. 577-579 (1986).

4. Weisenhorn A.L., Hansma P.K., Albrecht T.R., Quate C.F., Forces in atomic force microscopy in air and water, Appl. Phys. Lett. v. 54, p. 2651-2653 (1989).

5. Butt H.J., Siedle P., Seifert K., Fendler K., Seeger Т., Bamberg E., Weisenhorn A.L., Goldie K., Engel A. Scan speed limit in atomic force microscopy, J. Microsc., v. 169, p. 75 84 (1993).

6. Neumeister J.M., Ducker W.A. Lateral, normal, and longitudinal spring constants of atomic force microscopy cantilevers, Rev. Sci. Instrum., v. 65, p. 2527-2531 (1994).

7. Sader J.E. Parallel beam approximation for V-shaped atomic force microscope cantilevers, Rev. Sci. Instrum., v. 66, p. 4583 4587 (1995).

8. Khan A., Philip J., Hess P. Young's modulus of silicon nitride used in scanning force microscope cantilevers, J. Appl. Phys., v. 95, p. 1667-1672 (2004).

9. Senden T.A., Ducker W.A. Experimental Determination of Spring Constants in Atomic Force Microscopy, Langmuir, v. 10, p. 1003-1004 (1994).

10. Maeda N., Senden T.J. A Method for the Calibration of Force Microscopy Cantilevers via Hydrodynamic Drag, Langmuir, v. 16, p. 9282-9286 (2000).

11. Notley S.M., Biggs S., Craig V.S.J. Calibration of colloid probe cantilevers using the dynamic viscous response of a confined liquid, Rev. Sci. Instrum., v. 74, p. 4026-4032 (2003).

12. Degertekin F.L., Hadimioglu B., Sulchek T., Quate C.F. Actuation and characterization of atomic force microscope cantilevers in fluids by acoustic radiation pressure , Appl. Phys. Lett., v. 78, p. 1628-1630 (2001).

13. Holbery J.D., Eden V.L., Sarikaya M., Fisher R.M. Experimental determination of scanning probe microscope cantilever spring constants utilizing a nanoindentation apparatus , Rev. Sci. Instrum., v. 71, p. 3769-3776 (2000).

14. Cleveland J.P., Manne S., Bocek D., Hansma P.K. A nondestructive method for determining the spring constant of cantilevers for scanning force microscopy, Rev. Sci. Instrum., v. 64, p. 403-405 (1993).

15. Bonaccurso E., Butt H.J. Microdrops on Atomic Force Microscope Cantilevers: Evaporation of Water and Spring Constant Calibration, J. Phys. Chem. B, v. 109, p. 253-263 (2005).

16. Hutter J.L., Bechhoefer J. Calibration of atomic force microscope tips, Rev. Sci. Instrum., v. 64, p. 1868-1873 (1993).

17. Butt H. J., Cappella B., Kappl M. Force measurements with atomic force microscope: technique, interpretetion and applications, Surf. Sci. Rep., v. 59, p. 1-152 (2005).

18. Hudlet S., Saint Jean M., Guthmann C., Berger J. Evaluation of the capacitive force between an atomic force microscopy tip and a metallic surface, Eur. Phys. J. B, v. 2, p. 5-10 (1998).

19. Law B.M., Rieutord F. Electrostatic forces in atomic force microscopy, Phys. Rev. B, v. 66, 035402 (2002).

20. Colchero J., Gil A., Baro A.M. Resolution enhancement and improved data interpretation in electrostatic force microscopy, Phys. Rev. B, v. 64, 245403 (2001).

21. Hao H.W., Baro A.M., Saenz J.J. Electrostatic and contact forces in force microscopy , J. Vac. Sci. Technol. B, v. 9, p. 1323-1328 (1991).

22. Sacha G.M., Verdaguer A., Mart?nez J., Saenz J.J., Ogletree D.F., Salmeron M. Effective tip radius in electrostatic force microscopy, Appl. Phys. Lett., v. 86, 123101 (2005).

23. Israelachvili J.N. Intermolecular and surface forces, Third edition, Elsevier 2011, p. 312.

24. Hogg R., Healy T.W., Fuerstenay D.W. Mutual Coagulation of Colloidal Dispersions, Trans. Faraday Soc., v. 62, p. 1632-1637 (1966).

