Ацилирование аминосоединений в водной среде под действием пенициллинацилаз тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова

Химический факультет, кафедра химической энзимологии Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

на правах рукописи

Химюк Андрей Ярославович

Ацилирование аминосоединений в водной среде под действием

пенициллинацилаз

02.00.15 катализ 03.00.23 биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2005

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета и в отделе биокинетики Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

профессор, д.х.н. Швядас В.К. к.х.н. Д.Т. Гуранда

Официальные оппоненты:

д.б.н. Яненко А.С. д-х.н. Кочетков К. А.

Ведущая организация: Институт Биохимии им. А.Н. Баха

Защита состоится декабря 2005 г. в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, ауд. 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан J$ ноября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук

И.К. Сакодынская

247/3

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Пенициллинацилазы (ПА) - биокатализаторы промышленного значения, используемые в производстве пенициллинов и цефалоспоринов. В последние годы показано, однако, что ферменты этого семейства обладают существенно более широкой субстратной специфичностью. Открытая недавно способность малоизученной ПА из Alcaligenes faecalis катализировать высокоэффективное и стереоселективное ацилирование аминов в водной среде послужило стимулом, определившем цель настоящего исследования - выяснение причин того, чем обусловлен столь эффективный синтез амидной связи, катализируемый гидролазой в 100% водной среде, каковы его ограничения, какие возможности открывает использование этого подхода. Особый интерес представляет использование таких реакций для получения оптически чистых соединений, а также для разделения энантиомеров веществ. Кроме того, использование биокатализа в водных средах является одной из главных тенденций развития современной промышленности в связи с растущими экологическими требованиями.

Дель и задачи исследования. Целью работы явилось исследование кинетических закономерностей реакций ацильного переноса на первичную аминогруппу различных классов соединений, катализируемого ПА из A.faecalis в водной среде, включая стереоселективность ацилирования; выявление факторов, влияющих на эффективность синтеза N-ацильных производных и разделения энантиомеров аминосоединений, определение оптимальных условий этого процесса; разработка и апробация новых методов препаративного синтеза хиральных N-ацильных производных и получения индивидуальных энантиомеров аминосоединений при использовании как ПА из A.faecalis, так и ПА из Escherichia coli.

Научная новизна. Впервые показано, что ферментативное ацилирование высокоосновных аминосоединений, катализируемое ПА из A.faecalis в водной среде, протекает через стадию образования ацилфермент-нуклеофильного комплекса, выявлены особенности ацильного переноса на различные классы аминосоединений. Предложены "минимальные" кинетические схемы стереоселективного ацилирования аминокислот и аминов/аминоспиртов, на основании которых разработан алгоритм моделирования, позволяющий адекватно описать протекание реакции в условиях гомогенных и гетерогенных систем. Проанализировано влияние различных факторов на эффективность синтеза N-ацильных производных и разделения энантиомеров аминосоединений. Разработана методология определения ключевых кинетических параметров стереоселективного ферментативного ацильного переноса в водной среде. Впервые на количественном уровне показано влияние структуры ацильного донора на эффективность реакций ацильного переноса и стереоселективность по отношению к нуклеофилу. Разработан и апробирован принципиально новый полностью биокаталитический метод разделения энантиомеров аминосоединений в водной среде. i рос националы^"

I БИБЛИОТЕКА !

I С. Петербург Л/У i ОЭ М0>и J// •

Практическая значимость работы. Разработаны методы препаративного синтеза оптически активных N-ацильных производных аминокислот и дикетопиперазинов, избирательного ацилирования аминогруппы в боковой цепи аминокислот, основанных на использовании ПА из A.faecalis и E.coli в водной среде. Предложенный интегральный метод получения индивидуальных энантиомеров аминосоединений, сочетающий ферментативную реакцию стереоселективного ацилирования их рацематов и последующего ферментативного деацилирования в водной среде, по своей эффективности значительно превышает другие известные примеры из научной и патентной литературы в области препаративной хиротехнологии.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на Международных конференциях по биокатализу и биотрансформациям "Биотранс-200Р Дармштат, ФРГ, 2001г. и "Биотранс-2003" Оломоуц, Чехия, 2003г., Гордоновской конференции по биокатализу, Мериден, США, 2002г., Международных конференциях по биокатализу "Биокатализ-2000" Москва, 2000г., "Биокатализ-2002" Москва, 2002г. и "Биокатализ-2005" Санкт-Петербург, 2005г., Международной конференции "Прикладной биокатализ-2002" Комо, Италия, 2002г., Международной конференции "100 лет хроматографии", Москва, 2003г., Всероссийском симпозиуме "Хроматография и хроматографические приборы" Москва, 2004г., Международной конференции "Ломоносов-2004" Москва, 2004г., 2-ой Международной конференции "Инженерия ферментативных реакций", Цавтат, Хорватия, 2005г, на заседаниях кафедры химической этимологии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи, 1 международный патент и 10 тезисов докладов.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 196 ссылок. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц, 14 схем и 30 рисунков.

Результаты работы

Кинетические закономерности реакций ацильного переноса на аминосоединения, катализируемого пенициллинацилазой

Использование уникальных свойств ПА из A.faecalis для биокаталитического разделения энантиомеров широкого круга аминосоединений и синтеза N-ацильных производных представляет значительный интерес для тонкого органического и пептидного синтезов. С помощью этого фермента впервые осуществлен энантиоселективный синтез N-ацилпроизводных нефункционализированных аминов и аминоспиртов в 100% водной среде (схема 1). В качестве нуклеофилов в таких реакциях могут выступать не только амины и аминоспирты, но и аминокислоты, а в качестве ацильных доноров - различные

.NH

A.faecalis ПА

n=0, X=H, OH, NH. n=1, X«H

+

+

uu

pH 10, 25°C

(HSHtoim

(S)-AMUH

Схема 1. Стереоселективное актирование рацематов аминов.

активированные производные карбоновых кислот, а именно фенилацетамид, феноксиацетамид, амиды R-фенилглицина , R- и S- миндальных кислот.

Сравнивая перспективы использования ПА из E.coli с ферментом из A.faecalis, следует отметить, что интерес к последнему связан с более широким pH оптимумом активности, сдвинутым в щелочную область, этот фермент активен и стабилен при pH 10ч-10.5 в условиях депротонирования аминогрупп высокоосновных аминов и аминоспиртов. Высокая специфичность ПА из E.coli по отношению к аминокислотам как нуклеофилам позволяет использовать этот фермент для получения их N-ацильных производных, однако, ПА из E.coli является малоэффективным катализатором реакций ацильного переноса на амины и аминоспирты, что является следствием низкой специфичности фермента по отношению к данным классам аминосоединений. По-видимому, это объясняется ролью электростатических взаимодействий карбоксильной группы нуклеофила (в случае аминокислот) с положительно заряженным остатком участка связывания нуклеофила.

Использование водных сред имеет значительные преимущества по сравнению с известными реакциями ацильного переноса, основанными на использовании липаз и субтилизина в органических средах, такие как высокая каталитическая активность фермента, отсутствие побочных неферментативных процессов. Основной осложняющий фактор использования ПА в реакциях ацильного переноса в водном растворе обусловлен действием воды как конкурирующего нуклеофила. Поэтому необходимо провести детальное исследование кинетических закономерностей реакций ацильного переноса на различные аминосоединения, катализируемого ПА в водной среде, чтобы выявить критические факторы, ограничивающие эффективность ферментативного синтеза и разделения энантиомеров, построить алгоритм моделирования интегральной кинетики этих реакций и их оптимизации.

Ацилирование аминокислот

Исследование кинетики ацильного переноса на аминокислоты, катализируемого ПА из A.faecalis показало, что с увеличением концентрации нуклеофила в реакционной смеси подавляется непродуктивное превращение активированного донора в продукт гидролиза, а скорость синтеза N-ацильного

* в силу высокой стереоселективности фермента R-PGA и R-PG не выступают в качестве нуклеофила

• гидролиз

* синтез

0,00 0.05 0,10 0,15 0,20 0,00 0,06 0,10 0,15 0,20

[ЗДеииляланнн!, М [в-феинлаланин], М

Рис. 1 Зависимость начальной скорости накопления продукта синтеза и продукта гидролиза (А), и их соотношения ($/Н)о (Б) от концентрации нуклеофила в случае ацильного переноса К-РОА на Б-фенилаланин, катализируемого ПА из А./аесаИй.

производного аминокислоты гиперболически возрастает (рис. 1, А). Зависимость отношения начальных скоростей накопления продуктов синтеза и гидролиза -(Б/Н)о - от концентрации нуклеофила описывается гиперболой (рис. 1, Б), что позволяет предложить "минимальную" кинетическую схему, аналогичную случаю ацильного переноса на ядра антибиотиков, катализируемого ПА (схема 2).

Анализ соотношения (8/Н)0 от концентрации аминокислоты в рамках рассматриваемой схемы позволил оценить значение ключевых кинетических параметров, определяющих максимальный выход целевого продукта: а -параметра относительной специфичности фермента к синтезируемому продукту и

исходному ацильному донору, (Зо -

ЕА -3-- Е + Р,

Ь + в

Ев

к,

т

нуклеофильной способности

Р.

ЕАИ

К

параметра реакционной акцептора, у - параметра, характеризующего способность комплекса ацилфермент-

нуклеофил превращаться по пути

синтеза или гидролиза: *=»

Кр / . а _

к. -Кы

ЕР

Е + Р схема

Схема 2 "Минимальная" кинетическая ферментативного синтеза методом переноса ацильной части активированного донора на подходящий нуклеофил. Е - фермент, 8 - донор ацильной части, N - нуклеофил; ЕР - комплекс фермента с субстратом и синтезированным продуктом; ЕА - ацилфермент, ЕАЫ - комплекс ацилфермент-нуклеофил; Р/ - продукт, выделяющийся при образовании ацилфермепта; Р2 - продукт гидролиза ацилфермента.

где к2, кз, к4, к.4, кз, КР, К& Кы -элементарные и равновесные константы ферментативной

реакции (см. схему 2).

Принципиальным отличием реакций ацильного переноса на аминокислоты, катализируемого ПА из А./аесаШ и Е.соН, является тот факт, что в случае фермента из А./аесаШ скорость синтеза

превышает максимальную скорость гидролиза ацильного донора в 5-10 раз и достигает величин диффузионно контролируемых реакций.

Ацилирование аминов и аминоспиртов

Исследование кинетических закономерностей ацилирования аминов и аминоспиртов, катализируемого ПА из А./аесаШ, впервые выявило качественно новую особенность механизма протекания реакций ацильного переноса, катализируемых этой группой ферментов. При ацилировании аминов и аминоспиртов, в отличие от аминокислот, соотношение (5/77)0 линейно возрастает с увеличением концентрации нуклеофила (рис. 2). Этот факт свидетельствует о том, что комплекс БАИ "недоступен" для молекул воды, что обеспечивает превращение ЕАК исключительно по синтетическому пути с образованием целевого продукта (схема 2, ^=0, у=0).

Рис. 2 Зависимость начальной скорости накопления продукта синтеза и продукта гидролиза (А) и их соотношения (Б/Н)о (Б) от концентрации нуклеофила в случае ацильного переноса II-РСтА на 3-фенилпропиламин, катализируемого ПА из А./аесаШ (у=0).

Линейный рост эффективности ацильного переноса наблюдается вплоть до высоких концентраций аминосоединения и ограничивается его растворимостью в условиях проведения эксперимента. В этих условиях скорость синтеза Ы-ацильного производного, как и в случае ацилирования аминокислот, значительно превышает скорость гидролиза ацильного донора (табл. 1).

Табл. 1 Кинетические параметры ацилирования аминосоединений R-PGA, катализируемого ПА из A.faecalis (pH 10.0, 2?С)._

нуклеофил ßo) М"1 а Г V/Eo (сек1)

3-фенилпропиламин 282 0,55 0 105

бензиламин 39 н.о 0 4.2

R-PEA 146 0,44 0 270

S-феннлглицинол 115 2 0 200

S-фенилаланинол 7.7 н.о 0 33

S-лейцинол 104 0.8 0 75

S-2-амино-1 -бутанол 27 н.о 0 23

Таким образом, реакции ацильного переноса, катализируемого ПА из А./аесаШ, протекают через образование комплекса ацилфермент-нуклеофил, который в случае ацилирования аминов и аминоспиртов превращается исключительно продуктивно. Эффективный ацильный перенос, катализируемый ПА из А./аесаШ, на амины и аминоспирты принципиально выделяет этот биокатализатор в ряду ферментов семейства пенициллинацилаз.