25. Butt H.J. Electrostatic interaction in scanning probe microscopy when imaging in electrolyte solutions, Nanotechnology, v. 3 p. 60-68 (1992).

26. Israelachvili J.N., Adams G.E. Direct measurement of long range forces between two mica surfaces in aqueous KN03 solutions, Nature, v. 262, p. 774-776 (1976).

27. Hawn C.Z., Porter K.R., The fine structure of clots formed from purified bovine fibrinogen and thrombin: a study with the electron microscope, J Exp. Med., v. 86, p. 285-297 (1947).

28. Edsall J.T., Foster J.F., Scheinberg H., Studies on double refraction of flow. III. Human fibrinogen and fraction I of human plasma, J. Am. Chem. Soc., v.69, 2731-2738 (1947).

29. Porter K.R., Hawn C. Z., Sequences in the formation of clots from purified bovine fibrinogen and thrombin: a study with the electron microscope, J Exp. Med., v. 90, p. 225-237 (1949).

30. Hall C. E., Electron microscopy of fibrinogen and fibrin, J. Biol. Chem, v.179, p. 857865 (1949).

31. Hall C. E., Visualization of individual macromolecules with the electron microscope, Proc. N.A.S., v.42, p. 801-806 (1956).

32. Hall C. E., Slayter H.S., The fibrinogen molecule: its size, shape, and Mode of polymerization, J. Biophysic. And Biochem. Cytol., v. 5, № 1, p. 11-17 (1959).

33. Ehrlich P., Shulman S., Ferry J. D., The conversion of fibrinogen to fibrin. VIII. Sedimentation and viscosity studies on clotting systems inhibited by urea and on solutions of fibrin in urea, J. Am. Chem. Soc., v. 74, 2258-2265 (1952).

34. Katz S., Gutfreund K., Shulman S., Ferry J. D. The conversion of fibrinogen to fibrin. X. Light scattering studies of bovine fibrinogen, J. Am. Chem. Soc., v. 74, 5706-5709 (1952).

35. Fostern J. F., Samsa E. G., Shulman S., Ferry J. D., The conversion of fibrinogen to fibrin. VI. Flow birefringence studies on clotting systems inhibited by hexamethylene glycol, Arch. Biochem. Biophys., v. 34, 417-423 (1951).

36. Scheraga H.A., Backus J.K., Flow birefringence in arrested clotting systems, J. Am. Chem. Soc., v. 74, 1979-1983 (1952).

37. Casassa E.F., Light scattering from very long rod-like particles and an application to polymerized fibrinogen, J. Chem. Phys., v. 23, p. 596-597 (1955).

38. Ferry J.D., The mechanism of polymerization of fibrinogen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 38, p. 566-569 (1952).

39. Hantagan R. R., Hermans J., Assembly of Fibrin, J. Biol. Chem., v. 254, № 22, p. 11272-11281 (1979).

40. Hogg D. G., Blomback B., The mechanism of the fibrinogen-thrombin reaction, Thromb. Res., v. 12, № 6, p. 953-964 (1978).

41. Krakow W., Endres G.F., Siegel B.M., Scheraga H.A., An electron microscopy investigation of the polymerization of bovine fibrin monomer, J. Mol. Biol., v. 71, p. 95-103 (1972).

42. Slayter H.S., Heigh-resolution metal replication of macromolecules, Ultramicroscopy, v. 1, p. 341-357 (1976).

43. Flower W.E, Hantagan R.R., Hermans J., Erickson H.P., Structure of the fibrin protofibril, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, v. 78, pp.4872-4876 (1981).

44. Mosesson M. W., DiOrio J. P., Siebenlist K. R., Wall J. S., Heinfeld J.F., Evidence for a second type of fibril branch point in fibrin polymer networks, the trimolecular junction, Blood, v. 82, № 5, p. 1517-1521 (1993).

45. Wigren R., Elwing H., Erlandsson R., Welin S., Lundstrom I., Structure of adsorbed fibrinogen obtained by scanning force microscopy, FEBS, v. 280, №2, p. 225-228 (1991).

46. Ortega-Vinuesa J. L., Tengvall P., Lundstrom I., Molecular packing of HSA, IgG, and fibrinogen adsorbed on silicon by AFM imaging, Thin Solid Films, v. 324, p. 257-273 (1998).