Стереоселективное ацилирование аминосоединений

Кинетическая схема

Реакции ацильного переноса, катализируемого ПА из А./аесаШ, протекают энантиоизбирательно. При ацилировании рацемата аминосоединений, как правило, ацилируется один энантиомер (активный), а второй (неактивный) остается в свободной форме (схема 1). Если энантиоселективность реакции низкая в реакционной среде накапливается также определенная доля кадильного производного неактивного энантиомера аминосоединения.

Исследование кинетики ацилирования отдельных энантиомеров аминосоединений позволило предложить "минимальную" кинетическую схему для ацильного переноса на рацемат нуклеофила. Катализируемое ПА ацилирование включает конкуренцию двух энантиомеров нуклеофила за ацилферментный комплекс (схема 3). Кинетические уравнения, описывающие изменение концентрации компонентов во времени в соответствии с данной

Схема 3 "Минимальная" кинетическая схема ацилирования рацематов аминосоединений методом ацильного переноса, катализируемого ПА из А /аесаИя Е - фермент, 5 - донор ацильной части, N - нуклеофил; Е8, ЕР - комплекс фермента с субстратом и синтезированным продуктом; ЕА -ацилфермент, ЕАЫ-комплекс ацилфермент-нуклеофил; Р1 - продукт, выделяющийся при образовании ацилфермента; Р2 - продукт гидролиза ацилфермента. Индексы Л и 5 указывают соответствующий энантиомер. При ацилировании аминов и аминоспиртов кц и кщ равны нулю.

схемой, могут быть получены на основании материального баланса и допущении квазистационарности по ацилферментным комплексам. При начальных условиях: 1=0, 8=80, N=N0, Р5=Рк=Р2=0, накопление продуктов синтеза и гидролиза определяется следующим образом (например, Б-формы): в общем случае в случае аминов и аминоспиртов

е ¿р* _ УАг^оЛ Е

л ^•О+А-О+г)-*.) л к$-(\+р0ы0)'

ю, А-У, < = „ „

<и>1~1+р>-г К ¿рг р0

¿Рг ^УДи-Д-у-К,,) £ =__*2.Л>_ £

Л К5 (1 + До '0 +у)'Л'0) л А'^ О + ^о-А^о)

Энантиоселективность ферментативного ацилъного переноса

Традиционно понятие стереоселективности (Е) рассматривалось на примере реакций гидролиза, и было принято Е выражать отношением констант скорости реакций второго порядка (констант специфичности гидролиза) двух энантиомеров субстрата. Однако в случае реакций ферментативного ацильного переноса методология определения их стереоселективности не разработана.

В общем случае стереоселективность химических/ферментативных реакций следует определить как отношение начальных скоростей расходования/накопления двух энантиомерных форм рацемата субстрата/продукта (из предложенного определения Е вытекает, в частности, вышеупомянутое выражение стереоселективности реакций гидролиза.). Тогда, после несложных преобразований, стереоселективность ацилирования в рамках рассматриваемой кинетической схемы 3 выражается отношением максимальной нуклеофильной реакционной способности двух энантиомеров аминосоединения:

До*

Величину Е можно экспериментально определить при исследовании кинетики ацилирования рацемата аминосоединения, при этом необходимо проводить хиральный анализ продуктов реакции и энантиомеров нуклеофила.

Стереоселективное ацилирование аминосоединений при использовании Я-фенилглицин амида в качестве ацильного донора

Стереоизбирательность ПА из А./аесаШ по отношению к нуклеофилу исследовали на примере реакции ацилирования рацематов алифатических и ароматических аминов и аминоспиртов (табл. 2, 3, 4). В ряду полученных результатов выделяется достаточно низкая стереоселективность реакций ацилирования энантиомеров аминов, не содержащих функциональных групп (табл. 2), что наблюдали и в случае липаз, а также других ферментов. В силу близкой природы радикалов, примыкающих к хиральному центру нуклеофила, вклад инкремента гидрофобных взаимодействий недостаточен для эффективной дискриминации двух энантиомеров в активном центре биокатализатора.

Табл. 2 Кинетические параметры ацильного переноса на алифатические амины, катализируемого ПА из А./аесаИэ

амин У*/Ео, с1 (в/Щ, Е

(±)-2-амино-6-метилгептан Ив- 76 4 19 15 0.1 13

(±)-2-гептиламин (±)-2-аминопентан ив-й-в- 81 7.3 200 "" 3.1 2.6 0.2 "' з л м' 0.05 М

(±)-3-метил-2-бутиламин и-8- 36 5.5 0.66 , 0.1 6

(±)-2-аминобутан к- 8- 140 19 «« 8-5 0.5

* начальные концентрации: О.ЗМ Я-РвА, 0.2Мамин Табл. 3 Кинетические параметры ацильного переноса на ароматические амины, катализируемого ПА из А./аесаШ (рН 10.0, 25°С, ацильный донорЯ-РвА). **

амин Ув^цС 1 (8Ш)о Е

(±)-фенилэтиламинЕ ив- 120 0.1 20 8 -110« 0.02 1100

(±)-2-амино-3-фенилпропанА н-в- 40 35 2-0 ^ 1.8

(±)-2-амино-4-фенилбутан' 5 Ив- 86 0.2 аоз 500

(±)-(п-хлор)-фенилэтиламин0 ив- 6.4 17 8 >1000

(±)-1 -(1 -нафтил)этиламинг кв- 32.6 1.4 пп< 24 0.05

(±)-1 -(2-нафтил)этиламинг ив- 73 0.09 02003 800

** начальные концентрации: А: О.ЗМ Я-РОА, 0.2Мамин; Б: 0.2М Я-РОА, 0.2Мамин; В: 0.075МЯ-РвА, О.Шамин; Г. 0.2МЯ-РОА, О.Шамин Табл. 4 Кинетические параметры ацильного переноса на аминоспирты, катализируемого ПА из А /аесаШ (рН 10.0, 25°С, ацильный донор Я-РОА). ***

амин УЛс 1 (в/Щ, Е

(±)-аланинол (±)-2-амино-1 -бутанол в......«Г" к- 72 54 ......~64~' 45 14 1.4 1.0 ........ „ ... 1.0

(±)-лейцинол К* д. (±)-6-амино-2-метилгептанол V 180 0.2 5.3 а'н 14'5

(±)-фенилглицинол (±)-фенилаланинол 8-кН- 190 0.2 ' 11.4..... 0.7 77 '' >1000 0.008 .......О-3.........п""" 0.02

* начальные концентрации: 0:3 МЯ-РвА, 0.2Мамин

8

Исключение составляет 2-аминопентан, для которого значение Е удовлетворительно (Е=64). Следует отметить, что ацилирование амино-соединений с

третичным углеродным атомом, расположенным рядом с хиральным центром характеризуются наименьшими значениями (8/Н)0 и Е (см. 3,3-диметил-2-амино-бутан). Как правило, соотношение (8/Н)0

ацилирования активного энантиомера и, соответственно, Е значительно увеличивается при переходе от алифатических к ароматическим аминам. Это свидетельствует о реализации п-% взаимодействий на участке связывания нуклео-фила в активном центре фермента, поэтому дискриминация энантиомеров ароматических аминов (табл. 3) более эффективна.

Стереоселективность реакций ацилирования аминоспиртов выше (табл. 4), чем для соответствующих аминов. Как и в случае ариламинов, стери-ческие ограничения,

которые накладываются при связывании активного энантиомера аминосоеди-нения с бензильным заместителем у хирального атома углерода, существенно снижают эффективность и стереоселективность ацильного переноса (табл. 4).

Таким образом, реакции ацилирования аминосоединений, катализируемого ПА из А./аесаШ в водной среде, характеризуются высокими значениями скорости и эффективности синтеза, при этом дискриминация энантиомеров является удовлетворительной для многих алифатических аминов и аминоспиртов, и высокой для большинства ароматических аминосоединений.

Влияние структуры ацильного донора в реакциях ацилирования Характеристика доноров ацильной части

Кинетические параметры ферментативного превращения ацильных доноров наряду с их растворимостью и устойчивостью к спонтанному гидролизу определяют эффективность реакции ацильного переноса. Поэтому при ферментативном ацилировании аминосоединений важную роль играет выбор ацильного донора. Используемые амиды, в отличие от соответствующих эфиров, полностью устойчивы к неферментативному гидролизу в условиях ацилирования аминосоединений (рН 10) и характеризуются большей растворимостью в водной среде. Кинетические параметры ферментативного гидролиза и растворимость различных амидов различаются существенно (табл. 5). Однако высокое сродство

ПА к рассмотренным

Табл. 5 Кинетические параметры гидролиза доноров

ацильной части, катализируемого ПА из А./аесаП* (рН аЦИЛЬНЫМ Донорам

практически во всех случаях

позволяет проводить

ферментативные реакции в

режиме насыщающей

концентрации субстрата.

Несмотря на то, что

каталитическая активность

ПА из А./аесаШ по

отношению к различным

ацильным донорам отличается более чем на два порядка, каждый из этих

ацилирующих агентов, как будет показано в дальнейшем, имеет свои

преимущества, которые в совокупности делают ферментативное ацилирование

аминосоединений в водной среде перспективным препаративным методом.

Зависимость эффективности и стереоселективности ацильного переноса от природы донора

Формальный анализ кинетических схем (см. схему 3), описывающих протекание реакций ацильного переноса на аминосоединения, катализируемого ПА, позволяет предположить, что природа ацильного донора, в силу различия кинетических констант отдельных стадий ферментативной реакции, определяет скорость и эффективность синтеза. Сравнение кинетических параметров реакций ацильного переноса на ряд аминосоединений при использовании различных доноров, показало значительное различие в значениях скорости синтеза и

10.0, 25°С).

донор ^югг» с" Км> мМ китЖм*10^ (М*с)1 растворимость, М

К-РСА 40 1.5 25 0.35

Л-МА 73 3.7 20 0.37

8-МА 20 3.1 6.5 0.37

ФОАА 0.45 0.0013 346 0.085

ФАА 85 0.04 2300 0.068

нуклеофильной реакционной способности (табл. 6). Как правило, аминосоединения проявляют большую нуклеофильную реакционноспособность при использовании ФОАА в качестве ацильного донора, а наибольшие значения начальных скоростей накопления ацилированного продукта наблюдаются в случае ФАА.

Табл. 6 Влияние структуры ацильного донора на кинетические параметры реакции

Ацильный донор И-РСА ФОАА ФАА

--—Кщгетическпе параметры Аминосоединеиие ~ ——______ Ро, М"1 У/Е0, сек1 К м-1 У/Ее, сек"' Ро, М"1 У/Ео, сек"'

З-фенилпропиламин 280 102 1600 0,9 770 700

бензяламин 40 80 410 0,7 80 160

в-фенилглицинол 115 200 230 1,4 80 190

$-фенилаланинол 8 35 34 1,4 н.о н.о

£-лейщшол 105 75 н.о н.о 100 220

в-2-амиио-1-бутанол 27 23 15 0,84 17 100

&-фенилаланин 97 175 1330 2,5 н.о н.о

Исследования показали, что структура ацильного донора в значительной степени определяет относительную специфичность фермента (а). Параметр а принимает наименьшие значения в случае Ы-феноксиацетильных производных (рис. 3, Б). В случае Ы-феноксиацетильных производных высокая нуклеофильная реакционноспособность аминосоединений с одной стороны, и низкая

относительная специфичность а, с другой стороны (рис. 3, А и Б), способствуют эффективному ацильному переносу. Очевидно, ФОАА является наиболее

подходящим ацильным донором для Ы-

а, И-РСА

Рис. 3 Эффективность доноров ФОАА и Я-РвА в реакциях ацилирования

ацильного переноса. (А) - сравнение нуклеофильной аминосоединении,

реакционноспособности р0, (Б) - сравнение катализируемого ПА из относительной специфичности а. А./аесаШ в водной среде.

Стереоселективность реакции ацилирования аминов и аминоспиртов также существенно зависит от структуры ацильного донора (табл. 7). Наиболее ярко это наблюдается на примере (±)-лейцинола, когда значение стереоселективности варьируется от 20 до 500 для различных амидов. Как правило, энантиоселективность выше в случае Я-РИА и Я-МА. Полученные результаты можно объяснить взаимодействием между участком связывания ацильной группы и участком связывания нуклеофила активного центра фермента.