47. Taatjes D. J., Quinn A. S., Jenny R. J., Hale P., Bovill E. G., McDonagli J., Tertiary structure of the hepatic cell protein fibrinogenin fluid revealed atomic force microscopy, Cell Biol. Int., v. 21, № 11, p. 715-726 (1997).

48. Cacciafesta P., Humphris A. D. L., Jandt K. D., Miles M. J., Human plasma fibrinogen adsorption on ultrafiat titanium oxide surfaces studied with atomic force microscopy, Langmuir, v. 16, p. 8167-8175 (2000).

49. Marchant R. E., Barb M. D., Shainoff J. R., Eppell S. J., Wilson D. L., Siedlecki C.A., Three dimensional structure of human fibrinogen under aqueous conditions visualized by atomic force microscopy, Thromb. Haemost., v. 77, p. 1048-1051 (1997).

50. Sit P. S., Marchant R. E., Surface-dependent conformations of human fibrinogen observed by atomic force microscopy under aqueous conditions, Thromb. Haemost., v.82, p. 1053-1060 (1999).

51. Agnihotri A., Siedlecki C. A., Time-dependent conformational changes in fibrinogen measured by atomic force microscopy, Langmuir, v. 20, p. 8846-8852 (2004).

52. Jandt K.D., Finke M., Cacciafesta P., Aspects of the physical chemistry of polymers, biomaterials and mineralised tissues investigated with atomic force microscopy (AFM), Coll. Surf. B: Biointerfaces, v. 19, № 4, p. 301-314 (2000).

53. Marchin K.L., Berrie C.L., Conformational changes in the plasma protein fibrinogen upon adsorption to graphite and mica investigated by atomic force microscopy, Langmuir, v. 19, p. 9883-9888 (2003).

54. Ohta R., Saito N., Ishizaki T., Takai, Visualization of human plasma fibrinogen adsorbed on highly oriented pyrolytic graphite by scanning probe microscopy, Surface Science, v. 600, p. 1674-1678 (2006).

55. Gorkun O. V., Litvinov R. I., Veklich Yu. I., Weisel J.W., Interactions Mediated by the N-Terminus of Fibrinogen's B/3 Chain, Biochemistry, v. 45 (49), p. 14843-14852 (2006).

56. Litvinov R.I., Yakovlev S., Tsurupa G., Gorkun O. V., Medved L., Weisel J.W., Direct evidence for specific interactions of the fibrinogen aCdomains with the central E region and with each other, Biochemistry, v. 46(31), p. 9133-9142 (2007).

57. Weisel J.W., Medved L., The structure and function of the a-C domains of fibrinogen, Ann. N. Y. Acad. Sci., v. 936, p. 312-27 (2001).

58. Liu W., Carlisle C. R., Sparks E. A., Guthold M., The mechanical properties of single fibrin fibers, J. Thromb. Haemost., v. 8, p.1030-1036 (2010).

59. Collet J. P., Shuman H., Ledger R. E., Lee S., Weisel J. W., The elasticity of an individual fibrin fiber in a clot, PNAS, v. 102, № 26, p. 9133-9137 (2005).

60. Lim B., Lee E.H., Sotomaypr H., Schulten K., Molecular basis of fibrin clot elasticity, Structure, v. 16, p. 449-459 (2008).

61. Lee E. H., Hsin J., Sotomayor M., Cornelias G., Schulten K., Discovery through the computational microscope, Structure, v. 17(10), p. 1295 1306 (2009).

62. Zenhausen F., Adrian M., Emch R., Taborelli M., Jobin M., Descouts P. Scanning force microscopy and cryo-electron microscopy of tobacco mosaic virus as a test specimen, Ultramicroscopy, v. 42-44, № 6, p. 1168-1172 (1992).

63. Zhong Q., Innis D., Kjoller K., Elings V.B. Fractured polymer/silica fiber surface studied by tapping mode atomic force microscopy, Surface Science Letters, v.290, Nsl-2, p. L688-L692 (1993).

64. Kolbe W.F., Ogletree D.F., Salmeron M.B. Atomic force microscopy imaging of T4 bacteriophages on silicon substrates, Ultramicroscopy, v. 42-44, № 6, p. 1113-1117 (1992).