Табл. 7 Влияние структуры ацильного донора на кинетические параметры аципирования аминосоединений, катализируемого ПА из A.faecalis (pH 10.0, 25°С) *_

аминосоединение ацильный донор Vs/Eoc1 (S/H)„ E

R-PGAa 86 13 500

(±)-2-амино-4- R-MAB 150 13 800

фенилбутан S-MAB 15.8 5.4 150

ФААВ 240 6.5 120

R-PGA 90 21 1100

(±)-а-РЕА® R-MA S-MA 105 18.5 10 5.3 950 800

ФАА 210 7.2 350

R-PGA 260 12.6 500

R-MA 195 10.4 350

(±)-лейцинолв S-MA 16 8 120

ФАА 115 6.8 40

ФОАА 1 40 20

R-PGA 64 1.5 16

(±)-2-амино-1-бутанол® R-MA S-MA ФАА 100 7.0 100 2.4 0.8 3.4 20 1.3 1.7

ФОАА 1.0 12 4.0

*начальные концентрации: А: 0.2М донор ацильной части, О 2Мамин; Б: 0.25Мдонор ацильной части, 0.2Мамин; В: О.ЗМдонор ацильной части, 0.2Мамин

Таким образом, реакции ацилирования аминосоединений, катализируемые ПА из А./аесаШ в водной среде, характеризуются высокими значениями скорости синтеза, отношения (8/Н)0 и стереоселективности. Широкая субстратная специфичность фермента по отношению к структуре донора и нуклеофила, как будет показано в дальнейшем, позволяет успешно использовать ПА для препаративного разделения энантиомеров различных классов аминосоединений и синтеза оптически активных М-ацильных производных. Дополнительным преимуществом данного метода является возможность увеличения эффективности синтеза и разделения за счет рационального выбора ацильного донора.

Влияние различных факторов на эффективность стереоселективного ацилирования

Проведенные исследования позволили разработать алгоритм моделирования интегральной кинетики реакций ацильного переноса, на основании которого был проведен детальный анализ влияния различных факторов на эффективность и стереоселективность синтеза. Следует сказать, что такие реакции являются кинетически контролируемыми, поэтому интегральная кинетика и зависимость оптической чистоты компонентов реакции от степени превращения имеет сложный вид (рис. 4). Как видно, предложенная модель адекватно описывает экспериментальные результаты.

■н степень превращения

Рис. 4 Моделирование интегральной кинетики ацилированш (±)-б-амино-2-метил-2-гептанола амидом Я-миндальной кислоты, катализируемого ПА из А./аесаШ. (А) - интегральная кинетика, (Б) - зависимость оптической чистоты продукта и неактивного аминосоединения от степени конверсии амина в реакции ацильного переноса (продукт синтеза растворим). Для сравнения пунктирными линиями на графике (Б) представлена зависимость оптической чистоты для случая полностью нерастворимого продукта в аналогичной реакции (Е=17).

Формальный анализ кинетической схемы (схема 3), согласно которой протекает ацилирование аминов, позволил выявить факторы, определяющие эффективность синтеза Ы-ацильных производных и разделения энантиомеров аминов. Степень превращения, оптическая чистота продукта и не вступившего в реакцию амина определяются: ключевыми кинетическими параметрами (с/', с?, (?~у, исходными концентрациями реагентов (5о, и*, пЦ); растворимостью реагентов и продуктов реакции.

Интегральная кинетика реакций ацильного переноса может быть описана с использованием вышеприведенных параметров и значений эффективных констант диссоциации комплексов фермента с продуктами гидролиза и ацильного переноса.

Факторами, снижающими эффективность разделения энантиомеров аминосоединений, являются: низкая стереоселективность; низкая реакционноспособность аминосоединения; высокая растворимость продукта ацильного переноса.

Для рассмотрения влияния отдельных факторов на эффективность разделения энантиомеров аминосоединений было проведено математическое моделирование на примере реакции ацилирования рацемата а-РЕА при использовании амида ФУК в качестве донора ацильной части. Использованные при построении модели кинетические параметры гидролиза ацильного донора и продукта, кинетические константы стадий ацильного переноса, растворимости компонентов были определены экспериментально.

Влияние растворимости 1У-ацилированного продукта

Исследование влияния растворимости продукта ацильного переноса на эффективность синтеза Ы-ацильных производных и разделения энантиомеров аминосоединений методом ацильного переноса показало (рис. 5), что чем меньше

растворимость продукта (точнее отношение растворимости продукта и ацильного донора), тем выше выход и энантиомерная чистота двух форм - ацилированного продукта и свободной неактивной формы аминосоединения (рис. 5, Б). В случае хорошо растворимого продукта (например, М-ацильных производных аминокислот) значительно снижается степень конверсии исходного аминосоединения и, что более существенно, оптическая чистота непрореагировавшего энантиомера остается низкой (рис. 5, кривая 3). Последнее обстоятельство может быть серьезным недостатком при получении индивидуальных энантиомеров аминосоединений.

20 40 60 80 0 20 40 80 80 100

Время, мин Время, мин

Рис. 5 Влияние растворимости продукта переноса на выход целевого продукта (А) и оптическую чистоту аффилированного (пунктирная линия) и неактивного амина (непрерывная линия) (Б). Растворимость N-ацилированного амина: 0 бмМ(1), 12 мМ (2), >0.1 М(3).

Влияние концентраций реагентов

Влияние исходных концентраций реагентов на эффективность синтеза и разделения рассмотрены для двух случаев: 1) образования полностью растворимого продукта ацильного переноса и 2) осаждения продукта в ходе реакции. В первом случае высокое значение оптической чистоты неактивного энантиомера аминосоединения достигается при многократном избытке ацильного донора над нуклеофилом, а также при высоких концентрациях обоих реагентов

яь Щ

Рис. 6 Влияние начальной концентрации реагентов на максимально достижимое значение оптической чистоты неактивного энантиомера аминосоединения (Ы0 и Д> - начальные концентрации нуклеофила и донора ацильной части соответственно, /?о=100, а=0 05, Е~100)• (А) - случай растворимого продукта; (Б) - растворимость продукта 0 01 мМ

(рис. 6, А). В случае ограниченно растворимого продукта максимальный энантиомерный избыток неактивного энантиомера амина непрерывно растет с увеличением концентраций обоих реагентов (рис. 6, Б). При этом следует иметь в виду, что оптическая чистота продукта переноса на небольших глубинах превращения определяется исключительно стереоселективностью реакции и зависит от начальных концентраций и растворимости продукта только при больших степенях превращения реагентов.

Сделанные выводы подтверждают экспериментальные данные, полученные при ацилировании 2-амино-1-бутанола в гомогенной системе (табл. 8). Как и

ожидалось, наибольшая

Табл. 8 Влияние начальных концентраций реагентов на ______________

. оптическая чистота

оптическую чистоту амина и продукта реакции при

ацилировании (±)-2-амино-1-бутанола, катализируемого ПА неактивного энантиомера

аминоспирта достигается при высоких концентрациях обоих реагентов.

Аналогичные результаты были получены при ацилировании фенилалани-нола, протекающего с обра-

Я-РСА, амин, М М степень превращения, % максимальное %

0.4 0.2 70 79.8 67

1.0 0.2 70 79.2 65

2.7 1.3А 75 93.2 52

3.8 2.5а 64 95.6 56

А - сопровождается инактивацией ПА в ходе протекания 30ванием осадка Н.фенил.

реакции;

глицилфенилаланинола.

Синтез стереоизомерно чистых соединений при использовании пенициллинацилаз

Основываясь на результатах кинетических исследований ферментативного ацильного переноса, были разработаны методы препаративного синтеза хиральных Ы-ацильных производных и разделения энантиомеров аминосоединений при использовании ПА. Соответствующие целевые продукты были выделены в чистом виде, их структура доказана различными методами (ЯМР, элементный анализ, масс спектроскопия), определены физико-химические характеристики соединений (температура плавления, угол вращения).

Синтез М-ацильных производных Я-аминокислот

Стратегия полного ферментативного синтеза пептидов включает ферментативное введение защитных групп (например, при помощи ПА), синтез пептидной связи протеазой, затем ферментативное снятие защитных групп (ПА). Предложенная схема, в отличие от классического пептидного синтеза, позволяет проводить реакции в исключительно мягких условиях. Ранее было показано, что ПА из Е.соИ и А./аесаНв эффективно катализируют гидролиз Ы-ацильных производных аминокислот, поэтому в рамках данной работы исследовали возможность применения этих ферментов для синтеза Ы-ацильных производных аминокислот.

Используя ФАА в качестве ацильного донора, были синтезированы Ы-ацильные производные фенилаланина, фенилглицина и др. аминокислот. Катализируемое ПА ацилирование аминогрупп лизина и орнитина протекает с низкой региоселективностью. Для избирательного ацилирования е-аминогруппы лизина применили хемо-энзиматический подход - модификацию метода избирательного химического ацилирования аминогрупп боковой цепи а-аминокислот, основанного на предварительном образовании комплекса а-аминогруппы и карбоксильной группы с медью. Связывание а-аминогруппы в комплексе с катионом металла позволило не только провести избирательный синтез 1Ч-8-фенилацетильного производного, но и увеличить эффективность ферментативного ацилирования; дополнительным достоинством комплексообразования явилась низкая растворимость целевого продукта, что обеспечило его выведение из сферы реакции.

Следует отметить, что, при использовании ПА из Е.соН и ПА из А./аесаИя, в качестве катализаторов ацильного переноса соотношение (8/Н)0 и выход целевого продукта в обоих случаях сравнимы. Высокая специфичность ПА из Е.соН по отношению к аминокислотам как нуклеофилам, в отличие от нефункционализированных аминов и аминоспиртов, обеспечивает эффективный ацильный перенос. Уже при эквимолярном соотношении исходных реагентов максимальное накопление продукта превышает 50%.

Хемо-энзиматический синтез дикетопиперазинов

Использование Я-РОА в качестве ацильного донора позволяет синтезировать ди- и олигопептиды, содержащие Ы-концевую Л-амипокислоту. В свою очередь, при циклизации эфиров Я-фенилглициламинокислот можно получить дикетопиперазины (см. схему 4).

Во всех случаях синтеза дипептидов наблюдали достаточно высокое соотношение (8/Н)0, что обеспечило высокие выходы продуктов синтеза при использовании всего лишь 10% избытка ацильного донора над нуклеофилом (табл. 9). На второй стадии из выделенных дипептидов получали их метиловые эфиры, которые в слабощелочных условиях циклизовались с образованием соответствующих дикетопиперазинов (схема 4). Образование дикетопиперазинов протекало достаточно медленно: скорость циклизации в значительной степени зависела от природы боковых радикалов исходных аминокислот и варьировалась от нескольких дней до нескольких месяцев. Попытка сократить время циклизации увеличением рН и температуры реакционной системы приводила к увеличению вклада гидролиза эфира с образованием соответствующего дипептида, а не к образованию целевого продукта. Исключение составила циклизация метиловых эфиров Я-Рв-в-РО и в-РО-Б-Рв с образованием симметричных дикетопиперазинов, которая протекала намного быстрее (в течение нескольких часов) с выходом более 90%.

Г Синтез Оипептибов

NH,

NHj

(R)

* -Y

(S)

Ecoli ПА_

pH 9 7,25°C ^y NHj

(R.S)

II .Синтез метиловых эфиров дипвптидов ЛИ

„NH ^R

метанол /HCl

T

(R,S)

H20

(R.S)

iii' Синтез дикетопиперазинов

NHj

ЛИ.

метанол t КОН / ЬЦО

•CH,

(R.S)

CHjOH

rs-o......

N-

<R,S)

V ^

где R.

l

-(

ЛГ

-си,

CHj

Схема 4 Синтез диастереомерных дикетопиперазинов. Табл. 9 Препаративный синтез дикетопиперазинов.

нуклеофил

накопление

препаративный выход, %

дипептида, % дипептид метиловый эфир дипептида дикетопиперазии

Giy 85 61 - 31

S-Ala 88 34 66 42

S-Val 72 41 82 10

S-Leu 76 70 81 19

S-Пе 85 67 67 -

S-Phe 87 53 67 58

S-Trp 94 34 - 25

S-His 85 - - 26

Получение энантиомеров аминов и аминоспиртов при использовании пенициллинацилаз

Возможность использования ПА, с одной стороны, для высокоэффективного стереоселективного ацилирования первичных аминосоединений (при рН 9.5-10) и, с другой стороны, для стереоселективного гидролиза Ы-ацильных производных (при рН 7-8) позволяет объединить стадии ферментативного ацилирования и деацилирования в единый биокаталитический процесс получения энантиомеров широкого круга аминосоединений. Разработанный метод получения индивидуальных энантиомеров аминосоединений в водной среде является альтернативой существующим в настоящее время методам, основанных главным образом на энантиоселективном ацилировании аминосоединений липазами в органических средах с минимальным содержанием воды.

Интегральный биокаталитический метод

Интегральный биокаталитический метод получения энантиомеров аминосоединений сочетает в себе две ферментативные реакции, катализируемые ПА из А./аесаШ в 100% водной среде: стереоселективное ацилирование активного энантиомера из рацемата аминосоединения, и, после отделения неактивного энантиомера, гидролиз И-ацилированной формы с выделением активного энантиомера. Пример разделения (±)-2-амино-4-фенилбутана при использовании Я-РвА в качестве ацильного донора представлен на схеме 5.

N«2 N«5 МИ}

методом при использовании ПА.

Ацилирование протекает весьма эффективно (рис. 7), так как в этих условиях М-фенилглицильное производное характеризуется низкой растворимостью, что обеспечивает эффективный синтез продукта и упрощает его

• и-тел

□ (*)-2 ИЧ1Ц ^ фчщбути

О Н-ИЗ

А мим « фчипДудн

V Я-Рв-З-г амию < ¿еиилбудн

Рис. 7 Интегральная кинетика ацилирования Рис. 8 Гидролиз Ы-ацильных производных Й-РЕА, (±)-2-амино-4-фенилбутана Я-РвА, катализируемый ПА из А./аесаШ (рН 7.5, 25°С).

катализируемого ПА из Alcaligenes в водной среде (Е=500, рН 10.0, 25°С).

выделение (продукт можно выделить фильтрованием или экстракцией из реакционной смеси). При рН -7-7.5, К-фенилглицильные производные аминов обладают высокой растворимостью (за счет протонирования а-аминогруппы), а продукт гидролиза (фенилглицин) в этих условиях характеризуется ограниченной растворимостью и слабой ингибирующей способностью (табл. 10), поэтому

ферментативный

Табл. 10 Влияние структуры ацильной части на растворимость Ы-ацил-Я-РЕА и характеристика продуктов гидролиза, (рН7.5, 25°С').

растворимость, продукт растворимость Кь мМ гидролиза мМ мМ

субстрат

Ы-РЬас-Я-РЕА К-Я-РО-Я-РЕА

0.65 22

ФУК Я-Рв

>1000 35

0.016 17

гидролиз протекает эффективно вплоть до высоких степеней превращения (рис. 8). Благодаря

———————————————— высокой

стереоселективности обеих ферментативных стадий и эффективному разделению ацилированной и свободной форм амина, индивидуальные энантиомеры а-РЕА и 2-амино-4-фенилбутана были получены с высокой оптической чистотой и отличным выходом (табл. 11).

Табл. 11 Характеристика интегрального биокаталитического метода разделения рацематов аминов, основанного на использовании ПА из А./аесаШ.

ееа-ро-амин, евамин, степень производительность,

_%_%_превращения, %_кг/(м3*ч)_

Стадия I: Ферментативное ацилирование

а-РЕА 99.1 (Я) 97.8(8) 49.6

2-амино-4-фенилбутан 97.0 (Я) >99 (в) 52.7 Стадия II: Ферментативный гидролиз

а-РЕА - 99.1 (Л) >99

2-амино-4-фенилбутан - >99 (Я) 98.5

750 100

260 0.32

Выбор донора ацильной части

Очевидно, конечный выход и оптическая чистота полученных энантиомеров определяется эффективностью каждого из ферментативных превращений и

эффективностью разделения ацилированной и свободной форм аминосоединения, при этом выбор ацильного донора имеет принципиальное значение.

Так, например, использование ФАА в качестве донора имеет некоторые преимущества по сравнению с Я-РСА на стадии ацилирования, а также отделения М-ацилированного амина за счет низкой растворимости продукта. Однако, на стадии гидролиза низкая растворимость многих ТЧ-фенилацстиламинов является принципиальным недостатком. В ходе гидролиза накапливается ФУК - хорошо растворимый, сильный конкурентный ингибитор ПА (табл. 10), что приводит к медленному превращению плохо растворимого субстрата (рис. 8). С другой стороны, использование Я-РвА может быть ограничено в случае разделения аминосоединений с рК близким к рК а-аминогруппы фенилглицильных производных (рК~7.1), поскольку разделение ацилированной и свободной форм аминосоединения фильтрованием или экстракцией в этом случае мало эффективно.

В рамках данного исследования аминосоединения можно разделить на две группы: высокоосновные с рК>9.5-10, к которым относятся нефункционализированные амины, и аминосоединения с рК<9-9.5, к которым относятся, например, аминоспирты. Для разделения аминосоединений из первой

группы наиболее

Табл. 12 Эффективность использования различных доноров для получения энантиомеров аминов с рК>9.5~10 ацильный стадия I стадия II стадия Ш донор ацилирование разделение* гидролиз Я-РвА + +++

МА + ++ +

ФАА ++ +++

Табл. 13 Эффективность использования различных доноров для получения энантиомеров аминоспиртов с рК<9-9.5._

ацильный донор

Я-РвА МА ФАА

стадия I ацилирование

+ + ++

стадия II разделение4

стадия III гидролиз

+ ++

++ + +

А - разделение с помощью фильтрации или экстракции В - разделение возможно при использовании ионообменной хроматографии

подходящими ацильными донорами являются амиды Я-РО и миндальных кислот (табл. 12), причем в случае гидрофобных аминов

преимущество имеет Я-РСА. При разделении

аминоспиртов (табл. 13) более эффективным является применение амидов ФУК и миндальных кислот, а Я-РвА может быть использован лишь в случае использования препарати-вной ионообменной хроматографии в сочетании с ферментативными стадиями.

Модификация интегрального биокаталитического метода. Циклический подход

Разделение ряда нефункционализированных аминосоединений осложнено недостаточной энантиоселективностью фермента. Так, например, в случае близкой структуры радикалов, примыкающих к хиральному центру, стереоселективность ферментативной реакции, как правило, не превышает 20-50. В ряде случаев большей стереоселективности и эффективности разделения

удается добиться выбором подходящего ацильного донора. Однако, для ряда аминосоединений (2-амино-1-бутанол, см. табл. 7) таким путем не удается добиться существенного увеличения ключевого параметра - стереоселективности. При получении энантиомеров этих соединений можно использовать "циклический" подход, суть которого заключается в следующем (см. схему 6): 1) на первой стадии проводится ацилирование рацемата аминосоединения до степени конверсии, когда оптическая чистота неактивного энантиомера достигает высоких значений, >1-ацилированный продукт соответственно обогащен по активному энантиомеру; 2) после отделения от неактивной формы, продукт ацильного переноса подвергается гидролизу до глубины, когда в системе останется только ацилированный неактивный энантиомер высокой чистоты, а высвободившееся аминосоединение обогащено активным энантиомером. Далее ациламиносоединение подвергается гидролизу (химическому или ферментативному при использовании низкостереоселективного препарата ПА) для получения неактивного энантиомера, а свободный амин (обогащенный активным энантиомером) используется при проведении следующего цикла (для чего к нему добавляют новые порции ацильного донора, рацемического амина и вновь проводят ацилирование). После определенного числа циклов полученный на стадии гидролиза свободный амин будет представлять чистый активный энантиомер. При этом неактивный энантиомер аминосоединения выделяется после прохождения каждой стадии циклического процесса.

Схема 6 Схема получения энантиомеров аминосоединения циклическим методом на примере (±)-2-амино-1-бутанола и амида Л-миндальной кислоты (значения оптических чистот соединений и степени превращения определены экспериментально для 1 цикла и стадии ацилирования 2 цикла)

Другая модификация циклического метода заключается в следующем: на первой стадии также проводится полное ацилирование активного энантиомера из рацемата, а непрореагировавший неактивный энантиомер высокой оптической чистоты выделяют. Стадию гидролиза ацилированного амина проводится до глубин, когда освобождающийся активный энантиомер амина будет высокой оптической чистоты. Эти две стадии одного цикла позволяют получить оба энантиомера аминосоединения высокой оптической чистоты с выходом меньшим теоретического, а в остатке - непрогидролизованное Ы-ацильное производное, которое можно включать в последующие циклы разделения.

Две разновидности "циклического" подхода можно поочередно комбинировать. Следует отметить, что потери аминосоединения в ходе разделения минимизируются с увеличением числа проводимых циклов, и при проведении бесконечного числа циклов выход стремится к 100% по каждому из энантиомеров. Тем не менее, подобный метод вряд ли найдет применение для случая крайне низкой стереоселективности (Е<10).

Апробация предложенного метода была проведена на примере разделения энантиомеров 2-амино-1-бутанола (см. схему 6, циклы 1 и 2, стадия гидролиза 2 цикла была проведена, как описано во второй модификации "циклического" метода), используя в качестве ацильного донора Я-МА, и были получены 11-2-амино-1-бутанол с чистотой ее>95% и 8-2-амино-1-бутанол с чистотой ее 94%.

Сравнение методов получения индивидуальных энантиомеров

Предложенные методы получения энантиомеров аминосоединений, сочетающие ферментативные реакций стереоселективного ацилирования и деацилирования, катализируемые ПА в водной среде, высокоэффективны и охватывают широкий круг аминосоединений, для которых значения стереоселективности ферментативных стадий выше нескольких десятков.

Сравнивая разработанные нами процессы биокаталитического разделения а-РЕА с литературными и патентными данными по использованию липазы и субтилизина в безводных средах (табл. 14), следует отметить ряд преимуществ интегрального метода на основе реакций, катализируемых ПА из А./аесаИ$ в водной среде:

Табл. 14 Сравнение методов разделения энантиомеров а-РЕА с использованием различных ферментов._

Фермент Е Произ-ть, кг/м3*час

Пенициллинацилаза (ацилирование в водной среде) 1200 750

Пенициллинацилаза (гидролиз) 1700 260

Липаза (ацилирование в органической среде) >1000 50

Липаза (гидролиз) - 0.0013

Субтилизин (ацилирование в органической среде) 20 0.34

• более высокую производительность обеих стадий разделения

• использование двух биокаталитических стадий обеспечивает двойной контроль

энантиоселективности и исключает рацемизацию

• экологические преимущества использования водной среды

Основные результаты и выводы

1. Изучены кинетические закономерности реакций ацильного переноса на аминосоединения, катализируемого ПА из А./аесаШ в водной среде, предложены кинетические схемы стереоселективного ацилирования аминокислот и аминов/аминоспиртов, на основании которых разработан алгоритм моделирования интегральной кинетики реакции в условиях гомогенных и гетерогенных систем.

2. Проведен анализ влияния различных факторов на эффективность ацилирования аминосоединений в водной среде при использовании ПА. Показано, что наиболее благоприятные условия ацилирования достигаются в высококонцентрированных растворах реагентов.

3. Установлено, что эффективность и энантиоселективность ацилирования можно регулировать путем модификации структуры ацильного донора: ацильный перенос был наиболее эффективен в случае феноксиацетамида, а стереоселективность выше в случае амидов Я-фснилглицина и Я-миндальной кислоты.

4. Разработаны методы ферментативного синтеза М-ацильных производных Б-аминокислот, избирательного ацилирования е-аминогруппы лизина и орнитина, хемо-энзиматического синтеза оптически активных дикетопиперазинов.

5. Разработан высокоэффективный интегральный биокаталитический метод разделения энантиомеров аминов и аминоспиртов, сочетающий две последовательные стереоселективные реакции, катализируемые ПА из А./аесаШ в водной среде - ацилирование активного энантиомера из рацемата аминосоединения и, после отделения неактивного энантиомера аминосоединения, гидролиз продукта первой реакции для выделения немодифицированного активного энантиомера.

Список публикаций

1. Khimiuk A.Y., Korennykh A.V., Van Langen L.M., Van Rantwijk F., Sheldon R.A., Svedas. V.K. Penicillin acylase-catalyzed peptide synthesis in aqueous medium: a chemo-enzymatic route to stereoisomerically pure diketopiperazines. Tetrahedron: Asymmetry 2003, 14, 3123-3128.

2. Guranda D.T., Khimiuk A.I., Van Langen L.M., Van Rantwijk F., Sheldon R.A., Svedas V.K. An "Easy -on, easy-ofF' protecting group for the enzymatic resolution of (±)-l-phenylethyIamine in an aqueous medium. Tetrahedron: Asymmetry. 2004, 15, 2901-2906.

3. Guranda D.T., Kudiyavtsev P.A., Khimiuk A.Y., Svedas V.K. Efficient chiral analysis of primary amines and amino alcohols by HPLC with precolumn derivatization using novel jV-(/?)-mandelyl-(5)-cysteine. J. Chromatogr. A. 2005, J091, JCA345401.

4. Guranda D.T., Khimiuk A.J., Volovik T.S., Tarasov A.V., Yolkin P.G., Svedas V.K. Penicillin acylase-catalyzed resolution of amines in aqueous medium. Czech. Chem. Listy. 2003, 97,420-421.