65. Imai K., Yoshimura K., Tomitori M., Nishikawa O., Kokawa R., Yamamoto M., Kobayashi M., Ikai A. Scanning Tunneling and Atomic Force Microscopy of T4

66. Bacteriophage and Tobacco Mosaic Virus, Jpn. J. Appl. Phys. v. 32, p. 2962-2964 (1993).

67. Droz E., Taborelli M., Wells T. N. C., Descouts P. Preparation of Isolated Biomolecules for SFM Observations: T4 Bacteriophage as a Test Sample, Biophys. J., v.65, p.1180 1187 (1993).

68. Lyubchenko Yu.L., Oden P.I., Lampner D., LindsayS.M., DunkerK.A. Atomic force microscopy of DNA and bacteriophage in air, water and propanol: the role of adhesion forces, Nucleic Acids Res., V. 21, № 5, p. 1117-1123 (1993).

69. Karrasch S., Dolder M., Schabert F., Ramsden J., Engel A. Covalent binding of biological samples to solid supports for scanning probe microscopy in buffer solution, Biophys. J., v. 65, № 6, p. 2437-2446 (1993).

70. Malkin A. J., Land T. A., Kuznetsov Yu. G., McPherson A., DeYoreo J.J., Investigation of Virus Crystal Growth Mechanisms by In Situ Atomic Force Microscopy, Phys. Rev. Lett., v. 75, № 14, p. 2778-2781 (1995).

71. Lucas R. W., Kuznetsov Y. G., Larson S. B., McPherson A., Crystallization of Brome mosaic virus and T = 1 Brome mosaic virus particles following a structural transition, Virology, 286 (2), p. 290-303 (2001).

72. Dubrovin E.V., Drygin Yu.F., Novikov V.K., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy as a tool of inspection of viral infection, Nanomedicine: Nanotech., Bio., and Med. 3, p. 128-131 (2007).

73. McPerson A., Kuznetsov Yu. G., Atomic Force Microscopy Investigation of Viruses, In Atomic Force Microscopy in Biomedical Research, Methods in Molecular Biology, V. 736, Part 3, p. 171-195 (2011).

74. Falvo M. R., Washburn S., Superfine R., Finch M., Brooks F. P., Chi V., Taylor R. M., Manipulation of Individual Viruses: Friction and Mechanical Properties, Biophysical Journa,l V. 72, p. 1396-1403 (1997).

75. Drygin Yu. F., Bordunova O. A., Gallyamov M. O., Yaminsky I. V. Atomic force microscopy examination of tobacco mosaic virus and virion RNA, FEBS Letters, 425, p. 217-221 (1998).

76. Kuznetsov Yu. G., McPherson A. Atomic force microscopy investigation of Turnip Yellow Mosaic Virus capsid disruption and RNA extrusion, Virology, v. 352, p. 329-337 (2006).

77. Kiselyova O.I., Yaminskyl. V., Karpova О. V., Rodionova N. P., Kozlovsky S. V., Arkhipenko M. V., Atabekov J. G. AFM Study of Potato Virus X Disassembly Induced by Movement Protein, J. Mol. Biol., v. 332, p. 321-325 (2003).

78. Hewat E.A., Neumann E., Blaas D. The Concerted Conformational Changes during Human Rhinovirus 2 Uncoating, Molecular Cell, V. 10., № 2, p. 317-326 (2002).

79. Сушко А.Д., Яминский И.В., Гаврюшина Е.С., Дрыгин Ю.Ф. Высвобождение РНК из вируса обыкновенной простуды человека HRV 2 в кислой среде, Коллоидный журнал т. 72, № 4, стр. 549-554 (2010).

80. Kienberger F., Zhu R., Moser R., Blaas D., Hinterdorfer P. Monitoring RNA release from human rhinovirus by dynamic force microscopy, J. Virology, v. 78, p. 3203-3209 (2004).

81. Kuznetsov Yu. G., Datta S., Kothari N. H., Greenwood A., Fan H., McPherson A. Atomic force microscopy investigation of fibroblasts infected with wild-type and mutant murine leukemia virus (MuLV), Biophys. J. 83, p. 3665-3674 (2002).

82. MalkinA. J., McPherson A., Gershon P. D. Structure of Intracellular Mature Vaccinia Virus Visualized by In Situ Atomic Force Microscopy, J. Virology, v.77, №11, p.6332-0340 (2003).

83. Kuznetsov Yu., Gershon P. D., McPherson A. Atomic Force Microscopy Investigation of Vaccinia Virus Structure, J. of Virology, Vol. 82, № 15, p. 7551-7566 (2008).

84. Kuznetsov Yu. G., Victoria J. G., Robinson W. E., McPherson A. Atomic Force Microscopy Investigation of Human Immunodeficiency Virus (HIV) and HIV-infected Lymphocytes, J. of Virology, vol. 77, № 22, p. 11896-11909 (2003).

85. Plomp M., Rice M. K., Wagner E. K., McPherson A., Malkin A. J. Rapid Visualization at High Resolution of Pathogens by Atomic Force Microscopy, Am. J. Pathol., v. 160, p. 1959-1966 (2002).

86. Liashkovich I., Hafezi W., Kuhn J. E., Oberleithner H., Kramer A., Shahin V. Exceptional mechanical and structural stability of HSV-1 unveiled with fluid atomic force microscopy, J. Cell Sci., v. 121, p. 2287-2292 (2008).

87. Roos W. H., Radtke K., Kniesmeijer E., Geertsema H., Sodeik В., Wuite G. J. Scaffold expulsion and genome packaging trigger stabilization of herpes simplex virus capsids, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., v. 106, p. 9673 -9678 (2009).

88. Giocondi M., Ronzon F., Nicola M.C., Dosset P., Milhiet P.E., Chevalier M., Le Grimellec K. Organization of influenza A virus envelope at neutral and low pH, J. Gen. Vir., v. 91, p. 329-338 (2010).

89. Liu C.H., Horng J.Т., Chang J.S., Hsieh C.F., Tseng Y.C., Lin S. Localization and force analysis at the single virus particle level using atomic force microscopy, Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 417, p. 109-115 (2011).

90. Атабеков PI.Г. Применение вирусных структур в качестве инструментов нанотех-нологий, Рос. нанотехнологии, 3, 1-2, стр. 132-141 (2008).

91. Frenkel-Conrat Н., Williams R.C. Reconstitution of active tobacco mosaic virus from the inactive protein and nucleic acid components, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., v. 416, p. 690-698 (1955).

92. Bancroft J.В., Hiebert E. Formation of an infectious nucleoprotein from protein and nucleic acid isolated from a small spherical virus, Virology, v. 32., p. 354-356 (1967).

93. Новиков В.К., Кимаев В.З., Атабеков И.Г. Реконструкция нуклеопротеида X-вируса картофеля, Докл. АН СССР, № 204, с. 1259-1262 (1972).

94. Fox J.M., Wang G., Speir J.A., Olson N.H., Johnson J.E., Baker T.S., Young M.J. Comparison of the Native CCMV Virion with in Vitro Assembled CCMV Virions by Cryoelectron Microscopy and Image Reconstruction, Virology, v. 244, p. 212-218 (1998).

95. Frenkel-Conrat H., Singer B. Reconstitution of tobacco mosaic virus. IV. Inhibition by enzymes and other proteins, and use of polynucleotides, Virology, v. 23, p. 354-362 (1964).

96. Heibert E., Bancroft J.В., Bracker C.E. The assembly in vitro of some small spherical viruses, hybrid viruses and other nucleoproteins, Virology, v. 346, p. 492-508 (1968).

97. Black D.R., Connell C.J., Merigan T.C. Structure and infectivity of picornaviral RNA encapsidated by cowpea chlorotic mottle virus protein, J. of Virology, v. 12, N8 6, p. 1209-1215 (1973).

98. Santanu M., Pfeifer C. M., Johnson J. M., Liu J., Zlotnick A. Redirecting the coat protein of a spherical virus to assemble into tubular nanostructures, J. Am. Chem. Soc., v. 128, № 8, p. 2538-2539 (2006).

99. Erickson J.W., Abouhaidar M., Bancroft J.B. The specificity of papaya mosaic virus assembly, Virology, V. 90, P. 60-66 (1978)

100. Erickson J.W., Bancroft J.B. , Prog. Clin. Biol. Res. 1980, № 40, P. 293-300.

101. Kaftanova A.S., Kiselev N.A., Novikov V.K., Atabekov J.G. Structire of products of protein reassembly and reconstruction of potato virus X, Virology, v. 65, p. 283-287 (1975).