5. Svedas V.K., Guranda D.T., Khimiouk A .J., Sheldon R.A., van Rantwijk F., van Langen L.M. Process for the preparation of enantiomerically enriched amines. Patent Number WO 02/20820 A2, 14 March 2002.

6. Буданова Ю.А., Химгок А.Я., Ушаков Г.А., Гуранда Д.Т. Введение и снятие N-защитных групп в пептидном синтезе пенициллинацилазой. Материалы XI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоносов-2004". Москва, Россия. 2004, 8-9 с.

7. Фесько Е.Н., Химюк А.Я., Тарасов А.В., Ёлкин П.Г., Гуранда Д.Т. Закономерности реакций ацильного переноса, катализируемых пенициллинацилазой из Alcaligenes faecalis. Материалы XI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоносов-2004". Москва, Россия. 2004, 32 с.

8. Гуранда Д.Т., Кудрявцев П.А., Химюк А .Я., Фесько Е.Н., Пчелинцев Н.А., Швядас В.К. Новые JV-ацильные производные (5)-цистеина для количественного определения энантиомеров аминосоединений методом ВЭЖХ с предколоночной модификацией. Мониторинг стереоселективного ферментативного превращения аминосоединений. Всероссийский Симпозиум "Хроматография и хроматографические приборы". Москва, Россия. 2004, 170 с.

9. Guranda D.T., Kudryavtsev Р.А., Khimiuk A.J., Svedas V.K. Determination of enantiomers of primary amines by HPLC with pre-column modification with o-phthaldehyde. Abstracts of Int. Conf. "100 Years of Chromatography". Moscow, Russia. 2003, P-276, p. 388.

10.Guranda D.T., Khimiuk A.J., Svedas V.K. Enzymatic acyl transfer reactions in aqueous medium: new possibilities for organic synthesis and resolutions. Abstracts of Int. Conf. "Biocatalysis-2002: Fundamentals and applications". Moscow, Russia. 2002, p. 35.

11 .Guranda D.T., Kudryavtsev P.A., Khimiuk A.J., Pchelintsev N.A., Shapovalova I.V., Svedas V.K. New chiral thiols for HPLC determination of enantiomers of primary amines after pre-column modification with o-phthaldehyde. Abstracts of Int. Conf. "Biocatalysis-2002: Fundamentals and applications". Moscow, Russia. 2002, p. 88.

12.Guranda D.T., Youshko M.I., Khimiuk A.J. and Svedas V.K. Penicillin acylase-catalyzed acyl transfer reactions in aqueous medium: from kinetic analysis to practical applications in stereoselective synthesis and resolutions. Applied Biocatalysis 2002. Como, Italy. 2002, Proceeding L-25.

13.Guranda D.T., Van Langen L.M., Khimiuk A.J., Van Rantwijk F., Sheldon R.A. and Svedas V.K. Enzymatic acylation of amines in an aqueous medium. How far it is from quantitative yield and absolute enantioselectivity? The 5th Int. Symp. on Biocatalysis and Biotransformation. Darmstadt, Germany. 2001, Proceedings 0-17, p. 95.

M.Khimiouk A., Korennykh A., Van Langen L.M., Van Rantwijk F., Sheldon R.A., Svedas V.K. Penicillin acylase-catalyzed peptide synthesis: a chemo-enzymatic route to optically pure diketopiperazines. International conference "Biocatalysis-2000: fundamentals and applications", Moscow. 2000, Proceedings p.105-106.

Список сокращений

ПА пенициллинацил аза

ФУК фенилуксусная кислота

R-PG Я-фенилглицин

R-PGA R-фeнилrлицинамид

MA амид миндальной кислоты

ФАА фенилацетамид

ФОАА феноксиацетамид

a-PEA а-фенилэтиламин

E стереоспецифичность; Е=(к1ШТ/Км)ь/(к1аг/Км)к

ее оптическая чистота ее=(ск-сь)/(ск+с:')

(S/H)0 соотношение начальных скоростей накопления продуктов синтеза и гидролиза

Подписано в печать 17.11.2005 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 154 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

»2 27 7 0»

РНБ Русский фонд

2006-4 24713

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Пенициллинацил азы.

1.1.1. Общие свойства.

1.1.2. Строение активного центра ПА по данным РСА.

1.1.3. Механизм катализа.

1.1.4. рН-профиль каталитической активности и стабильности ПА.

1.1.5. Субстратная специфичность.

1.1.6. Стереоспецифичность.

1.2. Пенициллинацилазы в реакциях синтеза.

1.2.1. Синтез р-лактамных антибиотиков.

1.2.1.1. Кинетические закономерности ацильного переноса на ядра антибиотиков.

1.2.2. Ацилирование аминосоединений.

1.3. Ферменты в тонком органическом синтезе.

1.3.1. Использование ферментов в реакциях конденсации.

1.3.1.1. Селективное ацилирование полифункциональных субстратов.

1.3.2. Ферментативное получение оптически активных соединений.

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Определение активности пенициллинацилаз.

2.2.2. Определение компонентов реакционной смеси методом ВЭЖХ.

2.2.3. Определение оптической чистоты аминосоединений.

2.2.4. Изучение растворимости компонентов реакции.

2.2.5. Исследование кинетических закономерностей реакций ферментативного ацильного переноса

2.2.5.1. Определение зависимости соотношения начальных скоростей синтеза/гидролиза от концентрации аминосоединения.

2.2.5.2. Определение соотношения констант специфичности при ферментативном гидролизе ацильного донора и продукта переноса.

2.2.6. Слежение за реакцией синтеза ацильных производных аминов и аминокислот.

2.2.7. Хемо-энзиматический синтез дикетопиперазинов.

2.2.8. Слежение за ферментативным гидролизом рацематов N-ацильных производных аминосоединений.

2.2.9. Получение рацематов R-фенилглицильных производных аминосоединений.

2.2.10. Разделение энантиомеров ос-PEA.

2.2.11. Разделение энантиомеров 2-амино-4-фенилбутана.

2.2.12. Разделение энантиомеров 2-амино-1-бутанола.

2.2.13. Обработка результатов и вычисления.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Кинетические закономерности реакций ацильного переноса на аминосоединения, катализируемого пенициллинацилазой.

3.1.1. Ацилирование аминокислот.

3.1.2. Ацилирование аминов и аминоспиртов.

3.1.3. Стереоселективное ацилирование аминосоединений.

3.1.3.1. Установление кинетической схемы.

3.1.3.2. Энантиоселективность реакций ферментативного ацильного переноса по отношению к нуклеофилу.

3.1.3.3. Стереоселективное ацилирование аминосоединений при использовании R-фенилглицинамида в качестве ацильного донора.

3.2. Влияние структуры ацильного донора в реакциях ацилирования.

3.2.1. Характеристика доноров ацильной части.

3.2.2. Зависимость эффективности и стереоселективности ацильного переноса от природы донора

3.3. Моделирование интегральной кинетики ацилирования аминосоединений.

3.4. Влияние различных факторов на эффективность стереоселективного ацилирования.

3.4.1. Влияние растворимости N-ацилированного продукта. ф 3.4.2. Влияние концентраций реагентов.

3.4.3. Влияние ионной силы и температуры.

3.4.4. Использование нативных и иммобилизованных препаратов пенициллинацилазы.

3.5. Синтез стереоизомерно чистых соединений при использовании пенициллинацилаз.

3.5.1. Синтез N-ацильных производных S-аминокислот.

3.5.2. Региоселективное ацилирование аминогрупп лизина и орнитина.

3.5.3. Хемо-энзиматический синтез дикетопиперазинов.

3.6. Получение энантиомеров аминов и аминоспиртов при использовании пенициллинацилаз.

3.6.1. Выбор донора ацильной части.

3.6.2. Интегральный биокаталитический метод.

3.6.3. Модификация интегрального биокаталитического метода. Циклический подход.

3.6.4. Сравнение методов получения индивидуальных энантиомеров.

ВЫВОДЫ.

Актуальность проблемы. Пенициллинацилазы (ПА) - биокатализаторы промышленного значения, используемые в производстве пенициллинов и цефалоспоринов. В последние годы показано, однако, что ферменты этого семейства обладают существенно более широкой субстратной специфичностью. Открытая недавно способность малоизученной ПА из Alcaligenes faecalis катализировать высокоэффективное и стереоселективное ацилирование аминов в водной среде послужило стимулом, определившем цель настоящего исследования - выяснение причин того, чем обусловлен столь эффективный синтез амидной связи, катализируемый гидролазой в 100% водной среде, каковы его ограничения, какие возможности открывает использование этого подхода. Особый интерес представляет использование таких реакций для получения оптически чистых соединений, а также для разделения энантиомеров веществ. Кроме того, использование биокатализа в водных средах является одной из главных тенденций развития современной промышленности в связи с растущими экологическими требованиями. Цель и задачи исследования. Целью работы явилось исследование кинетических закономерностей реакций ацильного переноса на первичную аминогруппу различных классов соединений, катализируемого ПА из A.faecalis в водной среде, включая стереоселективность ацилирования; выявление факторов, влияющих на эффективность синтеза N-ацильных производных и разделения энантиомеров аминосоединений, определение оптимальных условий этого процесса; разработка и апробация новых методов препаративного синтеза хиральных N-ацильных производных и получения индивидуальных энантиомеров аминосоединений при использовании как ПА из A.faecalis, так и ПА из Escherichia coli.

Научная новизна. Впервые показано, что ферментативное ацилирование высокоосновных аминосоединений, катализируемое ПА из A.faecalis в водной среде, протекает через стадию образования ацилфермент-нуклеофильного комплекса, выявлены особенности ацильного переноса на различные классы аминосоединений. Предложены "минимальные" кинетические схемы стереоселективного ацилирования аминокислот и аминов/аминоспиртов, на основании которых разработан алгоритм моделирования, позволяющий адекватно описать протекание реакции в условиях гомогенных и гетерогенных систем. Проанализировано влияние различных факторов на эффективность синтеза N-ацильных производных и разделения энантиомеров аминосоединений. Разработана методология определения ключевых кинетических параметров стереоселективного ферментативного ацильного переноса в водной среде. Впервые на количественном уровне показано влияние структуры ацильного донора на эффективность реакций ацильного переноса и стереоселективность по отношению к нуклеофилу. Разработан и апробирован принципиально новый полностью биокаталитический метод разделения энантиомеров аминосоединений в водной среде.

Практическая значимость работы. Разработаны методы препаративного синтеза оптически активных N-ацильных производных аминокислот и дикетопиперазинов, избирательного ацилирования аминогруппы в боковой цепи аминокислот, основанных на использовании ПА из A.faecalis и E.coli в водной среде. Предложенный интегральный метод получения индивидуальных энантиомеров аминосоединений, сочетающий ферментативную реакцию стереоселективного ацилирования их рацематов и последующего ферментативного деацилирования в водной среде, по своей эффективности значительно превышает другие известные примеры из научной и патентной литературы в области препаративной хир отехноло гии.

1. Литературный обзор

Выводы

1. Изучены кинетические закономерности реакций ацильного переноса на аминосоединения, катализируемого ПА из A.faecalis в водной среде, предложены кинетические схемы стереоселективного ацилирования аминокислот и аминов/аминоспиртов, на основании которых разработан алгоритм моделирования интегральной кинетики реакции в условиях гомогенных и гетерогенных систем.

2. Проведен анализ влияния различных факторов на эффективность ацилирования аминосоединений в водной среде при использовании ПА. Показано, что наиболее благоприятные условия ацилирования достигаются в высококонцентрированных растворах реагентов.

3. Установлено, что эффективность и энантиоселективность ацилирования можно регулировать путем модификации структуры ацильного донора: ацильный перенос был наиболее эффективен в случае феноксиацетамида, а стереоселективность выше в случае амидов R-фенилглицина и R-миндальной кислоты.

4. Разработаны методы ферментативного синтеза N-ацильных производных S-аминокислот, избирательного ацилирования е-аминогруппы лизина и орнитина, хемо-энзиматического синтеза оптически активных дикетопиперазинов.

5. Разработан высокоэффективный интегральный биокаталитический метод разделения энантиомеров аминов и аминоспиртов, сочетающий две последовательные стереоселективные реакции, катализируемые ПА из A.faecalis в водной среде -ацилирование активного энантиомера из рацемата аминосоединения и, после отделения неактивного энантиомера аминосоединения, гидролиз продукта первой реакции для выделения немодифицированного активного энантиомера.

1. Sakaguchi К. and Murao S. A preliminary report on a new enzyme, "penicillin-amidase". J. Agr. Chem. Soc. (Japan). 1950, 23,411-414.