102. Goodman R.M. Reconstruction of potato virus X in vitro. I Properties of the dissociated protein structural subunits, Virology, v. 76, p. 72 -78 (1975).

103. Koo J., Rafailovich M. H., Medved L., Tsurupa G., Kudryk B. J., Liu Y., Galanakis D. K., Evaluation of Fibrinogen Self-assembly: Role of its alphaC Region, Thromb Haemost., 8(12) (2010) 2727-2735.

104. Chernysh, I.N., and Weisel, J.W., Dynamic imaging of fibrin network formation correlated with other measurements of polymerezation (2008) Blood, 111, 4854-4861

105. Yermolenko I.S., Lishko V.K., Ugarova T.P., Magonov S.N. High-resolution visualization of fibrinogen molecules and fibrin fibers with atomic force microscopy, Biomacromolecules, v. 12, 2, p. 370-379 (2011).

106. Santos, N. C., Castanho, M. A. Biophys. J. 1996, 71, p. 1641-1646.

107. Santos, N. C., Ter-Ovanesyan, E., Zasadzinski, J. A., Prieto, M., Castanho, M. A. R. B. Biophys. J. 1998, 75, 1869-1873.

108. Chinn J. A., Horbett T. A., Ratner B. D. Baboon fibrinogen adsorption and platelet adhesion to polymeric materials, Thromb. Haemostasis, v. 65, p. 608-617 (1991).

109. Pizzo S. V., Schwartz M. L., Hill R. L., McKee P. A. The Effect of Plasmin on the Subunit Structure of Human Fibrin, J of Bio. Chem., v. 248, № 13, p. 4574-4583 (1973).

110. Medved L.V., Gorkun O.V., Privalov P.L. Structural organization of C-terminal parts of fibrinogen Act-chains, FEBS Letters, v. 160, № 1,2, p. 291-295 (1983).

111. J. M. Kollman, L. Pandi, M. R. Sawaya, M. Riley, R. F. Doolittle, Crystal structure of human fibrinogen, Biochem., v. 48, p. 3877 3886 (2009).

112. M.Nelson, W.Humphrey, A.Gursoy, A.Dalke, L.Kale, R.D.Skeel, and K.Schulten. NAMD A parallel, object-oriented molecular dynamics program. Int. J. Supercomp. Appl. High Perform. Comp., 10, p. 251-268 (1996).

113. Kubiak K., Mulheran P.A.Molecular Dynamics Simulations of Hen Egg White Lysozyme Adsorption at a Charged Solid Surface, J. Phys. Chem. B, v. 113, p. 1218912200 (2009).

114. W. Humphrey, A. Dalke and K. Schulten, VMD: Visual molecular dynamics, J. Mol. Gr., 14(1), p. 33-38 (1996).

115. Blomback B, Hessel B, Hogg D, Therkildsen L. A two-step fibrinogen-fibrin transition in blood coagulation, Nature, v. 275, p.501-505 (1978).

116. Pechik I., Yakovlev S., Mosesson M.W., Gilliland G.L., Medved L. Structural basis for sequential cleavage of fibrinopeptides upon fibrin assembly, Biochemistry, v. 45, № 11, p. 3588-3597 (2006).

117. Baulcombe D.C., Chapman S., Santa Cruz S. Jellyfish green fluorescent protein as a reporter for virus infections, Plant J., V. 7., P. 1045-1053 (1995).

118. Bustamante C., Vesenka J., Tang C.L., Rees W., Guthod M., Keller R., Circular DNA molecules imaged in air by scanning force microscopy, Biochemistry, 31, 22-26 (1992).

119. Vesenka J., Guthod M., Tang C.L., Keller R., Delaine E., Bustamante C., Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope, Ultramicroscopy, 42-44, 1243-1249 (1992).

120. Koenig R., Tremaine J.H., Shepard J.F. // J. Gen. Virol. 1978. V. 38. P. 329.

121. Rodionova N. R, Karpova O. V., Kozlovsky S. V., Zayakina O. V., Arkhipenko M. V., Atabekov J. G. // Linear remodeling of helical virus by movement protein binding. J Mol Biol 2003, № 333, p. 565 572.