2. Murao S. Penicillin-amidase. 3. Mechanism of penicillin-amidase on sodium penicillin. J. Agr. Chem. Soc. (Japan). 1955, 29,404-407.

3. Hamilton-Miller J.M.T. Penicillinacylase. Bacterid. Rev. 1966, 30, 761-771.

4. Vandamme E.J. and Voets J.P. Microbial penicillin acylases. Adv. Appl. Microbiol. 1974, 17, 311-369.

5. Huang H.T., Seto T.A. and Shull G.M. Distribution and substrate specificity of benzylpenicillin acylase. Appl. Microbiol. 1963, 11, 1-6.

6. Maliajan P.B. Review. Penicillin acylases an update. Appl. Biochem. Biotechnol. 1984, 9, 537-554.

7. Кочеткова Е.Ф., Бартошевич Ю.Э. и Романова Н.Б. Биосинтез пенициллинацилаз. Антибиотики мед. биоте.хнол. 1986, 31(10), 729-740.

8. Virden R. "Structure, processing and catalytic action of penicillin acy lase". Biotechnol. Gen. Eng. Rev. 1990, 8, 189-218.

9. Oh S.-J., Kim Y.-Ch„ Park Y.-W., Min S.-Y., Kim I.-S. and Kang H.-S. Complete nucleotide sequence of the penicillin G acylase gene and the flanking regions, and its expression in Ecoli. Gene. 1987, 56, 87-97.

10. Bock A., Wirth R„ Schmid G„ Schumacher G., Lang G. and Buckel P. The penicillin acylase from E.coli ATCC11105 consists of two dissimilar subunit. FEMS Microbiol. Lett. 1983, 20, 135-139.

11. Bock A., Writli R., Schmid G., Schumacher G., Lang G. and Buckel P. The two subunits of penicillin acylase are processed from a common precursor. FEMS Microbiol. Lett. 1983, 20, 141-144.

12. Schumacher G., Sizmann D., Haug H„ Buckel P. and Bock A. Penicillin acylase from E.coli: unique gene-protein relation. Nucleic Acid. Res. 1986, 14,5713-5727.

13. Sizmann D., Keilmann C. and Bock A. Primary structure requirements for the maturation in vivo of penicillin acylase from Ecoli ATCC 11105. Eur. J. Biochem. 1990, 192, 143-151.

14. Kasche V., Lummer K., Nurk A., Piotraschke E., Rieks A., Stoeva S„ Voelter W. Intramolecular autoproteolysis initiates the maturation of penicillin amidasc from Escherichia coli. Bioch. Bioph. Acta. 1999, 1433, 76-86.

15. Kasche V., Galunsky В., Ignatova Z. Fragments of pro-peptide activate mature penicillin amidase of Alcaligenes faecalis. Eur. J. Biochem. 2003, 270,4721-4728.

16. Lindsay C.D. and Pain R.H. The folding and solution conformation of penicillin G acvlase. Eur. J. Biochem. 1990, 192, 133-141.

17. Lindsay C.D. and Pain R.H. Refolding and assembly of penicillin acylase, an enzyme composed of two polypeptide chains that results from proteolytic activation. Biochemistry. 1991,30, 9034-9040.

18. Brannigan J. A., Dodson G„ Duggleby H.J., Moody P.C., Smith J.L., Tomchick D.R. and Murzin A.G. A protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation. Nature. 1995, 378, 416-419.

19. Choi C.S., Kim J.A. and Kang H.S. Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from Ecoli ATCC 11105. J. Bact. 1992, 174, 6270-6276.

20. Done S.H., Brannigan J.A., Moody P.C.E. and Hubbard R.E. Ligand-induced conformational change in penicillin acylase. J. Mol. Biol. 1998, 284, 463-475.

21. Douglass J., Civelli O. and Herbert E. Review. Polyprotein gene expression: generation of diversity of neuroendocrine peptides. Annu. Rev. Biochem. 1984, 53,665-715.

22. Neuratli H. Review. Evolution of proteolytic enzymes. Science. 1984, 27, 224(4647), 350-357.

23. Valle F„ Balbas P., Merino E. and Bolivar F. The role of penicillinacylase in nature and in industry. TIBS. 1991, 16,36-40.

24. Verhaert R.M.D., Riemens A.M., van der Laan J.-M., van Duin J. and Quax W.J. Molecular cloning and analysis of the gene encoding the thermostable penicillin G acylase from A.faecalis. Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63(9), 3412-3418.

25. Barbero J.L., Buesa J.M., de Buitrago G.G., Mendez E„ Perez-Aranda A. and Garcia J.L. Complete nucleotide sequence of the penicillin acylase gene from KJuyvera citropliila. Gene. 1986,49, 69-80.

26. Ljubijankic G„ Konstantinovic M. and Glisin V. The primary structure of Providencia rettgeri penicillin G acylase gene and its relationship to other gram negative amidases. DNA Seq. 1992,3, 195-200.

27. Ohashi H., Katsuta Y., Hashizume Т., Abe S.N., Kajiura H„ Hattori H„ Kamei T and Yano M. Molecular cloning of the penicillin G acylase gene from Artlirobacter viscosus. Appl. Environ. Microbiol. 1988, 54, 26032607.

28. Martin L„ Prieto M. A., Cortes E. and Garcia J.L. Cloning and sequencing of the рас gene encoding the penicillin G acylase of Bacillus megaterium ATCC 14945. FEMS Microbiol. Lett. 1995, 125, 287-292.

29. Kaufmann W. The possible implication of a bacterial enzyme in the biochemical mode of action of penicillins on gram-negative bacteria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1964, 14. 458-462.

30. Szentirmai A. Production of penicillin acylase. Appl. Microbiol. 1963, 12, 185-187.

31. Duggleby, H. J., Tolley, S. P., Hill, C. P., Dodson, E. J., Dodson, G„ and Moody, P. С. E„ Penicillin acylase lias a single-amino-acid catalytic centre. Nature, 1995,373, 264-268.

32. Kutzbach C. and Rauenbusch E. Preparation and general properties of crystalline penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105. Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 1974, 354,45-53.

33. Швядас В.К., Марголин A.JI., Шерстюк С.Ф., Клесов А.А. Березин И.В. Определение абсолютной концентрации активных центров растворимой и иммобилизированной пенициллинамидазы. ДАН. 1977, 232, 1127-1129.

34. Konecny J., Schneider A. and Sieber М. Kinetics and mechanism of acyl transfer by penicillin acylases. Biotechnol. and Bioeng. 1983, 25, 451-467.

35. Daumy G.O., Danley D. and McColl A.S. Role of protein subunits in Proteus rettgeri penicillin G acy lase. J. Bacterid. 1985, 163(3), 1279-1281.

36. Martin J., Slade A., Aitken A., Arche R. and Virden R. Chemical modification of serine at the active site of penicillin acylase from Kluyvera citrophila. Biochem. J. 1991, 280, 659-662.

37. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. Москва, изд-во "Высшая школа", 1977.

38. Березин И.В., Клесов А.А., Марголин А.Л., Ныс П.С., Савицкая Е.М., Швядас В.-Ю.К. Изучение пенициллинамидазы из Exoli. рН зависимость кинетических параметров ферментативного гидролиза бензилпенициллина. Антибиотики. 1976, 21(5), 411-415.

39. Юшко М.И. Кинетические закономерности ферментативного синтеза ампициллина, катализируемого пенициллинацилазой, в гомогенных, гетерогенных и твердофазных системах. Канд. дисс. Москва. 2000.

40. Martin J., Prieto I., Mancheno J.M., Barbero J.L. and Arche R. pH studies to elucidate the chemical mechanism of penicillin acylase from Kluyvera citrophila. Biotechnol. Appl. Biochem. 1993, 17, 311-325.

41. Chilov G.G., Svedas V.K. Enzymatic hydrolysis of beta-lactam antibiotics at low pH in a two-phase "aqueous solution water-immiscible organic solvent" system". Can. J. Chem. 2002,80, 699-707.

42. Svedas, V., Guranda, D„ van Langen, L„ van Rantwijk, F. and Sheldon, R. Kinetic study of penicillin acylase from Alcaligenesfaecalis. 1997 FEBS Lett. 417, 414-418.

43. Morillas, M„ Goble, M.L. and Virden, R. The kinetics of acylation and deacylation of penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105: evidence for lowered pKa values of groups near the catalytic center. 1999 Biochem. J. 338, 235-239.

44. Shimizu, M., Okachi, R., Kimura, K. and Nara, T. Purification and propreties of penicillin acy lase from Kluyvera citrophila. 1975 Agr. Biol. Chem. 39, 1655-1661.

45. Lee, Y.S., Kim, H. W. and Park, S.S. The role of a-amino group of the N-terminal serine of |3 subunit for enzyme catalysis and autoproteolytic activation of glutaiyl 7-aminocephalosporanic acid acylase. 2000 J. Biol. Chem. 275, 39200-39206.

46. Carlsen, F. and Ernborg, C. Bacillus sphaericus V penicillin acylase. II. Isolation and characterization. 1982 J. Chem. Technol. Biotechnol. 32, 808-811.

47. Torres-Guzman, R., de la Mata, I., Torres-Bacete, J., Arroyo, M., Castillon, M.P. and Acebal, C. Chemical mechanism of penicillin V acylase from Streptomyces lavendulae: pH-dependence of kinetic parameters. 2001 J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 16,33-41.

48. Batchelor, F.R., Chain, E.B., Richards, M. and Rolinson, G.N. 6-APA. VI. Formation of 6-APA from penicillin by enzymatic hydrolysis. 1961 Proc. Roy. Soc. В 154, 522-531.

49. Гуранда Д.Т., Воловик T.C., Швядас B.K. рН-зависимость стабильности пенициллинацилазы из Escherichia coli. 2004 Биохимия. 69(12), 1700-1705.

50. Суплатов Д.А., Гуранда Д.Т. рН-Стабильность пенициллинацилаз. Материалы XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоносов-2005". Москва, Россия. 2005.

51. McVey С.Е., Walsh M. A, Dodson G.G., Wilson K.S., and Brannigan J. A. Cry stal structures of penicillin acylase enzyme-substrate complexes: structural insights into the catalytic mechanism. 2001 J. Mol. Biol., 313, 139-150.

52. Воловик T.C. Стабильность пенициллинацилазы. Дипл. работа. Хим. ф-т МГУ, кафедра хим. энзимологии. M. 2004.

53. Berezin I.V., Klibanov A.M., Klyosov A.A., Martinek К. and Svedas V.K. The effect of ultrasound as a new method of studying conformational transitions in enzyme active sites. FEBS Lett. 1975,49(3), 325-328.

54. Azevedo A.M., Fonseca L.P. and Prazeres D.M.F. Stability and stabilization of penicillin acy lase. 1999 J. Chem. Technol. Biotechnol., 74, 1110-1116.

55. Andersson E„ and Halin-Hagerdal B. Enzyme action in polymer and salt solutions. I. Stability of penicillin acylase in poly(ethyIene glycol) and potassium phosphate solutions in relation to water activity. 1987 Biochem. Biophys. Acta, 912, 317-324.

56. Kheirolomoom A., Ardjamand M„ Vossouglii M„ and Kazemeini M. The stability analysis and mjdeling of pH-and ionic strength inactivation of penicillin G acylase obtained from various species of Escherichia coli. 1998 Biochem. Eng. J., 2, 81-88.

57. Yang S., Zhou L., Tang H„ Pan J., Wu X., Huang H„ Yuan Z. Rational design of a more stable penicillin G acylase against organic cosolvent. 2002 J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 18, 285-290.

58. Margolin A.L., Izumrudov V.A., Svedas V.K., Zenin A.B., Kabanov V.A. and Berezin I.V. Preparation and properties of penicillin amidase immobilized in polyelectrolytic complexes. 1981 Biochem. Biophys. Acta, 660, 359-365.

59. Ямсков И.А., Буданов M.B., Даванков В.А. Координационно-ионная иммобилизация ферментов. Влияние металла и стационарного лиганда на свойства иммобилизированных препаратов пенициллинамидогидролазы. Биохимия. 1981 Биохимия, 46, 1603-1608.

60. Guisan J.M., Alvaro G., Fernandez-Lafoente R, Rossel C.M., Garcia J.L. and Tagliani A. Stabilization of heterodimeric enzyme by multipoint covalent immobilization: Penicillin G acy lase from Kluyvera citrophila. 1993 Biotechnol. Bioeng., 42, 455-464.

61. Ospina S.S., Lopez-Munguia A., Gonzalez R.L., and Quintero R. Characterization and use of a penicillin acy lase biocatalyst. 1992 J. Chem. Tech. Biotechnol., 53,205-214.

62. Стрельцова З.А., Швядас В.К., Максименко А.В., Клесов А.А., Браудо Е.Е., Толстогуюв В.Б., Березин И.В. Влияние полиэлектролитов на свойства пенициллинамидазы и щелочной фосфатазы. Биоорг. хим. 1975, 1(10), 1464-1469.

63. Ныс П.С., Савицкая Е.М., Клесов А.А., Синицын А.П., Швядас В.-Ю.К., Березин И.В. Изучение пенициллинамидазы из E.coli. рН-зависимость кинетики инактивации фермента. Антибиотики. 1978, 23(1), 46-50.

64. Haufler U„ Wiesemann I., Ulmke R. and Kasche V. Structure, pH-stability and renaturation of free and immobilized Kcoli penicillin amidase. Dechema Biotechnology Conferences 1 VCH Verlagsgesellschaft. 1988, 345-350.

65. Kazan D., Ertan H. and Erarslan A. Stabilization of penicillin G acylase against pH by chemical cross-linking. Process Biochem. 1996,31(2), 135-140.

66. Kazan D., Ertan H. and Erarslan A. Stabilization of Escherichia coli penicillin G acylase against thermal inactivation by cross-linking with dextran dialdehyde polymers. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997, 48, 191-197.

67. Kazan D. and Erarslan A. Stabilization of Escherichia coli penicillin G acylase by polyethylene glycols against thermal inactivation. Appl. Biochem. Biotechnol. 1997, 62, 1-13.

68. Erarslan A., Terzi I., Guray A. and Bermek E. Purification and kinetics of penicillin G acylase from a mutant strain of Escherichia coli ATCC 11105. J. Chem. Tech. Biotechnol. 1991, 51,27-40.

69. Biyjak J. and Noworyta A. Copolymer of butyl aciylate and ethylene glycol dimethacrylate. J. Chem. Tech. Biotechnol. 1993, 57, 79-85.

70. Scherbakova T.A., Korennykh A.V., van Langen L.M., Sheldon R.A. and Svedas V.K. Use of high acyl donor concentrations leads to penicillin acylase inactivation in the course of peptide synthesis. J. Mol. Cat. B. Enzymatic. 2004, 31, 63-65.

71. Cole M. Properties of the penicillin deacylase enzyme of Escherichia coli. Nature. 1964. 203(4944). 519-520.

72. Cole M. Formation of 6-aminopenicillanic acid, penicillins and penicillin acy lase by various fungi. Appl. Microbiol. 1966, 14, 98-104.

73. Cole M. Hydrolysis of penicillins and related compounds by the cell-bound penicillin acy lase of Escherichia coli. Biochem. J. 1969, 115, 733-740.

74. Cole M. Deacylation of acylainino compounds other than penicillins by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem. J. 1969, 115, 741-745.

75. Cole M. Penicillins and the other acylamino compounds synthesized by ceel-bound penicillin acylase of Escherichia coli. Biochem. J. 1969, 115, 747-756.

76. Бондарева H.C., Левитов M.M., Рабинович M.C. Изучение субстратной специфичности пенициллинацилазы из Kcoli. Биохимия. 1969, 34(3), 778-783.

77. Margolin A.L., Svedas V.K. and Berezin I.V. Substrate specificity of penicillin amidase from E.coli. Biochim. Biophys. Acta. 1980,616,283-289.

78. Fuganti C., Rosell C.M., Servi S., Tagliani A. and Terreni M. Enantioselective recognition of the phenacetyl moiety in the pen G acylase catalysed hydrolysis of phenylacetate esters. Tetrahedron: Asymmetry. 1992, 3(3), 383-386.

79. Van der Mey M. and De Vroom E. Substrate specificity of immobilized penicillin-G acylase. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994,4(2), 345-348.

80. Daumy G.O., Danley D„ McColl A.S., Apostolakos D. and Vinick F.J. Experimental evolution of penicillin G acylases from Kcoli and Proteus rettgeri. J. Bacterid. 1985, 163(3), 925-932.

81. Robak M. and Szewczuk A. Penicillin amidase from Proteus rettgeri. Acta Biochimica. Polonica. 1981, 28(3, 4), 275-284.

82. Chiang D. and Bennet R.E. Purification and properties of penicillin amidase from Bacillus megaterium. J. Bacterid. 1967, 93, 302-308.

83. Чилов Г.Г., Гуранда Д.Т., Швядас B.K. Роль гидрофобности в связывании спиртов активным центром пенициллинацилаз. Биохимия. 2000, 65(8), 1135-1139.

84. Гуранда Д.Т. Субстратная специфичность и стереоспецифичность пенициллинацилаз из Escherichia coli и Alcaligenes faecalis. Канд. дисс. Москва. 2000.

85. Швядас B.K., Галаев И.Ю., Семилетов Ю.А. и Коршунова Г.А. Субстратная специфичность пенициллинацилазы из E.coli в ряду производных N-ацилированных аминокислот и пептидов. Биоорг. химия. 1983,9(8), 1139-1141.

86. Waldmann Н. The use of penicillin acylase for selective N-tenninal deprotection in peptide synthesis. Tetrahedron Lett. 1988,29(10), 1131-1134.

87. Svedas V.K. and Beltser A.I. Totally enzymatic synthesis of peptides: penicillin acylase-catalyzed protection and deprotection of amino groups as important building bloks of this strategy. Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1998.

88. Baldaro E., D'Arrigo P., Pedrocchi-Fantoni G., Rossell C.M., Servi S„ Tagliani A. and Terreni M. Pen G acylase catalyzed resolution of phenylacetate esters of secondary alcohols. Tetrahedron: Asvmmetrv. 1993, 4(5), 10311034.

89. Waldmann Н. The phenylacetyl group as enzymatically removable protecting function for peptides and carbohydrates: selective deprotection with penicillin acylase. Liebig's Annalen der Cliemie. 1988, 12, 1175-1180.

90. Didziapetris R., Drabnig В., Schellenberger V., Jakubke H.-D. and Svedas V. Penicillin acylase-catalyzed protection and deprotection of amino groups as a promising approach in enzymatic peptide synthesis. FEBS Lett. 1991,287(1,2), 31-33.

91. Waldmann H., Heuser A., Reidel A. Selective enzymatic deprotection of hydroxy- and amino groups in carbohydrates and nucleosides. Synlett. 1994, January, 65-67.

92. Dineva M.A., Galunsky В., Kasche V. and Petkov D.D. Phenylacetyl group as enzyme-cleavable aminoprotection of purine nucleosides. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1993, 3(12), 2781-2784.

93. Wang Q.-C., Fei J., Cui D.-F., Zhu S.-G. and Xu L.-G. Application of an immobilized penicillin acylase to the deprotection of N-phenylacetyl insulin. Biopolimers. 1986, 25, 109-114.

94. Plaskie A., Roets E. and Vanderhaeghe H. Substrate specificity of penicillin acylase of E.coli. J. Antibiotics. 1978,31(8), 783-788.

95. Ямсков И.А., Буданов M.B., Даванков В.А., Ныс П.С., Савицкая Е.М. Энантиоселективный гидролиз N-фенилацетил-ОХ-С-фенилглицина пенициллинамидогидролазой из E.coli и ее иммобилизированными препаратами. Биоорг. химия. 1979, 5(4), 604-610.

96. Svedas V.K., Savchenko M.V., Beltser A.I. and Guranda D.F. Enantioselective penicillin acylase-catalyzed reactions: factors governing substrate and stereospecificity of the enzyme. Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1996, 799, 659669.

97. Диджяпетрис Р.И. Физико-химическое исследование реакций синтеза и гидролиза N-фенилацетильных производных аминокислот, их эфиров и пептидов, катализируемых пенициллинацилазой. Канд. дисс. Хим. ф-т МГУ. М. 1992.

98. Galunsky, В., Lummer, К. and Kasche, V. Comparative study of substrate- and stereospecificity of penicillin G axnidases from different sources and hybrid isoenzymes. 2000 Monatsh. Chem. 131, 623-632.

99. Cole M. Factors affecting the synthesis of ampicillin and hydroxypenicillins by cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli. Biochein. J. 1969, 115, 757-764.

100. Svcdas V.K., Margolin A.L., Borisov I.L. and Berezin I.V. Kinetics of the enzymatic synthesis of benzylpenicillin. Enzyme Microb. Technol. 1980, 2, 313-317.

101. Svcdas V.K., Margolin A.L. and Berezin I.V. Enzymatic synthesis of (3-lactam antibiotics: a thermodynamic background. Enzyme Microb. Technol. 1980, 2, 138-144.

102. Березин И.В., Клесов А.А., Марголин A.JI., Ныс П.С., Савицкая E.M., Швядас В.К. Изучение пенициллинамидазы из E.coli: рН-зависимости константы равновесия ферментативного гидролиза бензилпенициллина. Антибиотики. 1976, 21(6), 519-523.

103. Марголин А.Л., Швядас В.-Ю.К, Ныс П.С., Кольцова Э.В., Савицкая Е.М., Березин И.В. Изучение пенициллинамидазы из E.coli: рН-зависимость константы равновесия ферментативного гидролиза ампициллина. Антибиотики. 1978, 2, 114-118.

104. Швядас В.-Ю.К., Марголин А.Л., Березин И.В. Термодинамические особенности ферментативного синтеза р-лактамных антибиотиков. ДАН СССР. 1979, 248(2), 479-481.

105. Blinkovsky A.M. and Markaryan A.N. Synthesis of p-lactam antibiotics containing a-ainino-phenylacetyl group in the acyl moiety catalyzed by D-(-)-phenylgIycyl-p-lactamide ainidohydrolase. Enzy me Microb. Technol. 1993, 15, 965-973.

106. Diender M.B., Straatliof A.J.J., Van der Wielen L.A.M., Ras C. and Heijnen J.J. Feasibility of the thermodynamically controlled synthesis of amoxicillin. J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 1998, 5, 249-253.

107. Березин, И.В., Марголин, А.Л., Швядас, B.K., Ферментативный синтез антибиотиков. Исследование реакции гидролиза-синтеза цефалотина, катализируемой пенициллинамидазои, Докл. АН СССР, 1977, 235, 961-964.

108. Семенов, А.Н. Мартинек, К., Швядас, B.K., Марголин, А.Л, Березин, И.В, Ферментативный синтез бензилпенициллина в двухфазной водноорганической системе. Докл. АН СССР. 1981, 258(5), 1124-1126.

109. Fernandez-Lafuente, R., Rossel, С. М., Guisan, J. М., Enzyme reaction engineering: synthesis of antibiotics catalysed by penicillin G acy lase in the presence of organic cosolvents. Enzyme Microb. Technol., 1991, 13, 898905.

110. Fernandez-Lafuente, R„ Alvaro, G„ Blanco, R. M„ and Guisan, J. M., Equilibrium controlled synthesis of cephalothin in cosolvent water systems by stabilized penicillin G acylase, Appl. Biochein. Biotechnol., 1991. 27. 277-290.

111. Клесов А. А., Марголин А.Л., Швядас В.-Ю.К. Ферментативный синтез антибиотиков. Перенос ацильной группы на 6-аминопенициллановую кислоту, катализируемый пенициллинамидазои из Ecoli. Кинетическое рассмотрение. Биоорг. химия. 1977, 3(5), 654-662.

112. Kasche V., Haufler U. and Zollner R. Kinetic studies on the mechanism of the penicillin amidase-catalysed synthesis of ampicillin and benzylpenicillin. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1984,365, 1435-1443.

113. Kasche V. Review. Mechanism and yields in enzyme catalysed equilibrium and kinetically controlled synthesis of p-lactam antibiotics, peptides and other condensation products. Enzyme Microb. Technol. 1986, 8,4-16.

114. Stambolieva N„ Mincheva Z. and Galunsky B. Kinetic comparison of penicillin amidase catalysed transfer of nonspecific and specific acyl moieties to 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid. Biocatal. Biotransform. 1998, 16, 225-232.

115. Isaka K„ Suga N. and Ishimura F. Kinetics and Mechanism of acyl transfer by penicillin G acylase comparing acyl donors methyl chloroacetate and methyl phenylacetate. J. Fermentation Bioeng. 1995, 79(3), 224-228.

116. Gololobov M. Yu., Kozlova E. V., Borisov I. L„ Schellenberger U., Schellenberger V., Jakubke H.-D. How to predict product yield in kinetically controlled enzymatic peptide synthesis Biotechnol. Bioeng. 1992, 40(3), 432436.

117. Yousliko M.I., Chilov G.G., Slicherbakova T.A., Svedas V.K. Quantitative characterization of the nucleophile reactivity in penicillin acylase-catalyzed acyl transfer reactions. Bioch. Bioph. Acta. 2002, 1599, 134-140.

118. Gololobov M.Yu„ Borisov I.L., Svedas V.K. Acyl group transfer by proteases forming an acylenzyme intermediate: kinetic model analysis (including hydrolysis of acylenzyme-nuclcophile complex). J. Tlieor. Biol. 1989, 140, 193-204.

119. Youshko M.I., van Langen L.M., de Vroom E„ van Rantvvijk F„ Sheldon R. A., Svedas V.K. Penicillin acylase-catalyzed ampicillin synthesis using a pH gradient: a new approach to optimization. Biotechnol Bioeng. 2002, 78(5), 589-593.

120. Didziapetris R.J. and Svedas V.K. Penicillin acylase-catalyzed acyl group transfer to amino acids, their esters and peptides: a kinetic study. Biomed. Biochim. Acta. 1991, 50 (10-11), 237-242.

121. Уголева Д.М. Изучение ферментативного синтеза N-фенилацет ильных поизводных аминокислот и их эфиров, катализируемого пенициллинацилазой, в системах "водный раствор-осадок'. Дипл. работа. Хим. ф-т МГУ, кафедра хим. энзимологии. М. 1998.

122. Roche D„ Prasad К. and Repic О. Enantioselective acylation of p-aminoesters using penicillin G acylase in organic solvents. Tetrahedron Lett. 1999, 40, 3665-3668.

123. Fite M., Capellas M„ Dolors Benaiges M., Caminal G., Clapes P. and Alvaro G. N-protection of amino acid derivatives catalyzed by immobilized penicillin G acylase. Biocatal. Biotransform. 1997, 14, 317-332.

124. Langen L.M., Rantwijk F„ Svedas V.K. and Sheldon R.A. Penicillin acylase-catalyzed peptide synthesis: a chemo-enzymatic route to stereoisomers of 3,6-diphenylpiperazine-2,5-dione. Tetrahedron: Asymmetry, 2000, 11, 1077-1083.

125. Guranda D.T., Langen L.M., Rantwijk F„ Sheldon R.A. and Svedas V.K. Highly efficient and enantioselective enzymatic acy lation of amines in aqueous medium. Tetrahedron: Asymmetry, 2001. 12, 1645-1650.

126. Guy A., Dumant A. and Sziraky P. Kinetic resolution of p-hydroxyphenyl acetamides by hydrolysis with pen-G acylase. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1993, 3(6), 1041-1044.

127. Fernandez-Lafuente R., Rosell C.M. and Guisan J.M. Modulation of the properties of penicillin G acy lase by the acy l donor substrates during N-protection of amino compounds. Enzyme Microb. Technol. 1998, 22, 583-587.

128. Davis B. G. and Boyer V. Biocatalysis and enzymes in organic synthesis. Nat. Prod. Rep., 2001, 18,618-640.

129. Schid A., Dordick J.S., Hauer В., Kiener A., Wubbolts M. and Witholt B. Industrial biocatalysis today and tomorrow. Nature, 2001, 409, 258-268.

130. Klibanov A.M. Improving enzymes by using them in organic solvents. Nature, 2001, 409, 241-246.

131. Lee M.-Y., Dordick J.S. Enzyme activation for nonaqueous media. Current Opinion Biotechnol., 2002, 13, 376384.

132. Ulijn R.V., Hailing P.J. Solid-to-solid biocatalysis: thermodynamic feasibility and energy efficiency. Green Chem. 2004,6,488-496.

133. Ulijn R.V., De Martin L„ Gardossi L„ and Hailing P.J. Biocatalysis in reaction mixtures with undisolved solid substrates and products. Curr. Org. Chem. 2003, 7, 1333-1346.

134. Gill I., Vulfson E.N. Enzymatic synthesis of short peptides in heterogeneous mixtures of substrates. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115,3348-3349.

135. Gill I., Vulfson E. Enzymatic catalysis in heterogeneous eutectic mixtures of substrates. Trends Biotechnol. 1994, 12, 118-122.

136. Lopez-Fandino R., Gill I. Vulfson E.N. Enzymatic catalysis in heterogenous mixtures of substrates: the role of the liquid phase and the effects of "adjuvants". Biotechnol. Bioeng. 1994,43, 1016-1023.

137. Lopez-Fandino R„ Gill I. and Vulfson E.N. Protease-catalyzed synthesis of oligopeptides in heterogenous substrate mixture. Biotechnol. Bioeng. 1994, 43, 1024-1030.

138. Cerovsky V. Peptide synthesis in solid state systems. Biotechnol. Teclmiques. 1992, 6, 155-160.

139. Erbeldinger M„ Ni X., and Hailing P.J. Enzymatic synthesis with mainly undissolved substrates at very high concentrations. Enzyme Microb. Technol. 1998, 23, 141-148.

140. Jakubke H.D., Eichhorn U., Hansler M„ Ullmann D„ Non-conventional enzyme catalysis: application of proteases and zymogens in biotransformations. Biol. Chem. 1996, 377, 455-464.

141. Youshko M. I.,. Svedas V. K. Penicillin Acylase-Catalyzed Solid-State Ampicillin Synthesis. Adv. Synth. Cat., 2002, 344(8), 894-898.

142. Gotor V. Lipases and (R)-oxynitrilases: useful tools in organic synthesis. J Biotechnol., 2002, 96(1), 35-42.

143. Alfonso I. and Gotor V. Biocatalytic and biomimetic aminolysis reactions: useful tools for selective transformations on polyfimctional substrates Chem. Soc. Rev., 2004,33, 201-209.

144. Rantwijk F. and Sheldon R. A. Enantioselective acylation of chiral amines catalysed by serine hydrolases. Tetrahedron, 2004, 60, 501-519.

145. Muralidliar R.V., Chirumamilla R.R., Marchant R., Ramachandran V.N., Ward O.P. and Nigam P. Understanding lipase stereoselectivity. World J. of Microb. and Biotech., 2002, 18, 81-97.

146. Theil F. Enhancement of selectivity and reactivity of lipases by additives. Tetrahedron, 2000, 56, 2905-2919.

147. Villeneuve P., Muderhwa J. M., Graille J., Haas M. J. Customizing lipases for biocatalysis: a survey of chemical, physical and molecular biological approaches. J. of Mol. Cat. B: Enzymatic, 2000, 9, 113-148.

148. Shanna R„ Chisti Y„ Baneijee U. C. Production, purification, characterization, and applications of lipases. Biotech. Advances. 2001, 19, 627-662.

149. Castro M.S. and Gado J. V.S. Lipase-catalyzed synthesis of ciral amides. A systematic study of the variables that control the synthesis. Tetrahedron, 1998, 54, 2877-2892.

150. Smidt H., Fischer A., Fischer P., Sclunid R. D. Preparation of optically pure chiral amines by lipase-catalyzed enantioselective hydrolysis of N-acyl-amines. Biotechnol. Tech. 1996, 10, 335-338.

151. Ulijn R.V., Bisek N., Hailing P.J., Flitsch S.L. Understanding protease catalysed solid pliase peptide synthesis. Org. Biornol. Chem., 2003, 1, 1277-1281.

152. Waldmann H., Sebastian D. Enzymatic protecting group techniques. Chem. Rev. 1994, 94, 911-937.

153. Thust S., Koksch B. Protease-catalyzed peptide synthesis for the site-specific incorporation of alpha-fluoroalkyl amino acids into peptides. J. Org. Chem. 2003, 68, 2290-2296.

154. Ulijn R.V., Baragana В., Hailing P.J., Flitsch S.L. Protease-catalyzed peptide synthesis on solid support. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 10988-10999.

155. Cerovsky V., Kula M.R. Studies on peptide amidase-catalysed C-terminal peptide amidation in organic media with respect to its substrate specificity. Biotechnol. Appl. Biochem. 2001, 33, 183-187.

156. Yan A.-X., Xing G.-W., Ye Y.-H., Tian G.-L., Wong M.-S. and Lee K.-S. Studies of the enzymatic synthesis of N-protected amino acid-estradiol derivatives in an organic solvent. Tetrahedron Lett. 2000, 41, 5379-5381.

157. Singh S. K., Felse A. P., Nunez A., Foglia T. A. and Gross R. A. Regioselective enzyme-catalyzed synthesis of sophorolipid esters, amides, and multifunctional monomers. J. Org.Chem., 2003, 68, 5466-5477.

158. Conde S., Lopez-Serrano P. and Martinez A. Regioselective Iipase-catalysed g-monoamidation of d-glutamic acid diesters: effect of the N-protecting group. Tetrahedron: Asymmetry, 2000, 11, 2537-2545.

159. Reichert J.M. Trends in development and approval times for new therapeutics in the United States. Nat. Rev. Drug. Discov., 2003, 2, 695-702.

160. Brenna E„ Fuganti C„ Serra S.Enantioselective perception of chiral odorants. Tetraliedron: Asymmetry', 2003, 14, 1-42.

161. Ditrich K„ Balkenbohl F., Ladner W. Separation of optically active amides. US 5905167, 1999; Chem. Abstr. 1997, 126, 277259f.

162. Stelzer U., Dreisbach C. Process for the preparation of optically active amines. US 6387692, 2002; Chem. Abstr. 1997, 127, 108759i.

163. Stelzer U. Process for producing optically active amines. US 6187582, 2001; Chem. Abstr. 1998, 128, 60789k.

164. Reeve C. D. Resolution of chiral amines. WO 9931264, 1999; Chem. Abstr. 1999, 131, 43668q.

165. Skupinska K.A., McEachern E.J., Baird I.R., Skerlj R.T., Bridger G.J. Enzymatic resolution of bicyclic 1-heteroaiylamines using Candida antarctica lipase B. J. Org. Chem. 2003,68, 3546-3551.

166. Aoyagi N. Izumi T. Kinetic resolution of U'-binaphtliylamines via lipase-catalyzed amidation. Tetraliedron Lett. 2002,43,5529-5531.

167. Gedey S., Liljeblad A., Lazar L„ Fulop F„ Kanerva L.T. Preparation of highly enantiopure p-amino esters by Candida antarctica lipase A Tetraliedron: Asymmetry, 2001, 12, 105-110.

168. Kanerva L.T., Csomos P., Sundliolm O., Bematli G., Fulop F. Approach to Highly Enantiopure b-Amino Acid Esters by Using Lipase Catalysis in Organic Media. Tetraliedron: Asymmetry, 1996, 7, 1705-1716.

169. Solymar M., Fulop F„ Kanerva L.T. Candida antarctica lipase A-a powerful catalyst for the resolution of heteroaromatic b-amino esters. 2002 Tetraliedron: Asymmetry, 13, 21, 2383-2388.

170. Puertas S., Brieva R., Rebolledo F., Gotor V. Selective ammonolysis and aminolysis of dimethyl succinate. Synthesis of optically active yV-alkylsuccinimides. Tetraliedron 1995, 51, 1495-1502.

171. Wang Y.-F., Yakovlevsky K„ Zhang В., Margolin A.L. Cross-linked crystals of subtilisin: versatile catalyst for organic synthesis. J. Org. Chem. 1997,62, 3488-3495.

172. Gutman A.L., Meyer E„ Kalerin E„ Polyak F., Sterling J. Enzymatic resolution of racemic amines in a continuous reactor in organic solvents. Biotechnol. Bioengng. 1992, 40, 760-767.

173. Herradon В., Valverde S. Biocatalysis in Organic Synthesis. First use of an acylase as catalyst in the irreversible transacylation of alcohols and amines: application to selective tansformations. Synlett, 1995,599-602.

174. Yousliko M.I., Rantwijk F.V., Sheldon R.A. Enantioselective acylation of chiral amines catalysed by aminoacylase I. Tetraliedron: Asymm. 12, 2001, 3267-3271.

175. Гуранда Д.Т., Шаповалова И.В., Швядас B.K. Новое N-ацильное производное (Б)-цистснна для количественного определения энантиомеров аминосоединений методом ВЭЖХ с предколоночной модификацией о-фталевым альдегидом. Биоорг. Химия. 2004, 30, 1-7.

176. Hein G.E., Niemann С. Steric Course and Specificity of a-Chymotrypsin-catalvzed Reactions. J. Am. Chem. Soc. 1962, 84,4487-4494.

177. Chen C.S., Fujimoto Y., Girdaukas G., Sih C.J. Quantitative analyses of biochemical kinetic resolutions of enantiomers. J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 7294-7299.

178. Straatliof A.J.J., Jongejan J.A. The enantiomeric ratio: origin, determination and prediction. Enzyme Microb. Technol. 1997,21,559-571.

179. Гершкович А. А., Кибирев B.K. Синтез пептидов. Реагенты и методы. Киев изд-во "Наукова думка", 1987.